Protocolo para Rastreamento e Quantificação Comportamental Automatizada em Drosophila melanogaster

Summary

Esse protocolo utiliza estimativa de pose por Python para rastrear pontos-chave do corpo em Drosophila pareada, facilitando a quantificação automatizada de comportamentos sociais sutis, especialmente em interação social, assim como mapas de calor e trajetórias locomotoras.

Abstract

Para desenvolver uma ferramenta analítica de código aberto que supere as limitações dos métodos tradicionais de rastreamento baseados em centroides, apresentamos um protocolo para analisar com precisão as interações sociais em pares de Drosophila que se comportam livremente. Especificamente, este protocolo é inspirado na estrutura de rede de alta resolução (HRNet) para acompanhar simultaneamente cinco pontos-chave anatômicos — cabeça, tórax, abdômen e pontas das asas esquerda e direita — com o objetivo de gerar dados coordenadas de alta resolução para análises quantitativas subsequentes de comportamentos sociais. Esse protocolo fornece um fluxo de trabalho completo baseado em Python e uma interface gráfica (GUI) que projetamos, incluindo construção de conjuntos de dados, treinamento de modelos e extração automatizada de coordenadas, além de módulos integrados para gerar mapas de calor de ocupação espacial, trajetórias locomotoras e razões de interação social em moscas. Para validar essa estrutura, foi testada usando duas cepas amplamente utilizadas, w1118 e Canton-S (CS). Nossos resultados demonstraram a estabilidade da detecção de pontos-chave e revelaram diferenças específicas do genótipo na utilização espacial e na estrutura da locomotiva. Essa metodologia fornece uma base escalável para etologia quantitativa e análise automatizada das interações sociais em Drosophila, ao mesmo tempo em que reduz o esforço de anotação manual e melhora a reprodutibilidade.

Introduction

Drosophila melanogaster é um organismo-modelo amplamente utilizado, com ferramentas genéticas poderosas e circuitos neurais bem mapeados que permitem a dissecação mecanicista do comportamento¹. Possui uma ampla gama de comportamentos sociais, incluindo cortejo e agressividade, e uma forte habilidade de aprendizagem 2,3,4,5,6,7,8. Cada um é composto por elementos motores distintos, controlados por um sistema nervoso compacto, porém extremamente bem organizado. Importante, a medição precisa da postura corporal é essencial para entender as bases neurológicas da seleção de ações, pois muitos desses comportamentos contêm motivos posturais detalhados que codificam informações contextuais e do estado^{interno 9,10}.

Apesar da necessidade de resolução de mosca única para capturar diferenças individuais, muitos ensaios comportamentais de alto rendimento em Drosophila ainda dependem de índices em nível^{de grupo 11}. Ensaios comportamentais de alto rendimento incluem testes T-maze para preferência^{social 12,13}, ensaios de espaçamento social que quantificam distâncias entre moscas, ou paradigmas de agregação/evitação sob estimulação sensorial¹⁴ que podem capturar eficientemente tendências populacionais. No entanto, eles envolvem inerentemente a média entre indivíduos, obscurecendo assim a heterogeneidade nas sequências de ação e na estrutura temporal das trocas sociais. Ao longo dos anos, as tentativas de avançar para a identificação por mosca têm se baseado em métodos funcionalmente restritos, como a detecção de eventos baseada em regras usando limiares cinemáticos, subtração de fundo com rastreamento de centroides e anotação manual de vídeo 15,16,17,18. Como resultado, comportamentos discretos como investida, toque ou ameaças nas asas são frequentemente ignorados ou rotulados incorretamente, exigindo correções manuais significativas. Tais restrições restringiram estudos mecanicistas que exigem alinhamento temporal preciso entre a atividade neural e as ações individuais.

Uma solução revolucionária está agora disponível graças aos avanços recentes em visão computacional e estimativa de pose baseada em aprendizado de máquina. Frameworks de código aberto como DeepLabCut¹⁹ e SLEAP²⁰ permitem a detecção de partes do corpo sem marcadores, classificação escalável de ações discretas e preservação da identidade individual mesmo durante interações próximas. Essas características superam as desvantagens de abordagens anteriores baseadas em grupos e baseadas em regras, permitindo a quantificação repetível de comportamentos sociais complexos.

As interações individuais em Drosophila são caracterizadas por características motoras únicas que indicam a progressão das interações sociais. Agressão, por exemplo, inclui comportamentos típicos como investida, ameaças nas asas e agarramento, todos representando estágios crescentes^{de conflito 21,22}. O cortejo é definido de forma semelhante pela orientação, extensão unilateral das asas com produção de canto, batidas e tentativa de cópula, que se unem para formar a sequência temporal das interações^{de acasalamento 23}. Capturar esses motivos depende do reconhecimento preciso da postura corporal e dos movimentos^{articulares 24,25}. Na prática, a amostragem requer alta resolução espacial e temporal durante períodos prolongados de registro para garantir que padrões motores sutis possam ser detectados e alinhados com a atividade neural^25,26.

Aqui, apresentamos uma estrutura de código aberto baseada em visão para identificação automatizada de cinco pontos-chave anatômicos — cabeça, tórax, abdômen, pontas das asas esquerda e^{direita 27}. O sistema compreende um fluxo de trabalho completo para construção de conjuntos de dados, treinamento de modelos e extração de coordenadas, e gera dados de séries temporais de alta resolução adequados para classificação comportamental personalizável. Ao automatizar processos manuais de anotação e padronizar fluxos de trabalho analíticos, nosso método possibilita uma análise quantitativa em escala fina dos comportamentos de interação social, aumentando a eficiência e a reprodutibilidade, além de reduzir significativamente o tempo e o trabalho necessários para a análise.

Para validar a confiabilidade do sistema, aplicamos a duas cepas laboratoriais comumente usadas, w1118 e Canton-S (CS), e observamos detecção estável de pontos-chave entre quadros, além de diferenças específicas de genótipo em ocupação espacial, características da trajetória e indicadores de interação social baseados na distância da cabeça e no ângulo de orientação. Os pesquisadores podem avaliar a adequação desse protocolo com base na resolução espaço-temporal exigida (≥30 fps, ≤0,5 mm/pixel) e nas condições de gravação de vídeo (iluminação e contraste). O tamanho do pixel pode ser determinado diretamente pelas configurações da câmera. Uma mosca-das-frutas com comprimento corporal medido pode ser colocada dentro do campo de visão de imagem para calibração. Esse protocolo é particularmente adequado para os seguintes cenários: a necessidade de rastrear simultaneamente duas Drosophilas interagindo livremente e distinguir suas identidades individuais; focando em posturas finas (por exemplo, ângulo e distância da cabeça) em vez de apenas posições centróides; duração de gravação superior a 10 minutos quando a anotação manual não é viável; exigindo alinhamento temporal em nível milissegundo entre eventos comportamentais e atividade neural (por exemplo, imagem de cálcio ou eletrofisiologia) em análises subsequentes.

Protocol

1. Preparação para voar

1. Colete e sexe as moscas com cerca de 3–4 dias de idade sob breve anestesia por CO₂ antes dos experimentos.
   NOTA: A duração da anestesia e a vazão de CO₂ podem variar dependendo das especificações e da pressão do cilindro de dióxido de carbono usado em cada laboratório. As moscas devem ser monitoradas continuamente durante a anestesia, e a exposição ao CO₂ deve ser mantida apenas até que estejam totalmente anestesiadas e apresentem cessação total de movimento.
2. Coloque cada mosca individualmente em um tubo Falcon de 50 mL contendo meio padrão de farinha de milho–ágar–glicose–levedura.
3. Mantenha as moscas a 25 °C em um ciclo de 12 horas claro/escuro até o uso.

2. Construção da arena

1. Prepare duas placas acrílicas transparentes de 3 mm e uma placa de polietileno de 3 mm.
2. Corte quatro câmaras circulares (35 mm de diâmetro cada) no centro da placa de polietileno.
3. Use clipes para unir uma placa de acrílico à placa de polietileno para formar a base da câmara; Mantenha a segunda placa de acrílico como uma cobertura removível.

Figura 1: Esquema da arena comportamental e configuração de imagem. (A) A construção de uma câmara de observação personalizada é representada no diagrama. A câmara consiste em três camadas principais: uma base acrílica transparente de 3 mm; uma placa de polietileno de 3 mm com quatro recortes circulares de 35 mm de diâmetro servindo como poços individuais de câmara; e uma segunda placa de acrílico que funciona como uma tampa removível. (B) Uma grampa adaptadora de 90° é usada para instalar a câmera verticalmente em um poste óptico de 40 cm. Para imagens top-down, a câmera está posicionada diretamente acima da arena de observação em múltiplas camadas, com seu eixo óptico perpendicular à superfície da câmara. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Configuração de imagem

1. Monte dois postes ópticos de 20 cm e um poste de 40 cm com grampos adaptadores de 90°.
2. Monte a câmera (1280 × 1024 pixels) verticalmente no poste de 40 cm, alinhada perpendicularmente à superfície da arena, e ajuste a taxa de quadros para 150 fps.
3. Coloque a arena sobre um painel de LED diurno regulável de 25 cm × 25 cm, coberto por uma folha de difusão.
4. Ajuste a iluminação para cerca de 1500 lux na superfície da arena.
   NOTA: Garanta que as bordas das asas permaneçam visíveis na pré-visualização binária. Evite >2000 lux para evitar artefatos induzidos pelo calor, pois as moscas podem alterar sua locomoção ou distribuição natural devido ao estresse térmico da fonte de luz.

4. Procedimento de gravação

1. Coloque almofadas de espuma de 3 cm sob cada canto da arena para estabilizá-la.
2. Transferir pares de moscas sob anestesia CO₂ para câmaras; Vede com a placa acrílica superior.
3. Deixe as moscas se aclimatarem por 40 minutos antes de gravar.
4. Inicie a aquisição de vídeo usando MIAS.exe²⁷: pressione q para começar e c para parar.
   NOTA: Isso resulta em gravações contínuas de pares de moscas interagindo livremente sob condições padronizadas.

5. Defina o painel de atividades sociais

1. Execute o script de pré-processamento: python SoAL_PreProcess.py [video_file_path]
   NOTA: Todos os scripts de codificação são fornecidos no Arquivo Suplementar 1.
2. Anote a área da câmara e atribua metadados na forma de Genotype_age (dias) × 1 (número de câmaras). (por exemplo, CS_3 × 1)
3. Ajuste o controle deslizante do limiar de detecção até que as asas fiquem quase invisíveis na imagem binária para garantir subtração de fundo e visibilidade das asas de forma ideal.

6. Preparação de conjuntos de dados

1. Crie uma nova pasta de conjunto de dados executando:
   Ferramentas python/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME 10 (intervalo de amostragem de frames)
   NOTA: O parâmetro de intervalo de amostragem de quadro ("10") foi adaptado de um protocolo²⁷ publicado anteriormente. Valores mais baixos aumentam a densidade de amostragem e a carga computacional, enquanto valores mais altos reduzem a demanda computacional e podem ser ajustados com base no desempenho disponível do hardware e nos requisitos experimentais.
2. Configure o caminho do vídeo e o caminho do conjunto de dados em 'ferramentas/SoAL_DatasetUtils.py'
3. Interface de rotulagem manual de lançamento:
   >ferramentas python/SoAL_LabelUI.py NOME DO CONJUNTO DE DADOS
   1. Navegação de quadros: Pressione a tecla Espaço ou a tecla Z para navegar para o próximo ou o quadro anterior, respectivamente. Alternativamente, use o controle deslizante da linha do tempo para navegação.
   2. Rotulagem de pontos-chave: Clique na posição correta de uma mosca em cada imagem (em uma sequência específica: cabeça, tórax, abdômen, asa esquerda e asa direita) para marcar os 5 pontos-chave.
   3. Seleção de pontos-chave: Pressione as teclas numéricas para selecionar um ponto de chave (indicado por um círculo branco). O próximo clique reatribuirá um novo número ao ponto de chave selecionado.
   4. Salvamento: Feche a janela ou pressione a tecla D para salvar os resultados da anotação.
      NOTA: Um arquivo completo de conjunto de treinamento é composto por dois componentes: um diretório de imagens e um arquivo annotation.json.

7. Treinamento modelo

1. Divida o conjunto de dados em conjuntos de treinamento e validação:
   Ferramentas Python/SoAL_DatasetGen.py Divisão de nomes de conjunto de dados
   Duas novas pastas serão criadas em 'dataset/.'
2. Configure parâmetros de treinamento em hrnet/fly_w32.yaml:
   Fator de rotação: 15°
   Fator de escala: 0,35
   Fator de brilho: 0,25
   Tamanho do lote: 24
   Épocas: 200
3. Realize o programa de treinamento:
   Python hrnet/tools/train.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Encerrar os conjuntos de treinamento quando a precisão média (AP) estagnar; reter o melhor modelo (AP > 90%).
4. Valide o modelo usando:
   Python hrnet/tools/test.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Desfecho: Modelo robusto baseado em HRNet para detecção de pontos-chave multi-voo.

8. Execute o programa de detecção

1. Copie novos arquivos de vídeo para o diretório de vídeo.
2. Anote metadados conforme mostrado no passo 5.
3. Executar programa de detecção: python SoAL_KptDetect.py todos
4. Inspecionar os resultados da detecção:
   Ferramentas Python/SoAL_ViewKptUI.py excel_file_path (.cvs/xslx)
   Desfecho: Coordenadas bidimensionais de cinco marcos anatômicos por mosca através dos quadros.

9. Quantificação Comportamental

1. Inicie um aplicativo de interface (GUI independente para análise (Arquivo Suplementar 2) e importe arquivos de coordenadas para a interface.
2. Gerar mapas de calor de ocupação espacial (densidade de probabilidade das posições da arena).
3. Reconstrua trajetórias locomotoras a partir de séries de coordenadas.
4. Crie dados de interação social, incluindo distância da cabeça, orientação e estado social derivado.
   Desfecho: Visualização padronizada do uso espacial específico do genótipo e da dinâmica do movimento.

Results

A Figura 1 ilustra a geometria da arena, configuração de iluminação e posicionamento das câmeras usadas para registrar interações sociais naturais em Drosophila. O sistema garante iluminação uniforme e condições de imagem estáveis, adequadas para estimativa de pose e extração de coordenadas.

A estimativa automatizada da pose foi aplicada a todos os vídeos gravados para extrair coordenadas bidimensionais dos pontos-chave anatômicos pré-definidos de cada mosca. O modelo identificou consistentemente as articulações da cabeça, tórax, abdômen e asas em diferentes quadros, mesmo durante interações de curta distância. A Figura 2 mostra um quadro representativo com pontos-chave sobrepostos, demonstrando rastreamento preciso de múltiplas moscas e detecção estável de pontos-chave durante toda a gravação. A confiabilidade dessa etapa garante que a série temporal de coordenadas extraídas possa servir como uma base robusta para análises quantitativas posteriores. A Figura 3 ilustra o fluxo de trabalho analítico.

Usando as coordenadas extraídas e a proporção de quadros para cada coordenada, geramos mapas de calor de ocupação espacial para visualizar a distribuição cumulativa das posições de mosca dentro da arena. Esses mapas de calor resumem a densidade de probabilidade de localização das moscas ao longo do tempo e destacam regiões de ocupação preferencial. As Figuras 4 e 5 apresentam mapas de calor representativos para as moscas w1118 e Canton-S (CS). Diferenças nos padrões de uso espacial entre as zonas central e periférica dos dois genótipos são facilmente observáveis, refletindo tendências distintas na exploração de arenas e na preferência por zonas.

Além dos padrões de ocupação, reconstruímos trajetórias locomotoras a partir das séries temporais coordenadas para capturar dinâmicas de movimento em escala fina. As trajetórias foram geradas conectando as coordenadas bidimensionais das moscas de cada quadro sucessivo sem qualquer suavização. As trajetórias mostradas nas Figuras 4 e 5 ilustram trajetórias individuais de movimento para moscas w1118 e CS, revelando diferenças específicas de genótipo em alcance de movimento, complexidade de trajetórias e transições entre zonas de alta ocupação. Juntos, os resultados da detecção de pontos-chave, mapas de calor e reconstruções de trajetórias demonstram que o pipeline combinado de estimativa de pose e análise baseada em coordenadas captura e diferencia efetivamente a estrutura comportamental das Drosophila que interagem livremente entre genótipos.

Também definimos a interação social em cada quadro com base nas coordenadas bidimensionais de cinco pontos-chave anatômicos. Um par era considerado socialmente engajado quando ambos os critérios eram atendidos simultaneamente: distância cabeça a cabeça de mais de 0,5 mm, mas menos de 20 mm, e diferença de orientação superior a 30°28,29,30,31. Assim, medimos a proporção de tempo gasto em interação social para cada par (seis pares por genótipo). Nosso método pode medir de forma confiável o comportamento social em moscas, como mostrado na Figura 6. As razões sociais médias para moscas W1118 e CS foram 0,270 ± 0,001 e 0,252 ± 0,005, respectivamente, ao longo de seis experimentos de réplica independentes, sugerindo forte reprodutibilidade entre diferentes grupos experimentais. Também é consistente com o resultado de que não há diferença significativa na razão social entre as duas cepas de moscas do tipo selvagem.

Figura 2: Resultados representativos da detecção de pontos-chave. A estimativa automática da pose identificou todos os pontos-chave anatômicos pré-definidos para cada mosca através dos quadros. Marcadores sobrepostos ilustram o rastreamento preciso de múltiplas moscas durante interações sociais naturais. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Fluxo de trabalho de análise. O fluxo de trabalho principal compreende pré-processamento, preparação de dados, treinamento de modelos e validação, e finalmente produz coordenadas bidimensionais de Drosophila, seguidas por análise baseada em interface gráfica. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Mapa de calor representativo da atividade e trajetórias locomotoras das moscas do W1118. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O mapa de calor mostra a ocupação espacial acumulada dentro da arena por mais de 10 minutos, revelando as zonas de atividade preferidas para cada mosca w1118. Trajetórias sobrepostas ilustram caminhos individuais de movimento reconstruídos a partir de séries temporais coordenadas.

Figura 5: Mapa de calor representativo da atividade e trajetórias locomotoras das voas Canton-S (CS). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O mapa de calor exibe a distribuição de ocupação espacial de cada mosca CS durante a interação livre por 10 minutos. Trajetórias reconstruídas destacam a faixa de movimento e a estrutura do caminho, permitindo a comparação com padrões comportamentais do w1118.

Figura 6: Razão social em moscas do tipo selvagem. Quantificação do comportamento social após 10 minutos na câmara. Para seis pares de cada genótipo em uma pequena arena, para determinar a porcentagem de contato social. Os valores da razão social para moscas W1118 e CS foram, respectivamente, 0,270 ± 0,001 e 0,252 ± 0,005. Os dados são apresentados como média ± DS. Comparações estatísticas foram realizadas usando um teste t de Student bicaudal sem pareamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Arquivo Suplementar 1. Todos os arquivos de codificação necessários para executar o protocolo.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2. Aplicativo GUI independentePor favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3. Requisitos do PythonPor favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Nosso estudo mostra que a estimativa de poses baseada em aprendizado de máquina fornece um método escalável e confiável para medir interações sociais detalhadas em Drosophila. Ela supera as limitações das abordagens baseadas em centróides 15,16,17,18 ao rastrear cinco pontos-chave anatômicos em pares que interagem livremente, permitindo a aquisição de informações angulares fornecidas pelo eixo do corpo e pela distância cabeça a cabeça inferida a partir dos pontos da cabeça. Nossa técnica pode reconstruir padrões de ocupação espacial e trajetórias de movimento rastreando as coordenadas centróides das moscas em cada quadro de vídeo para obter rotas de movimento e usando marcos de cinco pontos para estimar a orientação da cabeça. A detecção estável de pontos-chave observada tanto nas cepas w1118 quanto Canton-S indica que o pipeline é robusto à variação natural na dinâmica do movimento, fornecendo uma base reprodutível para a classificação comportamental a jusante. Essas capacidades são essenciais para dissecar os elementos motores finos que codificam estados internos e informações contextuais nos comportamentos^{sociais 8,9}.

Vários fatores metodológicos foram considerados essenciais para garantir resultados consistentes. O calor e a intensidade da iluminação do sistema de iluminação afetaram significativamente a expressão comportamental, consistente com descobertas anteriores de que fatores ambientais afetam a atividade social e locomotora das^{moscas 32,33}. Parâmetros de imagem, incluindo distância focal, contraste e gama, que são ajustados empiricamente em nossos experimentos, também afetaram a precisão da estimativa de pose, alinhando-se com descobertas anteriores de que gravações comportamentais em alta velocidade exigem calibração óptica cuidadosa para capturar movimentos^{rápidos 34,35}. A variabilidade comportamental também foi influenciada pelos procedimentos de manuseio: a anestesia CO₂ resultou em mudanças quantificáveis na interação social e na locomoção, consistentes com publicações anteriores que mostraram mudanças comportamentais induzidas pela^anestesia 36,37,38. Essa etapa é especialmente crítica porque, quando a anestesia é insuficiente, as moscas podem recuperar a consciência e escapar após serem colocadas na câmara; Por outro lado, com anestesia adequada, as moscas precisam de tempo suficiente para se recuperar, pois a aclimatação inadequada reduz sua motivação para se mover depois, o que afetará severamente as análises subsequentes.

Mesmo com a força do oleoduto, várias limitações permanecem. A precisão da estimativa de pose é sensível à qualidade da anotação, de modo que até pequenos erros de rotulagem podem se propagar em distorções em trajetórias reconstruídas. Esse problema já foi observado anteriormente em outros frameworks de estimativa^{de pose 20,34}. Mudanças de domínio causadas por mudanças na iluminação, textura de fundo ou tensão de mosca podem reduzir o desempenho do modelo, exigindo retreinamentos periódicos ou expansão do conjunto de dados. Além disso, experimentos em que mais de 5% dos quadros dos pontos-chave não são detectados devem ser excluídos ou incorporados ao refinamento iterativo do modelo. Controle de versão rigoroso (conforme descrito no Arquivo Suplementar 3) também é necessário para a reprodutibilidade computacional, pois resultados inconsistentes podem resultar de diferenças nas dependências dos programas.

Melhorias futuras podem incluir procedimentos automatizados de calibração, estratégias de adaptação de domínio para aprimorar a generalização do modelo em condições experimentais e integração de aprendizado auto-supervisionado para reduzir a necessidade de anotação manual. A reprodutibilidade entre laboratórios seria ainda melhorada ao padronizar o relato de parâmetros de imagem, fatores ambientais e configurações de treinamento de modelos. Quando considerados como um todo, esses fatores destacam as vantagens e desvantagens da quantificação comportamental baseada em aprendizado de máquina e oferecem um roteiro para aprimorar ainda mais as abordagens de estimativa de postura nos estudos de comportamento social da Drosophila .

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	BioFroxx	8211GR500
camera(MV-CU013-A0UC)	Hikvision	MV-CU013-A0UC
Carbon Dioxide	Messer	124-38-9
D(+)-Glucose anhydrous	BioFroxx	1179GR500
Drosophila Narrow Vials (Falcon tube)	Biolgix	51-0500
Ethanol	Chron Chemicals	64-17-5
LED panel	/	/	feito sob encomenda
Methylparaben	Sigma	99-76-3
polyethylene plate	/	/	feito sob encomenda
Python	/	versão 3.6
Sucrose	DaMao	57-50-1
transparent acrylic plates	/	/	feito sob encomenda
Yeast	Angel	100004237033