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Artigo de investigação
Este estudo utilizou farmacologia em rede, acoplamento molecular e um modelo de punção caudal e disco em rato para investigar os potenciais efeitos pré-clínicos da Decocção Yi Qi Huo Xue na degeneração do disco lombar, com foco em alvos candidatos, incluindo AKT1, BCL2 e STAT3, e vias como sinalização PI3K-AKT.
Neste estudo, farmacologia em redes, acoplamento molecular, simulação de dinâmica molecular e validação experimental foram usadas para investigar a base farmacológica e os potenciais mecanismos moleculares da Decocção Yi Qi Huo Xue (YQHXD) na degeneração do disco lombar (LDD). Foram identificados um total de 678 alvos ativos relacionados a compostos de YQHXD e 296 potenciais alvos terapêuticos associados à LDD. A análise de redes de interação proteína-proteína e a análise topológica identificaram vários alvos candidatos, incluindo AKT1, IL6, TNF, BCL2 e STAT3. Análises de enriquecimento usando Gene Ontology e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes indicaram que os alvos candidatos estavam ligados a funções como ligação a proteínas e ligação ao ATP, com enriquecimento de vias que incluía sinalização PI3K-AKT. O acoplamento molecular previu interações entre compostos ativos selecionados, como quercetina, tetraneurina A e isorhamnetina, e os alvos centrais. Simulações de dinâmica molecular sugeriram ainda que os complexos de menor energia permaneciam estáveis. Setenta ratos machos de Sprague-Dawley foram aleatoriamente atribuídos aos grupos controle, simulado, modelo, controle positivo e YQHXD de baixa, média e alta dose. Após o estabelecimento de um modelo de punção do disco intervertebral coccígeo nos grupos modelo, controle positivo e YQHXD, os ratos receberam YQHXD ou celecoxib por gavage oral por 8 semanas, enquanto os grupos controle e operado por simulação receberam soro fisiológico normal. A avaliação histopatológica mostrou que o tratamento com YQHXD estava associado à redução da degeneração do disco intervertebral nesse modelo. Ensaio imunossorvente ligado a enzimas, reação em cadeia da polimerase e análises western blot mostraram mudanças nos níveis de expressão de mRNA e proteínas de alvos selecionados, incluindo AKT1, BCL2 e STAT3. Esses achados sugerem que a YQHXD pode exercer efeitos protetores pré-clínicos no LDD por meio da regulação multicomponente e multi-alvo envolvendo mecanismos relacionados à inflamação e apoptose. Este estudo fornece evidências pré-clínicas preliminares que apoiam investigações adicionais da YQHXD para LDD.
A degeneração do disco lombar (LDD) é uma condição ortopédica comum relacionada à idade, caracterizada por início tardio, dificuldade de tratamento, alta recidiva e incapacidade. A LDD envolve alterações patológicas degenerativas associadas a um desequilíbrio entre o metabolismo catabólico e anabólico da matriz extracelular (ECM) no disco intervertebral (DII) e está intimamente associada à dor lombar (LBP)1. Estudos epidemiológicos mostram que a lombalebral é uma das principais causas de deficiência na práticaclínica 2.
De 1990 a 2017, o número de casos globais aumentou de 42,5 milhões para 64,9milhões 3, afetando a vida cotidiana e impondo um ônus social e econômico substancial. Portanto, o tratamento eficaz da LDD continua sendo clinicamente importante. Na prática clínica, a LDD é frequentemente tratada com tratamentos sintomáticos conservadores ou cirúrgicos, que podem aliviar os sintomas, mas geralmente não revertem a degeneração do disco intervertebral (IVDD). Anti-inflamatórios orais não esteroides comumente usados para tratamento conservador também podem estar associados a efeitos colaterais renais, gastrointestinais e cardiovasculares.
A Medicina Tradicional Chinesa (MTC) tem sido usada há muito tempo no manejo de doenças4. Compostos herbais e constituintes individuais foram relatados como retardando a progressão da DDI e promovendo a regeneração dos tecidos5. Na prática clínica, as fórmulas da MTC também são usadas como parte de estratégias conservadoras de manejo para doenças degenerativas ósseas e articulares. A escola de medicina da família Wu, na região de Suzhou, utilizou a Decocção Yi Qi Huo Xue (YQHXD) como prescrição principal para distúrbios de DIV lombar; no entanto, são necessárias mais evidências mecanicistas para esclarecer seu papel potencial na LDD.
Estudos anteriores sugerem que YQHXD pode atrasar a IVDD ao promover a autofagia celular e exercer efeitos antienvelhecimento 6,7. No entanto, os mecanismos farmacológicos pelos quais a YQHXD pode afetar a LDD permanecem incertos, e uma análise sistemática de seu modo de ação ainda é ausente. Neste estudo, a farmacologia de redes foi usada para analisar as características multicomponentes e multi-alvo da YQHXD em relação à LDD. O acoplamento molecular foi usado para avaliar interações entre compostos e proteínas-alvo, seguido por simulações de dinâmica molecular. Essas previsões foram então avaliadas usando um modelo de punção caudal e disco de rato para investigar os potenciais mecanismos de YQHXD no LDD8. Como mostrado na Figura 1, este estudo fornece evidências pré-clínicas de que o YQHXD pode afetar processos relacionados ao LDD ao modular genes e proteínas como AKT1, BCL2 e STAT3, com enriquecimento de vias envolvendo sinalização PI3K-Akt e outras categorias de vias relacionadas à doença.
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Todos os experimentos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing (Código de Protocolo: 202501A018) e foram conduzidos de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos experimentais seguiram as diretrizes ARRIVE.
Medicamentos experimentais
A solução amostral YQHXD continha 20 g de raiz de Astragalus membranaceus , 20 g de raiz de Angelica sinensis , 15 g de rizoma Ligusticum chuanxiong , 6 g de raiz de Stephania tetrandra , 15 g de fruto de Chaenomeles speciosa e 10 g de sementes maduras de Sinapis alba , com um peso total bruto de 86 g por prescrição. Todos os materiais herbais foram autenticados de acordo com a Farmacopeia Chinesa (edição de 2020) pelo Departamento de Farmácia, Hospital Ruikang, afiliado à Universidade de Medicina Chinesa de Guangxi. A solução amostra YQHXD foi preparada usando um método de decocção em água. Água destilada estéril com 8 vezes o volume total de drogas brutas foi adicionada, e as ervas foram deixadas de molho por 30 minutos até ficarem totalmente submersas. A mistura foi então fervida e decoctada em fogo baixo por 30 minutos antes da filtração. Os resíduos foram extraídos novamente com o mesmo volume de água destilada estéril após o mesmo procedimento. Os filtrados das duas extrações foram combinados e concentrados a 55,5 mL sob pressão reduzida usando evaporação rotativa para obter a solução original YQHXD. Com base no peso total do medicamento bruto, a concentração final de medicamento bruto foi de 1,55 g/mL, com rendimento de extração de aproximadamente 64,5%. A dosagem administrada a ratos experimentais foi convertida a partir da dose clínica adulta usando o método de normalização da área superficial corporal. O coeficiente de conversão entre humanos e ratos era aproximadamente 6,3; Portanto, a dosagem para ratos (mg/kg) foi calculada como a dosagem humana (mg/kg) × 6,3. O grupo de alta dose recebeu 15,48 g/kg/dia como dose de referência, enquanto os grupos de médio e baixo receberam 7,74 g/kg/dia e 3,87 g/kg/dia, respectivamente. Para um volume de gavage de 10 mL/kg, as concentrações de trabalho correspondentes foram 1,548, 0,774 e 0,387 g/mL para os grupos de alta, média e baixa dose, respectivamente. A solução padrão foi diluída de acordo para atingir a dosagem-alvo para cada grupo experimental antes da administração. Após a preparação, as decocções eram resfriadas, aliquotadas em condições estéreis e armazenadas a −40 °C até o uso.
Análise de farmacologia de redes
Previsão das proteínas-alvo do princípio ativo
Em 24 de novembro de 2025, compostos ativos foram recuperados do banco de dados TCMSP usando os termos de busca "Huangqi, Angelica, Chuanxiong, Stephania, Mugua e Jiezi." Os compostos foram avaliados com base na biodisponibilidade oral (OB ≥ 30%) e na semelhança do medicamento (DL ≥ 0,18)9. A justificativa para esses limites é a seguinte: o banco de dados TCMSP integra dados de compostos de fontes autoritativas como PubChem, ChEMBL e ChemSpider e fornece parâmetros relacionados ao ADME, incluindo biodisponibilidade oral. Biodisponibilidade oral refere-se à proporção de uma dose administrada oralmente que chega à circulação sistêmica sem alterações, e um alto índice de obstetricidade é essencial para identificar moléculas bioativas. A semelhança com medicamentos é um indicador usado para avaliar a capacidade de uso de compostos e prever sua solubilidade e estabilidade. Neste estudo, foi aplicado um limiar OB mais rigoroso (≥30%), que exceda o valor recomendado pelo banco de dados (≥20%), para identificar compostos candidatos com absorção oral favorável e perfis farmacocinéticos. Enquanto isso, DL foi usado para estimar o potencial semelhante a fármacos dos compostos, e um corte de DL ≥ 0,18 foi adotado com base no valor médio de DL observado em compostos da medicina tradicional chinesa. Os compostos ativos selecionados foram recuperados no formato SMILES do banco de dados PubChem e importados para o banco de dados SwissTargetPrediction para previsão de alvos, com a espécie definida como Homo sapiens. As proteínas-alvo foram padronizadas usando símbolos genéticos oficiais, e apenas alvos com valores de probabilidade maiores que 0 foram mantidos para melhorar a confiabilidade da previsão. Compostos sem alvos previstos foram excluídos da análise subsequente da rede. Após a fusão de todos os alvos, entradas duplicadas foram removidas usando software de planilha para garantir que cada alvo fosse representado apenas uma vez no conjunto de dados final.
Coleção de alvos-chave
Genes relacionados à doença foram recuperados dos bancos de dadosGeneCards 10, OMIM11 e TTD12 usando a palavra-chave "degeneração do disco lombar". Os alvos gênicos coletados foram fundidos e entradas duplicadas removidas para obter um conjunto final de alvos associados à doença.
Potenciais alvos da YQHXD para o tratamento da LDD
A plataforma Venny 2.1.0 foi usada para determinar os potenciais alvos do YQHXD no LDD. Uma rede foi então gerada para mostrar as associações entre os componentes ativos e seus alvos previstos. Os componentes ativos centrais foram selecionados de acordo com seus valores de grau na rede.
Construção de rede de componentes de medicamentos e alvos de interseção de doenças
Ingredientes ativos, proteínas-alvo e genes relacionados ao LDD da fórmula TCM YQHXD foram importados para o softwareCytoscape 13 para construir um diagrama de rede de componente medicamento-alvo-doença.
Construção da rede PPI e identificação de alvos centrais chave
Alvos que se cruzavam eram submetidos à plataformaSTRING 14 para análise, com o organismo configurado para Homo sapiens. Para construir a rede de interação proteína-proteína (PPI), o limiar de pontuação de interação foi definido em >0,4, nós desconectados foram ocultados e todas as outras configurações foram mantidas como padrão. Os dados resultantes foram importados para o software, onde a ferramenta NetworkAnalyzer foi usada para avaliar propriedades topológicas e calcular os graus dos nós. Os cinco principais nós classificados por grau foram identificados como alvos centrais centrais.
Análise de enriquecimento de alvos centrais
Alvos que se cruzaram foram enviados para o banco de dadosDAVID 15 para anotação funcional de Ontologia Gênica (GO) e análise de enriquecimento de vias da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). O fundo do organismo foi definido como Homo sapiens, com o corte de enriquecimento definido de acordo com os parâmetros padrão de DAVID, incluindo um limiar de EASE < 0,1 e um limiar de contagem ≥ 2. O universo genético foi baseado no fundo padrão do genoma completo fornecido pelo DAVID. Testes múltiplos foram corrigidos usando o método de Benjamini-Hochberg para controlar a taxa de falsas descobertas (FDR), e os resultados do DAVID foram ajustados com base nisso. As vias enriquecidas foram ordenadas pelo valor de contagem em ordem decrescente. Os plots de barras de enriquecimento GO e KEGG foram produzidos usando uma plataforma online de bioinformática.
Acoplamento molecular
Para prever interações entre os principais componentes ativos do YQHXD e os alvos centrais do LDD, foi realizada uma análise de acoplamento molecular neste estudo. Os cinco principais compostos ativos, classificados de acordo com valores de grau topológico da rede e relevância do alvo, foram selecionados como ligandos, enquanto as respectivas proteínas alvo centrais foram usadas como receptores. Arquivos SDF de ligantes foram recuperados do PubChem, e as estruturas tridimensionais das proteínas alvo foram baixadas do Banco de Dados de Proteínas (PDB). A análise de acoplamento foi realizada na plataforma CB-Dock2 usando seu protocolo totalmente automatizado de acoplamento cego. Após o upload das estruturas proteicas, a plataforma removeu automaticamente os heteroátomos, incluindo pequenas moléculas, íons e moléculas de água, e posteriormente reparou átomos ausentes e átomos de hidrogênio. O modo Auto Blind Docking foi usado. Nesse modo, o CB-Dock2 identifica potenciais bolsões de ligação à superfície da proteína com um algoritmo de detecção de cavidades baseado em curvatura e então realiza cálculos de acoplamento usando o motor integrado AutoDockVina 16. Durante o processo de acoplamento, as proteínas foram tratadas como estruturas rígidas, enquanto os ligantes foram considerados flexíveis, e todos os parâmetros de acoplamento foram definidos para os valores padrão da plataforma. Os resultados do acoplamento foram submetidos a visualização tridimensional e análise de interação usando as ferramentas integradas do CB-Dock217, e as energias de ligação foram calculadas para estimar as afinidades de ligação previstas entre os compostos ativos e as proteínas alvo.
Simulação de dinâmica molecular
Simulações de dinâmica molecular foram realizadas para o complexo proteína-ligante-alvo usando o GROMACS 2022.2. A proteína foi modelada com o campo de força Amber14SB, e o sistema de solventes foi representado usando o modelo de água TIP3P. Cargas atômicas de ligantes foram calculadas usando o método AM1-BCC implementado no Antechamber, seguido pela atribuição dos tipos de átomos GAFF2. Os arquivos de topologia resultantes foram convertidos para um formato compatível com GROMACS usando ACPYPE. Parâmetros iônicos consistentes com o modelo de água TIP3P foram atribuídos com base no conjunto de parâmetros de Joung-Cheatham. O complexo inicial foi colocado em uma caixa de simulação dodecaedrica truncada com pelo menos 1,2 nm entre a superfície da proteína e a borda da caixa. Moléculas de água TIP3P foram adicionadas para solventar o sistema, e íons Na+ e Cl− foram introduzidos para neutralizar a carga do sistema e ajustar a força iônica para 0,15 M. A minimização de energia foi realizada com o algoritmo de descida mais íngreme até que a força máxima ficasse abaixo de 1.000 kJ·mol−1·nm−1. O sistema foi então equilibrado para 100 ps sob o conjunto NVT a 298 K e 1 bar. Após o equilíbrio, uma simulação de produção de 100 ns foi executada sob o conjunto NPT com um passo de tempo de 2 fs. Interações não vinculadas eram tratadas com o esquema de corte Verlet. Interações eletrostáticas foram calculadas usando o método de Ewald de malha de partículas (PME), e um cutoff de 1,2 nm foi usado tanto para as interações de van der Waals quanto de Coulomb. As ligações contendo hidrogênio foram restringidas pelo algoritmo LINCS. A temperatura era controlada com o termostato Nosé-Hoover, e a pressão era controlada com o barostato Parrinello-Rahman, mantendo o sistema em 298 K e 1 bar. Trajetórias eram salvas a cada 10 ps. Dinâmicas estruturais e interações intermoleculares foram analisadas usando ferramentas integradas do GROMACS, VMD e PyMOL. A energia livre de ligação foi estimada com gmx_MMPBSA quando aplicável.
Estudos com animais
Criação de animais
Setenta ratos machos de Sprague-Dawley (SD) entre 3 e 8 semanas foram aleatoriamente atribuídos a sete grupos experimentais (n = 10 por grupo) usando números aleatórios gerados por computador, garantindo que não haja diferenças estatisticamente significativas no peso corporal inicial entre os grupos. Todos os animais foram alojados sob condições controladas (22 ± 1 °C, 55 ± 10% de umidade relativa, 12 horas de ciclo claro/escuro) com livre acesso a comida e água. As posições das gaiolas foram randomizadas a cada mudança de gaiola para minimizar o viés ambiental. Após 1 semana de aclimatação, ratos dos grupos modelo passaram por punção caudal por IVD para induzir degeneração. Anestesia local de infiltração com bupivacaína foi administrada pré-operatório para reduzir a dor. Os animais foram monitorados de perto durante a cirurgia e durante toda a recuperação pós-operatória. As observações pós-operatórias incluíram tempo de recuperação, restauração da atividade espontânea, consumo de alimentos e água, e mudanças no peso corporal. Uma semana após o estabelecimento do modelo, dois ratos de cada grupo foram selecionados aleatoriamente para radiografia digital pós-operatória (DR) e coloração por hematoxilina e eosina (HE). A análise radiográfica mostrou redução da altura do IVD caudal, enquanto a coloração com HE revelou uma redução significativa nas células notocordiais do núcleo pulposo (NP) e a desorganização da estrutura lamelar do anel fibroso18, confirmando o estabelecimento bem-sucedido do modelo. Oito semanas após a cirurgia, ratos foram eutanasiados por inalação de uma overdose de isoflurano, e amostras de tecido caudal e sangue foram coletadas. Após validação preliminar, foram usadas três amostras independentes por grupo que atendessem aos critérios de qualidade pré-definidos para as análises finais de histologia, ELISA, PCR e western blot. As seções histológicas foram avaliadas sob condições de simples cegueira, com lâminas rotuladas apenas por números de identificação dos animais. Para ensaios ELISA, PCR e western blot, a codificação cega foi aplicada durante a alicotação e rotulagem da amostra, e a ordem de teste de todas as amostras foi randomizada antes dos experimentos. Dados brutos, incluindo valores de absorção, valores Ct e intensidades de banda, foram decodificados em identidades de grupo por um estatístico não envolvido em agrupamento experimental ou processamento de amostras e posteriormente analisados por pessoal estatístico. Todas as análises estatísticas foram realizadas por estatísticos que não participaram do agrupamento experimental ou processamento da amostra. Quaisquer eventos adversos, incluindo infecção de ferida, deiscência, sangramento ou letargia severa, foram imediatamente registrados e avaliados. Condições leves foram monitoradas de perto com cuidados de suporte aprimorados. Critérios humanos foram aplicados se ratos apresentassem perda de peso corporal superior a 20% do valor inicial, dor intensa não aliviada por analgésicos, perda de mobilidade, incapacidade de acessar alimentos ou água, infecção, necrose, outras complicações pós-operatórias graves, dificuldade respiratória ou qualquer condição potencialmente fatal. Nesses casos, os animais eram eutanasiados humanamente por inalação de uma overdose de isoflurano.
Modelagem experimental
Os ratos foram anestesiados com isoflurano inalado e posicionados de bruços. Os IVDs de cauda Co6/7, Co7/8 e Co8/9 estavam localizados sob orientação fluoroscópica de raios X. Uma agulha de 21 G era avançada verticalmente para dentro do IVD até alcançar o lado oposto da pele, após o que a ponta da agulha era retraída em direção ao centro da cauda. Uma segunda agulha servia como referência posicional. Para induzir a degeneração sustentada da DIVI, a agulha era girada 360°, mantida no lugar por 30 segundos e depois removida. No grupo Sham, a profundidade da perfuração através da pele e músculo foi de aproximadamente 2 mm, sem danificar o DI. Nos outros grupos, a agulha foi inserida 5 mm em direção ao centro do DIVI, evitando os vasos sanguíneos. Após a inserção, a agulha era girada 360° e deixada no lugar por 30 segundos. O local da perfuração foi desinfetado, marcado e protegido com gaze estéril. Uma semana após a modelagem, a imagem por raio-X da coluna caudal mostrou diminuição na altura do DIVI. A coloração com HE revelou uma redução significativa nas células notocordiais NP e desorganização da estrutura da lamela anular, confirmando o estabelecimento bem-sucedido do modelo. Após modelagem bem-sucedida, os grupos que receberam tratamentos com MTC e o grupo controle positivo (PC) receberam as doses apropriadas, calculadas com base na razão da área superficial corporal entre humanos e ratos.
Agrupamento e intervenção
Um total de 70 ratos machos SD de 3 a 8 semanas foram usados neste experimento, divididos em sete grupos:
(1) Grupo controle (Ctrl): Ratos deste grupo foram designados aleatoriamente ao mesmo tempo e sob as mesmas condições dos grupos experimentais. Eles eram alojados em gaiolas individuais em uma instalação animal de nível SPF, com acesso livre a comida e água potável padrão.
(2) Grupo simulado: Os ratos foram anestesiados por inalação de isoflurano. Após a anestesia ser estabelecida, a pele da cauda foi desinfetada com povidona-iodo, e os ratos foram posicionados pronos. Os IVDs Co6/7 e Co7/8 foram localizados sob orientação fluoroscópica de raios X. A agulha foi avançada aproximadamente 2 mm através da pele e do músculo sem ferir o DI. Água destilada (10 mL/kg) era administrada uma vez ao dia por gavage durante 8 semanas.
(3) Grupo modelo: Os ratos foram anestesiados com isoflurano inalado. Após a anestesia ser estabelecida, a pele da cauda foi desinfetada com povidona-iodo, e os ratos foram posicionados pronos. Sob orientação fluoroscópica de raios X, os IVDs Co6/7, Co7/8 e Co8/9 foram localizados. Uma agulha de 21 G era avançada verticalmente para dentro do DIV até alcançar o lado oposto da pele, e a ponta da agulha era então retirada em direção ao centro da cauda.
Uma segunda agulha era usada como referência posicional. A agulha era girada 360° e mantida no lugar por 30 segundos para induzir degeneração contínua do DIV antes da remoção. Água destilada (10 mL/kg) foi administrada diariamente por gavage durante 8 semanas, e a recuperação dos ratos foi monitorada de perto após a cirurgia.
(4) Grupo PC: O grupo controle positivo foi submetido ao mesmo procedimento de modelagem do grupo modelo e, posteriormente, recebeu gavage oral de celecoxib (20 mg/kg/dia), preparado em suspensão em carboximetilcelulose de sódio 0,5% (CMC-Na), por 8 semanas consecutivas, com um volume de gavage de 10 mL/kg de peso corporal.
(5) YQHXD grupo de baixa dose [YQHXD(L)]: A modelagem foi realizada como no grupo modelo. Os ratos receberam YQHXD a 3,87 g/kg/dia por gavage durante 8 semanas, com volume de gavage de 10 mL/kg e concentração de trabalho de 0,387 g/mL.
(6) YQHXD grupo de dose média [YQHXD(M)]: A modelagem foi realizada como no grupo modelo. Os ratos receberam YQHXD a 7,74 g/kg/dia por gavage durante 8 semanas, com volume de gavage de 10 mL/kg e concentração de trabalho de 0,774 g/mL.
(7) YQHXD grupo de alta dose [YQHXD(H)]: A modelagem foi realizada como no grupo modelo. Os ratos receberam YQHXD a 15,48 g/kg/dia por gavage durante 8 semanas, com volume de gavage de 10 mL/kg e concentração de trabalho de 1,548 g/mL.
Mudanças patológicas
O tecido caudal da DIV do rato foi isolado cirurgicamente, e foram observadas alterações na DIV e nos tecidos musculares ao redor. O tecido coletado foi então processado em seções patológicas, com amostras preparadas em seções longitudinais para observação morfológica. O IVD vertebral caudal, fixado em formaldeído por 96 horas, foi rapidamente descalcificado usando uma solução descalcificante, desidratado por uma série de álcool graduado e eliminado com xileno. Após a incorporação na parafina, foram preparadas seções de 5 μm com parafina. Após a desparafinização com xileno e desidratação por uma série de gradientes de álcool, as seções foram coradas com hematoxilina e eosina. Depois, foram desidratados, limpos e montados. As amostras foram observadas sob um microscópio óptico para examinar mudanças morfológicas na estrutura do DIV caudal entre os grupos. Posteriormente, foi realizada a coloração tricromática de Masson. As seções foram coradas sequencialmente com solução de dicromato de potássio e hematoxilina por 3 minutos cada, seguidas de diferenciação com etanol ácido e depois coloridas com Vermelho de Picrosírio por 10 minutos. Após tratamento com ácido fosfotungstico por 10 minutos, as seções foram tingidas com azul de toluidina por 5 minutos. Após a desidratação, as seções foram limpas com xileno, montadas e observadas ao microscópio para examinar as alterações na DIV caudal.
Detecção ELISA de proteínas-alvo séricas
Oito semanas após a cirurgia, os ratos foram anestesiados com isoflurano inalado, e sangue da aorta abdominal foi coletado. As amostras periféricas de sangue foram mantidas em temperatura ambiente por 1 hora e centrifugadas a 1.400 × g por 10 minutos. O soro era separado e armazenado a −80 °C até o uso. Os níveis séricos de AKT1, STAT3 e Bcl-2 foram quantificados por meio de ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA). Os ensaios foram realizados de acordo com os protocolos dos fabricantes. A absorvância foi registrada em 450 nm, e as concentrações foram determinadas a partir de curvas padrão. Os intervalos de detecção para AKT1, STAT3 e BCL-2 foram de 0,625–40 ng/mL, 31,25–1000 pg/mL e 0,16–10 ng/mL, respectivamente, com sensibilidades de 0,1 ng/mL, 10 pg/mL e 0,1 ng/mL. Todas as amostras séricas foram analisadas sem diluição, e todos os resultados se enquadraram nas faixas correspondentes de curvas padrão. Todas as amostras e padrões foram analisados em duplicado, e a normalização foi realizada com base em volumes séricos iguais.
Detecção por PCR dos níveis de expressão gênica
Tecidos intervertebrais do disco foram dissecados das vértebras caudais de rato, e aproximadamente 20 mg foram coletados de cada amostra. Os tecidos foram pulverizados em nitrogênio líquido e lisados em 500 μL de tampão de lise não enzimática por 15 minutos. O RNA total foi então extraído, e sua concentração e pureza foram medidas com um espectrofotômetro. Amostras com valores A260/A 280 de 1,8–2,0 foram aceitas para análise, e as concentrações de RNA ajustadas para 500 ng/μL. A transcrição reversa foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. A PCR quantitativa (qPCR) foi realizada em um sistema de PCR em tempo real para medir a expressão de mRNA de Akt1, Bcl-2 e Stat3 . As sequências de primeiro são fornecidas na Tabela 1. O programa de PCR consistia em desnaturação inicial a 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos de 95 °C por 5 s e 60 °C por 30 s. A análise da curva de fusão foi realizada após amplificação para verificar a especificidade do produto. O Gapdh foi usado como gene de referência, e todas as amostras foram analisadas em triplicado. As eficiências de amplificação dos primers foram de 90% a 110%. A expressão gênica relativa foi calculada usando o método 2−ΔΔCt .
Western blot para níveis de expressão proteica
Proteína total foi isolada dos tecidos caudais do disco intervertebral de rato de cada grupo. Os tecidos foram lisados em tampão RIPA suplementado com inibidores de protease. A concentração de proteína foi medida usando um kit de ensaio de proteínas BCA e ajustada para 2 μg/μL. Quantidades iguais de proteína (15 μg por amostra) foram separadas por 10% de SDS-PAGE e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) a uma corrente constante de 300 mA por 90 minutos usando um sistema de transferência úmida. As membranas foram então bloqueadas com leite desnatado a 5% por 1 hora em temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra AKT1 (1:5.000), STAT3 (1:6.000), Bcl-2 (1:1.500) e β-actina (1:4.000). Após a lavagem com TBST, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte (HRP) em uma diluição de 1:5.000 por 1 h em temperatura ambiente. As bandas proteicas foram detectadas usando um reagente de quimioluminescência aprimorada (ECL), e imagens foram obtidas com um sistema de imagem em gel sob condições idênticas de exposição. As intensidades das bandas foram medidas usando ImageJ e normalizadas para β-actina para determinar a expressão relativa da proteína. Cada experimento foi realizado independentemente em triplicado, com cada amostra obtida de um animal diferente.
Estatísticas
Os resultados são expressos como média ± desvio padrão (DS). As diferenças entre os grupos foram avaliadas por análise unilateral da variância (ANOVA), seguidas pelo teste de diferença de menor significância (LSD) post hoc. A significância estatística foi definida como P < 0,05.
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Conclusões derivadas do estudo
Este estudo integrou farmacologia de redes, acoplamento molecular, simulações de dinâmica molecular e experimentos in vivo para investigar os potenciais efeitos protetores do YQHXD contra o LDD. Os resultados sugerem que YQHXD pode agir, ao menos em parte, por meio da regulação do eixo de sinalização AKT1/STAT3/BCL-2, caracterizado pela redução da expressão de STAT3 e aumento da expressão de AKT1 e Bcl-2. Análises histológicas e...
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Medicamentos tradicionais chineses têm relatos de efeitos farmacológicos, incluindo anti-inflamatórios, analgésicos e atividades de promoção da circulaçãosanguínea 19. Estudos anteriores sugeriram que a Decocção Xiaosui Huahe, a fórmula precursora do YQHXD, pode promover a reabsorção da hérnia massiva de DIV ao afetar a reabsorção do núcleo pulposo (NP) e a absorção deDIV 20; no entanto, os mecanismos moleculares subjacentes permanecem ince...
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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecemos ao Dr. Jintao Liu, do Hospital Afiliado do Hospital Tradicional Tradicional de Suzhou, Afiliado à Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing, Suzhou, pela ajuda em todas as etapas deste estudo. Esse trabalho foi apoiado por uma bolsa do National Natural Science Foundation of China Project (82474529); Liu 2024, Projeto da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82374220); Jiang 2023, a Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (Nº BK20250396); o Projeto de Desenvolvimento da Ciência e Tecnologia da Medicina Tradicional Chinesa da província de Jiangsu (Nº QN202419); O Projeto de Inovação em Ciência e Tecnologia de Pesquisa Básica Aplicada (médica e saúde) de Suzhou (Nº SYWD2024154); Projeto de Desenvolvimento de Tecnologia da Medicina Tradicional Chinesa da Província de Jiangsu (MS2022080); A terceira turma de talentos líderes em medicina tradicional chinesa na província de Jiangsu (Su TCM Science and Education [2023] nº 17); Projeto de Aprimoramento da Capacidade Científica e Educacional da Província de Jiangsu: Projeto de Construção de Disciplinas Médicas-Chave e Laboratórios Médicos Principais da Província de Jiangsu (Suwei Ciência e Educação [2022] Nº 17); Projeto da Fundação Provincial de Ciências Naturais de Jiangsu (Nº: BK20241802); A 29ª Turma do Plano de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia de Suzhou para 2022 (Projeto de Construção de Novos Laboratórios-Chave) (SZS2022019); o Projeto de Melhoria da Capacidade de Pesquisa Básica de Professores Jovens e de Meia-Idade em Universidades em Guangxi até Yuan Chai (2024KY0300); Projeto de Pesquisa Científica Autofinanciado (GXZYA20240113) da Administração da Região Autônoma Zhuang de Medicina Tradicional Chinesa; Uma bolsa do Projeto de Pesquisa em Nível Universitário da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Guangxi para Yuan Chai (2023QN010); Uma bolsa do Projeto de Treinamento em Inovação para Estudantes Universitários na Região Autônoma Zhuang de Guangxi para Yongyuan Li (202410600022); Uma bolsa do Projeto de Treinamento em Inovação para estudantes universitários da Universidade de Medicina Chinesa de Guangxi para Sujie Liu (X202410600062); Uma bolsa do Projeto de Treinamento em Inovação para estudantes universitários da Universidade de Medicina Chinesa de Guangxi para Mengfei Lin (S202410600084)
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Carboximetilcelulose de sódio 0,5% (CMC-Na) | Não especificado | Veículo usado para preparar a suspensão do celecoxib para o gavage. | |
| Agulha 21 G | Não especificado | Usado para punção caudal do disco intervertebral. | |
| 2 vezes; Mistura Master Universal Blue SYBR Verde qPCR | Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan | G3326 | reagente de amplificação qPCR. |
| Solução de gel 30% de acrilamida/bis-acrilamida (29:1) | Solarbio Co., Ltd. | Solução de preparação em gel para SDS-PAGE; listado na tabela original de materiais como solução de gel 30%/29:1. | |
| Máquina de moer congelada 3D | Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan | Usado para homogeneização/moagem de tecidos. | |
| 4 e vezes; Tamponador de gel concentrador SDS-PAGE (pH 6,8) | Solarbio Co., Ltd. | Reagente de preparação do gel Western Blot. | |
| Etanol ácido | Não especificado | Usado para diferenciação histológica de coloração. | |
| ACPYPE | Projeto ACPYPE | Usado para converter arquivos de topologia de ligantes em um formato compatível com GROMACS. | |
| Kit AKT1 ELISA | Hangzhou UpingBio Technology Co., Ltd. | SYP-R1928 | Usado para medir os níveis séricos de AKT1; alcance de detecção 0,625– 40 ng/mL. |
| Método de carga AM1-BCC | Ferramentas de Antecâmara/AMBER | Usado para cálculo de carga atômica de ligantes. | |
| Campo de força Amber14SB | Campo de força AMBER | Campo de força proteico usado na simulação de dinâmica molecular. | |
| Raiz de Angelica sinensis | Farmácia Jianshou, Nanning, Guangxi, China | Lote nº 20250503 | componente botânico YQHXD; 20 g por prescrição. |
| Etanol anidro | Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd. | Usado em processamento/desidratação de tecidos. | |
| Antecâmara | Ferramentas AMBER | Usado para cálculo de carga de ligantes e tipagem de átomos. | |
| Anticorpo anti-AKT1 | Wuhan Sanying Co., Ltd. | Anticorpo primário para Western bloting; diluição 1:5.000. | |
| Anticorpo anti-Bcl-2 | Wuhan Sanying Co., Ltd. | Anticorpo primário para Western bloting; diluição 1:1.500. | |
| Anticorpo anti-STAT3 | Wuhan Sanying Co., Ltd. | 10253-2-AP | Anticorpo primário para Western bloting; diluição 1:6.000. |
| Reagente APS | Beyotime/Biyuntian Co. | Reagente de polimerização em gel Western Blot. | |
| Raiz de Astragalus membranaceus | Farmácia Jianshou, Nanning, Guangxi, China | Lote nº 20250405 | componente botânico YQHXD; 20 g por prescrição. |
| Autoclave | SANYO, Japão | Equipamentos de esterilização. | |
| Motor AutoDock Vina | Projeto AutoDock/Vina | Motor de acoplamento usado dentro do CB-Dock2. | |
| Kit de ensaio proteico BCA | Solarbio Co., Ltd. | Usado para determinar a concentração de proteína antes do Western bloting. | |
| Kit ELISA de BCL-2 | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | PMK1545 | Usado para medir os níveis séricos de Bcl-2; alcance de detecção 0,16– 10 ng/mL. |
| Bupivacaína | Não especificado | Anestésico local de infiltração usado pré-operatório. | |
| CB-Dock2 | Servidor web CB-Dock2 | Plataforma automatizada cega de acoplamento molecular. | |
| Celecoxib | Sichuan New Ston Pharmaceutical Co., Ltd. | H20233911 | Medicamento controle positivo; 20 mg/kg/dia por Gavage. |
| Fruto de Chaenomeles speciosa | Farmácia Jianshou, Nanning, Guangxi, China | Lote nº 231001 | componente botânico YQHXD; 15 g por prescrição. |
| Citoscape | Consórcio Cytoscape | Versão 3.9.0 | Usado para construir e analisar diagramas de rede. |
| Kit de reagentes cromogênicos DAB (20 e 20 vezes) | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | Listado na tabela de materiais existentes. | |
| DAVID | Instituto Nacional do Câncer | Versão 6.8 | Banco de Dados para Anotação, Visualização e Descoberta Integrada; utilizado para análise de enriquecimento GO e KEGG. |
| Solução de descalcificação | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | Usado para descalcificação do tecido caudal vertebral IVD. | |
| Agitador de descolorização | Liu Yi Biotechnology Co., Ltd., Pequim | Shaker de laboratório. | |
| Água do DEPC | Wuhan Sanying Co., Ltd. | Trabalho com RNA/preparação de reagentes. | |
| Sistema de imagem por radiografia digital | Não especificado | Usado para validação pós-operatória de modelos radiográficos. | |
| Água destilada | Não especificado | Preparação de gavage de veículo/controle e decocção YQHXD. | |
| Substrato quimioluminescente de ECL | Biosharp Co. | Reagente de detecção de sinal de Western Blot. | |
| Solução de recuperação de antígeno EDTA (pH 8,0) | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | Listado na tabela de materiais existentes. | |
| Aparelho de eletroforese | Não especificado | Usado para eletroforese SDS-PAGE. | |
| Buffer de eletroforese | Servicebio Co. | Solução de eletroforese Western Blot. | |
| Máquina de gelo FM40 | Changliu Scientific Instruments Co., Ltd., Pequim | Máquina de gelo. | |
| Formaldeído | Não especificado | Fixador usado para tecido de dvisão intraveinosa caudal vertebral. | |
| Tipos de átomos GAFF2 | Ferramentas AMBER | Tipos de átomos de ligantes usados em simulações de dinâmica molecular. | |
| Sistema de imagem em gel | Tianen Scientific, Xangai | Usado para capturar imagens de manchas ocidentais. | |
| GeneCards | Instituto Weizmann de Ciências | Versão 5.26 | Banco de dados de genes humanos usado para recuperar alvos associados a doenças. |
| gmx_MMPBSA | gmx_MMPBSA projeto | Usado para estimativa de energia livre de ligação MM-PBSA quando aplicável. | |
| GraphPad Prisma | GraphPad Software | Versão 8.0 | Software estatístico/gráfico listado na versão anterior do manuscrito dos autores. |
| Esferas de moagem | Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan | Usado para moagem/homogeneização de tecidos. | |
| GROMACS | Equipe de desenvolvimento do GROMACS | Versão 2022.2 | Usado para simulações de dinâmica molecular. |
| Reagentes de coloração de hematoxilina e eosina | Não especificado | Usado para coloração HE em seções caudais de IVD. | |
| Centrífuga de alta velocidade | Eppendorf, Alemanha | Centrífuga de laboratório. | |
| Moedora de tecidos de alta velocidade e baixa temperatura | Servicebio, China | Usado para moagem de tecidos em baixa temperatura. | |
| Agitador horizontal | Companhia Chirinbell | Shaker de laboratório. | |
| Anticorpo anti-coelho marcado com HRP | Servicebio Co. | Anticorpo secundário para Western bloting; diluição 1:5.000. | |
| HyperScript III RT SuperMix para qPCR com removedor de gDNA | Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan | Reagente de transcrição reversa listado na tabela de materiais existentes. | |
| Máquina de gelo | SIMAG, China | Máquina de gelo. | |
| ImageJ | Institutos Nacionais de Saúde | Usado para quantificação de intensidade de bandas Western blot. | |
| Microscópio biológico invertido | Olympus, Japão | Usado para microscopia de seções tingidas. | |
| Isoflurano | Não especificado | Agente anestésico/eutanásia inalatorial. | |
| Reagente de isopropanol | China National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd. | Reagente de extração de RNA. | |
| Parâmetros de íons de Joung-Cheatham | Não aplicável | Conjunto de parâmetros de íons usado para simulações de dinâmica molecular. | |
| Rizoma de Ligusticum chuanxiong | Farmácia Jianshou, Nanning, Guangxi, China | Lote nº 20250301 | componente botânico YQHXD; 15 g por prescrição. |
| Nitrogênio líquido | Não especificado | Usado para moagem de tecidos antes da extração de RNA. | |
| Centrífuga de baixa velocidade | Eppendorf, Alemanha | Usado para separação sérica e outras etapas de centrifugação em baixa velocidade. | |
| Solução de coloração tricromática de Masson | Não especificado | Usado para coloração Masson em seções caudais de IVD. | |
| Leitor de microplacas (TECAN) | TECAN, Suíça | Usado para medição de absorção em 450 nm; listados na tabela de materiais existentes. | |
| Leitor de microplacas (Thermo Fisher Scientific) | Thermo Fisher Scientific, EUA | Leitor de microplacas multifuncional listado na tabela de materiais existentes. | |
| Microsoft Excel/software de planilha | Microsoft | Usado para remover entradas duplicadas de destino e gerenciar dados tabulares. | |
| Espectrofotômetro NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific, EUA | Usado para medir a concentração e pureza do RNA. | |
| Tampão de lise não enzimático | Não especificado | Usado para lisagem de tecidos antes da extração de RNA. | |
| OMIM | Faculdade de Medicina da Universidade Johns Hopkins | Herança Mendeliana Online no Homem; Usado para recuperar alvos associados a doenças. | |
| Plataforma online de traçado de bioinformática | Não especificado | Usado para gerar gráficos de barras GO e KEGG. | |
| Agente de polimerização em gel PAGE | Solarbio Co., Ltd. | Reagente de preparação do gel Western Blot. | |
| Parafina | Não especificado | Meio de embedding para seções histológicas. | |
| Primers de PCR para Akt1, Bcl-2, Stat3 e Gapdh | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | As sequências de espoletas estão listadas na Tabela 1. | |
| PDB | RCSB PDB | Banco de Dados de Proteínas; usado para obter estruturas 3D de proteínas alvo. | |
| Inibidores fosforilados/proteases | Servicebio Co. | Adicionado ao tampão de lise RIPA para extração de proteína. | |
| Ácido fosfotungístico | Não especificado | Usado na coloração de Masson. | |
| Picrosirius Red | Não especificado | Usado na coloração de Masson. | |
| Membrana de difluoreto de polivinilideno (0,45 & mu; m) | Servicebio Co. | Membrana PVDF usada para transferência de Western blot. | |
| Veículo de controle positivo de drogas | Não especificado | Veículo suspenso CMC-Na 0,5% para celecoxib. | |
| Povidona-iodo | Não especificado | Usado para desinfecção do local cirúrgico. | |
| Marcador proteico | Thermo Fisher Scientific, EUA | Marcador de peso molecular para Western blotting. | |
| Aparelho de transferência de proteínas | Bio-Rad, EUA | Equipamento de transferência úmida para Western blotting. | |
| Módulo de transferência de proteínas (transferência úmida) | Bio-Rad, EUA | Módulo de transferência úmida Western Blot. | |
| PubChem | Centro Nacional de Informação em Biotecnologia (NCBI) | Usado para obter arquivos SMILES/SDF de estruturas compostas. | |
| Sistema de preparação de água pura | Le Feng Biotechnology Co., Ltd., Xangai | Usado para preparação de água pura. | |
| PyMOL | Schrö dinger, LLC | Usado para visualização e análise de dinâmica molecular/saídas de acoplamento. | |
| Sistema de PCR em tempo real qPCR | Applied Biosystems QuantStudio, EUA | Usado para amplificação quantitativa por PCR. | |
| Tampão de lise de tecido/célula RIPA | Solarbio Co., Ltd. | Usado para extração total de proteína. | |
| Solução para dissolução de RNA | Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan | Reagente de manuseio de RNA. | |
| Evaporador rotativo | Não especificado | Usado para concentrar os filtrados combinados YQHXD sob pressão reduzida. | |
| Sementes maduras de Sinapis alba | Farmácia Jianshou, Nanning, Guangxi, China | Lote nº 20240801 | componente botânico YQHXD; 10 g por prescrição. |
| Ratos Sprague-Dawley | Shanghai Slack Experimental Animal Co., Ltd. | SCXK (Xangai) 2022-0004 | Setenta ratos machos, com 3 anos e ndash; 8 semanas, usado para o modelo de punção caudal com disco. |
| SPSS | IBM, EUA | Versão 21.0 | Software estatístico listado na versão anterior do manuscrito dos autores. |
| Kit STAT3 ELISA | Hangzhou UpingBio Technology Co., Ltd. | SYP-R1555 | Usado para medir os níveis séricos de STAT3; alcance de detecção 31,25– 1000 pg/mL. |
| Raiz de Stephania tetrandra | Farmácia Jianshou, Nanning, Guangxi, China | Lote nº 230301 | componente botânico YQHXD; 6 g por receita. |
| Gaze estéril | Não especificado | Usado para proteger o local da perfuração após a modelagem. | |
| STRING | Consórcio STRING | Versão 12.0 | Plataforma de interação proteína-proteína em rede de interação. |
| SweScript All-in-One RT SuperMix para qPCR | Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan | G3337 | Reagente de transcrição reversa listado na tabela de materiais existentes. |
| SwissTargetPrediction | SIB Instituto Suíço de Bioinformática | Usado para prever possíveis alvos de compostos. | |
| Buffer TBST | Não especificado | Usado para lavagem de membranas durante Western bloting. | |
| TCMSP | Centro de Bioinformática, Faculdade de Ciências da Vida, Noroeste A & Universidade F | Versão 2.3 | Banco de Dados de Sistemas de Farmacologia da Medicina Tradicional Chinesa; usado para obter ingredientes ativos de compostos herbais chineses. |
| Modelo de água TIP3P | Não aplicável | Modelo de água usado em simulações de dinâmica molecular. | |
| Azul toluidina | Não especificado | Usado na coloração de Masson. | |
| Buffer de transferência | Servicebio Co. | Buffer de transferência de manchas ocidentais. | |
| Reagente TriQuick | Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan | Reagente de extração de RNA. | |
| Reagente Trizol | Não especificado | Reagente de extração de RNA total mencionado no manuscrito. | |
| TTD | A Universidade Chinesa de Hong Kong (IDRBLab) | Banco de Dados de Alvos Terapêuticos; Usado para recuperar alvos associados a doenças. | |
| Venny | BioinfoGP, CNB-CSIC | Versão 2.1.0 | Usado para identificar alvos sobrepostos entre YQHXD e LDD. |
| Esquema de corte Verlet | GROMACS | Esquema de interação não ligada usado em simulações de dinâmica molecular. | |
| Aparelho de eletroforese vertical | Bio-Rad, EUA | Usado para SDS-PAGE. | |
| VMD | Universidade de Illinois em Urbana-Champaign | Usado para visualização e análise de saídas de dinâmica molecular. | |
| Sistema de transferência úmida | Bio-Rad, EUA | Usado para transferência de proteína em Western bloting. | |
| Sistema de fluoroscopia de raios X | Não especificado | Usado para identificar os níveis de DII caudal durante a modelagem por punção. | |
| Xylene | Não especificado | Usado para desparafinização/limpeza durante histologia. | |
| Anticorpo primário β-actina | Wuhan Sanying Co., Ltd. | Anticorpo primário de controle de carga para Western bloting; diluição 1:4.000. |