Este estudo investigou se a acupotomia promove a reparação da cartilagem em um modelo de osteoartrite do joelho em coelhos. Cinquenta coelhos foram distribuídos em cinco grupos. A acupotomia foi administrada semanalmente durante 4 semanas. Foram avaliadas a inflamação articular, a histopatologia, as citocinas inflamatórias e os marcadores relacionados ao eixo circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK para explorar o mecanismo subjacente.
Artigo de investigação
A acupotomia regula o eixo RIC8A/P38 MAPK baseando-se no arcabouço de circRNA para promover a reparação da cartilagem na osteoartrite do joelho
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A osteoartrite do joelho (OJ) caracteriza-se pela degeneração progressiva da cartilagem e inflamação. Este estudo investigou os efeitos terapêuticos da acupotomia em um modelo de OJ em coelhos e sua associação com o eixo de sinalização do RNA circular fosfodiesterase 4B (circPDE4B)/resistência aos inibidores da colinesterase 8A (RIC8A)/quinase de proteína ativada por mitógeno p38 (MAPK). Cinquenta coelhos da raça Nova Zelândia Branca foram aleatoriamente distribuídos em cinco grupos (n = 10 por grupo): controle, modelo de OJ, celecoxibe, acupotomia e acupotomia simulada. A OJ foi induzida utilizando o método modificado de Videman. A partir de seis semanas após a indução do modelo, a acupotomia foi administrada uma vez por semana durante 4 semanas, enquanto o celecoxibe foi administrado diariamente por gavagem na dose de 24 mg/kg durante 4 semanas. Foram avaliadas a inflamação articular e a histopatologia da cartilagem. Os níveis de interleucina-1β (IL-1β), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) em homogenatos de tecido cartilaginoso foram medidos por ensaio imunoenzimático (ELISA). A expressão gênica e proteica associada ao metabolismo da cartilagem e ao eixo circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK foi avaliada por reação de transcrição reversa quantitativa em cadeia da polimerase e por Western blotting. Em comparação com o grupo modelo de OJ, a acupotomia reduziu a inflamação articular, melhorou os escores histopatológicos, diminuiu os níveis de citocinas inflamatórias, reduziu a expressão da metaloproteinase da matriz-3 (MMP-3), metaloproteinase da matriz-13 (MMP-13), RIC8A e p38 MAPK fosforilada, e aumentou a expressão do fator de transcrição SRY-box 9 (SOX9), agreglicano e circPDE4B relativo. Seus efeitos foram comparáveis aos do celecoxibe, enquanto a acupotomia simulada não produziu melhora significativa. Esses achados indicam que a acupotomia atenua a inflamação e a degeneração da cartilagem na OJ em coelhos e está associada à modulação do eixo circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK.
Introdução
A osteoartrite do joelho (OJ) é uma doença articular degenerativa prevalente, caracterizada pela degradação progressiva da cartilagem, inflamação sinovial, esclerose óssea subcondral e formação de osteófitos1,2,3. Com o envelhecimento da população mundial, a incidência de OJ continua a aumentar, tornando-se uma das principais causas de disfunção articular e dor crônica entre adultos de meia-idade e idosos em todo o mundo4,5,6. Os tratamentos clínicos atuais focam-se principalmente no alívio dos sintomas por meio de agentes farmacológicos, como drogas anti-inflamatórias não esteroides (AINEs) e injeções intra-articulares de corticosteroides. No entanto, as terapias modificadoras da doença capazes de interromper a progressão da enfermidade ou promover a reparação da cartilagem ainda são limitadas7,8.
Evidências emergentes destacaram os importantes papéis reguladores dos RNAs não codificantes (ncRNAs) na patogênese e progressão da OA9,10,11. Dentre esses ncRNAs, os RNAs circulares (circRNAs) têm atraído crescente atenção devido à sua estrutura única em alça covalentemente fechada, que confere maior estabilidade em comparação aos RNAs lineares, além de suas diversas funções biológicas12,13. Shen et al. relataram que o circPDE4B atua como um arcabouço molecular que regula a resistência aos inibidores da via de sinalização da resistência à colinesterase 8A (RIC8A)/p38 mitógeno-ativada por proteína quinase (MAPK), influenciando assim o metabolismo da matriz extracelular e as respostas inflamatórias dos condrocitos14. A via RIC8A/p38 MAPK desempenha um papel importante na regulação da inflamação, catabolismo, apoptose e senescência nos condrocitos, processos que contribuem todos para a patogênese da osteoartrite15.
A acupotomia é uma abordagem terapêutica minimamente invasiva que integra a teoria da medicina tradicional chinesa com princípios anatômicos modernos e demonstrou eficácia promissora no tratamento clínico da OA de joelho16,17. Esta técnica utiliza um dispositivo especializado em forma de agulha-lâmina para liberar aderências nos tecidos moles, melhorar a circulação local e restaurar o equilíbrio biomecânico ao redor das articulações afetadas, aliviando assim a dor e melhorando a função em pacientes com OA de joelho18. Apesar desses benefícios clínicos relatados, os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos terapêuticos da acupotomia, particularmente sua possível regulação de vias de sinalização mediadas por circRNA envolvidas na reparação da cartilagem, permanecem amplamente inexplorados.
Mecanicamente, a acupotomia gera estímulos mecânicos locais por meio da liberação do tecido mole periarticular. Os condrócitos são células mecanossensíveis que respondem a sinais biomecânicos, e demonstrou-se que os circRNAs participam das respostas de mecanotransdução dos condrócitos19,20. Embora não haja evidências diretas associando a acupotomia à regulação de circRNAs específicos da cartilagem articular, é biologicamente plausível que os sinais mecânicos gerados pela acupotomia possam modular circRNAs mecanossensíveis, como o circPDE4B. Essa possibilidade constituiu a base da presente investigação.
Com base em descobertas anteriores sobre o papel regulador do circPDE4B no eixo de sinalização RIC8A/p38 MAPK, o presente estudo utilizou um modelo de OA em coelhos induzido pelo método modificado de Videman para testar a hipótese de que a acupotomia promove a reparação da cartilagem por meio da modulação da via de sinalização circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK. A acupotomia foi escolhida para este estudo em vez de outras intervenções para OA por várias razões. Primeiro, em comparação com agentes farmacológicos como drogas anti-inflamatórias não esteroides (AINEs) e celecoxibe, que fornecem principalmente alívio sintomático e têm sido associados a efeitos limitados na modificação da doença e eventos adversos potenciais a longo prazo7,8, a acupotomia oferece uma abordagem não farmacológica que atua tanto sobre fatores mecânicos locais quanto sobre vias de sinalização biológica. Segundo, ao contrário das injeções intra-articulares de corticosteroides ou ácido hialurônico, que exigem administração intra-articular repetida e trazem riscos de infecção e lesão articular, a acupotomia direciona-se aos tecidos moles periarticulares e pode exercer efeitos biomecânicos e bioquímicos sustentados21. Terceiro, evidências clínicas demonstraram que a acupotomia produz resultados comparáveis ou superiores às terapias convencionais na redução da dor e na melhoria da função articular em pacientes com OA, e estudos experimentais sugeriram que a acupotomia modula as respostas inflamatórias e o metabolismo dos condrocitos21,22. No entanto, as vias moleculares específicas pelas quais a acupotomia exerce seus efeitos condroprotetores ainda não são bem caracterizadas, particularmente em relação à sinalização mediada por circRNAs. Assim, investigar a associação entre acupotomia e o eixo circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK pode fornecer novos insights mecanicistas e apoiar o uso da acupotomia como uma intervenção modificadora da doença na OA16,18. Os desfechos primários foram o inchaço da articulação do joelho, degeneração cartilaginosa histopatológica (escores de Mankin e Moran), níveis de citocinas inflamatórias (interleucina-1β, fator de necrose tumoral-α e interleucina-6), expressão de marcadores relacionados ao metabolismo da cartilagem (metaloproteinase da matriz-3, metaloproteinase da matriz-13, fator de transcrição SRY-box 9 e agregacano) e expressão de circPDE4B e RIC8A, bem como a fosforilação do p38 MAPK. A acupotomia foi administrada uma vez por semana durante 4 semanas em pontos periarticulares selecionados, utilizando a técnica de quatro etapas (liberação longitudinal, separação transversal e incisão de nódulos). A avaliação histopatológica, a medição de citocinas inflamatórias e as análises de expressão gênica e proteica foram utilizadas para caracterizar os efeitos da acupotomia e explorar sua base molecular potencial na OA.
Protocolo
Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Anhui (número de aprovação AHUCM-rabbits-2023195). Os reagentes, produtos químicos, softwares e ferramentas utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Animais experimentais e agrupamento
Cinquenta coelhos adultos machos saudáveis da raça Nova Zelândia Branca (6 meses de idade, pesando 2,0–2,5 kg) foram obtidos na Fazenda de Criação Laifu do Distrito de Pukou, Nanjing (Licença de Produção Animal nº: SCXK (Su) 2024-0007). Todos os animais passaram por um período de aclimatação de 1 semana antes do experimento. O joelho direito foi designado para avaliação do inchaço e o joelho esquerdo para coleta de tecido cartilaginoso, seguindo uma convenção procedural consistente, e não com base em uma hipótese experimental específica. Após a aclimatação, os coelhos foram aleatoriamente distribuídos em cinco grupos (n = 10 por grupo): um grupo controle, que não recebeu procedimento de modelagem nem tratamento; um grupo modelo de OAQ, no qual a OAQ foi induzida pelo método modificado de Videman; um grupo celecoxibe, no qual o tratamento com medicamento foi iniciado 6 semanas após a modelagem; um grupo acupotomia, no qual o tratamento com acupotomia foi iniciado 6 semanas após a modelagem; e um grupo placebo de acupotomia, no qual foi realizada a inserção de agulha sem corte ou soltura, iniciada 6 semanas após a modelagem.
2. Estabelecimento do modelo de AOT
Todos os coelhos, exceto os do grupo controle, foram submetidos ao procedimento modificado de Videman para induzir AOT. Os animais foram mantidos em jejum por 12 h antes da cirurgia. A anestesia foi induzida pela administração intravenosa de pentobarbital sódico a 3% na dose de 30 mg/kg através da veia marginal da orelha. Após a preparação rotineira do campo cirúrgico, desinfecção e colocação de campos estéreis, foi feita uma incisão longitudinal ao longo da face medial da articulação do joelho. O ligamento colateral medial e o ligamento cruzado anterior foram seccionados sequencialmente e o menisco medial foi completamente removido. Em seguida, a incisão foi fechada em camadas.
Para reduzir o risco de infecção pós-operatória, a penicilina foi administrada por via intramuscular na dose de 40.000 U/kg/dia durante 3 dias consecutivos. Após a cirurgia, os coelhos foram devolvidos às suas gaiolas e tiveram movimentação livre, sem imobilização articular.
3. Tratamento simulado com acupotomia
Seis semanas após a modelagem da OA, coelhos no grupo de acupotomia simulada passaram pelos mesmos procedimentos de palpação e marcação dos pontos utilizados no tratamento ativo com acupotomia. Uma agulha estéril descartável de acupotomia medindo 0,35 mm × 25 mm foi inserida perpendicularmente através da pele em cada ponto marcado até alcançar o tecido subcutâneo. Nenhuma incisão, soltura, manipulação transversal ou outra manobra de liberação mecânica foi realizada. A agulha foi retirada imediatamente após a inserção, sem manipulação do tecido. O tratamento simulado foi administrado uma vez por semana durante 4 semanas consecutivas.
4. Tratamento com acupotomia
Seis semanas após a modelagem da OA, os coelhos do grupo de acupotomia foram imobilizados em uma mesa de tratamento. Os tecidos periarticulares ao redor do joelho afetado foram palpados, especialmente ao redor da patela e dos espaços articulares medial e lateral, com o objetivo de identificar estruturas em forma de cordão ou nódulos duros. Quatro a seis pontos de tratamento foram selecionados com base nos achados da palpação e marcados na pele.
A área de tratamento foi raspada e desinfetada utilizando procedimentos estéreis de rotina. Uma agulha descartável estéril de acupotomia medindo 0,35 mm × 25 mm foi inserida lentamente e perpendicularmente em cada ponto marcado até alcançar a superfície óssea. O procedimento foi realizado de acordo com a técnica de acupotomia em quatro etapas. Primeiro foi realizada a liberação longitudinal, seguida pela separação transversal. Quando um nódulo duro foi encontrado, foi feita uma incisão até que uma sensação distinta de liberação fosse percebida através da agulha-cortante. Após o procedimento, a agulha foi retirada e cada local de inserção foi comprimido brevemente com gaze estéril e coberto com um curativo adesivo. O tratamento foi administrado uma vez por semana durante 4 semanas consecutivas.
5. Tratamento com medicamento
Aos 6 semanas após a modelagem de OAQ, coelhos do grupo celecoxib receberam suspensão de celecoxib por gavagem oral na dose de 24 mg/kg uma vez ao dia durante 4 semanas consecutivas. A suspensão foi preparada diariamente, fresca, em solução salina fisiológica. As informações do fornecedor e do catálogo estão fornecidas na Tabela de Materiais.
6. Avaliação do inchaço da articulação do joelho
Ao final do período de intervenção, correspondente a 10 semanas após a modelagem da OA de joelho, foi avaliado o inchaço da articulação do joelho. Um fio de seda macio foi enrolado ao redor da região mais inchada do joelho direito, normalmente ao nível da placa tibial. O fio foi removido e seu comprimento medido com uma régua até o milímetro mais próximo, sendo o valor registrado definido como a circunferência do joelho.
A razão de inchamento relativo foi calculada usando a seguinte equação:
7. Coleta de amostras
Ao final do período de intervenção, os coelhos foram anestesiados pela administração intravenosa de pentobarbital sódico a 3% na dose de 30 mg/kg pela veia marginal da orelha. A articulação do joelho esquerdo foi aberta com lâmina de bisturi nº 23 para expor as superfícies articulares do platô tibial e dos côndilos femorais. O tecido da cartilagem articular foi coletado dessas regiões.
Cada amostra de cartilagem foi dividida em duas partes. Uma parte foi fixada em paraformaldeído a 4% para exame histopatológico. A segunda parte foi colocada em tubos criogênicos, congelada rapidamente em nitrogênio líquido e armazenada a −80 °C até a realização das análises moleculares. Imediatamente após a conclusão de todos os procedimentos de coleta de tecidos, os coelhos foram eutanasiados por embolia aérea mediante injeção intravenosa rápida de ar pela veia marginal da orelha.
As colorações histológicas e as pontuações de Mankin e Moran foram realizadas utilizando amostras de cartilagem de todos os 10 coelhos por grupo (n = 10). Imagens representativas de hematoxilina e eosina e de Safranina O–Verde Rápido foram selecionadas de três coelhos aleatoriamente escolhidos por grupo. A imuno-histoquímica e o Western blot foram realizados utilizando amostras de três coelhos aleatoriamente selecionados por grupo (n = 3). A reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa e o ensaio imunoenzimático (ELISA) foram realizados utilizando amostras de seis coelhos aleatoriamente selecionados por grupo (n = 6). Todas as seleções de subconjuntos foram feitas aleatoriamente, sem conhecimento prévio das atribuições aos grupos.
8. Coloração com hematoxilina e eosina
O tecido cartilaginoso fixado em paraformaldeído a 4% foi descalcificado em solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) a 10% com pH 7,4 por 4 a 6 semanas. A solução descalcificante foi substituída a cada 3 dias. Após a confirmação da descalcificação por penetração com agulha, o tecido foi desidratado em uma série crescente de etanol de 70%, 80%, 90%, 95% e 100%, clarificado em xilol e embutido em parafina. O tecido embutido foi seccionado com espessura de 5 µm utilizando um micrótomo, e as seções foram montadas em lâminas de vidro.
Para coloração com hematoxilina e eosina, os cortes foram aquecidos a 60 °C por 60 min, desparafinizados em xilol com três trocas de 5 min cada e reidratados sequencialmente em etanol a 100%, 95%, 80% e 70%, seguido por água destilada. Os cortes foram corados com hematoxilina por 5 min, lavados sob água corrente por 10 min, diferenciados em ácido clorídrico a 1% preparado em etanol a 70% por 2–3 s e lavados com água destilada. Em seguida, os cortes foram corados com eosina por 2 min, lavados com água destilada, desidratados em etanol a 70%, 80%, 90%, 95% e 100%, clarificados em xilol e montados com resina neutra. A morfologia da cartilagem foi examinada e imagens representativas foram obtidas utilizando um microscópio óptico.
9. Coloração com Safranina O–Verde Rápido
As seções de cartilagem em parafina foram desparafinizadas e reidratadas conforme descrito na seção 8. As seções foram coradas com hematoxilina férrica de Weigert por 5 min e lavadas com água destilada. Em seguida, as seções foram coradas com solução a 0,05% de Verde Rápido por 3 min, lavadas brevemente em ácido acético a 1% por 10–15 s e coradas com solução a 0,1% de Safranina O por 5 min.
Após a coloração, as seções foram rapidamente desidratadas em etanol 95% e 100%, clarificadas em xilol e montadas com resina neutra. As seções coradas foram examinadas usando um microscópio óptico. A intensidade da coloração com Safranina O, que reflete o teor de proteoglicanos, foi analisada de forma semiquantitativa utilizando software de análise de imagem.
10. Pontuação histológica
Dois patologistas, que desconheciam as atribuições aos grupos experimentais, avaliaram independentemente as seções coradas utilizando os sistemas de pontuação de Mankin e Moran para avaliar o grau de degeneração da cartilagem. Antes da avaliação, todas as seções receberam códigos de identificação aleatórios. As alocações dos tratamentos não foram reveladas aos patologistas até que toda a pontuação fosse concluída23.
11. Ensaio imunoenzimático
O tecido de cartilagem congelado foi pesado, combinado com solução salina tamponada com fosfato em pH 7,4 e homogeneizado completamente em gelo. O homogeneizado foi centrifugado a 3.000 × g durante 20 min a 4 °C, e o sobrenadante foi coletado para análise. As concentrações de interleucina-1β (IL-1β), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) no sobrenadante tecidual foram medidas utilizando kits de ensaio imunoenzimático específicos para coelhos, conforme as instruções do fabricante.
12. Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa
O RNA total foi extraído de tecido cartilaginoso utilizando um método baseado em fenol–clorofórmio. Resumidamente, o tecido foi lisado em reagente de extração de RNA, e o clorofórmio foi adicionado para separar as fases aquosa e orgânica. A fase aquosa foi coletada, e o RNA foi precipitado com isopropanol, lavado com etanol 75%, seco ao ar e dissolvido em água tratada com pirocarbonato de dietila. A concentração e pureza do RNA foram medidas utilizando um espectrofotômetro.
Antes da transcrição reversa, o DNA genômico residual foi removido utilizando um reagente de eliminação de DNA genômico. O DNA complementar foi então sintetizado usando um kit de transcrição reversa, conforme as instruções do fabricante. A reação em cadeia da polimerase quantitativa foi realizada utilizando um método de detecção baseado em SYBR Green em um sistema de reação em cadeia da polimerase em tempo real. As condições de ciclagem foram as seguintes: desnaturação inicial a 95 °C por 1 min, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 20 s e hibridização e extensão a 60 °C por 1 min. Uma análise de curva de dissociação foi realizada para avaliar a especificidade da amplificação.
Os níveis de expressão da metaloproteinase da matriz-3 (MMP-3), metaloproteinase da matriz-13 (MMP-13), fator de transcrição SRY-caixa 9 (SOX9), agregana, RIC8A e circPDE4B foram medidos. β-actina foi utilizada como gene de referência interno. A expressão relativa foi calculada utilizando o método. As sequências dos primers estão fornecidas na Tabela 1.
13. Análise por Western blot
O tecido cartilaginoso foi lisado em tampão de radioimunoprecipitação suplementado com fluorureto de fenilmetilsulfonila. O lisado foi centrifugado a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C, e o sobrenadante foi coletado como a fração proteica total. A concentração proteica foi determinada utilizando um ensaio com ácido bicinconínico.
Quantidades iguais de proteína (30 µg por poço) foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecilsulfato de sódio a 10% e transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno previamente ativadas em metanol. A transferência foi realizada a 300 mA a 4 °C. Os tempos de transferência foram os seguintes: aggrecano (250 kDa) por 90 min; MMP-3 (60 kDa), RIC8A (59 kDa), SOX9 (56 kDa) e MMP-13 (52 kDa) por 50 min; e p38 MAPK (41 kDa) e GAPDH (36 kDa) por 40 min. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tris contendo Tween 20 por 2 h à temperatura ambiente. Em seguida, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra MMP-3 (1:2.000), MMP-13 (1:1.000), SOX9 (1:1.000), aggrecano (1:1.000), RIC8A (1:1.500), p38 MAPK fosforilada (1:1.000) e p38 MAPK total (1:2.000). GAPDH (1:2.000) foi utilizada como controle de carga. Após três lavagens com solução salina tamponada com Tris contendo Tween 20 (10 min cada), as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados à peroxidase do rabanete (1:20.000) por 1,2 h à temperatura ambiente. Após três lavagens adicionais, as bandas proteicas foram visualizadas utilizando um substrato de quimioluminescência aprimorado e imagens foram obtidas com um sistema de documentação de géis. As intensidades das bandas foram quantificadas utilizando o software ImageJ e normalizadas em relação a GAPDH.
14. Imunohistoquímica
Seções de cartilagem em parafina foram desparafinizadas e reidratadas em uma série de etanol progressivo (três mudanças de xilol, 5 min cada; seguidas por etanol a 100%, 95% e 80%, 3 min cada). A recuperação de antígenos foi realizada aquecendo as seções em tampão de EDTA (pH 9,0) em uma panela de pressão. O tampão foi aquecido até fervura, e após a pressurização, a recuperação foi mantida por 2 min, seguida de resfriamento à temperatura ambiente. A atividade de peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 3% por 10 min à temperatura ambiente. Após lavagem, a ligação inespecífica foi bloqueada com soro de cabra por 20 min à temperatura ambiente no escuro.
As seções foram incubadas com anticorpos primários contra p38 MAPK fosforilada (1:800) e fator nuclear kappa B (NF-κB) fosforilado (1:300) por 60 min a 37 °C. Após três lavagens com solução salina tamponada com fosfato contendo Tween 20, as seções foram incubadas com os anticorpos secundários conjugados à peroxidase do rabo-de-cavalo apropriados por 30 min a 37 °C. Após mais três lavagens, a diaminobenzidina foi utilizada para o desenvolvimento da coloração (controlado ao microscópio), seguido de contracoloração com hematoxilina (2 min), diferenciação em ácido clorídrico a 1% em etanol a 70% e realce em solução de carbonato de lítio (30 s). Em seguida, as seções foram desidratadas, clareadas, montadas e examinadas ao microscópio óptico. A coloração foi avaliada utilizando o software ImageJ, e a densidade óptica integrada foi calculada para análise semiquantitativa.
15. Análise estatística
Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). As comparações entre múltiplos grupos foram realizadas utilizando análise de variância unidirecional seguida pelo teste post hoc de Tukey. Um valor de P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
A acupotomia alivia alterações histológicas na cartilagem articular
Conforme mostrado nas Figuras 1A e 1B, a circunferência do joelho e a razão relativa de inchaço foram significativamente aumentadas no grupo modelo de OAQ em comparação com o grupo controle. Ambas as medidas foram significativamente reduzidas após o tratamento com acupotomia ou celecoxibe, enquanto a acupotomia simulada não produziu melhora significativa em comparação com o grupo modelo de OAQ.
Conforme mostrado nas Figuras 1C e 1D, a pontuação de Mankin foi significativamente maior no grupo modelo de OAQ do que no grupo controle e reduziu-se significativamente após o tratamento com acupotomia ou celecoxibe. Nenhuma redução significativa foi observada no grupo de acupotomia simulada. A pontuação de Moran mostrou um padrão oposto.
As colorações com hematoxilina e eosina e Safranina O–Verde Rápido mostraram afinamento e descontinuidade da superfície da cartilagem articular, com erosão localizada, no grupo modelo de OAQ em comparação com o grupo controle (Figura 1E,F). A acupotomia e a celecoxibe atenuaram essas alterações patológicas, conforme indicado por contornos da cartilagem mais nítidos e redução dos danos estruturais. Em contraste, o grupo de acupotomia simulada apresentou características patológicas semelhantes às do grupo modelo de OAQ. Esses achados indicam que a acupotomia produziu efeitos comparáveis aos da celecoxibe na redução do inchaço articular e da degeneração da cartilagem, além de melhorar os escores histológicos no modelo de OAQ.
A acupotomia reduz os níveis de citocinas inflamatórias
Conforme mostrado nas Figuras 2A–C, as concentrações de interleucina-1β (IL-1β), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) nos homogeneizados de tecido cartilaginoso foram significativamente mais elevadas no grupo modelo de OAQ do que no grupo controle. O tratamento com acupotomia ou celecoxibe reduziu significativamente os níveis das três citocinas inflamatórias. Em contraste, o grupo de acupotomia simulada não apresentou redução significativa em comparação com o grupo modelo de OAQ.
A acupotomia modula a via de sinalização RIC8A/p38 MAPK ao nível proteico
A análise imunohistoquímica mostrou que a expressão da proteína quinase ativada por mitógeno p38 fosforilada (p-p38 MAPK) e do fator nuclear kappa B fosforilado (NF-κB) foi significativamente menor nos grupos submetidos à acupotomia e ao celecoxibe em comparação com o grupo modelo de OA (Figura 3A). Nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos de acupotomia simulada e modelo de OA.
A análise por Western blot mostrou que os níveis proteicos da metaloproteinase da matriz-3 (MMP-3), metaloproteinase da matriz-13 (MMP-13), resistência aos inibidores da colinesterase 8A (RIC8A) e p-p38 MAPK foram significativamente mais altos no grupo modelo de OAQ do que no grupo controle, enquanto os níveis das proteínas relacionadas à síntese da cartilagem, fator de transcrição SRY-box 9 (SOX9) e agregãcan, foram significativamente mais baixos. Em comparação com o grupo modelo de OAQ, os grupos submetidos à acupotomia e à celecoxibe apresentaram redução na expressão de MMP-3, MMP-13, RIC8A e p-p38 MAPK e aumento na expressão de SOX9 e agregãcan. O grupo de acupotomia simulada apresentou padrões de expressão proteica semelhantes aos do grupo modelo de OAQ, sem alterações significativas nas proteínas analisadas (Figura 3B–I). Esses achados indicam que os efeitos da acupotomia e da celecoxibe sobre a OAQ estiveram associados à modulação da via de sinalização RIC8A/p38 MAPK.
A acupotomia modula a via de sinalização RIC8A/p38 MAPK no nível transcricional
Conforme mostrado nas Figuras 4A–G, os níveis de expressão de MMP-3, MMP-13 e RIC8A foram significativamente mais altos no grupo modelo de OAQ do que no grupo controle, enquanto a expressão de SOX9 e agreglicano foi significativamente mais baixa. Em comparação com o grupo modelo de OAQ, a acupotomia e a celecoxiba reduziram a expressão de MMP-3, MMP-13 e RIC8A e aumentaram a expressão de SOX9 e agreglicano. O grupo de acupotomia simulada não apresentou diferenças significativas em relação ao grupo modelo de OAQ nos níveis transcricionais medidos.
A acupotomia também aumentou a expressão relativa de circPDE4B, indicando que seus efeitos terapêuticos estavam associados à modulação do eixo de sinalização circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK e à redução da sinalização inflamatória e catabólica.
DISPONIBILIDADE DE DADOS :
Os dados brutos que apoiam os achados deste estudo, incluindo ELISA, coloração H&E, imunohistoquímica, RT‑qPCR, coloração com Safranina O–Verde Rápido e dados de western blot, estão disponíveis publicamente no repositório Figshare em https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33090935.
Figura 1. A acupotomia reduz o inchaço do joelho e a degeneração da cartilagem articular em coelhos com osteoartrite do joelho. (A) Circunferência do joelho. (B) Índice relativo de inchaço do joelho. (C) Pontuação histológica de Mankin. (D) Pontuação histológica de Moran. (E) Cortes representativos corados com hematoxilina e eosina da cartilagem articular dos grupos controle, modelo de osteoartrite do joelho (KOA), celecoxibe, acupotomia e acupotomia simulada. (F) Cortes representativos corados com Safranina O–Fast Green dos cinco grupos experimentais. A pontuação histológica (Mankin e Moran) foi realizada utilizando amostras de todos os 10 coelhos por grupo (n = 10), enquanto imagens representativas para as colorações H&E e Safranina O–Fast Green foram obtidas de 3 coelhos selecionados aleatoriamente por grupo. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). As comparações estatísticas foram realizadas utilizando análise de variância unidirecional seguida pelo teste post hoc de Tukey. Barras horizontais indicam os grupos comparados. P < 0,05, P < 0,01 e P < 0,001. Barras de escala: 100 µm. Abreviações: KOA = osteoartrite do joelho; SEM = erro padrão da média. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.
Figura 2. A acupotomia reduz os níveis de citocinas inflamatórias em coelhos com osteoartrite do joelho. (A) Concentração de interleucina-1β. (B) Concentração de interleucina-6. (C) Concentração de fator de necrose tumoral-α. As concentrações de citocinas foram medidas por ensaio imunoenzimático em amostras de seis coelhos por grupo (n = 6). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. As comparações estatísticas foram realizadas por meio de análise de variância unidirecional seguida pelo teste post hoc de Tukey. As barras horizontais indicam os grupos comparados. P < 0,05, P < 0,01 e P < 0,001. Abreviações: IL-1β = interleucina-1β; IL-6 = interleucina-6; KOA = osteoartrite do joelho; SEM = erro padrão da média; TNF-α = fator de necrose tumoral-α. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3. A acupotomia modula proteínas relacionadas à inflamação e ao metabolismo da cartilagem em coelhos com osteoartrite do joelho. (A) Imagens imuno-histoquímicas representativas mostrando a expressão do fator nuclear kappa B fosforilado e da proteína quinase ativada por mitógeno p38 fosforilada na cartilagem articular dos grupos controle, modelo de osteoartrite do joelho (KOA), celecoxibe, acupotomia e acupotomia simulada. Barras de escala, 100 µm. (B) Ensaios de Western blot representativos mostrando a expressão de SOX9, RIC8A, MMP-13, p38 MAPK fosforilada, p38 MAPK total, MMP-3, agregãcan e GAPDH. (C) Quantificação densitométrica de agregãcan normalizada em relação à GAPDH. (D) Quantificação de MMP-13 normalizada em relação à GAPDH. (E) Quantificação de MMP-3 normalizada em relação à GAPDH. (F) Quantificação de p38 MAPK total normalizada em relação à GAPDH. (G) Quantificação de p38 MAPK fosforilada normalizada em relação à GAPDH. (H) Quantificação de SOX9 normalizada em relação à GAPDH. (I) Quantificação de RIC8A normalizada em relação à GAPDH. As análises por Western blot foram realizadas utilizando amostras de três coelhos por grupo (n = 3). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). As comparações estatísticas foram realizadas por meio de análise de variância unidirecional seguida pelo teste post hoc de Tukey. Barras horizontais indicam os grupos comparados. P < 0,05, P < 0,01 e P < 0,001. Abreviações: GAPDH = desidrogenase gliceraldeído-3-fosfato; KOA = osteoartrite do joelho; MAPK = proteína quinase ativada por mitógeno; MMP-3 = metaloproteinase da matriz-3; MMP-13 = metaloproteinase da matriz-13; NF-κB = fator nuclear kappa B; p-NF-κB = fator nuclear kappa B fosforilado; p-p38 MAPK = p38 MAPK fosforilada; RIC8A = resistência aos inibidores da colinesterase 8A; SEM = erro padrão da média; SOX9 = fator de transcrição SRY-box 9. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4. A acupotomia modula transcritos relacionados ao metabolismo da cartilagem e a expressão de circPDE4B em coelhos com osteoartrite do joelho. (A) Expressão relativa de agrecana. (B) Expressão relativa de MMP-3. (C) Expressão relativa de MMP-13. (D) Expressão relativa de p38 MAPK. (E) Expressão relativa de SOX9. (F) Expressão relativa de circPDE4B. (G) Expressão relativa de RIC8A. A expressão foi medida por reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa e normalizada em relação ao gene de referência. As análises foram realizadas utilizando amostras de seis coelhos por grupo (n = 6). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). As comparações estatísticas foram realizadas por meio de análise de variância unidirecional seguida pelo teste post hoc de Tukey. As barras horizontais indicam os grupos comparados. P < 0,05, P < 0,01 e P < 0,001. Abreviaturas: circPDE4B = RNA circular fosfodiesterase 4B; KOA = osteoartrite do joelho; MAPK = quinase ativada por mitógeno; MMP-3 = metaloproteinase da matriz 3; MMP-13 = metaloproteinase da matriz 13; RIC8A = resistência aos inibidores da colinesterase 8A; SEM = erro padrão da média; SOX9 = fator de transcrição SRY-box 9. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Gene | Tamanho do amplicon | Primer sentido | Primer antissentido |
| (pb) | (5'→3') | (5'→3') | |
| β-actin | 113 | CAGCCCTCCTTCATCGGTAT | GACATGACGTTGTTGGCGTA |
| MMP-3 | 108 | TGTGAGTTGAAGTGGCTCAT | CCTGTTTGAACACCCGTAAC |
| MMP-13 | 119 | GGCTCCTAGGCAAGTACAAT | GTGTACGCCCATCAGGATAA |
| SOX9 | 85 | GGAGGAAGTCGGTGAAGAAT | GCCTTGAAGATGGCGTTG |
| Aggrecan | 70 | TTGATGAGTGCCTTTCAAGC | CATGTGAAAGAGTCGATGGC |
| RIC8A | 100 | ATAAACTTTCCAGAGAGGAGTTGC | TCGATGACAGAGTACTGGTTG |
| p38 MAPK | 103 | TGTTCAAGGTCTCCCACAAG | TGCAGCTCCCTTATGATCTG |
| CircPDE4B | 174 | GTCATTTTGCCGAACTCCC | CATTATCATCTGCCGTCACTG |
Tabela 1: Sequências de iniciadores utilizadas para a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa. A tabela lista os genes-alvo, os tamanhos esperados dos amplicons e as sequências dos iniciadores direto e reverso na direção 5′ a 3′. Abreviações: bp = pares de bases; circPDE4B = RNA circular fosfodiesterase 4B; MAPK = quinase ativada por mitógeno; MMP-3 = metaloproteinase da matriz 3; MMP-13 = metaloproteinase da matriz 13; RIC8A = resistência aos inibidores da colinesterase 8A; SOX9 = fator de transcrição SRY-caixa 9.
Discussão
Este estudo avaliou os efeitos terapêuticos da acupotomia em um modelo de coelho de osteoartrite do joelho (KOA) e identificou uma associação entre a expressão de circPDE4B e o eixo de sinalização RIC8A/p38 da quinase ativada por mitógeno (MAPK). A acupotomia melhorou o inchaço articular e as alterações histopatológicas e modificou marcadores relacionados à inflamação e ao metabolismo da cartilagem nos níveis de transcritos e de proteínas.
A redução nas concentrações de interleucina-1β, fator de necrose tumoral-α e interleucina-6 após o tratamento com acupotomia foi compatível com os efeitos imunomoduladores da acupotomia previamente relatados21. Essas citocinas contribuem para a degeneração da cartilagem ao promover enzimas degradadoras da matriz e inibir a síntese da matriz extracelular22,24,25. As reduções simultâneas nas metaloproteinases da matriz-3 (MMP-3) e metaloproteinases da matriz-13 (MMP-13) nos níveis de transcritos e proteínas sugerem ainda que a acupotomia suprime a atividade catabólica associada à OA.
Uma descoberta notável foi a associação entre as alterações induzidas pela acupotomia na expressão de circPDE4B e a modulação da via RIC8A/p38 MAPK. A ativação anormal dessa via está associada à inflamação, ao estresse oxidativo e à degradação da matriz extracelular. As reduções na expressão de RIC8A e na fosforilação de p38 MAPK após a acupotomia sugerem que o tratamento pode ajudar a restaurar o equilíbrio do sinalização dentro dessa via. As alterações coordenadas nos marcadores relativos a circPDE4B e à via RIC8A/p38 MAPK são compatíveis com a hipótese de que circPDE4B possa funcionar como uma estrutura molecular, conforme previamente proposto26,27. No entanto, os achados atuais são correlacionais e não estabelecem que circPDE4B media os efeitos terapêuticos da acupotomia. Estudos de perda e ganho de função são necessários para determinar a causalidade.
A possível associação entre acupotomia e regulação de circRNA é um aspecto importante deste estudo. Estimulação mecânica tem demonstrado influenciar a expressão de circRNA em diversos tecidos28,29,30,31. No entanto, evidências diretas que liguem a estimulação mecânica induzida pela acupotomia à regulação de circRNAs específicos da cartilagem articular ainda são limitadas. A alteração observada na expressão relativa de circPDE4B após o tratamento pode refletir uma resposta direta à estimulação mecânica ou uma resposta indireta à redução da inflamação. Estudos futuros que combinem estimulação mecânica controlada com manipulação específica de circPDE4B em condócitos ajudariam a distinguir entre essas possibilidades.
A acupotomia e o celecoxib produziram tendências semelhantes em diversos desfechos medidos, apesar de seus modos de ação distintos. Várias explicações podem justificar essa convergência. Primeiro, ambos os tratamentos podem atuar em vias comuns a jusante, incluindo o eixo RIC8A/p38 MAPK e a sinalização do fator nuclear kappa B. Segundo, as semelhanças observadas podem refletir características comuns de proteção da cartilagem, em vez de efeitos específicos da via. Terceiro, os marcadores selecionados podem representar pontos finais compartilhados da inflamação e do metabolismo da cartilagem e, portanto, podem ser insuficientes para distinguir entre mecanismos distintos a montante. A eficácia semelhante não implica mecanismos idênticos, mas sugere que ambas as intervenções podem afetar componentes comuns da rede patológica da osteoartrite26,32,33. Abordagens imparciais, como perfis transcriptômicos ou proteômicos, podem ajudar a definir assinaturas moleculares específicas do tratamento.
Os efeitos comparáveis do acupotomia e do celecoxib também podem ter relevância clínica. A acupotomia pode oferecer uma opção de tratamento não farmacológica que aborda fatores mecânicos periarticulares, ao mesmo tempo que evita alguns efeitos adversos associados ao uso prolongado de medicamentos. No entanto, essa interpretação deve ser feita com cautela, pois o modelo de coelho não captura completamente a complexidade da OA gonadal humana. Estudos translacionais e clínicos adicionais são necessários antes que essas descobertas pré-clínicas possam apoiar uma aplicação clínica mais ampla.
Várias limitações devem ser reconhecidas. Primeiro, a associação entre a circPDE4B e o eixo RIC8A/p38 MAPK não foi testada por meio de experimentos de perda ou ganho de função. Segundo, o modelo em coelhos e o período de tratamento de quatro semanas limitam as conclusões quanto à doença humana e aos desfechos de longo prazo. Terceiro, os ensaios moleculares utilizaram subconjuntos relativamente pequenos de animais, o que pode ter limitado a detecção de diferenças sutis entre os grupos. Quarto, o painel de marcadores selecionado pode não distinguir mecanismos upstream específicos ao tratamento. Por fim, as respostas semelhantes ao acupotomia e à celecoxiba exigem investigação adicional para determinar se as duas intervenções atuam por meio de vias convergentes ou independentes.
Conclusão
A acupotomia reduziu o inchaço articular, os níveis de citocinas inflamatórias, a degeneração da cartilagem e a expressão de marcadores catabólicos em um modelo de coelho de OA. Esses efeitos estiveram associados a alterações na expressão relativa de circPDE4B e à modulação do eixo de sinalização RIC8A/p38 MAPK. Como os achados atuais são correlacionais, estudos mecanicistas adicionais são necessários para determinar se o circPDE4B media diretamente os efeitos terapêuticos da acupotomia.
Divulgações
Os autores declaram que não possuem interesses financeiros concorrentes nem relações pessoais que poderiam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº do convênio 81774436), pelo Projeto de Transformação da Pesquisa Clínica da Província de Anhui (nº do convênio 202427b10020136), pelo Projeto de Pesquisa Científica do Departamento de Educação da Província de Anhui (nº do convênio 2023AH050824), pelo Programa de Pesquisa em Saúde de Anhui (nº do convênio AHWJ2023A30123) e pelo Projeto de Pesquisa de Inovação e Herança da Associação de Medicina Chinesa Tradicional de Anhui (nº do convênio 2024ZYYXH153).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Peróxido de hidrogênio a 3% | Fuzhou Maixin Biotech | SP kit-A3 | Inibe a atividade de peroxidase endógena durante a imuno-histoquímica. |
| Paraformaldeído a 4% | Biosharp | BL539A | Fixa o tecido cartilaginoso antes da descalcificação e do processamento histológico. |
| Ácido acético | Merck | A6283 | Utilizado para preparar ácido clorídrico a 1% em 70% |
| Curativos adesivos | Zhejiang Renkang | RK-8802 | Utilizados após acupotomia. |
| Anticorpo contra agreglicano | Proteintech | 13880-1-AP | Anticorpo primário utilizado para detectar agreglicano em extratos proteicos de cartilagem. |
| Etanol anidro | Sinopharm Chemical Reagent | 10009228 | Utilizado para desidratação tecidual e reidratação de cortes durante o processamento histológico. |
| Kit de ensaio de proteína BCA | Thermo Fisher Scientific | A55860 | Utilizado para determinar a concentração de proteína. |
| Celecoxibe | Biochempartner | BCP02156 | Tratamento farmacológico de referência administrado por gavagem oral. |
| Centrífuga | Anhui Jiawen Instruments | JW-3021HR | Utilizada para clarificar lisados e homogeneizados teciduais por separação centrífuga. |
| Clorofórmio | Nanjing Reagent | 67-66-3 | Utilizado para separação de fases durante a extração total de RNA. |
| Tampão citrato, pH 6,0 | ZSGB-BIO | ZLI-9065 | Utilizado para recuperação de antígenos induzida por calor antes da imuno-histoquímica. |
| Criotubos | NEST Biotechnology | 607001 | Utilizados para armazenamento de amostras congeladas |
| Substrato DAB | Fuzhou Maixin Biotech | Kit-5230 | Substrato cromogênico utilizado para visualização de sinais imuno-histoquímicos marcados com HRP. |
| Água tratada com DEPC | Generay Biotech | D1007 | Água livre de RNase utilizada para dissolução de RNA e procedimentos de biologia molecular. |
| Agulha descartável de acupotomia, 0,35 mm × 25 mm | Ma'anshan Bond Medical Equipment | GB3525R | Agulha-cortante estéril utilizada para procedimentos de acupotomia e acupotomia simulada. |
| EDTA | biosharp | BL617A | Utilizado para preparar a solução de descalcificação para tecidos contendo cartilagem. |
| Substrato de quimioluminescência aprimorada | Thermo 340958 | 340958 | Utilizado para visualizar as bandas de Western blot. |
| Solução de eosina | Zhuhai Beso | BA4022 | Contracorante utilizado na coloração com hematoxilina e eosina. |
| Solução de verde rápido | Solarbio | G1371 | Contracorante utilizado na coloração com Safranina O–Verde Rápido. |
| Anticorpo contra GAPDH | Zsbio | TA-08 | Utilizado como controle de carga em Western blot, mas não listado atualmente. |
| Sistema de imagem de géis | Shanghai Peiqing Technology | JS-1070P | Captura imagens quimioluminescentes de Western blot. |
| Lâminas de microscópio de vidro | CITOTEST | 188105 | Utilizadas para montagem de cortes |
| Anticorpo secundário conjugado com HRP, anti-IgG de cabra, anti-murino | ZSGB-BIO | ZB-2305 | Anticorpo secundário conjugado com HRP para anticorpos primários murinos. |
| Anticorpo secundário conjugado com HRP, anti-IgG de cabra, anti-coelho | ZSGB-BIO | ZB-2301 | Anticorpo secundário conjugado com HRP para anticorpos primários de coelho. |
| Soro de cabra | ZSGB-BIO | ZLI-9056 | Inibe a ligação inespecífica de anticorpos durante a imuno-histoquímica. |
| GraphPad Prism, versão 10 | GraphPad Software | Não aplicável | Utilizado para análise estatística e preparação de gráficos. |
| Solução de hematoxilina | Zhuhai Beso | BA4041 | Corante nuclear utilizado na coloração com hematoxilina e eosina e na contracoloração imuno-histoquímica. |
| Homogeneizador | Witeg | SGCR-5-553-722 | Homogeneiza tecido cartilaginoso para ensaios ELISA e moleculares. |
| Ácido clorídrico | Merck | 7607 | Utilizado para preparar ácido clorídrico a 1% em 70% |
| Software Image Lab | Bio-Rad | Não aplicável | Utilizado para análise densitométrica de bandas de Western blot. |
| Image-Pro Plus, versão 6.0 | Media Cybernetics | Não aplicável | Utilizado para análise semi-quantitativa da intensidade da coloração com Safranina O. |
| Isopropanol | Sinopharm Chemical Reagent | SCR40007960 | Utilizado para precipitar RNA durante a extração total de RNA. |
| Microscópio óptico | Olympus | CX41 | Utilizado para examinar e imagens cortes de cartilagem corados. |
| Marcação médica | edding | 497985 | Utilizada para marcar pontos de tratamento |
| Metanol | Shanghai Suyi | 20180427 | Utilizado para ativar a membrana PVDF |
| Micrótomo | Leica | RM2016 | Secciona tecidos embebidos em parafina em cortes de 5 µm. |
| Anticorpo contra MMP-13 | Bioss | bs-0575R | Anticorpo primário utilizado para detectar metaloproteinase da matriz-13. |
| Anticorpo contra MMP-3 | Bioss | bs-43017R | Anticorpo primário utilizado para detectar metaloproteinase da matriz-3. |
| Resina neutra | Wuxi Jiangyuan | ZLI-9516 | Meio de montagem utilizado para preparação permanente de cortes teciduais corados. |
| Coelhos Nova Zelândia Brancos (machos, 6 meses de idade, pesando 2,0–2,5 kg) | Fazenda de Criação Laifu, Distrito de Pukou, Nanjing | SCXK (Su) 2024-0007 | Animais experimentais utilizados para modelagem de osteoartrite do joelho e avaliação de tratamento. |
| Lâmina de bisturi nº 23 | Caisson | SCX08-100PC | Utilizada durante a coleta de amostras. |
| Leite em pó desnatado | Gene | 9999S | Utilizado como reagente de bloqueio. |
| Anticorpo contra p38 MAPK | Bioss | bs-0637R | Anticorpo primário utilizado para detectar p38 MAPK total. |
| Parafina | Thermo | 8330 | Utilizada para inclusão tecidual |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | Utilizado para homogeneização tecidual, lavagem e preparação de reagentes. |
| Penicilina | Produtos Veterinários Jilin Huamu | Não aplicável | Utilizada pós-operatória a 40.000 U/kg/dia |
| Pentobarbital sódico | Reagentes Químicos de Pequim | 61222 | Utilizado para anestesia a 3%, 30 mg/kg. |
| Solução salina tamponada com fosfato | beyotime | ST448 | Utilizada para homogeneização tecidual e lavagem durante a imuno-histoquímica. |
| Soro fisiológico | servicevio | G4702 | Utilizado para preparar a suspensão de celecoxibe |
| PMSF | Beyotime | ST506 | Inibidor de protease adicionado ao tampão de lise durante a extração de proteínas. |
| Anticorpo contra p-NF-κB | Santa | sc-136548 | Anticorpo primário utilizado para detectar p-NF-κB na análise imuno-histoquímica. |
| Anticorpo contra p-p38 MAPK | Bioss | bs-5476R | Anticorpo primário utilizado para detectar p38 MAPK fosforilada. |
| Kit Reagente PrimeScript RT com Eraser de gDNA | TaKaRa | RR047A | Utilizado para remoção de DNA genômico e transcrição reversa de RNA para cDNA. |
| Membrana PVDF | Millipore | IPVH00010 | Membrana utilizada para transferência proteica durante o Western blot. |
| Kit ELISA para IL-1β de coelho | Jiyinmei | JYM0011Rb | Quantifica a interleucina-1β de coelho na amostra analisada. |
| Kit ELISA para IL-6 de coelho | Jiyinmei | JYM0006Rb | Quantifica a interleucina-6 de coelho na amostra analisada. |
| Kit ELISA para TNF-α de coelho | Jiyinmei | JYM0003Rb | Quantifica o fator de necrose tumoral-α de coelho na amostra analisada. |
| Sistema de PCR em tempo real | Thermo Fisher Scientific | PIKOREAL 96 | Realiza amplificação de PCR quantitativa baseada em fluorescência. |
| Anticorpo contra RIC8A | Bioss | bs-11355R | Anticorpo primário utilizado para detectar RIC8A. |
| Tampão de lise RIPA | Beyotime | P0013B | Extrai proteína total do tecido cartilaginoso. |
| Solução de Safranina O | Solarbio | G1371 | Cora proteoglicanos da cartilagem na histologia Safranina O–Verde Rápido. |
| Reagentes ou géis pré-moldados de SDS-PAGE | Solarbio | S8010 | Incluem porcentagem do gel ou produto. |
| Anticorpo contra SOX9 | Bioss | bs-4177R | Anticorpo primário utilizado para detectar SOX9. |
| Espetrofotômetro | Tecnologia Nanjing Wuyi | OD1000+ | Mede concentração e pureza de RNA. |
| Gaze estéril | Zhende | V505463 | Utilizada para compressão após a retirada da agulha. |
| SYBR Green Master Mix | Novoprotein | E096-01B | Reagente fluorescente utilizado para PCR quantitativa. |
| Solução salina tamponada com Tris | Solarbio | T8060 | Utilizada para preparar tampões de lavagem e bloqueio para Western blot. |
| Reagente TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Reagente fenol–guanidínio utilizado para extração total de RNA. |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | Detergente não iônico adicionado às soluções de lavagem de solução salina tamponada com Tris e solução salina tamponada com fosfato. |
| Solução de hematoxilina férrica de Weigert | Merck | 1.15973 | Utilizada na coloração com Safranina O–Verde Rápido. |
| Xilol | Sinopharm Chemical Reagent | 10023428 | Utilizado para desparafinização e clareamento tecidual. |
Referências
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