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Artigo de método
Este estudo utilizou análise transcriptômica integrada, aprendizado de máquina (LASSO, SVM-RFE e XGBoost), análise de infiltração imunológica, acoplamento molecular e validação RT-qPCR para identificar genes relacionados à glicosilação associados à fibrose pulmonar idiopática. Dez genes diagnósticos candidatos foram identificados, e um modelo diagnóstico com forte desempenho em conjuntos de dados de tecidos pulmonares foi desenvolvido e validado.
Fibrose pulmonar idiopática (FPI) é uma doença pulmonar crônica progressiva com etiologia incerta, e a contribuição dos genes relacionados à glicosilação (GRGs) para sua patogênese ainda é pouco compreendida. Este estudo foca em elucidar os potenciais mecanismos dos GRGs na IPF, identificar biomarcadores-chave e desenvolver um modelo diagnóstico usando bioinformática e aprendizado de máquina. Dados transcriptômicos do banco de dados GEO foram integrados com GRGs para investigar seu papel na IPF. Genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados e submetidos a análises de enriquecimento funcional e interação proteína-proteína (IBP). Um fluxo de trabalho de aprendizado de máquina combinando regressão LASSO, eliminação de características recursivas por vetores de suporte (SVM-RFE) e XGBoost foi aplicado para identificar genes-chave e construir um modelo diagnóstico usando o conjunto de dados de treinamento GSE150910. O desempenho do modelo foi posteriormente avaliado em quatro conjuntos de dados independentes de validação. Análises adicionais, incluindo análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA), análise de infiltração imunológica, análise de interação medicamento-gênico, acoplamento molecular e validação RT-qPCR usando amostras de sangue periférico de pacientes com IPF e controles saudáveis, foram realizadas para investigar a relevância biológica dos genes identificados. Um total de 126 DEGs relacionados à glicosilação foram identificados e 10 genes-chave foram selecionados. O modelo diagnóstico alcançou valores de área abaixo da curva (AUC) de 0,963 e 0,814 em conjuntos de dados de tecido pulmonar, e 0,681 e 0,706 em conjuntos de dados sanguíneos. A análise de infiltração imune revelou diferenças na abundância de células B entre subgrupos de pacientes, e a validação da RT-qPCR confirmou a expressão diferencial de genes selecionados em amostras clínicas. Esses achados fornecem insights sobre o possível envolvimento dos GRGs na IPF e apoiam sua relevância como genes diagnósticos candidatos.
A fibrose pulmonar idiopática (FPI) é uma doença pulmonar intersticial progressiva e fibrosante, caracterizada por uma patogênese heterogênea, que envolve predisposição genética, gatilhos ambientais e disfunçãoimunológica 1,2. A doença apresenta desafios clínicos significativos, principalmente devido a dificuldades no diagnóstico precoce, eficácia terapêutica limitada e um prognóstico geralmente ruim. A prevalência de FPI varia de 20 a 80 pacientes por 100.000 e, sem tratamento, o tempo mediano de sobrevivência após o diagnóstico é tipicamente de 3 a 5anos e 3,4. Identificar pacientes com maior risco de progressão rápida da doença é fundamental para estratégias de tratamento eficazes, possibilitando terapias direcionadas para aqueles com maior probabilidade de apresentar o declínio da doença.
A glicosilação, uma modificação co-traducional e pós-translacional das proteínas, desempenha um papel fundamental na regulação da atividade proteica e da biologia celular 5,6. Glicosilação proteica desregulada provavelmente contribui para a progressão daIPF 7,8. Em muitas doenças reumáticas, são observadas alterações na glicosilação proteica, que estão intimamente associadas aos processos inflamatórios e à progressão dadoença 9. Por exemplo, Lyu et al. descobriram que CRLF1 e GLG1 são atores-chave nos processos patológicos daosteoartrite 10. Além disso, a glicosilação tem sido implicada na ativação das células imunológicas nos tecidos pulmonares, ligando-a ainda mais à patogênese das doençaspulmonares 11. Diante disso, a desregulação da glicosilação proteica também pode contribuir para a progressão da IPF. No entanto, o papel dos genes relacionados à glicosilação (GRGs) na FPI ainda é pouco explorado, e seu potencial para o diagnóstico da FPI merece investigação adicional.
Aqui, realizamos um estudo integrando abordagens de aprendizado de máquina e dados de sequenciamento de RNA para identificar GRGs-chave associados ao IPF. Estudos anteriores em IPF frequentemente se basearam em análises convencionais de expressão diferencial ou em um único algoritmo de aprendizado de máquina, o que pode limitar a robustez e a generalização de biomarcadores candidatos12,13. Para enfrentar essas limitações, empregamos um fluxo de trabalho computacional em múltiplas etapas que combinava análise diferencial de expressões com múltiplos algoritmos de aprendizado de máquina, incluindo LASSO, SVM-RFE e XGBoost, para melhorar a confiabilidade da seleção de características. Além disso, o modelo diagnóstico foi avaliado em múltiplos conjuntos de dados independentes, e os principais achados foram validados posteriormente usando amostras clínicas. Um modelo diagnóstico foi posteriormente desenvolvido e validado, e as características de infiltração imune foram analisadas. Além disso, foram explorados o microambiente imunológico e as potenciais interações moleculares associadas aos genes identificados. Embora este estudo tenha focado na IPF, a estratégia analítica empregada aqui pode ser aplicável a outras doenças pulmonares crônicas e conjuntos de dados transcriptômicos, fornecendo uma estrutura reprodutível para a identificação e validação de genes-chave. Veja a Figura 1 para o processo específico.
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Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Bengbu (Número de Aprovação: 2023YJS162). Foi obtido consentimento informado por escrito de todos os participantes antes da coleta da amostra.
Coleta de dados
Os dados do transcriptoma usados neste estudo foram obtidos do banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/; RRID: SCR_005012). O conjunto de dados primário de treinamento, GSE150910, foi gerado usando a plataforma Illumina NovaSeq 6000 (GPL24676) e compreendia 103 amostras de tecido pulmonar IPF e 103 de tecido pulmonar normal. Para validar os achados, foram utilizados conjuntos de dados independentes GSE24206, GSE110147, GSE93606 e GSE38958. Informações detalhadas sobre cada conjunto de dados são fornecidas na Tabela 1. Além disso, um total de 636 GRGs foram selecionados de um estudopreviamente publicado 14.
Análise diferencial de expressão e caracterização funcional de DEGs relacionados à glicosilação
A análise diferencial de expressão entre amostras de tecido pulmonar IPF e normal do conjunto de dados GSE150910 foi realizada usando o pacote R DESeq2 (RRID: SCR_015687). Genes com um valor P ajustado (padj) < 0,05 e |log2FoldChange| > 0,5 foram considerados genes diferencialmente expressos (DEGs). Os DEGs relacionados à glicosilação (GR-DEGs) foram identificados ao intersectar os DEGs com um conjunto pré-definido de 636 GRGs. Para investigar mais profundamente os papéis biológicos desses genes, foram realizadas análises de enriquecimento por Ontologia Gênica (GO) e análise de vias da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) para elucidar seus papéis funcionais e envolvimento das vias. Uma rede de interação proteína-proteína (PPI) foi gerada usando o banco de dados STRING (RRID: SCR_005223)15 , com um limiar de confiança de interação de > 0,7, para elucidar as interações moleculares e os potenciais mecanismos regulatórios dos GR-DEGs na IPF.
Triagem de genes-chave e construção de um modelo diagnóstico
Para triar genes-chave para IPF a partir de GR-DEGs, empregamos múltiplos algoritmos de aprendizado de máquina. Inicialmente, a regressão LASSO (RRID: SCR_003418) foi equipada com regressão logística binária (família = "binomial") e o parâmetro de penalização ótimo λ foi selecionado por meio de validação cruzada 10 vezes (nfold = 10). Os resultados finais da seleção foram as características com coeficientes diferentes de zero correspondentes a λ_(min) (0,01700442). Para SVM-RFE, a função rfe do caret do pacote R foi utilizada. A eliminação recursiva de características foi realizada por meio de validação cruzada 10 vezes (método = "cv", número = 10), filtrando progressivamente características de 1 a 126, com precisão usada para determinar o subconjunto ótimo de características. No XGBoost, a função objetivo era definida para regressão logística binária (objetivo = "binário: logístico"), com a métrica de avaliação definida para log loss (eval_metric = "logloss"), o número de iterações (nrounds) definido para 100 e a taxa de aprendizado (eta) definida para 0,1. Os 20 melhores genes foram selecionados com base em suas pontuações de importância de característica (Ganho). Ao intersectar os resultados desses métodos, foi identificado um conjunto refinado de genes-chave. Com base nesse conjunto de genes, um modelo diagnóstico XGBoost foi construído usando o conjunto de dados de treinamento (GSE150910), e seu desempenho preditivo foi avaliado usando análise de características operacionais do receptor (ROC) em conjuntos de dados externos de validação (GSE110147, GSE24206, GSE93606 e GSE38958). Além disso, foi desenvolvido um nomograma para visualizar a contribuição de cada gene selecionado para a probabilidade da doença, e a utilidade clínica do modelo foi avaliada por meio de curvas de calibração e análise de curvas de decisão (DCA).
Exploração das vias biológicas de genes-chave
Explorar o contexto biológico dos genes-chave identificados pelo aprendizado de máquina. A Análise de Enriquecimento de Conjuntos Genéticos (GSEA)16 foi realizada com base nas listas de genes do Molecular Signatures Database (MSigDB) (RRID: SCR_016863)17e as vias foram rastreadas para NES > 1. As vias enriquecidas superiores foram visualizadas usando a função enrichplot.
Explorando a função biológica e as diferenças no cenário imunológico em subtipos de FPI com base em escores genéticos chave
Com base nos perfis de expressão dos genes-chave identificados, foram calculadas e usadas pontuações de Análise de Enriquecimento de Conjuntos de Genes de amostra única (ssGSEA) para estratificar pacientes com IPF em grupos de alta e baixa pontuação com base na mediana da pontuação. A análise diferencial de expressão foi realizada entre os dois grupos, seguida pelo GSEA (RRID: SCR_003199)18 para realizar análises de Processos Biológicos GO (GOBP) e enriquecimento de vias KEGG nos DEGs.
Análise da infiltração de células imunes e das principais diferenças de expressão gênica
Após a estratificação de subgrupos baseada nas pontuações ssGSEA, as diferenças na infiltração imune entre os grupos de pontuação alta e baixa foram avaliadas. Primeiro, calculamos as abundâncias relativas de 22 tipos de células imunes nas amostras usando o algoritmo CIBERSORT (RRID: SCR_016955)19 em combinação com a matriz de características LM22. Especificamente, a função deconv_tme no pacote R IOBR (parâmetros: método = "cibersort", arrays = FALSE, perm = 200) foi usada para os cálculos, e gráficos de caixa foram gerados usando o pacote ggpubr (RRID: SCR_021139) para avaliar diferenças na infiltração de células imunes entre os grupos de alta e baixa pontuação. Além disso, a função gsva no pacote R GSVA (usando o método ssGSEA) foi usada para calcular as pontuações de enriquecimento de 28 tipos de células imunológicas. Essas pontuações foram então normalizadas usando escala Min-Max para mapeá-las ao intervalo [0, 1], facilitando comparações entre tipos de células. Por fim, foram realizados testes de soma de ranks de Wilcoxon para comparar a expressão de genes-chave entre amostras normais e pacientes com IPF nos conjuntos de dados GSE150910 e GSE110147, fornecendo uma análise abrangente da infiltração celular imune e das diferenças de expressão gênica entre subgrupos de IPF.
Validação de genes-chave em pacientes com IPF usando análise RT-qPCR
Para validar a relevância diagnóstica dos genes identificados, seis genes com as maiores pontuações de importância do algoritmo XGBoost foram selecionados para validação do nível de expressão em pacientes com IPF e controles saudáveis usando transcrição reversa por PCR quantitativa (RT-qPCR). Um total de 20 amostras de sangue, incluindo 9 de pacientes com IPF e 11 de indivíduos saudáveis, foram coletadas no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Bengbu. O RNA total foi extraído das amostras de sangue, e a concentração de RNA foi medida usando um leitor multifuncional de microplacas. A qualidade do RNA foi avaliada antes das análises posteriores. O DNA genômico foi removido durante a transcrição reversa, e as sequências de primer usadas para RT-qPCR estão listadas na Tabela 2. A especificidade do primer foi verificada por análise da curva de fusão. O GAPDH foi usado como gene de referência interno. Os níveis relativos de expressão gênica foram calculados usando o método 2-ΔΔCt . Essa etapa de validação fornece suporte experimental preliminar para a expressão diferencial e a possível relevância diagnóstica dos genes identificados na IPF.
Análise estatística
Os dados foram analisados em R, e o teste de Wilcoxon foi usado para detectar diferenças entre os dois grupos. As análises de enriquecimento GSEA, GO e KEGG foram realizadas usando o cluster Profiler do pacote R (RRID: SCR_016884). Um valor-p < 0,05 era considerado significativo, salvo especificação em contrário.
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Análise funcional e análise de redes de interação de GR-DEGs
Para investigar o envolvimento gênico na IPF, foi realizada uma análise de expressão diferencial de GSE150910, identificando 4.216 DEGs (Figura 2A). Ao intersectar esses DEGs com 636 GRGs, foram identificados 126 genes de glicosilação associados à doença (Figura 2B). Além disso, para avaliar as funções bioló...
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A IPF é uma doença crônica e progressiva de etiologia desconhecida que reduz significativamente a qualidade de vida dos pacientes e leva a mortalidadeprecoce 4. Apesar dos avanços nas estratégias terapêuticas, o tempo mediano de sobrevivência permanece baixo após o diagnóstico, e a patogênese da FPI ainda não é totalmentecompreendida 22. Portanto, elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à FPI é tanto urgente quanto crítico. Estudos a...
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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecemos a todos os colegas que prestaram assistência e apoio durante todo o processo de pesquisa. A colaboração e o incentivo deles foram inestimáveis para o nosso trabalho. Essa pesquisa não recebeu financiamento externo.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Caret | R Foundation for Statistical Computing | Versão 6.0.94 | SVM-RFE |
| ClusterProfiler | R Foundation for Statistical Computing | Versão 4.12.6 | GSEA, GO e análise de enriquecimento KEGG |
| DESeq2 | R Foundation for Statistical Computing | Versão 1.44.0 | Análise de expressão diferencial |
| Fast First-Strand cDNA Synthesis Mix | Goonie Biotech Co., Ltd. | 500-101 | Síntese de cDNA para RT-qPCR |
| FastTaq qPCR SYBR Green Master Mix | Gooniebio | 500-102 | Amplificação de PCR quantitativa |
| Sistema de PCR Quantitativo Fluorescente | Bio-Rad Laboratories, Inc. | CFX96 | Amplificação de PCR quantitativa |
| Banco de Dados GEO | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | Fonte de dados de transcriptoma |
| ggpubr | R Foundation for Statistical Computing | Versão 0.6.0 | Geração de gráficos de caixa |
| GSVA | R Foundation for Statistical Computing | Versão 1.52.3 | ssGSEA |
| MSigDB | Broad Institute | https://www.gsea-msigdb.org/ | Análise GSEA |
| Sistema de PCR | Bio-Rad Laboratories, Inc. | PTC Tempo | Síntese de cDNA para RT-qPCR |
| Primers | Tsingke Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Síntese personalizada de primers para qPCR |
| Software R | R Foundation for Statistical Computing | Versão 4.4.1 | Análise estatística e visualização |
| Reagente de Extração de RNA Total RNA Isolater | Vazyme Biotech Co., Ltd. | R401-01 | Extração de RNA total a partir de sangue total |
| Banco de Dados STRING | STRING Consortium | https://string-db.org/ | Construção de rede PPI |
| Leitor Multimodo Synergy HTX | BioTek Instruments, Inc. | Synergy HTX | Medição de concentração de RNA |
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