Produção em Larga Escala de Vesículas Extracelulares a partir de Culturas Celulares 3D de Alta Densidade em Biorreatores de Perfusão de Fibras Ocas

Resumo

São fornecidas instruções para montar e usar um biorreator de fibras ocas de perfusão 3D para produção de vesículas extracelulares a partir de MSC e outros tipos celulares. Esse protocolo descreve um método para produzir vesículas extracelulares em altas concentrações de forma contínua, enquanto se controla a densidade celular em biorreatores de fibras ocas.

Resumo

O progresso no campo da pesquisa com exossomos é dificultado pelo pequeno número celular e pela baixa produtividade dos exossomos secretados na cultura tradicional de células 2D. Culturas celulares de alta densidade em biorreatores de fibras ocas (HFBRs) permitem a produção contínua de biomoléculas secretadas e vesículas extracelulares (EVs), a partir de grandes números de células, por períodos prolongados e em altas concentrações em cultura 3D. Este protocolo descreve a coleta de exossomos secretados concentrados, mantendo a massa celular ideal e condições de cultura de perfusão 3D que apoiam o crescimento celular de alta densidade durante várias semanas ou meses de produção contínua em um HFBR comercialmente disponível. O sistema é compacto, fechado, de uso único, pode ser compatível com cGMP, simples de usar e cabe em uma incubadora padrão de^CO2 . Certas células, como as células-tronco mesenquimatosas (MSCs) e as células-tronco do líquido amniótico humano (HAFSCs), podem apresentar redução da proliferação nessas condições, potencialmente influenciando a diferenciação e o fenótipo ao longo do tempo. Resultados representativos demonstram rendimentos típicos de EV e viabilidade celular ao longo de semanas ou mais de produção contínua. Esse método fornece colheitas de veículos elétricos reprodutíveis e de alta qualidade, adequadas tanto para aplicações de pesquisa quanto clínicas.

Introdução

As vesículas extracelulares são cada vez mais reconhecidas por seus papéis na comunicação intercelular e aplicações terapêuticas, incluindo medicina regenerativa. Métodos tradicionais de cultura celular 2D são laboriosos e de rendimento limitado, às vezes exigindo centenas de frascos de cultura para obter EVs suficientes para experimentos ou estudos^{com animais 1,2}. A escala de tradução clínica geralmente utiliza biorreatores tradicionais agitados usando microtransportadores ou outros suportes. Esses sistemas são inerentemente não fisiológicos, ineficientes e podem ter resultados variáveis. Biorreatores de fibras ocas fornecem um ambiente tridimensional baseado em perfusão que suporta culturas celulares de alta densidade dentro de uma área compacta e em uma escala potencialmente apropriada para aplicações^{clínicas 3,4}.

Os HFBRs oferecem um sistema compacto de cultura celular de alta densidade, permitindo a produção contínua de EVs concentrados com menor mão de obra, tempo e espaço em comparação com a cultura tradicional^{2D 5}. Eles possibilitam culturas celulares de alta densidade em um espaço compacto, apoiando a produção em grande escala de veículos elétricos em qualquer laboratório. HFBRs cultivam grandes quantidades de células (1X10⁹ a 1×10¹⁰) em um pequeno volume (20–60 mL), em uma incubadora padrão de_CO2 , e não requerem equipamentos especializados. Esses sistemas permitem colheitas contínuas e concentradas de EVs ao longo de semanas ou meses, ao mesmo tempo em que facilitam o uso de soro reduzido ou meios definidos quimicamente. Em um HFBR, as células são retidas no pequeno volume do espaço capilar extra (ECS), separado do meio recirculante por uma membrana de fibras ocas semipermeáveis de corte de peso molecular definido (MWCO) (Figura 1). Pequenas moléculas como glicose e lactato podem facilmente atravessar as fibras, enquanto elementos maiores, como anticorpos ou vesículas extracelulares, são retidos e concentrados no ECS, onde podem ser colhidos.

Três características fundamentais diferenciam a cultura celular de fibras ocas de qualquer outro método: 1) a alta relação área superficial/volume (200 cm²/mL) permite densidades celulares in vivo, 1–2 ×^{10 8}células por mL. 2) As células estão ligadas a um suporte poroso, não a um prato plástico não poroso. A divisão de células não é necessária³. O corte de peso molecular (MWCO) da fibra pode ser controlado. Os produtos secretados são retidos e concentrados 10–100X em comparação com a cultura de frascos 2D dentro do ECS do cartucho. Além disso, matrizes proteicas específicas, como fibronectina ou colágeno, podem ser facilmente aplicadas na superfície da fibra sem afetar o fluxo através das fibras.

O HFBR oferece um ambiente de cultura baseado em perfusão 3D, mais semelhante ao in vivo do que a cultura^{2D 6}, reduzindo de forma única a dependência das células do suporte sérico e simplificando suas necessidades de meio. Esse ambiente de cultura de alta densidade pode suportar diferenças no processamento de proteínas em comparação com a cultura 2D, além de relatar aumento da bioatividade ^{dos EVs 7,8,9}. Biorreatores de fibra oca são "histocêntricos"; Eles tentam imitar as propriedades semelhantes aos tecidos da fisiologia celular in ^{vivo 10}. As duas características principais de um biorreator histocêntrico são 1) alta densidade celular, permitindo que as células gerem seu próprio microambiente específico, e 2) não é necessário o desmembramento ou passagem das células, permitindo que interações célula a célula e estruturas 3D como esferoides se desenvolvam organicamente ao longo do tempo. Esse método permite densidades celulares difíceis de alcançar com sistemas convencionais de cultura 2D e pode facilitar o uso de meios simplificados, livres de proteínas e definidos quimicamente.

Qualquer tipo de célula que possa ser cultivada em frascos pode ser cultivada em um biorreator de fibras ocas. Linhagens celulares transformadas serão^{proliferativas 11}. O parâmetro chave a ser monitorado é a taxa de absorção de glicose. O monitoramento de glicose fornece uma medida direta da atividade metabólica, permitindo otimização do momento da colheita e controle da densidade^{celular 12}. É importante controlar a massa celular dentro do cartucho para que a taxa de absorção de glicose não exceda a capacidade do sistema de fornecer oxigênio e remover o^CO2. Isso é feito simplesmente removendo a massa celular durante a colheita. MSCs e HAFSCs não proliferam no biorreator de fibras ocas, mas permanecem em repouso (quiescentes). Essas células precisam de expansão antes de serem semeadas no biorreator. No entanto, uma vez estabelecida a cultura, os VE podem ser colhidos continuamente por semanas ou meses. O fenótipo MSC não muda ao longo de 30 dias de cultivo, exceto talvez pela expressão do CD105, que diminui nesse período. Quando as MSCs do biorreator foram posteriormente placadas em um frasco com meio contendo soro, a expressão do CD105 retornou aos níveis^{iniciais 13}. A expressão do CD105 pode servir como marcador para a cultura vs. 3D 2D. Técnicas de transfecção transitória também podem ser usadas para criar um¹⁴ transfectante quase estável.

Exemplos das condições e vantagens de cultura celular mais in vivo da cultura celular de fibras ocas 3D incluem modificações pós-traducionais completas e uniformes ao longo do^{tempo 15,16}, formação de vilosidades por epitélio gástrico para a cultura de criptosporídio¹⁷, fígado^{3D 18}, barreira hematoencefálica 3D^{modelo 19}, formação²⁰ de esporozoito de plasmodium e co-cultivo de medula óssea/células-tronco²¹.

No HFBR, os EVs são altamente concentrados, com redução da contaminação por proteínas intracelulares e fragmentos de membrana, já que a lise celular é limitada. Biorreatores de fibras ocas são compatíveis com qualquer meio, desde que não haja componentes de alto peso molecular que não cruzem as fibras. Se necessário, essas moléculas grandes podem ser adicionadas diretamente ao ECS do biorreator. Meios com alto teor de glicose, como DMEM, são preferidos. Meios de cultivo celular menos complexos e livres de proteínas podem simplificar a purificação ao reduzir a carga proteica. Células-tronco mesenquimatosas e células-tronco do líquido amniótico humano foram cultivadas em meios basais padrão e FBS, bem como em várias formulações comerciais de meios MSC. O HFBR pode produzir quantidades de gramas de exossomos usando cartuchos prontos para uso. Um biorreator de fibra oca é um método útil para a produção em larga escala de exossomos sob condições potenciais de cGMP e representa uma mudança de paradigma no avanço tanto da pesquisa com exossomos quanto da tradução clínica.

O uso bem-sucedido de um biorreator de fibra oca para a produção de vesículas extracelulares é altamente específico do protocolo. A manipulação do biorreator, densidade de semeadura celular, frequência de colheita e o meio utilizado podem contribuir para uma operação bem-sucedida do biorreator. Esse protocolo descreve um método padronizado para usar um biorreator de fibra oca para produzir e coletar vesículas extracelulares de culturas celulares de alta densidade. O objetivo é fornecer uma abordagem reprodutível para a colheita de VE, incluindo orientações sobre configuração do sistema, inoculação celular, manutenção da cultura e procedimentos de colheita. O método tem como objetivo apoiar a produção consistente de VE para aplicações de pesquisa e fornecer uma estrutura que possa ser adaptada para diferentes tipos celulares e objetivos experimentais.

Protocolo

Todos os procedimentos seguem as diretrizes padrão de Boas Práticas Laboratoriais (GLP) e Boas Práticas de Cultura Celular e de Tecidos.

NOTA: O cartucho é pré-montado e esterilizado por gama. É dupla embalada, e as tampas de luer estão em cada conexão, então fica completamente selada e permanecerá estéril do lado de fora dos sacos. Veja a Figura 2 para identificação da porta do cartucho. Todos os passos foram realizados em temperatura ambiente em um exaustor de fluxo laminar.

1. Preparação e esterilização da Tampa do Reservatório.

1. Remova os dois pedaços curtos de tubo do cartucho com dois sacos.
2. Prenda o tubo às farpas da mangueira no tubo de aço inoxidável da tampa do reservatório.
3. Envolva o tubo curto e as extremidades expostas do tubo de aço inoxidável com papel alumínio para manter a esterilidade após o autoclav. Coloque os componentes montados em uma bolsa de autoclave.
4. Autoclave usando um ciclo seco a 121 °C por 15–30 minutos. Deixe a tampa esfriar até a temperatura ambiente antes de usar.

2. Anexe o cartucho de fibra oca à garrafa reservatório

1. Transfira 50 mL de PBS de uma garrafa de 1 L para um tubo cônico de 50 mL para uso posterior.
2. Remova a tampa do reservatório do saco do autoclave e remova o papel protetor dos tubos longos de aço.
3. Remova a tampa da garrafa PBS e rosqueie a tampa do reservatório em seu lugar. Retire o cartucho do saco estéril interno.
4. Remova o papel alumínio de um dos pedaços de tubo no topo da tampa do reservatório.
5. Remova a tampa luer de um dos pedaços longos do tubo do cartucho e prenda-a ao tubo do reservatório na tampa do reservatório. Use um pouco de backspin para evitar dobras de torta.
6. Repita para a segunda conexão do tubo.
7. Esprema suavemente o tubo marrom da bomba para conduzir PBS pelo sistema até que todas as bolhas de ar sejam removidas.

3. Preenchimento do espaço capilar extra (ECS)

1. Extrair 20 mL de PBS em uma seringa estéril usando uma agulha de calibre grande com pelo menos 1,5" de comprimento; A agulha cega é preferida para segurança.
2. Desinfete ambas as conexões de luer da porta lateral com álcool e deixe-as secar.
3. Conecte a seringa cheia de PBS em uma das portas laterais e uma seringa estéril vazia na porta oposta. Feche as duas portas finais e abra as duas portas laterais.
4. Injete lentamente PBS no ECS enquanto segura o cartucho em um leve ângulo para minimizar bolhas de ar. A seringa vazia no porto do lado oposto vai se encher de ar.
5. Se houver ar presente no ECS, abra a porta da extremidade direita e retire o fluido para a seringa vazia até que o ECS seja preenchido com líquido (isso puxa PBS do recipiente reservatório, passa pelas fibras e entra no ECS).
6. Feche as duas grampos laterais do ferrolho, abra as das duas extremidades e verifique o fluxo comprimindo suavemente o tubo da bomba com os dedos.
7. Deixe as seringas vazias presas às portas laterais para servir como tampas. Troque as seringas por novas toda vez que elas estiverem fora do exaustor de fluxo laminar.

4. Revestir fibras e inoculação celular

NOTA: Os procedimentos para revestir fibras com uma proteína matriz específica e para inocular células são essencialmente os mesmos. O excesso de líquido fluirá pelas fibras e entrará no reservatório, enquanto as células ou o material de revestimento permanecerão do lado de fora das fibras no ECS. 1 × 10 10^{8 células} para semeadura são recomendadas. Recomenda-se 100–500 μg de proteína matricial em 20 mL de PBS para o HFBR de 4.000^cm. Proteínas matricial ligadas às superfícies das fibras não afetam o MWCO

1. Prepare solução de revestimento ou suspensão de células em um tubo cônico estéril de 50 mL. 1 x 108 células em meio condicionado a partir de expansão em frascos ou proteína matriz de 100–500 ug em PBS. Volume 20 mL.
2. Retire 20 mL de células ou solução de revestimento em uma seringa estéril usando uma agulha de calibre grande.
3. Prenda a seringa contendo a solução em uma porta lateral e uma seringa estéril vazia na outra porta lateral.
4. Feche as duas portas finais e abra as duas portas laterais.
5. Misture suavemente a solução transferindo o fluido entre as duas seringas. Deixe metade da solução em cada seringa. Feche as duas portas laterais.
6. Abra a porta da extremidade direita e afrouxe a tampa do reservatório 1/4 de volta.
7. Injete a solução de uma seringa no ECS. Feche a porta lateral conectada.
8. Injete a solução da outra seringa. Feche a porta lateral conectada. Abra as duas portas das extremidades.
9. Se inocular células, deixe o cartucho na horizontal por 30 minutos à temperatura ambiente, depois gire 180° ao longo do eixo longo e deixe repousar por mais 30 minutos.
   1. Se revestir as fibras com proteína matricial, deixe durante a noite em temperatura ambiente.
10. Coloque o cartucho no sistema de bomba Duet e inicie o fluxo a 25.

5. Preparação para a colheita (ver Figura 2)

1. Conecte uma seringa estéril vazia com uma torneira de 3 vias e filtro estéril na porta do lado direito.
2. Ajuste a torneira de 3 vias para permitir a ventilação pelo filtro estéril. Conecte uma segunda seringa estéril vazia na porta lateral esquerda.

6. Coleta de meio condicionado (Colheita)

1. Abra a porta do lado direito e mantenha a ventilação estéril através do filtro.
2. Incline a extremidade direita do cartucho para cima e retire o meio condicionado (produto) para dentro da seringa esquerda. Drene completamente o conteúdo do ECS para a seringa esquerda.
3. Feche a porta direita. Feche a porta lateral esquerda, retire a seringa e recolha a colheita em um tubo cônico de 50 mL.
4. Troque a seringa na porta do lado esquerdo. Abra a porta do lado esquerdo. Abra a porta da extremidade direita.
   Desrosqueie a tampa do reservatório por 1/4 de volta.
5. Incline a extremidade esquerda do cartucho para cima e encha o ECS retirando a seringa conectada à porta lateral esquerda. Encha completamente o ECS até que o menisco líquido fique no meio do tubo da porta lateral.
6. Feche a porta da extremidade direita. Abra a porta do lado direito e ajuste a torneira de 3 vias para ventilar pelo filtro.
7. Abra a porta do lado esquerdo. Incline o cartucho para a direita e drene completamente o ECS para a seringa esquerda.
8. Feche a porta do lado esquerdo. Retire a seringa e recolha o ECS colhido no tubo cônico de 50 mL.
9. Coloque a seringa na porta do lado esquerdo. Feche a porta direita. Abra a porta da extremidade direita
10. Incline o lado esquerdo do cartucho para cima e encha o ECS retirando a seringa esquerda. Encha completamente o ECS até que o menisco líquido fique no meio do tubo da porta lateral.
11. Feche a porta do lado esquerdo. Abra a porta da extremidade esquerda. Aperte a tampa do reservatório.
12. Confirme o fluxo do sistema comprimindo manualmente o tubo da bomba antes de retornar o cartucho à bomba Duet.

7. Insira o biorreator no sistema de bomba.

1. Ajuste a vazão da bomba para 25 na caixa de controle. O cartucho é mais fácil de instalar enquanto a bomba está funcionando.
2. Segure a borda direita do suporte do caminho de fluxo. Deslize o tubo da bomba dentro do tubo da bomba.
3. Deslize a base do caminho de fluxo para dentro da ranhura na base da bomba. Certifique-se de que o registro retangular encaixe no recorte do suporte do caminho de fluxo.
4. Coloque a garrafa do reservatório na reentrância lateral da base da bomba.
5. O cabo fino para alimentação vai caber entre a junta da incubadora. A caixa de controle possui um ímã para fixá-la na lateral da incubadora.

8. Monitorar os níveis de glicose

1. Usando uma pipeta de 1 mL, retire uma amostra de 1 mL de meio do frasco reservatório.
2. Meça a concentração de glicose usando um medidor compatível colocando uma pequena gota do meio amostrado na fita de teste do medidor.

9. Cálculo da taxa de absorção de glicose

NOTA: A taxa de absorção de glicose é calculada subtraindo a medição de glicose 24 horas depois da medição inicial de glicose. Como a taxa depende do volume do reservatório, multiplique a queda na concentração de glicose pelo volume do reservatório em litros. Por exemplo, se houver 250 mL na garrafa do reservatório, multiplique por 0,25 (25%). (Glicose1-Glicose2) X (garrafa reservatório em litros). 250 mL equivale a 0,25 L. Se mais de um dia se passou, divida isso pelo número de dias. Por exemplo: Começar a tomar 4,5 g/L de glicose; medir a glicose 24 h depois: 2,7 g/L; garrafa do reservatório: 250 mL. 4,5-2,7=1,8 g. 1,8X,25 (a garrafa do reservatório é 0,25 L), 0,45 g de glicose consumida. A taxa de captação de glicose é de 450 mg/dia.

10. Verificação de Viabilidade

1. Colete uma pequena amostra de células utilizando o protocolo de colheita.
2. Placar as células em um frasco de cultura T 25 com um meio sérico fresco de 10%. Avalie visualmente o apego e a viabilidade.

11. Manutenção diária do cartucho e a primeira semana de cultivo.

NOTA: Durante a primeira semana de cultivo, as células proliferativas estarão expandindo para atingir sua taxa alvo de 1–2 gramas de glicose consumida por dia.

1. Dia 0: Inocular as células, determinar a concentração inicial de glicose a partir da formulação do meio. Volume inicial do reservatório: 125 mL.
2. Dias 1-2: Meça a glicose todos os dias. Quando a glicose inicial estiver esgotada em 50%, substitua o reservatório de 125 mL por meio fresco de 250 mL e reduza o soro para 7,5%.
3. Dias 3-4: Meça a glicose. Quando a glicose inicial estiver esgotada em 50%, substitua o reservatório de 250 mL por meio fresco de 500 mL e reduza o soro para 5%.
4. Dias 4-5: Meça a glicose. Quando a glicose inicial estiver esgotada em 50%, substitua 500 mL por 1L de meio fresco. Reduza o soro para 2,5% e troque para substratos quimicamente definidos, se desejar.
5. Dia 6+: Mede glicose, colhe o ECS. Controle a densidade celular colhendo para manter a captação de glicose entre 1 e 2 gramas por dia.
6. Para células não proliferativas, comece com 125 mL no frasco reservatório e troque o meio a cada 3 dias.
7. Se houver consumo significativo de glicose, aumente o reservatório para 250 mL. Retire o soro do ECS nos dias 3-4 e substitua por meio basal.

Resultados

Seguindo esse protocolo, um cartucho² de 4.000 cm com linhagens celulares proliferantes normalmente consome 1–2 g de glicose por dia. Isso se traduz em 1 L de meio a cada 2–3 dias quando se usa um meio de alta glicose, como DMEM. As células atingem a densidade máxima dentro de uma semana após a semeadura. A colheita deve começar após 5–7 dias ou quando a taxa de absorção de glicose atingir 1 g por dia e deve ser realizada diariamente, se possível. Durante essa primeira semana de cultura, o meio contendo soro no ECS pode ser substituído por meio basal sem soro, mantendo o soro no meio circulante, caso seja necessário. Quando a taxa de absorção de glicose atingir 1 g/dia, você pode facilmente trocar para meios séricos reduzidos ou outros meios definidos quimicamente. MSCs e HAFSCs consomem glicose em uma taxa muito menor do que linhas celulares transformadas, como CHO, 293 ou higidomas. A formação de esferoides é típica da MSC e da HAFSC, juntamente com outros tipos celulares (Figura 3). O monitoramento diário da glicose fornece uma medida confiável da saúde da cultura e da atividade metabólica. Mídias padrão e comercialmente livres de xeno têm sido usadas com sucesso com MSC e HAFSC. Os volumes de colheita são cerca de 20 mL. Intervalos de 24 horas entre as colheitas são ideais, pois as concentrações de EV atingem o máximo após 24 horas (Figura 4). As concentrações típicas de exossomos em meio colhido variam de 1–5 × 10^{a 12} partículas/mL, dependendo do tipo de célula, número de semeadura celular e outros fatores, podendo resultar em pellets visíveis após centrifugação (Figura 5). Grandes quantidades de células podem ser semeadas e devem ser baseadas no número de células, não na área de cultivo (Figura 6).

Os resultados demonstram que a produção de VE está correlacionada com a atividade metabólica medida pelo consumo de glicose, fornecendo um parâmetro prático para monitorar e otimizar o desempenho da cultura. A colheita diária em intervalos de 24 horas maximiza a concentração de EV enquanto mantém a estabilidade da cultura. Esses achados apoiam o uso do monitoramento de glicose e da frequência controlada de colheita como parâmetros-chave para a produção reprodutível de VE em biorreatores de fibras ocas.

Figura 1: Seção transversal do biorreator de fibra oca. O meio flui pelo interior das fibras, e as células se fixam em suas partes externas. Componentes de pequeno peso molecular, como glicose e lactato, podem facilmente cruzar as fibras. Produtos secretados, como os EVs, não conseguem cruzar as fibras e se tornam altamente concentrados na área externa às fibras, chamada ECS (espaço extracapilar). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Foto do cartucho com portas e grampos identificados. Válvulas de retenção unidirecionais no caminho do fluxo geram um fluxo de recirculação do meio. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Células-tronco mesenquimatosas, células-tronco do líquido amniótico humano, progenitores cardíacos e alguns outros tipos celulares formam esferoides quando semeados no cartucho em quantidade suficiente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Medição das concentrações de EV após colheitas em intervalos de tempo diferentes. Após 24 horas, a concentração de EV atinge uma concentração máxima. A colheita ótima ocorre após 24 horas. (Dados cortesia de Paolo Neviani, núcleo EV, Hospital Infantil de Los Angeles). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Colheita de uma semana de EVs de células DIFI cultivadas no biorreator de fibra oca C2011. EVs isolados por centrifugação diferencial. (dados cortesia de Jeff Franklin, Universidade Vanderbilt)^18,19. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Um número surpreendentemente grande de células pode ser semeado no biorreator de fibras ocas. Os MSCs ocupam grande parte da cultura 2D; quando cultivados como esferoides na cultura 3D, ocupam menos espaço. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Biorreatores de fibras ocas não conseguem fabricar proteínas ou anticorpos razoavelmente em quantidades comerciais reais. No entanto, eles têm uma capacidade única de cultivar um número relativamente grande de células em alta densidade e secretar um produto concentrado de EV em uma escala clinicamente relevante. Somente nos últimos anos as verdadeiras vantagens de um biorreator histocêntrico foram reconhecidas. As condições de cultura de perfusão de alta densidade resultam em EVs concentrados, utilizando meios compatíveis com cGMP, em quantidades que podem ser adequadas para pesquisa e aplicações clínicas potenciais. Uma única colheita de um² de 4.000 cm pode conter 5 × 10¹² a 1 × 10¹⁴ EVs em um volume de 10 a 20 mL. Esses rendimentos estão dentro da faixa relatada em estudos que avaliam a dosagem de EV²².

O monitoramento diário da taxa de absorção de glicose é um parâmetro importante para avaliar o desempenho da cultura e é um indicador direto do metabolismo celular, número de células e saúde. Geralmente, meios com glicose mais altos são preferidos, como o DMEM, que tem uma concentração inicial de glicose de 4,5 g/L. O meio deve ser trocado para meio fresco quando a glicose estiver consumida em 50%. Certas células, como as MSCs, parecem consumir glicose e produzir lactato em concentrações acima de 3 g/L, depois passam a consumir glutamina e produzir amônia em concentrações abaixo de 3 g/L. O perfil metabólico completo das MSCs em cultura 3D ainda não foi realizado.

O parâmetro mais crítico para uma cultura de biorreator bem-sucedida é o número de inoculação celular. O número mínimo de células de inoculação para um biorreator²C2011 de 4.000 cm é 1 × 10⁸ células. Para células não proliferantes, como MSC ou HAFSC, prefere-se um número maior, até 1 × 10⁹ células no total. O volume do reservatório deve ser proporcional ao número de células no cartucho. 1 × 10⁸ células devem usar um reservatório no máximo 125 ml. 1 × 10^{9 células devem} ter reservatório no máximo 1 L. Um reservatório muito grande pode levar as células para a fase de lag. Isso é caracterizado pela ausência de consumo de glicose pelas células, mesmo que sejam viáveis, conforme determinado pela coloração com Trippan Blue. Nesse caso, reduza o volume do reservatório ou semeie mais células. Podem ser necessárias inoculações múltiplas para obter números suficientes de células para uma cultura eficaz de biorreator. Basta semear mais células sobre as células já presentes no cartucho. Ao avaliar o desempenho do biorreator, observe o tamanho do inoculo celular. Um aumento de 10 vezes na semeadura de células pode resultar em uma produção de EVs 10 vezes maior.

Modificações no protocolo podem incluir alterações nas formulações do meio, revestimentos superficiais, número de células, volume de colheita, frequência de colheita ou tamanho da seringa, dependendo do tipo de célula e do rendimento desejado. A cultura contínua permite otimização fácil e em tempo real das condições, pois mudanças podem ser feitas durante a cultura e os resultados obtidos em tempo^{real 21}. A solução de problemas deve focar em manter a esterilidade e monitorar a atividade metabólica. Certifique-se de que não haja obstruções ou dobras no tubo, especialmente ao redor das grampos do ferrolho. A contaminação bacteriana resultará em consumo rápido de glicose e turvam na garrafa do reservatório. A contaminação fúngica é indicada por um acúmulo branco e fofo na extremidade esquerda do cartucho, bloqueando o fluxo. O uso do sistema de biorreator de fibra oca exige manuseio habilidoso e rigorosa adesão aos protocolos. Passos críticos incluem semear o número correto de células, manter a esterilidade durante a colheita e monitorar cuidadosamente o consumo de glicose para evitar crescimento excessivo ou esgotamento de nutrientes. A maioria das células se liga às fibras, às vezes dependendo da matriz proteica revestida de fibronectina, que facilita a rápida fixação celular. Algumas células, como MSCs, HAFSCs e progenitores cardíacos, permanecem ligadas às fibras e formam esferoides 3D.

O sistema HFBR suporta culturas de alta densidade, quimicamente definidas e livres de xeno da maioria dos tipos celulares, facilitando a produção em larga escala de EV²³. O monitoramento diário de glicose fornece uma métrica confiável para o desempenho do biorreator. O sistema fechado, baseado em perfusão, é compatível com os padrões cGMP, e a ampliação é possível usando cartuchos maiores ou até múltiplos. A produção de veículos elétricos em escala gramada pode ser possível sob condições otimizadas. O biorreator de fibra oca oferece uma plataforma reprodutível para produção e coleta sustentada de veículos elétricos sob condições controladas. O protocolo aqui descrito enfatiza considerações práticas, incluindo configuração do sistema, manuseio asséptico e monitoramento metabólico, para apoiar operação consistente e resultados confiáveis. Estudos adicionais podem ser necessários para avaliar as características e propriedades funcionais dos VE sob diferentes condições de cultura e para comparar o desempenho com sistemas de produção alternativos.

Esse método é amplamente aplicável para pesquisa e produção clínica de veículos elétricos, incluindo medicina regenerativa e aplicações terapêuticas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
16 gauge 1.5" needle	Stellar Scientific	SOLM-111615
3-way stopcock, sterile	Cole-Parmer	UX-48523-28
20mL luer lock syringe	Becton Dickenson	302830
25mL serological pipette, sterile	Stellar Scientific	TC50-TAU-25
25mm syringe filter, sterile	Thomas Scientific	1162B74
38 mm reservoir cap	FiberCell Systems	A1006
50 mL conical centrifuge tubes	Stellar Scientific	T50-101-PK
500 mL Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
CVS Sterile Alcohol Prep Pads, 480 CT	CVS Pharmacy	Item # 376560
Hollow fiber bioreactor	FiberCell Systems	C2011
Human Fibronectin, 1 mg	Corning	354008