Reação em Cadeia de Hibridação Assistida por Expansão - smFISH e Imunohistoquímica no Cérebro de Drosophila

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de HCR-smFISH assistido por expansão e imunohistoquímica para análise quantitativa específica por tipo celular da expressão de RNA e proteínas no cérebro de Drosophila , incluindo imagens com microscopia de folha de luz ou confocal e quantificação automatizada de transcritos nucleares e citoplasmáticos.

Resumo

A análise quantitativa e espacialmente resolvida da expressão gênica é essencial para avaliar perfis moleculares específicos do tipo celular. No sistema visual de Drosophila , extensas ferramentas genéticas abrem uma estrutura para avaliação direta tanto dos níveis de RNA quanto de proteínas em populações neuronais definidas. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo que combina HCR-smFISH assistido por expansão (hibridização em cadeia de reação de reação de molécula única em hibridação) com imunohistoquímica para permitir a análise quantitativa de perfis moleculares específicos de tipo celular em tipos neuronais de sistemas visuais geneticamente definidos. O fluxo de trabalho é otimizado para células marcadas com marcadores localizados nuclearmente ou ligados à membrana, permitindo a medição dos níveis de transcritos e proteínas nos mesmos neurônios. Após a expansão do tecido, as amostras são analisadas usando microscopia de folha de luz para aquisição volumétrica rápida, com um fluxo de trabalho alternativo de montagem e imagem demonstrado para microscópios confocais padrão de varredura a laser invertido e disco giratório. Além disso, fornecemos um algoritmo automatizado de segmentação que distingue transcritos nucleares e citoplasmáticos, permitindo análises do estado transcricional e localização de RNA subcelular. Orientações práticas são fornecidas sobre parâmetros experimentais e armadilhas comuns que afetam a qualidade do sinal, integridade dos tecidos e desempenho quantitativo. Aplicações representativas incluem a validação da interferência de RNA específica do tipo celular por meio da quantificação das mudanças correspondentes nos níveis de RNA e proteínas. Ao possibilitar medições integradas em nível de RNA e proteína com especificidade de tipo celular, essa abordagem oferece uma estratégia escalável para análise molecular baseada em hipóteses e, em contextos direcionados, uma alternativa prática aos ensaios transcriptômicos de célula única. Esse protocolo oferece uma abordagem prática para validar perturbações moleculares específicas do tipo celular, preservando o contexto anatômico do cérebro intacto de Drosophila .

Introdução

O sistema visual de Drosophila melanogaster serviu como um modelo poderoso para abordar uma ampla gama de questões na neurociência do desenvolvimento, incluindo diferenciação^{neuronal 1,2}, especificação de tipo celular ^3,4 e lógica molecular da fiação cerebral ^5,6,7. Esse progresso tem sido impulsionado por um conjunto experimental excepcionalmente rico, incluindo grandes coleções de linhas genéticas específicas para tipos^{celulares 8, 9, 10}, reconstruções conectômicas abrangentes^{recentes 10, 11, 12}, e cada vez mais detalhadas transcribômicas^{unicelulares 13, 14} e multiômica¹⁵ conjuntos de dados. Juntos, esses recursos definem tipos neuronais de forma multimodal e possibilitam manipulações genéticas precisas. Como resultado, o campo agora pode gerar hipóteses cada vez mais preditivas sobre como genes específicos regulam a identidade neuronal, a conectividade e^{a função 16}.. Embora o sequenciamento de RNA unicelular forneça insights poderosos sobre estados transcricionais, a abundância de RNA nem sempre prevê a expressão^{de proteínas 17}, e muitos experimentos de perturbação exigem, em última análise, medição direta e quantitativa tanto do RNA quanto da proteína nos mesmos neurônios.

A hibridização in situ por fluorescência de molécula única (smFISH^)18,19 permite a medição quantitativa da abundância de transcritos com resolução celular e subcelular, preservando o contexto anatômico. A combinação do smFISH com a microscopia de expansão 20,21,22 ampliou ainda mais sua utilidade para cérebros intactos ao aumentar fisicamente o tecido dentro de um hidrogel inchaço, reduzindo assim o aglomeramento molecular, melhorando o acesso óptico e aumentando a resolução espacial efetiva. Quando combinado com amplificação de sinal²³ baseada em reação em cadeia de hibridização (HCR), o smFISH assistido por expansão permite a detecção robusta de transcritos discretos em tecido neural espesso e apoia a imagem do cérebro inteiro usando microscopia de folha de luz ou confocal.

Uma variedade de abordagens de imagem de RNA in situ foi aplicada ao cérebro de Drosophila , refletindo diferentes prioridades experimentais. O HCR-FISH iterativo assistido por expansão permitiu a detecção de RNA espacialmente resolvida em todo o^{cérebro 24}. Paralelamente, abordagens FISH de montagem inteira sem expansão têm sido usadas para medições de RNA em neurônios geneticamente marcados, incluindo estratégias de mapeamento de atividades baseadas em HCR centradas nos genes imediatos^{iniciais 25} e fluxos de trabalho de contagem de transcritos baseados em segmentação usando marcadores geneticamente^{codificados em membranas 26}. Métodos comerciais baseados em sondas, como o RNAscope, possibilitaram ainda mais a detecção de RNA multiplex em cérebros inteiros, frequentemente combinados com imunohistoquímica para identificar populações celulares^{alvo 27}. Juntas, essas abordagens estabelecem que a análise espacialmente resolvida de RNA no cérebro da mosca é tecnicamente viável. No entanto, experimentos de perturbação baseados em hipóteses impõem um conjunto mais específico de requisitos que não são totalmente atendidos por nenhum fluxo de trabalho único existente. Muitos métodos priorizam o mapeamento de transcritos no estilo de descoberta multiplexado, o perfilamento de estado de atividade ou a quantificação de RNA isoladamente, com a imunocoloração normalmente servindo como identificador celular em vez de uma leitura pareada da proteína perturbada, ou sendo aplicada na ausência da atribuição genética do tipo celular²⁸. Além disso, aplicações rotineiras se beneficiariam da compatibilidade com múltiplas plataformas de imagem e de pipelines de análise automatizados e escaláveis.

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho integrado e passo a passo para o sistema visual Drosophila que combina HCR-smFISH assistido por expansão com imunohistoquímica realizada antes da expansão, permitindo a medição pareada dos níveis de RNA e proteína nos mesmos neurônios dentro da mesma amostra biológica. Com base no framework^{FlySeg 29} que desenvolvemos anteriormente, fornecemos um pipeline automatizado de quantificação para segmentação nuclear e contagem de transcritos que distingue pontos nucleares e citoplasmáticos, suportando tanto medições de expressão total quanto análises sensíveis ao estado transcricional. O protocolo é demonstrado tanto em um microscópio de folha de luz quanto em dois sistemas confocais, com fluxos de trabalho alternativos de montagem e imagem. Por fim, ilustramos a utilidade da leitura integrada RNA–proteína com um experimento representativo de validação de perturbações (ou seja, knockdown mediado por RNAi de um alvo definido), fornecendo orientações práticas sobre parâmetros e armadilhas que afetam a qualidade do sinal, integridade tecidual e desempenho quantitativo.

Esse protocolo geralmente se baseia no framework²⁴ EASI-FISH descrito anteriormente para a detecção de RNA no cérebro inteiro em Drosophila, e mantém seus princípios centrais de ancoragem de RNA, expansão de hidrogel e amplificação de sinais baseada em HCR. O protocolo atual amplia e refina essa abordagem integrando imunohistoquímica antes da expansão para permitir medições de RNA e proteína correspondentes nos mesmos neurônios, revisando múltiplas etapas de processamento e manuseio ao longo do fluxo de trabalho para melhorar a robustez e reprodutibilidade, fornecendo estratégias práticas de montagem e imagem tanto para microscópios de folha de luz quanto confocais invertidos convencionais, e incorporando segmentação automatizada de soma e quantificação de transcritos com separação explícita dos reservatórios de RNA nuclear e citoplasmático.

Esse fluxo de trabalho é mais adequado para experimentos direcionados cujo objetivo é quantificar leituras definidas de RNA e proteínas em neurônios geneticamente identificados, preservando o contexto anatômico. É particularmente útil para validar perturbações moleculares quando o objetivo é medir a regulação para cima ou para baixo de um gene definido ou de um pequeno conjunto de genes candidatos, comparar a expressão entre genótipos ou estágios de desenvolvimento, ou avaliar o estado transcricional por meio da localização nuclear versus da localização citoplasmática de transcritos. É menos adequado para descoberta de transcritos não enviesados ou mapeamento de expressão cerebral inteira com alto complexo, onde sequenciamento de célula única, transcriptômica espacial ou abordagens FISH multiplexadas iterativas podem ser mais apropriadas.

Protocolo

Declaração de ética

Esse protocolo utiliza Drosophila melanogaster. Nenhum animal vertebrado ou sujeito humano foi utilizado. Portanto, não era necessária aprovação do comitê institucional de cuidado e uso animal.

NOTA: Use a técnica RNase-clean durante todo o processo. Use luvas, limpe superfícies e ferramentas com solução de descontaminação de RNase e prepare todas as soluções com água sem RNase.

Figura 1. Fluxo de trabalho passo a passo do protocolo de preparação da amostra (A) Linha do tempo esquemática do protocolo, indicando a progressão aproximada dia a dia e as etapas de incubação durante a noite. (B–J) Visão geral esquemática das principais etapas de preparação da amostra, desde a dissecação e fixação cerebral até imunohistoquímica, cruzamento de RNA/proteína, embedding de hidrogel, digestão, hibridização da sonda e amplificação do sinal de HCR. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

1. Dissecação cerebral, fixação e imunohistoquímica (Dias 1–3)

NOTA: Execute todas as etapas em uma placa de múltiplos poços estilo Terasaki, salvo indicação em contrário. Use 10 μL por poço para incubações e lavagens. Mantenha a umidade colocando um lenço umedecido em um canto da placa.

ATENÇÃO: Paraformaldeído e fixadores glioxais são tóxicos/irritantes. Manuseie em um exaustor e use o EPI adequado.

1. Dissecar cérebros em meio de insetos S2 gelado. Transfira cérebros para poços, até 10 cérebros por poço (Figura 1B–C).
   NOTA: Para os experimentos representativos mostrados aqui, foram usados 72 cérebros de pupa com h-old (h-old hh).
2. Substitua o meio S2 por fixador de 10 μL por poço, troque uma vez.
3. Fixe com Addax glyoxal sem ácido com 5% (p/v) de sacarose durante a noite a 4 °C (Figura 1C).
4. Lave cérebros 3× em 10 μL PBST (0,5% Triton X-100 em PBS) por 10 minutos cada em temperatura ambiente.
   ATENÇÃO: Triton X-100 é um irritante; Evite contato visual com pele.
5. Incubar cérebros em solução primária de anticorpos de 10 μL (em PBST, nas diluições listadas na Tabela de Materiais) por 24 horas a 4 °C. (Figura 1D).
6. Lave o cérebro 3× por 10 minutos em 10 μL PBST a 4 °C. Para cada lavagem, substitua a solução uma vez no meio da incubação (duas trocas por lavagem).
7. Incube cérebros em solução secundária de anticorpos de 10 μL (em PBST, nas diluições listadas na Tabela de Materiais) por 24 horas a 4 °C (Figura 1D).
   NOTA: Proteja as amostras da luz.
8. Lave o cérebro 3× por 10 minutos em 10 μL PBST a 4 °C. Para cada lavagem, substitua a solução uma vez no meio da incubação (duas trocas por lavagem).
   NOTA: Use concentrações de anticorpos primários e secundários 2–3 vezes maiores do que as concentrações padrão de imunohistoquímica de montagem total
   PONTO DE PAUSA: Armazene cérebros em 10 μL 1× PBS a 4 °C por até 96 horas.

2. Ancoragem covalente de RNA e proteínas (Dia 4) (Figura 1E)

ATENÇÃO: Alquiladores ancoradores de RNA e AcX são perigosos (tóxicos/irritantes; alguns suspeitos de serem carcinógenos). Prepare e manuseie as soluções em uma exaustão química com EPI apropriado. Colete todo o lixo como resíduos químicos perigosos.

1. Incubar cérebros em 10 μL de tampão MOPS de 20 mM (pH 7,7) por 20 minutos a 37 °C.
2. Prepare a solução de ancoragem misturando 49,5% (v/v) de 20 mM MOPS, 49,5% (v/v) de estoque Melphalan (2,5 mg·^mL-1 em DMSO) e 1% (v/v) de estoque AcX (10 mg·^mL-1 em DMSO). Isso resulta em concentrações finais de 1,24 mg·^mL-1 melfalano e 0,10 mg·^mL-1 AcX.
3. Substitua o MOPS por uma solução de ancoragem de 7–8 μL por poço, troque a solução uma vez e incube durante a noite a 37 °C no escuro.
   NOTA: Use 7–8 μL para minimizar o transbordamento e a mistura entre poços, mantendo a cobertura total da amostra.

3. Gelação (imobilização de cérebros em um hidrogel) e digestão de proteinase K (Dia 5)

ATENÇÃO: Monômeros acrílicos, APS e TEMED são irritantes/tóxicos. Manuseio com EPI; Prepare componentes voláteis/exotérmicos em uma exaustão exaustânica.

1. Conecte uma vedação adesiva de silicone com 0,5 mm de espessura em uma lâmina de vidro de microscópio sem carga (Figura 1F, canto inferior esquerdo), pressione firmemente para garantir contato total e vedação.
2. Adicione 200 μL de solução de poli-L-lisina à câmara e espalhe uniformemente para revestir a superfície, incube em temperatura ambiente por 5 minutos e remova a solução com uma pipeta.
3. Deixe a poli-L-lisina evaporar completamente até que a superfície fique visivelmente seca.
   NOTA: A evaporação da poli-L-lisina é lenta. Para resultados confiáveis, prepare as câmaras com antecedência e deixe-as secar durante a noite em um ambiente sem poeira. Alternativamente, seque câmaras em uma incubadora a 37 °C por ≥ 1 hora no dia do uso.
4. Lave cérebros 2× em 10 μL 1× PBS por 10 minutos cada em temperatura ambiente.
5. Prepare a solução de monômero em gel e adicione reagentes de polimerização imediatamente antes do uso, misturando a solução de monômero com 4HT, TEMED e APS (faça novo) na proporção de 47:1:1:1. A solução final de gelificação contém 1 M de acrilato de sódio, 14% de acrilamida, 0,1% de bis-acrilamida, 1× de PBS, 0,01% de 4HT, 0,2% de TEM e 0,2% de APS.
6. Faça um vórtice breve e mantenha a solução final de gelificação no gelo. Use a solução imediatamente.
7. Incube cérebros em solução gelificante fria de 10 μL por 15 minutos sobre gelo.
8. Durante o pré-equilíbrio, usando uma nova lâmina de barbear, corte um canal estreito de cada lado da junta de silicone para permitir a saída do ar durante o enchimento (Figura 1F, canto superior esquerdo)
9. Usando uma ponta de pipeta, transfira cérebros para a câmara de gelificação preparada, garantindo que cada cérebro permaneça submerso em solução gelificante o tempo todo.
   ATENÇÃO: Após ancorar e equilibrar, o cérebro se torna altamente adesivo e adere facilmente às superfícies plásticas. Para evitar perda de amostra, use pontas de pipeta de grande calibre ou corte a ponta de uma ponta padrão para alargar a abertura.
10. Remova o revestimento protetor do adesivo de silicone da superfície e coloque delicadamente uma cobertura de vidro limpa de 1,5H sobre a câmara, evitando bolhas de ar presas.
11. Pipete-se lentamente 200 μL de solução gelificante recém-preparada na câmara através de um dos canais laterais, até que a câmara esteja completamente cheia.
12. Coloque a câmara selada em um recipiente escuro e incube a 37 °C por 2 horas.
    NOTA: Coloque os lenços umedecidos de laboratório umedecidos com água) dentro do recipiente. Certifique-se de que o lâmina não entre em contato direto com água líquida.
13. Prepare um tampão de digestão composto por 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM de NaCl, 1 mM de EDTA e 0,5% (v/v) de Triton X-100 em água livre de RNase.
14. Imediatamente antes do uso, adicione a Proteinase K a 1:100 de um estoque de 20 mg·^mL-1 até uma concentração final de 0,2 mg·^mL-1.
    ATENÇÃO: A proteinase K é um irritante e deve ser tratada com luvas; Evite inalação e contato com a pele.
15. Deixe o slide esfriar em temperatura ambiente por 5 minutos antes de remover o coverslip. Corte o gel com um bisturi até formar um formato retangular usando cortes simples e retos. Minimize o excesso de volume de gel ao redor de cada cérebro (Figura 1F, canto superior direito).
16. Coloque cada gel aparado em um poço individual de uma placa de 24 poços contendo uma solução digestiva de 1000 μL. Certifique-se de que os géis estejam totalmente submersos.
17. Sele a placa com Parafilm e incube durante a noite em temperatura ambiente em um agitador orbital a 0,11 g (Figura 1G).

4. Digestão de DNase e hibridização com sonda HCR-smFISH (Dia 6)

1. Aspire cuidadosamente a solução digestiva usando uma pipeta posicionada na borda do poço para evitar contato ou deformação do gel.
2. Lave os géis 3× com 500 μL 1× PBS por 15 minutos cada em temperatura ambiente em um agitador orbital a 0,11 g.
   PONTO DE PAUSA: Armazene os géis submersos em 500 μL 1× PBS a 4 °C por até 7 dias antes de prosseguir.
3. Prepare uma solução de trabalho de DNase de 500 μL por gel diluindo o estoque de DNase I do conjunto QIAGEN RNase-Free DNase 1:10 no tampão RDD. A solução final de trabalho contém aproximadamente 0,27 unidades de Kunitz·^μL-1.
4. Incube géis em solução de trabalho de 500 μL de DNase por 2 horas a 37 °C com balanço suave (Figura 1H).
5. Gel de lavagem 4× com 500 μL de PBS livre de RNase 1× por 15 minutos cada em temperatura ambiente.
6. Equilibrar géis em tampão de hibridização de sonda pré-aquecida de 500 μL por 30 minutos a 37 °C
7. Estoque de sondas HCR smFISH diluído (1 μM; Instrumentos Moleculares) 1:300 em buffer de hibridização de sonda para uma concentração final de ~3,3 nM. Mistura por vórtice
8. Substitua o tampão de equilíbrio por mistura de 500 μL para sonda por gel e incube durante a noite a 37 °C em um agitador orbital a 0,11g (Figura I).
   ATENÇÃO: Os tampões de hibridização da sonda contêm formamida, que é tóxica. Use luvas e evite inalação.

5. Reação em Cadeia de Hibridização (Dia 7) (Figura 1J)

1. Gel de lavagem 3× com tampão de lavagem pré-aquecido de 500 μL por 30 minutos cada a 37 °C em um agitador orbital a 0,11 g.
   ATENÇÃO: Os buffers de lavagem da sonda contêm formamida, que é tóxica. Use luvas e evite inalação.
2. Lave os géis 3× com 500 μL 1× PBS por 30 minutos cada em temperatura ambiente em um agitador orbital a 0,11 g.
3. Deixe os géis em 1 mL 1× PBS durante a noite em temperatura ambiente em um agitador orbital a 0,11 g.
   NOTA: Uma lavagem prolongada durante a noite melhora a relação sinal-ruído ao reduzir a ligação da sonda fora do alvo e os pontos de fundo. Para processamento no mesmo dia, proceda diretamente para a amplificação HCR.
   PONTO DE PAUSA: Após lavagens pós-hibridização, armazene os géis em 1 mL 1× PBS em temperatura ambiente ou 4 °C por até 96 horas antes da amplificação por HCR.
4. Substitua o PBS por um buffer de amplificação de 500 μL (previamente equilibrado à temperatura ambiente) por poço e incube por 30 minutos em temperatura ambiente em um agitador orbital a 0,11 g.
5. Para cada conjunto de sondas, diluir os grampos h1 e h2 (estocada de 3 μM; Instrumentos Moleculares) em buffer de amplificação 1:100 (concentração final de 30 nM). Prepare 350 μL de mistura de hairpin diluída por poço.
6. Soluções hairpin diluídas por calor em tubos de PCR a 95 °C por 90 s em um ciclador térmico ou bloco de calor. Use 100 μL de volume total por tubo para garantir aquecimento uniforme e equilíbrio de temperatura.
   NOTA: As diretrizes HCR geralmente recomendam o aquecimento rápido dos hairpin h1 e h2 separadamente e combiná-los somente após o resfriamento; alternativamente, combinar H1 e H2 antes do aquecimento instantâneo quando for necessário um manuseio simplificado.
7. Deixe os grampos esfriarem até a temperatura ambiente por 10 minutos no escuro, sem ser perturbados.
8. Remova o buffer de amplificação e adicione mistura de grampo de cabelo de 350 μL por poço.
9. Incube géis por 2 horas em temperatura ambiente, no escuro, em um agitador orbital a 0,11 g.
10. Lave os géis 3× com 500 μL 5× SSCT por 10 minutos cada em temperatura ambiente em um agitador orbital a 0,11 g.
11. Recupere as soluções de hairpin após a amplificação, proteja-as da luz e armazene-as a -20 °C para reutilização.
12. Transfira os géis para 500 μL 1× PBS e lave 3× por 30 minutos em temperatura ambiente.
13. Armazene os géis em 500 μL 1× PBS a 4 °C, protegidos da luz.
    PONTO DE PAUSA: Géis amplificados podem ser armazenados por até 2 semanas antes da imagem, com perda mínima de sinal.

6. Preparação, montagem e imagem de amostras expandidas (Dia 8) (Figura 2)

1. Incube géis em 1× PBS contendo DAPI (1:1000) durante a noite a 4 °C em um shaker orbital a 0,11 g.
2. Use iluminação UV breve para visualizar o cérebro dentro do gel. Oriente a amostra e corte o excesso de gel conforme necessário.
   ATENÇÃO: A iluminação UV é usada durante o posicionamento e montagem da amostra. Use proteção ocular adequada.
3. Monte amostras em 1× PBS complementadas com DAPI (1:1000) usando a configuração apropriada para a plataforma de imagem selecionada (veja a Tabela 1).
4. Permita que as amostras se equilibrem por pelo menos 1 hora antes da aquisição.
5. Use objetivos de imersão em água com distância de trabalho suficiente para visualizar através do gel expandido.
6. Amostras de imagem usando microscopia de folha de luz, microscopia confocal de varredura a laser ou microscopia confocal de disco giratório. Parâmetros representativos específicos de montagem e aquisição usados neste estudo são resumidos na Tabela 1.
   NOTA: Após a imagem de imagem, sondas e grampos de cabelo HCR podem ser removidos por digestão de DNase, conforme descrito acima. Os géis podem então ser submetidos a rodadas adicionais de hibridização com sonda e amplificação por HCR.

Plataforma	Visualização, montagem e localização de exemplos	Objetivo / detector	Configurações representativas de aquisição
Zeiss Lightsheet 7	Use iluminação UV breve para visualizar a posição do cérebro no gel. Corte o excesso de gel e oriente cada cérebro em direção ao objetivo de detecção. Coloque 5–6 géis sobre uma capa coberta de poli-L-lisina de 1 × 1 cm, com géis voltados para fora (Figura 2A). Fixe a cobertura ao suporte da amostra LS7 usando uma pequena gota de adesivo curável por UV; Desligue a lâmpada UV antes de aplicar adesivo. Monte na câmara LS7 e localize regiões cerebrais usando visualização ao vivo em ZEN Black.	Objetivo de detecção de imersão em água de 20×/1,0 NA; Zoom óptico de 2,5× (50× ampliação total).	Z-step, 0,4 μm com 2,5× de zoom e 2× de expansão. Escaneamento por pivô ativado. Exposição, 50 ms para todos os canais. Lasers: 405 nm a 5%, 488 nm a 2%, 561 nm a 8%. Emissão: 420–470 milhas náuticas, 505–545 milhas náuticas, 570–620 milhas náuticas.
			(Figura 2C, esquerda)
Confocal de varredura a laser Nikon Ti2-E AXR NSPARC	Use iluminação UV breve para visualizar o cérebro dentro do gel. Oriente um único gel de modo que o cérebro fique voltado para baixo, em direção ao objetivo invertido. Transfira para uma placa de imagem com fundo de vidro preenchida com 1× PBS + DAPI (Figura 2B). Localize o cérebro com um objetivo de 4×, identifique ROIs com objetivo de 20× e registre posições X-Y nos elementos NIS. Adicione um meio de imersão, revise os ROIs registrados e traga isso em foco.	Objetivo de imersão em água a longa distância de 40× (Nikon CFI APO LWD 40× WI, 1,15 NA Lambda S, distância de trabalho de 0,61 mm); Detector NSPARC em modo super-resolução.	Varredura de galvanômetro, 2048 × 2048 pixels, 1,6 μs/pixel, zoom 8,0×. Lasers: 488 nm a 2%, 640 nm a 20%. Emissão: 502–546 milhas náuticas e 666–732 milhas náuticas.
			(Figura 2C, meio)
Confocal de disco giratório Evident Scientific IXplore IX85 / Yokogawa CSU-W1	Monte amostras como para imagens confocais invertidas: oriente o gel com o cérebro voltado para o objetivo e coloque em um prato de imagem com fundo de vidro com 1× PBS + DAPI (Figura 2B). Identifique regiões de interesse conforme descrito para microscopia confocal de varredura a laser usando o software cellSens.	objetivo de imersão em água de 60× longa distância (Olympus LUMFLN60XW LWD, 1,10 NA, distância de trabalho de 1,5 mm); Câmera Hamamatsu ORCA-Fusion BT GenIII (2304 × 2304 pixels; tamanho de pixel 6,5 × 6,5 μm).	excitação de 488 nm a 75% de potência, exposição de 200 ms; Excitação de 640 nm a 100% de potência, exposição de 800 ms. Emissão: 500–550 milhas náuticas e 665–705 milhas náuticas.
			(Figura 2C, à direita)

Tabela 1: Montagem representativa, localização da amostra e parâmetros de imagem entre as plataformas de microscopia. Resumo das estratégias de montagem da amostra, abordagens de localização, objetivos e parâmetros de aquisição usados em plataformas de microscopia de folha de luz e confocal.

7. Análise quantitativa da expressão de RNA e proteínas

NOTA: Escolha o fluxo de trabalho de análise com base no objetivo experimental. Uma comparação dessas abordagens é fornecida na Tabela Suplementar 1.

1. Quantificação de transcritos em escala populacional usando FlySeg.
   NOTA: A análise baseia-se na versão atualizada do pipeline FlySeg²⁹ . Uma visão esquemática do fluxo de trabalho de análise é mostrada na Figura 3A–B
   1. Instale o FlySeg, um pacote baseado em Python, criando um ambiente Conda usando:
      conda env create -f environment.yml
   2. Ative o ambiente antes da análise usando:
      Conda ativar flyseg
   3. Comece a análise usando:
      Python main.py --arquivo >
      Use formatos de entrada suportados, incluindo arquivos CZI ou NPY.
   4. Personalize a análise usando argumentos opcionais conforme necessário, incluindo:
      Número de canais (--canais)
      Canal de núcleos (--nuclei_ch ou --nuclei_wavelength)
      Canal de citoplasma (--cytoplasm_ch ou --cytoplasm_wavelength)
      Parâmetros de detecção de núcleos (--nuclei_sigma_range, --nuclei_threshold)
      Fator de dilatação nuclear (--nuclei_dilation)
      Limiares de detecção FISH (--fish_threshold_range)
      Diretório de saída (--output_dir)
      Visualização via Napari (--visualize)
   5. Exiba todas as opções disponíveis usando:
      Python main.py – ajuda
   6. Inspecionar os metadados da imagem usando:
      Python main.py --metadata_only.
      Confirme tamanho do voxel, número de canais e identidade do canal.
   7. Execute a análise usando parâmetros ajustados adequadamente para o conjunto de dados. Normalmente, especifique o número total de canais, canal de núcleos, canal de citoplasma (se disponível) e fator de dilatação nuclear.
      NOTA: Defina o valor --nuclei_dilation apropriado para a fronteira nuclear/citoplasmática desejada. Veja a Figura 3C–D para um exemplo.
   8. Monitore o registro de processamento. Todas as saídas são salvas em uma pasta nomeada em homenagem ao arquivo de entrada.
   9. Identificar os principais resultados para análise a jusante, incluindo:
      1. -Nuclei-df.csv
         que contém medições de características por núcleo e contagens de pontos associadas para cada canal FISH e fornece dados quantitativos para análise estatística.
      2. -Nuclei-equivalent-diameter-area-scatter.png
         Que é um gráfico de dispersão usado para identificar valores atípicos de segmentação com base no tamanho e intensidade nuclear; exclua núcleos marcados como valores aberrantes de análises posteriores.
   10. Use saídas intermediárias adicionais (por exemplo, máscaras de segmentação, tabelas de detecção de pontos e arquivos de resumo FISH mesclados) para pós-processamento avançado, se necessário.
2. Contagem de transcritos em células individualmente identificáveis usando Imaris
   1. Usando a ferramenta Surfaces, segmente o neurônio de interesse com base em um canal marcador citoplasmático ou de membrana.
   2. Ajuste os parâmetros de suavização da superfície e do limiar de intensidade para garantir que a superfície resultante englobe com precisão o soma, excluindo estruturas vizinhas.
   3. Usando a ferramenta de detecção Spots, identifique pontos de transcrição no canal FISH. Defina o diâmetro estimado do ponto e o limiar de intensidade com base no tamanho do ponto e na intensidade do sinal (por exemplo, 0,25 μM para expansão de tecido 2x).
   4. Restringa a detecção de pontos à superfície previamente gerada para garantir que apenas os pontos dentro do neurônio sejam contados.
   5. Extraia o número total de pontos detectados na superfície do neurônio usando o painel de Estatísticas.
   6. Contagens pontuais de exportação e medições associadas para análise a jusante.
3. Quantificação de fluorescência baseada em ROI usando FIJI/ImageJ
   1. Abrir pilhas de imagens no FIJI e gerar projeções de máxima intensidade usando Image > Stacks > Z Project > Maximum Intensity Projection. Use configurações de projeção idênticas para todas as amostras dentro de um experimento.
   2. Identifique a estrutura neuronal de interesse usando um canal marcador anatômico (por exemplo, GFP membranar ou citoplasmático). Usando a ferramenta de Seleção de Polígonos ou Mão Livre, delinee manualmente o retorno sobre investimento correspondente à estrutura (por exemplo, dendrito de fibra gigante).
   3. Mude para o canal de proteína e meça a intensidade de fluorescência dentro do ROI definido usando Analyze > Measure. Registre os seguintes parâmetros: Intensidade média de fluorescência; Densidade integrada; Área de retorno sobre o investimento.
   4. Meça a intensidade da fluorescência em um ROI de fundo próximo de tamanho semelhante que não possuja sinal específico e esteja fora da estrutura neuronal marcada. Use a mesma estratégia de ROI de fundo para todas as amostras dentro do experimento e subtraia o valor de fundo da medição de ROI.
   5. Use valores integrados de densidade ou intensidade média corrigidos pelo fundo para comparação quantitativa entre genótipos ou condições experimentais. Certifique-se de que configurações de imagem idênticas sejam usadas para todas as amostras a serem comparadas.

Resultados

Para validar o fluxo de trabalho de HCR-smFISH assistido por expansão e imunohistoquímica em um contexto biologicamente relevante, focamos no circuito de escape iminente do sistema visual Drosophila. Esse circuito consiste em neurônios de projeção visual LC4 geneticamente^{definidos 30,31} que detectam estímulos ameaçadores e um neurônio descendente de Fibra Gigante (GF) bem caracterizado que impulsiona decolagens^{rápidas 32,33}, fornecendo um sistema anatomicamente estereotipado para medições moleculares específicas de tipo celular em cérebros intactos.

A proteína da junção gap da Drosophila Shaking-B (ShakB)³⁴ tem sido implicada na transmissão elétrica dentro de múltiplos componentes do circuito GF, incluindo sinapses axonais^{de saída 35} e entradas auditivas³⁵. Embora a evidência direta de acoplamento elétrico nos dendritos GF durante a detecção de ameaça seja limitada, trabalhos recentes indicam que os neurônios LC4 expressam altos níveis de shakB³⁶. Essas observações motivaram o uso de estratégias de knockdown e marcação do shakB como caso de teste para avaliar se o protocolo pode avaliar quantitativamente perturbações moleculares direcionadas tanto nos níveis de RNA quanto de proteína em tipos neuronais geneticamente definidos.

Primeiro avaliamos a eficiência do knockdown do shakB no GF e LC4 usando HCR-smFISH combinado com coloração por anticorpos do ShakB. O GF, um único neurônio por hemicérebro, foi marcado com um marcador de membrana (Figura 4A). LC4, uma população de aproximadamente 60 neurônios por hemicérebro, foi marcada com um marcador nuclear para possibilitar a quantificação em nível populacional (Figura 4B). Nos cérebros controle, transcritos de shakB foram claramente detectados tanto nos neurônios GF quanto LC4. A expressão do RNAi shakB resultou em uma redução significativa dos pontos do mRNA shakB em neurônios alvo de ambos os tipos celulares (Figuras 4C–D). Consistente com o local citoplasmático da interferência de RNA, a depleção dos transcritos foi mais pronunciada no compartimento citoplasmático. A separação dos pontos nucleares e citoplasmáticos usando a quantificação baseada em FlySeg revelou uma redução seletiva dos transcritos de shakB citoplasmático na população de LC4, enquanto os pontos nucleares foram significativamente menos afetados (Figura 4D, redução de 69% vs 22%, respectivamente).

Encontramos coloração por anticorpos ShakB localizada em áreas onde os dendritos GF se sobrepõem aos axônios dos Interneurônios Comissurais Gigantes (GCI), que conectam as duas Fibras Gigantes e possibilitam respostas visuais^{contralaterais 37} (Figura 4E). Essas observações são consistentes com estudos anteriores³⁵ que demonstraram acoplamento elétrico dependente de ShakB entre o GF e o GCI. A coloração por anticorpos ShakB também foi observada em regiões onde os axônios LC4 entram em contato com dendritos GF, embora a localização nessa região tenha sido menos claramente resolvida. Independentemente da localização subcelular precisa, o sinal de anticorpos ShakB associado à região dendrítica GF foi marcadamente reduzido após a expressão de RNAi (Figura 4F).

No entanto, a detecção baseada em anticorpos não permite a atribuição inequívoca da proteína ShakB aos terminais LC4 pré-sinápticos versus dendritos GF pós-sinápticos nos locais de contato. Além disso, a expressão generalizada de shakB em todo o sistema^{visual 34,36} limita a quantificação específica do tipo celular nos neurônios LC4 usando imunocoloração anti-ShakB. Para superar essas limitações e avaliar diretamente a localização específica do tipo celular do ShakB, utilizamos um alelo ShakB marcado endógenamente que anteriormente^{geramos 36,38}. Isso possibilitou a visualização seletiva da proteína ShakB especificamente dentro dos neurônios LC4. O ShakB marcado com SmGdP-10×V5 foi enriquecido tanto em dendritos (correspondentes a regiões de entrada dos neurônios visuais a montante) quanto em terminais axônicos que entram em contato com os dendritos GF (Figura 4G). A expressão do RNAi do shakB resultou em um desaparecimento quase completo do sinal V5 tanto nos compartimentos dendrítico quanto no axonal (Figura 4H). Esses resultados demonstram que o protocolo possibilita a resolução específica e subcelular da localização de proteínas endógenas dentro de neuropil densamente inervados.

Como controle qualitativo adicional, testamos FISH não expandido combinado com imunohistoquímica em populações neuronais identificadas (Figura Suplementar 1). O sinal FISH do grd sobrepôs-se ao LC22 somata, consistente com a expressão prevista dos dados do scRNA-seq do lobo óptico (Figura Suplementar 1A–C)¹³. Nos neurônios Tm3 que expressam tdTomato, o mRNA tdTomato sobrepôs-se à proteína tdTomatoes, enquanto o mRNA VGlut1 não se sobrepôs ao Tm3 somata, consistente com a identidade colinérgica dos neurônios Tm3 (Figura Suplementar 1)¹³. Esses exemplos ilustram que o FISH + IHC não expandido é suficiente para avaliação qualitativa de presença/ausência, enquanto a expansão é necessária para quantificação confiável de ponto único.

A implementação bem-sucedida desse protocolo é indicada por marcagem clara específica para o tipo celular, pontos discretos de smFISH com baixo fundo, segmentação confiável de núcleos individuais ou volumes celulares definidos manualmente, e redução consistente do sinal de RNA ou proteína alvo após perturbação. Desfechos negativos ou de baixo sinal também devem ser interpretáveis: por exemplo, o RNAi do ShakB produziu redução do sinal de mRNA do ShakB e da proteína do ShakB, enquanto o FISH não expandido apresentou falta de sinal de VGlut1 no somata Tm3, apesar da detecção clara do mRNA do tdTomate. Desfechos subótimos incluem sinal fraco de anticorpos ou smFISH, pontos de fundo elevados, segmentação incompleta, má alocação de pontos ou deriva amostral durante a imagem, todos os quais podem afetar a quantificação a jusante.

Figura 2. Montar e imaginar amostras expandidas usando placas de luz e plataformas de microscopia confocais. (A) Visualização e corte de hidrogéis expandidos (1–2), comuns a todas as plataformas de imagem, seguidos pela montagem para microscopia de folhas de luz (3–4; Zeiss Lightsheet 7). (B) Fotografia de uma amostra expandida montada em um microscópio confocal de varredura a laser invertido (Nikon Ti2-E AXR). (C) Seções ópticas simples representativas (planos Z simples) de uma amostra expandida do sistema visual de Drosophila (neurônios LC4 marcados com marcador nuclear fluorescente) sondadas em busca de mRNA shakB (ver Figura 4), adquiridas em três plataformas de imageamento. Escamas, 10 μm (tecido pós-expansão). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3. Análise quantitativa dos pontos do smFISH usando FlySeg. (A) Visão esquemática do fluxo de trabalho de análise FlySeg para segmentação automatizada e quantificação de pontos dentro das células identificadas. (B) Tesselação Voronoi tridimensional ilustrando a lógica central de segmentação do FlySeg. O volume de imagem é dividido em domínios espaciais (cada um mostrado em uma cor distinta), com cada partição restrita a conter no máximo um núcleo, garantindo a atribuição de célula única. Dentro de cada domínio de Voronoi, o núcleo é segmentado usando um procedimento de otimização funcional que determina a superfície nuclear ótima com base nos valores de intensidade nuclear e citoplasmática ao redor. (C) Demonstração da opção nuclei_dilation para distinguir transcritos nucleares e citoplasmáticos Uma única seção óptica mostrando um núcleo marcado com GFP cercado por pontos smFISH, com sinal DAPI difuso delineando o compartimento citoplasmático após o tratamento com DNase. Linhas indicam 0 e 0,5 fatores de dilatação, correspondentes aos volumes nuclear e citoplasmático, respectivamente. (D) Projeção de intensidade máxima de (C), ilustrando que os pontos localizam tanto os compartimentos nuclear quanto o citoplasmático. Escamas, 10 μm (tecido pós-expansão). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4. Validação do fluxo de trabalho quantitativo usando projeções de perturbação molecular (A) de folha de luz mediada por RNAi (10 μm de espessura, não cobrindo todo o volume celular) do soma da Fibra Gigante (GF) marcado com marcador de membrana e sondado para mRNA shakB em condições de controle (superior) e RNAi shakB (inferior). Contornos verdes tracejados indicam as bordas do soma para destacar a depleção do reservatório citoplasmático, mas não do mRNA nuclear. N, cérebros (um lado por animal). (B) é o mesmo que (A) para neurônios LC4 marcados com um marcador nuclear. (C) Quantificação dos pontos FISH do shakB em neurônios GF (piscinas nucleares e citoplasmáticas combinadas) sob condições de controle e RNAi do shakB . Os pontos representam neurônios individuais (um neurônio por cérebro, um lado por animal). (D) Igual a (C) para neurônios LC4. Os pontos representam cérebros individuais (um lado por animal; contagem de pontos por célula em média por cérebro). (E) Projeções confocais dos dendritos GF marcadas com um marcador de membrana e coradas para ShakB em condições de controle (superior) e RNAi de shakB (inferior). (F) Quantificação dos níveis de proteína ShakB nos dendritos GF medida como intensidade média de fluorescência sob controle e condições de RNAi GF>shakB . N, cérebros (um lado por animal). (G) Projeções confocais de neurônios LC4 marcados com um marcador de membrana e expressando ShakB marcado com smGdP-10xV5 em condições de controle (superior) e RNAi shakB (inferior). Contornos verdes tracejados indicam áreas de dendritos LC4 e terminais axônicos onde a densidade ShakB-V5 foi avaliada (H). Quantificação dos níveis de proteína ShakB-smGdP-V5 nos dendritos LC4 e terminais axônicos medidos como intensidade média de fluorescência sob controle e condições de RNAi LC4 > ShakB . N, cérebros (um lado por animal). Barras de erro indicam média ± SEM. Todas as comparações estatísticas foram realizadas usando testes t de Welch de dois lados. Barras de escama, 10 μm em todas as imagens (tecido pós-expansão). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Esse protocolo combina HCR-smFISH assistido por expansão, imunohistoquímica pré-expansão e quantificação de transcritos baseada em segmentação para permitir medições de RNA e proteínas correspondentes nos mesmos neurônios geneticamente definidos. Ao integrar esses componentes em um único fluxo de trabalho, esse método deve facilitar a análise molecular quantitativa e específica para tipo celular no cérebro intacto de Drosophila .

Várias modificações práticas introduzidas aqui representam etapas críticas para combinar a imunohistoquímica com HCR-smFISH assistida por expansão no cérebro^{de Drosophila 24}. Primeiro, a imunohistoquímica deve ser realizada antes da expansão do tecido e do smFISH. Como o protocolo inclui uma etapa de digestão da Proteinase K, realizar imunohistoquímica após a expansão pode reduzir a integridade do epítopo. Importante destacar que a incubação de anticorpos pré-expansão (primária de 24 h + 24 h secundária) não reduz perceptivelmente a intensidade do sinal de RNA quando são usadas técnicas de limpeza RNase e ancoragem covalente de RNA. Segundo, as concentrações primárias e secundárias de anticorpos devem ser aumentadas, tipicamente de 2 a 3× em relação ao IHC padrão de montagem integral, para compensar a perda de sinal associada à digestão e expansão tecidual da Proteinase K. Terceiro, as condições de fixação são importantes para preservar tanto o sinal de proteínas quanto o de RNA. A fixação glioxal sem ácidos melhora a preservação da localização de proteínas sinápticas pontuadas, mantém a integridade estrutural dos processos neuronais e não compromete a detecção quantitativa dos pontos de mRNA. Também observamos que a ancoragem simultânea de RNA e proteína é compatível tanto com a detecção de HCR-smFISH quanto com a imunofluorescência a jusante. Juntos, esses ajustes melhoram a compatibilidade entre imunohistoquímica e detecção de transcritos assistida por expansão.

A expansão adiciona uma única etapa da noite para o dia e não é tecnicamente complexa, mas seu uso depende do objetivo experimental. Como demonstrado na Figura Suplementar 1, a FISH não expandida combinada com imunohistoquímica é suficiente para avaliar se um gene é expresso em um dado tipo celular, enquanto a expansão é necessária quando pontos individuais de smFISH precisam ser resolvidos de forma confiável, atribuídos a somatas individuais e analisados quantitativamente, devido ao aumento substancial na resolução espacial efetiva. De forma semelhante, placas multipoço no estilo Terasaki não são estritamente obrigatórias, mas reduzem o uso de reagentes, permitem o processamento paralelo de múltiplas condições e ajudam a manter a identidade da amostra em pequenos lotes; Tubos de microcentrífuga padrão também podem ser usados quando o volume do reagente é menos limitante. Embora a microscopia de folha de luz permita a imagem volumétrica rápida de tecidos expandidos, demonstramos que sistemas confocais padrão de varredura a laser invertida e disco giratório são suficientes para a imagem completa das populações neuronais selecionadas no cérebro expandido de Drosophila . Uma limitação comum da microscopia confocal é a curta distância de trabalho. No entanto, como o cérebro da mosca é pequeno e as amostras são expandidas aproximadamente 2× no PBS, objetivos de imersão em água a longa distância proporcionam profundidade de penetração adequada. Para comparações quantitativas, as configurações de aquisição devem ser mantidas idênticas entre as amostras, pixels saturados devem ser evitados e o tamanho do voxel deve ser suficiente para resolver pontos individuais do smFISH. Isso amplia o acesso do protocolo a laboratórios sem instrumentação dedicada de lâmina de luz.

A implementação atualizada do FlySeg se baseia no framework FlySeg publicado anteriormente e introduz duas adições principais para esse protocolo. Primeiro, um parâmetro configurável de dilatação nuclear permite que pontos smFISH sejam classificados como nucleares ou citoplasmáticos com base em sua relação espacial com núcleos segmentados. A coloração DAPI citoplasmática após o tratamento com DNase é importante para essa etapa, pois fornece um sinal difuso que delineia o corpo celular e apoia uma segmentação nuclear confiável, apoiando a separação dos reservatórios de transcritos nucleares e citoplasmáticos. Segundo, a detecção automatizada de valores atípicos identifica núcleos mal segmentados, que podem ser excluídos da quantificação a jusante. Além de avaliar os efeitos moleculares do knockdown gênico específico do tipo celular, separar transcritos nucleares e citoplasmáticos pode ser informativo quando a localização do transcrito reflete atividade transcricional contínua. No cérebro dos mamíferos, transcritos gênicos imediatos induzidos pela atividade aparecem primeiro no núcleo e posteriormente se acumulam no citoplasma à medida que os mRNAs são processados e^{exportados 39}, um princípio usado na análise^{catFISH 40} dos tempos de ativação neuronal. Se dinâmicas transcricionais comparáveis ocorrem no cérebro de Drosophila é atualmente desconhecido, mas isso pode, em princípio, ser explorado usando o fluxo de trabalho atual. Em qualquer outro experimento de perseguição de pulsos, distinguir pontos nucleares de citoplasmáticos pode, portanto, fornecer informações temporais além do total de transcritos. Ao mesmo tempo, o fluxo de trabalho não se restringe à segmentação nuclear e pode ser adaptado para segmentação celular whole-soma (ou seja, definida por membrana). O fluxo de trabalho quantitativo atual é otimizado para somata neuronal; embora as regiões neuropil possam ser visualizadas, a atribuição quantitativa dos pontos de mRNA a axônios ou dendritos individuais exigiria estratégias adicionais de segmentação específicas de compartimentos. FlySeg é mais útil para quantificação automatizada e de alta taxa em populações neuronais densas, onde são necessárias estatísticas em nível populacional. Para neurônios individualmente identificáveis ou compartimentos definidos manualmente, outras ferramentas como Imaris ou FIJI/ImageJ podem ser mais apropriadas. Um resumo dessas estratégias de quantificação, incluindo suas principais aplicações, vantagens e limitações, é fornecido na Tabela Suplementar 1.

Pontos comuns de solução incluem sinal fraco de anticorpos, alto fundo de smFISH, danos em gel ou perda de amostra, deriva da amostra durante a imagem e segmentação deficiente. O sinal fraco de anticorpos pode frequentemente ser melhorado aumentando ainda mais a concentração de anticorpos ou estendendo as incubações primárias e/ou secundárias de anticorpos de 24 horas para 48 horas. O fundo alto de smFISH pode frequentemente ser reduzido estendendo as lavagens pós-hibridização e evitando configurações saturadas de aquisição. Danos ao gel e perda de amostra são minimizados usando pontas de amplo calibre, aparando géis com cortes retos e cortando canais de ventilação para evitar bolhas durante o enchimento da câmara. A deriva da amostra durante a imagem é reduzida ao equilibrar os géis montados por pelo menos 1 hora antes da aquisição; se a deriva persistir, o equilíbrio pode ser estendido para 2 horas ou mais. Segmentação ruim pode resultar de coloração DTAPIs fraca ou equilíbrio incompleto da amostra, que pode reduzir o sinal da fronteira celular ou causar deslocamentos X-Y-Z durante a aquisição; esses devem ser verificados antes de ajustar os parâmetros do FlySeg. Neste protocolo, os géis são mantidos em 1× PBS, resultando em aproximadamente 2× expansão isotrópica. Se for necessária maior resolução espacial, maior expansão pode ser alcançada em PBS diluído ou água deionizada. Por outro lado, quando o objetivo é apenas avaliar a presença ou ausência de expressão em um tipo celular definido, a FISH não expandida combinada com imunohistoquímica pode ser suficiente, como demonstrado na Figura Suplementar 1. O protocolo permanece compatível com fluxos de trabalho iterativos do FISH. Sondas e grampos de cabelo HCR podem ser removidos por tratamento com DNase, permitindo rodadas adicionais de hibridização e amplificação no mesmo espetáculo. Futuras extensões técnicas poderão incluir HCR-smFISH iterativo de maior complexo, registro automatizado entre rodadas de imagem, segmentação aprimorada de células inteiras ou neuritos, e pipelines de análise mais padronizados para comparar sinais de RNA e proteínas entre experimentos. O desenvolvimento adicional de estratégias de segmentação específicas para compartimentos poderia estender a análise quantitativa além dos somatas neuronais para axônios e dendritos. Juntos, a leitura combinada RNA–proteína, a quantificação de transcritos resolvidos em compartimentos e a compatibilidade com plataformas padrão de imagem tornam esse fluxo de trabalho adequado para experimentos de validação molecular direcionada em neurônios geneticamente definidos do cérebro intacto de Drosophila .

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de Hidróxido de Sódio 10N	Fisher Scientific	Cat# SS255-1
Solução de Hidróxido de Sódio 1N	Fisher Scientific	Cat# SS266-1
20X Buffer de Soro-Citrato de Sódio	Invitrogen	Cat# AM9763
4-Hidroxi-TEMPO	Sigma-Aldrich	Cat# 176141
Solução de Cloreto de Sódio 5M	Sigma-Aldrich	Cat# S5150
Acrilamida	Sigma-Aldrich	Cat# A9099
Ácido acrílico	Sigma-Aldrich	Cat# 147230
Acryloil-X, SE & NBSP;	Invitrogen	Cat# A20770
Adobe Illustrator	Adobe	N/A
Alexa Fluor 488 Anti-Frango de Cabra (1:200)	Laboratórios de Pesquisa Imunológica Jackson	Cat# 103-545-155, RRID:AB_2337390
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-21124, RRID:AB_2535766
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-11011, RRID:AB_143157
Persulfato de amônio	Sigma-Aldrich	Cat# A3678
DMSO e nbsp anidro;	Sigma-Aldrich	Cat# 900645-4X2ML
Adesivo UV-curador bondic	Bondic	Kit inicial Bondic
software de imagem cellSens v4.4.1	Evidente Científico	N/A
Anti-GFP policlonal de frango (1:400)	Abcam	Cat# ab13970, RRID:AB_300798
Conda (gerente ambiental)	Anaconda, Inc	N/A
Corning e comércio; Lâminas de Microscópio Fosco	Corning	Cat# 2948-75X25
Suporte de Amostra LS7 Personalizado	Janelia Tech	ID 2021-021
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat# D9542
Bisturi Estéril Descartável de Aço Inoxidável	MedPride	MPR-47101
Etilenediaminamina, ácido tetraacético	Sigma-Aldrich	Cat# EDS-100G
Software de análise de imagens Fiji (ImageJ) v2.14.0	Consórcio ImageJ	N/A
FlySeg (pipeline personalizado)	https://github.com/avaccari/DrosophilaFISH	N/A
Solução fixativa GAF	Addax Biosciences	Cat# VI25
GenClone® Placas de Cultura Celular de 24 Poços, Não Tratadas	Genesee Scientific	Cat# 25-102
GMR-86D05-Gal4 (LC4)	Centro de Estoques de Bloomington	#41315
Rebanho de Doador de Soro de Cabra	Sigma-Aldrich	Cat# G6767
HCR e comércio; Buffer Amplificador RNA-FISH(v3.0)	Instrumentos Moleculares	N/A
HCR e comércio; Amplificadores RNA-FISH(v3.0): AF546, JF669	Instrumentos Moleculares	N/A
HCR e comércio; Buffer de Hibridização de Sonda RNA-FISH(v3.0)	Instrumentos Moleculares	N/A
HCR e comércio; Buffer de Lavagem de Sonda RNA-FISH(v3.0)	Instrumentos Moleculares	N/A
HCR e comércio; Sonda ShakB RNA-FISH(v3.0)	Instrumentos Moleculares	N/A
Imaris 10.1	Oxford Instruments	N/A
Microscópio Confocal de Disco Giratório IXPlore IX85 SpinSR	Evidente Científico	N/A
Microscópio de Folha de Luz LS7	Carl Zeiss	N/A
Melphalan	Cayman Chemical	Cat# 16665
MOPS Buffer	Fisher Scientific	Cat# BP308-100
Anti-V5 Monoclonal de Mouse (SV5-Pk1) (1:100)	Abcam	Cat# ab27671, RRID:AB_471093
N,N,N',N'--Tetrametiletilenediamina	Sigma-Aldrich	Cat# T7024
N,N'-Metilenebisacrilamida	Sigma-Aldrich	Cat# M7279
Napari	Comunidade de código aberto	N/A
Software de imagem de pesquisa avançada NIS-Elements	Nikon Corporation	N/A
Água Livre de Nuclease	Qiagen	Cat# 129114
Nunc™ MiniTrays com Nunclon e comércio; Delta surface	Invitrogen	Cat# 163118
PBS (10X), pH 7,4	Gibco	Cat# 70011044
Detergente Photo-Flo	Ciências da Microscopia Eletrônica	Cat# 74257
Solução de poli-L-lisina	Ted Pella	Cat# 18026
Óculos de Capa de Precisão, #1,5H Espessura	Thorlabs	Cat# CG15CH2
Press-to-Seal & comércio; Isolador de silicone com adesivo, um poço, 20 mm de diâmetro, 0,5 mm de profundidade	Invitrogen	Cat# P24740
Proteinase K	Nova Inglaterra   Biolaboratórios	Cat# P8107S
Coelho Anti-ShakB (1:400)	Presente de Geord Ammer	N/A
RNase AWAY™ Descontaminante de superfície	Invitrogen	Cat# 7002
RNase-Free DNase Set	Qiagen	Cat# 79256
Schneider' s Drosophila Medium	Gibco	Cat# 21720001
shakB-KDRT-stop-KDRT-smGdP-V5;;	Frighetto et al., 2025	PMID: 41278920
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	Cat# S8032
Microscópio Estereoscópico Stemi 508	Carl Zeiss	N/A
SYTO & trade; 41 Coloração Azul de Ácido Nucleico Fluorescente	Invitrogen	Cat# S11352
Microscópio Confocal de Varredura a Laser Ti2E AXR NSPARC	Nikon Corporation	N/A
Tris Base	Fisher Scientific & nbsp;	Cat# BP152-500
Tritão e comércio; X-100	Sigma-Aldrich	Cat# T8787
UAS-GFP-2A-KDR;	Sanfilippo et al. 2024	PMID: 38262414
UAS-his2A-GFP;	Dombrovski et al., 2025	PMID: 40468081
UAS-mCherry RNAi	Centro de Estoques de Bloomington	#35785
UAS-myr::GFP;	Centro de Estoques de Bloomington	#32198
UAS-shakB RNAI	Ammer et al., 2022	PMID: 35385694
UltraPure™ 1M Tris-HCI, pH 8,0 & nbsp;	Invitrogen	Cat# 15568025
VT042336-Gal4 (Fibra Gigante)	Dombrovski et al., 2025	PMID: 40468081
Zen Black 3.1	Carl Zeiss	N/A