A acupuntura do couro cabeludo combinada com exercício induz a ativação do PI3K/Akt e melhora a plasticidade sináptica em ratos espásticos pós-AVC

Resumo

Este estudo tem como objetivo investigar os efeitos da acupuntura do couro cabeludo combinada com exercício na plasticidade sináptica do córtex motor em um modelo de rato de espasticidade pós-AVC no membro e explorar a associação entre a atividade da via PI3K/Akt e os efeitos terapêuticos.

Resumo

Tratamentos eficazes para a espasticidade pós-AVC (PSS) continuam limitados, e o mecanismo pelo qual a acupuntura do couro cabeludo combinada com exercícios (SAE) alivia a PSS não é totalmente compreendido. Este estudo investigou os efeitos da SAE em ratos com PSS e explorou se a SAE regula a plasticidade sináptica por meio da via PI3K/Akt. Foi estabelecido um modelo de ratos de oclusão da artéria cerebral média (MCAO), e os ratos foram randomizados em cinco grupos: Blank, Sham, MCAO, SAE e Baclofen. Todas as intervenções foram aplicadas por 7 dias consecutivos. Função neurológica, volume de infarto cerebral, histopatologia, ultraestrutura sináptica e expressão proteica relacionada foram então avaliadas. Comparado ao grupo MCAO, a SAE melhorou déficits neurológicos, reduziu a hipertonia muscular, diminuiu o volume do infarto, aliviou a lesão neuronal, aumentou o número de sinapses e melhorou a morfologia sináptica. A SAE também aumentou o fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial (GDNF), PI3K fosforilado (p-PI3K), Akt fosforilado (p-AKT) e proteínas sinápticas, incluindo sinaptofisina (SYN), proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD-95) e proteína associada ao crescimento 43 (GAP-43). A coloração por imunofluorescência sugeriu ainda mais uma expressão aumentada de SYN e p-Akt no córtex motor após o tratamento com SAE. Esses achados sugerem que a SAE pode estar correlacionada com a ativação da sinalização PI3K/Akt por meio da regulação para cima do GDNF, melhorando assim a plasticidade sináptica e aliviando os sintomas do PSS. Este estudo investigou os efeitos da SAE em ratos com PSS e explorou a possível associação entre intervenção na SAE, atividade das vias PI3K/Akt e plasticidade sináptica.

Introdução

O infarto cerebral continua sendo uma das principais causas de morte e incapacidade no mundo todo. Isquemia e hipóxia danificam neurônios, perturbam o equilíbrio excitação-inibição nos circuitos motores e levam à disfunção^{motora 1}. A espasticidade pós-AVC se manifesta como aumento do tônus muscular e redução da mobilidade articular, o que prejudica as atividades diárias e aumenta a carga do^{cuidador 2}. Embora agentes antiespásticos, como o baclofeno, possam proporcionar alívio temporário dos sintomas, o uso prolongado pode levar à tolerância e efeitos adversos ao medicamento, e não restaura a função neural^{comprometida 3}. A reabilitação motora convencional também é limitada por um início lento do benefício e duração prolongada do tratamento. Portanto, estratégias terapêuticas mais seguras e eficazes são urgentemente necessárias, e os mecanismos subjacentes merecem investigação adicional. A neuroplasticidade é um mecanismo central de recuperação funcional pós-AVC e envolve remodelação sináptica, regeneração axonal e sobrevivência^{neuronal 4}. Após o AVC isquêmico, os neurônios no núcleo do infarto sofrem uma morte rápida, enquanto respostas inflamatórias locais agravam a lesão tecidular na penumbra isquêmica; Juntos, esses processos causam lesão cerebral ^5,6. A plasticidade sináptica, um componente chave da neuroplasticidade, pode ser avaliada por proteínas relacionadas à sinapse, incluindo marcadores pré-sinápticos como sinaptofisina (SYN) e proteína associada ao crescimento 43 (GAP-43), bem como proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD-95)^7,8,9.

Fatores neurotróficos fornecem uma base molecular para a plasticidade sináptica. O fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial (GDNF) é particularmente importante porque promove a sobrevivência e reparação neuronal, suprime a inflamação e melhora o microambiente^{sináptico 10}. Ao se ligar ao receptor Ret, o GDNF pode ativar a sinalização PI3K/^{Akt 11}. A cascata PI3K/Akt é uma importante via pró-sobrevivência no sistema nervoso, e sua ativação inibe a apoptose, ao mesmo tempo em que apoia a síntese proteica necessária para a remodelação^{sináptica 12,13}. A acupuntura do couro cabeludo combinada com exercícios (EAE) é uma estratégia integrativa de reabilitação que combina a estimulação por acupuntura do couro cabeludo com o treinamento motor ativo. O objetivo geral desse método é modular simultaneamente a atividade neural central e promover a recuperação motora relacionada à tarefa, reduzindo assim a hipertonia muscular e melhorando os resultados funcionais após AVC. A SAE é amplamente utilizada na China para o tratamento da espasticidade pós-AVC (PSS). A justificativa dessa abordagem combinada é que a acupuntura do couro cabeludo pode modular a excitabilidade cortical e a perfusão cerebral, enquanto a terapia de exercício oferece treinamento motor dependente da atividade que promove a recuperação funcional e a remodelação sináptica. Comparado apenas com a terapia com exercício, evidências clínicas anteriores mostraram que a acupuntura do couro cabeludo nos pontos do couro cabeludo, combinada com terapia com exercício, reduz ainda mais a espasticidade dos membros e melhora a função motora e as atividades diárias em pacientes com espasmo pós-AVC^{no membro 14}.

Uma revisão sistemática recente e meta-análise também sugeriu que acupuntura no estilo de movimento do couro cabeludo ou intervenções concorrentes relacionadas a acupuntura-exercício proporcionam melhorias maiores na espasticidade, função motora, equilíbrio e atividades da vida diária do que intervenções monocomponentes ou sequenciais, apoiando a potencial vantagem da neuromodulação concorrente e do treinamento motor¹⁵. Estudos pré-clínicos mostraram que protocolos de acupuntura no couro cabeludo com SAE ou estilo de movimento relacionado podem melhorar o fluxo sanguíneo cerebral e atenuar a espasticidade por meio da reativação espinal KCC2 mediada pelo receptor^{5-HT₂A 16,17}. Um estudo recente sugere ainda que a acupuntura promove a neuroplasticidade por meio da sinalização PI3K/^{Akt 18}. Portanto, a SAE pode ser particularmente adequada para contextos experimentais e clínicos nos quais a modulação da plasticidade neural pós-AVC, a recuperação motora e a redução da espasticidade são objetivos terapêuticos chave. No entanto, a possível associação entre SAE, sinalização GDNF/PI3K/Akt e plasticidade sináptica no alívio da PSS continua pouco compreendida. O presente estudo estabeleceu um modelo de PSS em ratos para avaliar os efeitos da SAE em déficits neurológicos e espasticidade muscular, e para caracterizar mudanças na expressão do GDNF, atividade da via PI3K/Akt e proteínas relacionadas à plasticidade sináptica após a intervenção. Este estudo pode fornecer evidências experimentais para determinar se a SAE é uma estratégia reabilitadora adequada para a PSS e para esclarecer seu potencial mecanismo de ação.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Changchun (Aprovação nº 20251038) e foram conduzidos de acordo com as diretrizes Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE 2.0), bem como com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os materiais utilizados neste estudo estão apresentados na Tabela de Materiais.

Procedimentos experimentais
Animais experimentais e agrupamento
Oitenta ratos adultos machos específicos livres de patógenos (SPF) de Sprague–Dawley (220–250 g) foram adquiridos na Hongda Animal Breeding Farm (Distrito de Kuancheng, Changchun, China). Os animais eram alojados no Centro Experimental de Animais da Universidade de Medicina Chinesa de Changchun sob condições controladas de 22–25 °C, 50–60% de umidade relativa e um ciclo de 12 horas de luz/escuridão, com acesso livre a alimento e água. Após 1 semana de aclimatação, os ratos foram aleatoriamente designados para um grupo em branco (n = 12), um grupo Sham (n = 12) e um grupo modelo-reserva (n = 56). O grupo em branco foi incluído como controle normal, não tratado, para fornecer valores de base para desempenho comportamental, características histopatológicas e expressão de marcadores moleculares em ratos saudáveis. O grupo Sham passou pela mesma anestesia e exposição cirúrgica que o grupo MCAO, exceto que a oclusão arterial não foi realizada; Portanto, esse grupo serviu como controle para os potenciais efeitos da anestesia e manipulação cirúrgica. A inclusão dos grupos Blank e Sham permitiu distinguir os efeitos da lesão isquêmica daqueles relacionados ao procedimento cirúrgico em si.

O grupo de reserva-modelo passou por modelagem MCAO. Os primeiros 3 dias após a cirurgia foram definidos como o período de indução do modelo. Durante esse período, 8 de 56 ratos morreram, correspondendo a uma taxa de mortalidade de 14,29%, e 12 ratos foram excluídos porque a modelagem não teve sucesso. Os 36 ratos restantes com estabelecimento bem-sucedido do modelo foram alocados aleatoriamente, usando uma tabela de números aleatórios, para os grupos MCAO, SAE e Baclofeno, com 12 ratos em cada grupo. As intervenções em grupo foram as seguintes: (I) Grupo em branco: apenas alimentação rotineira, sem intervenção. (II) Grupo simulado: exposição cirúrgica da artéria carótida comum, artérias carótidas internas e externas, e nervo vago, sem ligadura ou inserção de filamento. (III) Grupo MCAO: O MCAO-MCAPI foi estabelecido sob anestesia intraperitoneal com pentobarbital sódico a 3%, sem tratamento subsequente. (IV) Grupo SAE: após modelagem e validação bem-sucedidas do MCAO, os ratos receberam acupuntura do couro cabeludo combinada com exercício. A anestesia por inalação de isoflurano em 1,5%–2,0% foi usada apenas durante a breve fase de inserção da agulha. O treinamento na esteira só foi iniciado após a recuperação completa da consciência e a restauração da capacidade de caminhar espontâneamente. A acupuntura foi realizada no GV20 e no bilateral EX-HN1. Agulhas eram inseridas até uma profundidade de 1 mm e mantidas durante o período de treinamento na esteira. O período padronizado de retenção/treinamento com agulha de 30 minutos foi definido como o período de treinamento na esteira e consistia em 6 m/min por 10 min, seguido por 12 m/min por 20 min com inclinação 0°. A intervenção foi aplicada uma vez ao dia por 7 dias consecutivos. (V) Grupo Baclofeno: após modelagem e validação bem-sucedidas do MCAO, os ratos receberam baclofeno por gavage intragástrico a 0,4 mg/kg uma vez ao dia por 7 dias consecutivos.

Estabelecimento do modelo MCAO
O modelo MCAO de ratos foi estabelecido usando um método modificado de filamento^{intraluminal 19}. Após 12 horas de jejum e privação de água, os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio a 3% e colocados em posição supina. Após a desinfecção da pele, foi feita uma incisão cervical na linha média para expor a artéria carótida comum direita (CCA) e os nervos e músculos adjacentes. A artéria carótida externa (ECA) foi identificada e ligada, e a artéria carótida interna (ICA) foi isolada. As ligaduras foram colocadas nas ACI e ACC proximais, e a ACC distal foi temporariamente clampada. Uma pequena arteriotomia foi então realizada no CCA próximo ao clamp. Um filamento de náilon de 0,26 mm foi inserido e avançado 18–20 mm através da ACI para ocultar a origem da artéria cerebral média. A ACI e a ACC foram posteriormente ligadas, e a incisão foi suturada. Após a cirurgia, os ratos eram mantidos aquecidos durante a recuperação e recebiam uma injeção intraperitoneal de penicilina (40.000 U) para prevenir infecção. No grupo simulado, apenas a exposição vascular foi realizada, sem inserção de filamento; O fechamento da ferida e o cuidado pós-operatório foram idênticos aos do grupo MCAO. O estabelecimento bem-sucedido do modelo foi definido como um escore Zea Longa ≥ 2 3 dias após a^{cirurgia 19} e um escore de tônus muscular modificado na Escala de Ashworth (MAS) ≥ Grau^{1 20}.

Métodos de intervntion
Acupuntura no couro cabeludo combinada com intervenção de exercício
Estudos anteriores mostram que, em ratos MCAO, déficits neurológicos atingem o pico no terceiro dia e permanecem elevados em até 10 dias após a cirurgia, enquanto a resistência muscular periférica aumenta progressivamente do dia 6 ao dia^{9 de 21}. Portanto, o tratamento foi iniciado no terceiro dia pós-operatório e continuado uma vez ao dia por 7 dias consecutivos para minimizar o impacto da recuperação espontânea. Antes de modelar, ratos designados para o grupo SAE passavam por 3 dias de treinamento adaptativo na esteira a 5 m/min durante 10 min/dia²². Esse treinamento adaptativo foi usado para familiarizar os ratos com a corrida na esteira e para reduzir a probabilidade de lutar, cair, recusa em correr ou parar durante o período formal de intervenção. Durante o treinamento adaptativo e a intervenção formal, eventos anormais relacionados à esteira foram definidos como dificuldade persistente, queda da pista de corrida, recusa em correr por mais de 1 minuto ou paragem por mais de 1 minuto durante o treinamento na esteira. Esses eventos foram registrados em registros experimentais quando observados. Hesitação breve ou paradas temporárias não levaram à exclusão se a corrida na esteira pudesse ser retomada após um leve incentivo. Os dados foram excluídos apenas se um animal não conseguisse completar a sessão diária de esteira atribuída devido a quedas repetidas, recusa persistente em correr ou sofrimento severo. Após validação bem-sucedida do modelo no terceiro dia, a intervenção SAE foi aplicada uma vez ao dia por 7 dias consecutivos.

Em cada sessão de tratamento, os ratos foram anestesiados com 1,5% a 2,0% de isoflurano. A anestesia foi interrompida imediatamente após a inserção da agulha. Na prática experimental, os ratos normalmente recuperavam a consciência total em aproximadamente 1–2 minutos após a retirada de isoflurano. O treinamento na esteira não começou enquanto os ratos estavam anestesiados. Os pontos de acupuntura foram localizados por acupunturistas animais experientes de acordo com a Nomenclatura e Localização dos Pontos de Acupuntura Comuns em Animais Experimentais emitida pela Associação Chinesa de Acupuntura-Moxibusção em 2020. GV20 foi definida como o ponto médio da linha que conecta as fontanelas anterior e posterior na linha média craniana. Os pontos bilaterais EX-HN1 estavam localizados 2 mm laterais em relação ao GV20. Agulhas descartáveis medindo 0,25 mm × 13 mm foram inseridas verticalmente até uma profundidade de 1 mm e mantidas durante todo o período padronizado de treinamento em esteira, que dura 30 minutos. As agulhas foram fixadas com fita médica respirável para evitar deslocamento, e a penetração do crânio foi excluída pela palpação para garantir a consistência do procedimento. A posição da agulha e a fixação da fita eram verificadas antes do treinamento na esteira, durante pausas breves caso ocorresse comportamento anormal de corrida, e imediatamente após a conclusão do treinamento. Além disso, a posição da agulha era verificada visualmente a cada 5 minutos durante o treinamento na esteira, independentemente do comportamento animal. O deslocamento da agulha foi definido como afrouxamento visível, mudança no ângulo da agulha, retirada parcial ou deslocamento completo durante a corrida na esteira. Se ocorresse um leve afrouxamento sem perda da posição da agulha, a fita era gentilmente reforçada enquanto a esteira era pausada brevemente. Se uma agulha fosse parcialmente retirada ou completamente deslocada, a agulha não era reinserida durante essa sessão; O rato completou o treinamento restante na esteira sem manipulação adicional da agulha, e o evento foi documentado no registro experimental. Os animais não foram excluídos apenas por um único evento de deslocamento de agulha, a menos que o evento tenha sido acompanhado de incapacidade de completar o treinamento na esteira ou sinais de sofrimento severo.

O período padronizado de 30 minutos de retenção/treinamento com agulha começava quando o rato começava a correr na esteira após a recuperação total da anestesia com isoflurano e terminava imediatamente após a conclusão do treinamento na esteira, quando as agulhas eram removidas. O breve intervalo de recuperação após a descontinuação do isoflurano não foi incluído no período padronizado de treinamento de 30 minutos. Como as agulhas foram inseridas antes da recuperação, o tempo físico real de permanência foi aproximadamente 1 a 2 minutos maior do que o período de treinamento na esteira de 30 minutos. Essa definição foi aplicada de forma consistente em todos os ratos do grupo SAE. Um rato era considerado suficientemente recuperado para iniciar o treinamento na esteira quando os seguintes critérios eram atendidos: recuperação completa da consciência, capacidade de ficar em pé de forma independente, capacidade de andar de forma estável em superfície plana e resposta normal a estimulação externa suave. Esses critérios foram verificados antes de colocar na esteira.

Durante a retenção da agulha, os ratos realizaram exercícios na esteira com inclinação 0°: 6 m/min por 10 min, seguidos por 12 m/min por 20 min. O choque elétrico não foi usado em nenhum momento durante o estudo. Se um rato parasse de correr ou se recusasse a correr por mais de 1 minuto durante o treinamento formal, estimulação auditiva suave e não aversiva, como bater levemente na parede da esteira, era usada para incentivar o movimento. O uso desse estímulo, assim como qualquer luta, queda, parada, recusa em correr ou deslocamento da agulha, foi documentado no registro experimental quando observado. Esses eventos foram monitorados de forma descritiva e documentados no registro experimental quando observados. A intensidade do exercício foi ajustada de forma abrangente com base em protocolos previamente relatados que combinavam acupuntura do couro cabeludo com treinamento na^{esteira 16,23}. A intervenção SAE foi aplicada uma vez ao dia por 7 dias consecutivos (Figura 1A).

Intervenção com baclofeno
Após validação bem-sucedida do modelo, ratos do grupo Baclofeno receberam solução de baclofeno por gavage intragástrico na dose de 0,4 mg/kg. O medicamento era administrado uma vez ao dia, às 9h, por 7 dias consecutivos.

Significado do resultado
Observação geral
A condição geral foi monitorada diariamente em todos os grupos, incluindo peso corporal, estado mental, consumo de alimentos e água, e atividade espontânea.

Avaliação da função neurológica e do tônus muscular
Déficits neurológicos e espasticidade dos membros foram avaliados nos dias 1, 3, 5 e 7 após validação do modelo usando o escore Zea Longa, o escore de gravidade neurológica modificada (mNSS) e a escala de Ashworth modificada. Todas as avaliações comportamentais em todos os momentos foram realizadas independentemente por dois pesquisadores que ficaram cegos quanto à alocação de grupos durante todo o período de observação. Critérios detalhados de pontuação são apresentados (Tabelas 1–3).

Determinação do volume do infarto cerebral
O volume do infarto cerebral foi avaliado usando coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC). Após 7 dias de intervenção, três ratos de cada grupo foram selecionados aleatoriamente e eutanasiados por overdose intraperitoneal de pentobarbital sódico, seguida por decapitação rápida para coleta total do cérebro. Os cérebros foram primeiro congelados a −20 °C e depois cortados em seções coronais de 2 mm de espessura. As seções foram incubadas em solução de 2% para TTC a 37 °C por 30 minutos no escuro, depois fixadas durante a noite em paraformaldeído a 4% a 4 °C. No dia seguinte, todas as seções foram fotografadas com uma câmera digital. O tecido cerebral normal era tingido de vermelho escuro, enquanto o tecido infarto apareceu branco pálido. As áreas do infarto foram quantificadas com o ImageJ, e o volume do infarto foi expresso como uma porcentagem usando a fórmula:

Volume do infarto (%) = área do infarto / área total da seção cerebral X 100%.   (1)

Exame histopatológico do tecido cerebral
Coloração por hematoxilina–eosina (HE)
A coloração por hematoxilina e eosina foi usada para avaliar alterações histopatológicas no córtex peri-infarto. Após 7 dias de intervenção, os ratos foram eutanasiados por overdose intraperitoneal de pentobarbital sódico. A perfusão transcárdica rápida foi então realizada com soro salino tamponado com fosfato (PBS) de 0,01 M para remover sangue, seguido de 250 mL de paraformaldeído frio a 4% (4 °C) para fixação. Cérebros inteiros foram coletados, e tecido cortical peri-infarto foi isolado e fixado em paraformaldeído a 4% a 4 °C por 24 horas. Os tecidos foram embutidos com parafina e seccionados coronalmente a 5 μm. As seções eram montadas em slides, cozidas a 60 °C por 30 minutos e desparafinizadas em xileno I–III (10 minutos cada). Em seguida, foi realizada a coloração com HE, seguida de desidratação e limpeza. Por fim, as seções eram cobertas com bálsamo neutro, e as imagens eram obtidas usando um microscópio óptico Nikon.

Coloração Nissl
A coloração de Nissl foi usada para avaliar a sobrevivência neuronal e a densidade corporal de Nissl na região peri-infarto. Após 7 dias de intervenção, os ratos foram eutanasiados e perfundidos transcardicalmente com 0,01 M PBS (37 °C), seguidos por 250 mL de paraformaldeído a 4% (4 °C). Cérebros inteiros foram removidos, e os tecidos corticais peri-infarto e contralaterais foram dissecados e fixados durante a noite em paraformaldeído a 4% a 4 °C. Após a incorporação de parafina, seções de 5 μm foram preparadas. As seções foram desparafinizadas em xileno por 10 minutos, reidratadas por uma série de soluções de etanol graduadas (95%, 90%, 80%, 70% e 50%; 5 min para cada concentração) e coradas com solução de trabalho Nissl por 30 minutos em temperatura ambiente. Após um breve enxágue com água destilada, as seções foram desidratadas com etanol graduado, limpas em xileno por 2 minutos e, finalmente, montadas com coberturas. Imagens foram capturadas e analisadas sob um microscópio óptico.

Análise por Western blot da expansão proteica
Western blot foi realizado para avaliar proteínas envolvidas na sinalização PI3K/Akt e na plasticidade sináptica. Após 7 dias de intervenção, os ratos foram eutanasiados com overdose de pentobarbital de sódio, e tecido do córtex motor peri-infarto foi coletado. Os tecidos foram totalmente homogeneizados em tampão de lise com ensaio de imunoprecipitação por radioimunoprecipitação (RIPA) sobre gelo e centrifugados a 1610 × g a 4 °C por 30 minutos para extrair proteína total. A concentração de proteína foi quantificada usando um kit comercial de ensaio proteico de ácido bicincônínico (BCA). Quantidades iguais de proteína (50 μg por via) foram separadas pela eletroforese do gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidas eletricamente para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF). As membranas foram bloqueadas com solução de albumina sérica bovina (BSA) a 5% por 1 hora em temperatura ambiente para eliminar a ligação inespecífica, e então incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 °C. Após três rodadas de lavagem com soro salino tampão Tris-buffer com Tween-20 (TBST), as membranas foram incubadas com anticorpos secundários (razão de diluição 1:1000) por 1 hora em temperatura ambiente. As bandas proteicas foram visualizadas usando quimioluminescência aprimorada (ECL), e a intensidade da banda foi quantificada com o ImageJ. A expressão relativa da proteína foi calculada como a razão entre a proteína alvo e o controle interno. Os anticorpos primários foram os seguintes: GAPDH (1:1000), PI3K (1:1000), fosfo-PI3K (1:1000), Akt (1:1000), fosfo-Akt (1:1000), GAP-43 (1:1000), SYN (1:1000), PSD-95 (1:1000) e GDNF (1:1000).

Observação da ultraestrutura sináptica
A microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi usada para avaliar o número de sinapses e a integridade estrutural. Após 7 dias de intervenção, os ratos foram anestesiados e perfundidos transcardicamente com fixador misto contendo 4% de paraformaldeído e 2,5% de glutaraldeído. Bloqueios do tecido cortical peri-infarto (1 mm × 1 mm × 1 mm) foram coletados e fixados em glutaraldeído a 2,5% por 2 horas, seguidos por pós-fixação com tetróxido de ósmio a 1% por 1 hora. As amostras foram então processadas com desidratação graduada de etanol, incorporação de resina epóxi, corte ultrafino (espessura de 50 nm) e dupla coloração com acetato de uranila e citrato de chumbo. A ultraestrutura sináptica foi examinada usando um microscópio eletrônico de transmissão. Imagens foram adquiridas a 8.000× para avaliação estrutural, e as sinapses foram contadas em 5.000×. Três campos aleatórios de neuropil por grupo foram analisados para calcular o número médio de sinapse, e os dados foram comparados usando ANOVA unidirecional.

Ensaio de dupla marcação por imunofluorescência
Foi realizada coloração dupla por imunofluorescência para avaliar a expressão e distribuição de SYN e p-Akt no córtex peri-infarto. Após 7 dias de intervenção, os ratos foram eutanasiados por overdose intraperitoneal de pentobarbital de sódio, e o tecido cortical peri-infarto foi rapidamente dissecado. As amostras foram fixadas em paraformaldeído a 4% por 24 horas, incorporadas em composto de temperatura de corte ideal (OCT) e cortadas em seções de 10 μm de espessura. As seções foram secas ao ar em temperatura ambiente por 1 hora e lavadas três vezes com tampão TBST para remover o composto residual de OCT. As seções foram permeabilizadas com 0,3% de Triton X-100 por 20 minutos em temperatura ambiente, enxaguadas com PBS e bloqueadas com solução de BSA a 5% por 1 hora em temperatura ambiente. Em condições escuras, as seções foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários anti-SYN de coelho (diluição 1:200) e anti-p-Akt de coelho (diluição 1:200). No dia seguinte, as seções foram lavadas três vezes com PBS e incubadas no escuro com anticorpo secundário (diluição 1:400) por 50 minutos em temperatura ambiente. Após mais seis lavagens com tampão TBST, núcleos celulares foram contra-coloridos com solução de trabalho 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 5 minutos em temperatura ambiente. As imagens foram obtidas sob configurações idênticas de exposição e fundo usando um microscópio de fluorescência. Imagens representativas foram usadas para avaliar padrões de expressão de SYN e p-Akt no córtex motor entre os grupos.

Análise estatística
Análises estatísticas foram realizadas usando o GraphPad Prism 10.1.2 e o IBM SPSS Statistics 25. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DS). Dados comportamentais coletados em múltiplos pontos de tempo, incluindo o escore Zea Longa, o Escore de Severidade Neurológica modificado e a Escala de Ashworth modificada, foram analisados usando uma ANOVA de medidas repetidas bidirecionais, com o grupo como fator entre sujeitos e o tempo como fator dentro dos sujeitos. Quando efeitos principais significativos ou interações foram detectados, o teste de múltiplas comparações de Sidack foi utilizado para análise post hoc. Outros dados foram analisados usando ANOVA unidirecional, seguido pelo teste de múltiplas comparações de Sidack para comparações post hoc. Um p. < de duas caudas de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Em gráficos de barras, a significância estatística é indicada por asteriscos, conforme definido nas legendas correspondentes das figuras.

Resultados

A SAE melhora a função neurológica e reduz a espasticidade muscular em ratos PSS
Os efeitos terapêuticos da SAE sobre a disfunção comportamental em ratos com espasticidade pós-AVC foram avaliados usando o escore Zea Longa, o Escore de Severidade Neurológica modificado e a Escala de Ashworth modificada nos dias 1, 3, 5 e 7 após validação do modelo (n = 12 por grupo). A pontuação Zea Longa e a mNSS foram usadas para avaliar déficits neurológicos, enquanto a pontuação MA...

Discussão

Estudos clínicos anteriores mostraram que a acupuntura do couro cabeludo combinada com exercícios pode aliviar sintomas espásticos em pacientes com espasticidade pós-AVC, ao mesmo tempo em que melhora a função motora e as atividades da vida diária (AVD)^14,24. Esses achados comprovam seu valor clínico. O presente estudo confirmou ainda o benefício terapêutico da SAE em um modelo de rato usando três medidas comportamentais, incluin...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining solution	Beyotime	C0651	TTC staining
3MM Filter Paper	Whatman, UK	3030861	Western blot transfer
AKT Antibody	Affinity	AF0836	Primary antibody
Acetone	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10000418	Infiltration of electron microscopy specimens
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	Version 29.5 (64-bit), https://www.adobe.com/products/illustrator.html	64-bit version, used for graphic editing and scientific figure preparation
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	100092683	Deparaffinization of paraffin sections
Anti-fade mounting medium	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1020	coverslipping
BCA Protein Assay Kit	MDL	MD913053	Protein concentration determination
Bluishing solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	Hematoxylin staining
Chemiluminescence Imaging System	CLINX, China	ChemiScope6100	System Detect target protein
Concentrated normal goat serum	Boster Biological Technology	AR1009	serum blocking
DAPI	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1030	nuclear staining
Diamond Knife	Daitome	Ultra 45°	Slice ultrathin specimens
Differentiation solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	HE staining
Drying Oven	Tianjin Labory Instruments Equipment Co., Ltd.	GFL-230	Bake fixed tissue slices
EDTA (pH 9.0) antigen retrieval solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1052	Antigen retrieval
Electron microscopy fixative	ASPEN	AS1063	Fixation of electron microscopy specimens
Electrophoresis Power Supply	Longfang	LF-2000	Provide electrophoresis voltage
Embed 812 embedding medium	SPI	90529-77-4	Infiltration of electron microscopy specimens
EndNote X9	Clarivate Analytics (US) LLC	Version X9, https://endnote.com/	Used for reference management and academic citation formatting
Freezing Stage	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-L5	Freeze frozen tissue blocks
GAP-43 Antibody	Affinity	Df7766	Primary antibody
GAPDH Antibody	Affinity	AF7021	Primary antibody
GDNF Antibody	Biosynthesis	Bs-1024r	Primary antibody
Glacial acetic acid	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2138	Nissl staining
Glass Slides and Coverslips	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10212432C	Mount tissue sections
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 10.1.2 (324) for Windows 64-bit, https://www.graphpad.com/	64-bit version, used for statistical analysis and scientific plotting
Grinding machine	Beijing Herde	N.9548	Grind tissue samples
HE staining solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2103	HE staining
HRP-Conjugated Goat Anti-Mouse Secondary Antibody	Servicebio	C030205	Secondary Antibody
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody	SeraCare	5220-0336	Secondary antibody
Hydrogen peroxide (H2O2)	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C5101	preparation of TSA reagents
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	Version 25, 64-bit, https://www.ibm.com/products/spss-statistics	64-bit version, used for statistical data analysis and processing
Imaging System	Nikon, Japan	Nikon DS-U3	Capture microscopic images
Metal Bath	COYOTE	H203-H	Constant temperature incubation
Microwave Oven	Galanz Microwave Electrical Appliance Co., Ltd.	P70D20TL-P4	Antigen retrieval
NC Membrane (0.22 μm)	GVS, USA	ISEQ00010	Protein blot transfer
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10004160	dehydration and coverslipping
PBS buffer	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C0003	decolorization and washing
PI3K Antibody	Affinity	AF6241	Primary antibody
PSD-95 Antibody	Affinity	Af5283	Primary antibody
Pathological Microtome	Leica Instruments (Shanghai) Co., Ltd.	RM2016	Cut paraffin sections
Phospho-AKT Antibody	Affinity	Af0832	Primary antibody
Phospho-PI3K Antibody	Affinity	Af3241	Primary antibody
Pipette	Dragonlab	KE0003087/KA0056573	Quantitative liquid transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Beyotime	P1005	Protease inhibition
RIPA Lysis Buffer (Medium)	Beyotime	P0013C	Tissue lysis
Refrigerated Centrifuge	SEILOGEX, China	CF1524R	Low-speed sample separation
SDS-PAGE Electrophoresis System	Beyotime	MiniProGel™ Gel Casting, Electrophoresis and Western Blot Transfer System	Protein electrophoretic separation
SDS-PAGE Precast Gel Kit	MDL	MD911919	SDS-PAGE electrophoresis
SYN (Synapsin) Antibody	Biosynthesis	bs-3501R	Primary antibody
Shaker	Qilinbeier	TS-8	Sample oscillation washing
Tissue Dehydrator	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JJ-12J	Dehydrate paraffin tissue
Tissue Embedding Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-P5	Embed tissue in paraffin
Tissue Spreading Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	KD-P	Unfold paraffin slices
Toluidine blue staining solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2131	Nissl staining
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G2 20 TWIN	Observe ultrastructure
Tri-Color Pre-Stained Broad Range Protein Molecular Weight Marker (10–180 kDa)	Servicebio	G2091	SDS-PAGE electrophoresis
Tyramide-488	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C6002	TSA reagents
Tyramide-CY3	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C6003	TSA reagents
Ultramicrotome	Leica	Leica UC7	Cut ultrathin EM sections
Ultrasonic Cell Disruptor