Um modelo de enterocolite acelerada com piroxicam em camundongos knockout com interleucina-10 para estudar alterações metabólicas induzidas por inflamação

Resumo

Esse protocolo utiliza piroxicam para acelerar o desenvolvimento da colite no modelo de camundongos knockout com interleucina (IL-10). O protocolo garante a sincronização com colite, resultando em resultados rigorosos e reproduzíveis, independentemente do sexo, da tensão de fundo ou das condições do vivário. Ele serve como um modelo útil para estudar alterações metabólicas durante a inflamação intestinal.

Resumo

A doença inflamatória intestinal (DII) é um distúrbio inflamatório crônico do trato digestivo que afeta mais de 10 milhões de pessoas no mundo todo. Embora pesquisas substanciais tenham se concentrado nos mecanismos imunológicos e nas consequências subjacentes à DII, pouco se entende sobre como a inflamação mucosa contribui para a desregulação metabólica, incluindo perda de peso e redução do apetite. Aqui, os autores descrevem um modelo camundongo de enterocolite acelerada por piroxicam em camundongos com interleucina-10-knockout (IL-10-KO) para estudar a desregulação metabólica induzida por inflamação. Sabe-se que camundongos IL-10-KO desenvolvem enterocolite espontânea e apresentam suscetibilidade aumentada à enterocolite desencadeada por infecções ou medicamentos. No entanto, condições de vivário e antecedentes de tensão foram relatadas como fatores de confusão no desenvolvimento da colite neste modelo. Piroxicam, um anti-inflamatório não esteroide (AINE), demonstrou desencadear ou acelerar enterocolite em modelos animais ao aumentar a exposição mucosa a bactérias luminais. Nesse protocolo, camundongos machos e fêmeas com IL-10-KO foram alimentados com uma dieta fortificada com piroxicam em vez da dieta regular de cfood. A ingestão de alimentos e o peso corporal foram medidos diariamente para refletir alterações metabólicas do corpo inteiro, juntamente com manifestações clínicas de enterocolite, como diarreia e sangramento retal. O protocolo é eficiente e reproduzível, induzindo enterocolite simultaneamente em múltiplos camundongos e permite a avaliação da desregulação metabólica em um modelo de doença inflamatória intestinal. Estudos adicionais que utilizem esse protocolo podem investigar os efeitos da enterocolite em outros componentes da desregulação metabólica, como o gasto energético e a composição corporal, revelando conexões mais amplas entre doença inflamatória intestinal e metabolismo do hospedeiro.

Introdução

Doença de Crohn e colite ulcerativa, conhecidas coletivamente como doença inflamatória intestinal (DII), são doenças autoimunes crônicas do trato gastrointestinal caracterizadas por inflamação mucosa, com manifestações clínicas incluindo dor abdominal, perda de peso, hematoquezia e diarreia. A DII afeta milhões de indivíduos em todo o mundo, com a maior prevalência em sociedades^{ocidentalizadas 1}. Nos EUA, estima-se que mais de 3 milhões de pessoas sejam^{afetadas 2,3}, com aumento da incidência e prevalência, especialmente entre crianças e jovens ^4,5.

Os mecanismos exatos subjacentes à patogênese da DII permanecem incompletamente compreendidos, mas acredita-se amplamente que a doença resulte de uma resposta imune exagerada à microbiota intestinal em indivíduos geneticamente suscetíveis. Citocinas que modulam respostas inflamatórias desempenham papéis críticos na manutenção da homeostase intestinal e no desenvolvimento da DII. Entre elas, a interleucina-10 (IL-10) é uma citocina anti-inflamatória bem estudada que ajuda a manter a homeostase imunológica em humanos ao regular tanto os braços inato quanto o adaptativo da resposta^{imunológica 6,7}. Notavelmente, polimorfismos em IL-10 e seu receptor (IL-10RA/B) foram identificados em bebês com II DE INÍCIO MUITO PRECOCE (VEO-IDI), apresentando-se classicamente com doença perianal nos primeiros meses de^{vida 8}. Essa associação é ainda reforçada pelo sequenciamento em larga escala do exoma em pacientes adultos com doença de Crohn, que identificou a IL-10RA como um locus de suscetibilidade à doença na^{DII 9} não monogênica. Além disso, uma via não genética envolvendo anticorpos neutralizadores de IL-10 foi descrita em pacientes com VEO-IBD, destacando ainda mais a importância dessa via na manutenção da homeostase imune^{mucosal 10}.

Com base em estudos humanos que implicam a IL-10 em DII, camundongos de interleucina-10-knockout (IL-10-KO) foram desenvolvidos como modelo para estudar o papel da IL-10 na DII. Sabe-se que camundongos IL-10-KO desenvolvem enterocolite espontânea com uma resposta exagerada CD4+ Th1 a estímulos, tipicamente começando entre 8 e 12 semanas^{de idade.} No entanto, o desenvolvimento de enterocolite espontânea em camundongos IL-10-KO pode ser imprevisível na ausência de um agente^acelerador 12,13,14, dependendo da cepa genética, composição da microbiota e condições de ^{habitação 15,16}. O uso de um protocolo confiável para induzir colite é fundamental para que o modelo IL-10-KO seja praticamente útil. Estudos anteriores utilizaram anti-inflamatórios não esteroides (AINEs), como o piroxicam, para induzir enterocolite em camundongos IL-10-KO^17,18. No entanto, esses estudos focaram principalmente em alterações imunológicas, com relativamente pouca ênfase nos efeitos da enterocolite no metabolismo ou no papel do sexo na gravidade^{da colite 19}. Os autores aqui descrevem o uso de uma dieta fortificada com piroxicam para induzir enterocolite em camundongos IL-10-KO e caracterizam desregulação metabólica e respostas inflamatórias mucosas nesse modelo usando tanto camundongos machos quanto fêmeas. Esse protocolo mede o peso corporal e a ingestão de alimentos para refletir alterações metabólicas do corpo inteiro, bem como manifestações clínicas de colite e alterações histológicas e transcriptômicas que refletem inflamação mucosa. Esse modelo eficiente e reproduzível fornece uma ferramenta valiosa para investigar a conexão entre a DII e o metabolismo do hospedeiro.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com o protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) do Centro Médico Southwestern da Universidade do Texas, de acordo com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" [Número de Aprovação: 2017-102011]. A eutanásia foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais. Não foi necessária anestesia para os procedimentos realizados. Detalhes específicos dos materiais são descritos na Tabela de Materiais.

1. Estabelecimento do modelo de enterocolite acelerada por piroxicam em camundongos IL-10-KO

1. Mantenha camundongos IL-10-KO em uma instalação específica livre de patógenos (SPF) em um ciclo de luz de 12 horas, com acesso ad libitum a comida e água.
2. Individualmente, abrigam camundongos de 7–8 semanas, idade e sexo em gaiolas de microisolamento. Permita que os camundongos se acostumem ao alojamento individual e ao manuseio diário por pelo menos uma semana antes do início do experimento.
   NOTA: Certifique-se de que o peso corporal seja >20 g para machos ou >17 g para fêmeas, e que os camundongos estejam livres de feridas de luta.
3. Atribua camundongos a um grupo experimental e um grupo controle. Para o grupo experimental, substitua o jantar padrão por comida fortificada com piroxicam. Para o grupo de controle, forneça comida padrão fresca. Adicione 50 g de chow a cada funil da gaiola.
   NOTA: Aloque pelo menos cinco camundongos por sexo para cada grupo. O alimento fortificado com piroxicam (200 ppm) foi preparado pela Teklad usando piroxicam fornecido pelos investigadores para a produção de uma dieta personalizada para animais de laboratório. Para minimizar a variabilidade de lote para lote, recomenda-se que todos os animais de um determinado experimento recebam comida do mesmo lote de produção. Quando possível, o mesmo lote também deve ser usado em experimentos para melhorar a reprodutibilidade.

2. Monitoramento do peso corporal e do comportamento alimentar

1. Usando uma balança analítica, registre o peso corporal de cada rato. Pese cada camundongo individualmente no mesmo horário todos os dias, diariamente por 7 dias consecutivos. Informe o peso corporal diário como uma porcentagem do peso de base no dia 0 (definido como 100%).
   NOTA: Uma perda de peso superior a 20% indica estresse excessivo e risco de morte iminente. Ratos devem ser eutanasiados se esse limite for atingido.
2. Usando uma balança analítica, registre o peso inicial do chow fortificado com piroxicam e do chow padrão em cada gaiola.
3. Depois, meça o alimento restante em cada funil de gaiola no mesmo horário todos os dias, diariamente por 7 dias consecutivos.
4. Calcule o consumo diário de comida subtraindo o peso diário do remédio restante do dia anterior.
   NOTA: Verifique rotineiramente a quantidade de comida e reabasteça se estiver abaixo de 10 g. A palatabilidade do piroxicam não influencia a ingestão e deve se assemelhar muito à da comida padrão.

3. Monitoramento da atividade da doença

1. Nos dias 0 e 7, inspecionar visualmente pellets fecais de camundongos individuais e determinar a presença de sangue nas fezes.
2. Se não houver sangue visível, faça um teste de sangue oculto nas fezes espalhando um pellet no cartão de teste e depois adicionando o reagente revelador fornecido. Resultados de pontuação de acordo com a Tabela 1.
3. Nos dias 0 e 7, inspecione visualmente os pellets fecais recém-vazados para avaliar a consistência das fezes. Use pinças planas para ajudar a determinar a consistência. Resultados de pontuação de acordo com a Tabela 1.
4. Nos dias 0 e 7, determine o grau de prolapso retal inspecionando a região perianal. Resultados de pontuação de acordo com a Tabela 1.
5. Meça o peso corporal conforme descrito acima. Resultados de pontuação de acordo com a Tabela 1.
   NOTA: A pontuação do índice de atividade da doença (DAI) deve ser realizada de forma cega pelo mesmo pesquisador durante todo o experimento para garantir consistência, minimizar o viés do observador e melhorar a confiabilidade da avaliação.

4. Colheita de tecido cólico

1. Eutanasiar camundongos por asfixia de CO₂ e luxação cervical, conforme relatado em outros^{lugares 20}.
2. Coloque o rato em posição supina e borrife 70% de etanol no abdômen ventral.
3. Levante a pele com pinças e use tesoura cirúrgica para cortar ao longo da linha média. Expõe a cavidade peritoneal e localiza o cólon.
4. Expõe o cólon e o ceco usando dissecação contundente. Remova o cólon em bloco, incluindo o ceco e o manguito anal.
5. Coloque o cólon em uma superfície plana e remova qualquer tecido conjuntivo.
6. Meça e registre o comprimento do cólon.
7. Após a medição do comprimento do cólon, remova o ceco cortando na junção ceco-cólon.
8. Prepare uma seringa de 10 mL preenchida com soro salino tamponado com fosfato (PBS) com uma agulha de aço reutilizável de ponta esférica calibre 22 acoplada. Enfie a agulha no cólon e limpe o conteúdo intestinal.
9. Coloque o cólon lavado em uma placa de Petri contendo PBS e enxágue para remover o conteúdo residual. Depois de liberado, use-o para ensaios posteriores.

5. Análise histológica

1. Deite o cólon plano sobre uma lâmina de vidro. Use pinças para enrolar o tecido ao redor de si mesmo, começando pela extremidade distal, para formar um "rolo suíço (Swiss roll). Dessa forma, a extremidade distal/anal permanecerá no rolo interno, com as regiões mais proximais se estendendo até o rolo externo.
2. Usando uma agulha calibre 27, prenda o cólon enrolado para manter o rolo e coloque-o dentro de um fita de tecido embutido.
3. Para fixar tecidos, submerga cassetes de tecido em solução de formalina tamponada a 10% por 16 horas a 4 °C.
   ATENÇÃO: 10% de formalina é prejudicial se estiver em contato com a pele e pode causar queimaduras graves e danos oculares. Manuseie com cuidado com luvas protetoras e óculos científicos. O formol residual deve ser devidamente descartado seguindo as diretrizes institucionais.
4. Após a fixação de formalina, processe os tecidos para embedding de parafina e os separe para montagem em lâminas de vidro.
   NOTA: As amostras devem ser enviadas a um laboratório de histologia com o equipamento necessário para processar cassetes de tecido em parafina, corte por perrolo, montagem de lâminas e coloração por hematoxilina e eosina.
5. Laminas de tecido de staining com hematoxilina e eosina (HE), conforme protocolos^{estabelecidos 21}.
6. Utilizando o sistema de pontuação histológica descrito na Tabela 2, avalie as seguintes características histológicas em cada seção: dano tecidual por enterocolite, infiltração celular inflamatória da lâmina própria e porcentagem da área envolvida. Combine as pontuações de cada seção para gerar uma pontuação total (Tabela 2).
   Escore total = Envolvimento × Características (Dano Tecidual) + Envolvimento × Características (Infiltração Celular Inflamatória da Lâmina Própria) (1)
7. Imagens histopatológicas representativas de danos teciduais e infiltração celular podem ser encontradas na publicação de Erben et^{al 22}.
   NOTA: A pontuação histológica deve ser realizada de forma cega, preferencialmente por um patologista treinado, para garantir consistência e confiabilidade da avaliação.

6. Coloração imunofluorescente de tecido embutido em parafina fixada em formalina

1. Coloque as lâminas de papel em um suporte de lâminas e em um secador de lâminas a 55 °C por 1 hora para derreter parafina.
2. Coloque as lâminas em um suporte de tingimento e submerga sequencialmente o suporte por 3 minutos em potes de coloração com xileno. Repita essa etapa em 3 ocasiões.
3. Submerga o suporte de tingimento por 3 minutos em potes de tingimento com 100% etanol. Repita essa etapa em 3 ocasiões.
4. Submerga o suporte de tingimento por 3 minutos no pote de tingimento com etanol 95%.
5. Submerga o suporte de tingimento por 3 minutos no pote de tingimento com etanol 80%.
6. Submerga o suporte de tingimento por 5 minutos em potes de tingimento com água desionizada (DI).
   NOTA: Todos os passos anteriores devem ser realizados em uma coifa ventilada devido aos vapores de xileno. Manuseie com cuidado com luvas protetoras e óculos científicos. O xileno residual deve ser devidamente descartado de acordo com as diretrizes institucionais.
7. Transfira as lâminas para um suporte de lâminas e submerga em um pote de coloração com solução de 1× de citrato.
8. Coloque o pote de tingimento no suporte do prato de tingimento.
9. Coloque o suporte para a travessa na panela de pressão.
10. Cozinhe por 15 minutos em panela de pressão.
11. Recupere os lâminas da panela de pressão e deixe-os esfriar até a temperatura ambiente.
12. Incube lâminas com tampão bloqueador de 300 μL (soro de cabra 3,5% diluído em PBS) por 1 hora em uma câmara umidificada. Certifique-se de que o tecido esteja completamente coberto pelo tampão bloqueador.
13. Expor as lâminas a 300 μL de anticorpo primário diluído em tampão bloqueador por 16 horas a 4 °C, dentro de uma câmara umidificada. Certifique-se de que o tecido esteja completamente coberto pelo anticorpo primário. O seguinte anticorpo primário foi utilizado: Anti-S100A8/S100A9 (1:500).
    NOTA: As diluições de anticorpos serão específicas do reagente e devem seguir as recomendações do fornecedor.
14. Enxague os slides submergindo em série em PBS por 5 minutos em 3 ocasiões em um pote de tingimento.
15. Expor as lâminas a 300 μL de um anticorpo secundário fluorescente diluído em buffer bloqueador por 1 h em temperatura ambiente, em uma câmara umidificada. Certifique-se de que o tecido esteja completamente coberto pelo anticorpo secundário. O seguinte anticorpo secundário fluorescente foi utilizado: anti-coelho Alexa Fluor 555 (diluição 1:150).
    NOTA: A partir desse ponto, as lâminas devem ser protegidas da luz para evitar o fotobranqueamento dos fluoróforos. As diluições dos anticorpos secundários serão específicas do reagente e devem seguir as recomendações do fornecedor.
16. Enxague os slides submergindo em série em PBS por 5 minutos em 3 ocasiões em um pote de tingimento.
17. Expõe as lâminas à coloração nuclear submergindo em solução Hoechst diluída 1:5000 em PBS por 20 minutos em um pote de coloração.
18. Enxague os slides submergindo em série em PBS por 5 minutos em 3 ocasiões em um pote de tingimento.
19. Limpe cuidadosamente qualquer PBS das lâminas usando um papel de papel não abrasivo. Adicione 50 μL de meio de montagem antifade e um coverslip.

7. Extração de RNA

1. Congele bruscamente o cólon inteiro ou um fragmento em nitrogênio líquido e depois armazene a -80 °C. Alternativamente, submerga em 1,5 mL de solução preservadora RNALater e armazene conforme as instruções do fabricante.
2. Descongele o cólon previamente congelado e coloque em uma superfície plana. Desregule e homogeneize o tecido com um homogeneizador portátil.
3. Isole o RNA usando o kit, seguindo as instruções do fabricante.
4. Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro. Razões_{A 260}/_{A 280} > 1,8 e_{A 260}/_{A 230} de 2,0–2,2 indicam pureza aceitável de RNA.
5. Prossiga com a transcrição reversa, seguida de qPCR com corante intercalante verde SYBR.
6. Analise os resultados usando a plataforma de quantificação ou um instrumento similar.

Resultados

Camundongos machos e fêmeas IL-10-KO desenvolvem enterocolite após uma breve exposição a uma dieta fortificada com piroxicam (Figura 1A–E). No segundo dia, camundongos expostos ao piroxicam apresentaram perda de peso estatisticamente significativamente maior do que seus controles regulares alimentados com comida do mesmo sexo, e perda de peso comparável foi observada entre os sexos (Figura 1B). A ingestão diária aparente de alimentos permaneceu inalterada durante a exposição ao piroxicam e o desenvolvimento de enterocolite, e se assemelhou à ingestão padrão da comida, indicando que a perda de peso nesse modelo não é principalmente impulsionada pela redução da ingestão, mas sim por outros fatores que promovem o gasto metabólico (Figura 1C).

Para investigar mais a fundo a progressão da inflamação intestinal, a atividade da doença foi avaliada por meio de uma pontuação combinada de perda de peso, sangue nas fezes, consistência das fezes e grau de prolapso retal. O índice de atividade da doença modificada (DAI) foi avaliado no início e no dia 7; as pontuações do dia 7 são mostradas na Figura 1D. Além disso, o desenvolvimento de enterocolite observado em camundongos expostos ao piroxicam esteve associado a uma forte tendência de aumento da mortalidade, embora essa diferença não tenha sido estatisticamente significativa (p = 0,12; Figura 1E). Neste modelo, a mortalidade precoce é secundária ao alcance dos camundongos em objetivos humanos (perda de peso > 20%) e afeta preferencialmente os machos (Figura 1E). Se a mortalidade for um desfecho experimental muito procurado, pode ser considerado um número maior de animais experimentais do que o utilizado aqui. Neste estudo, os autores usaram o número mínimo de animais necessário para alcançar o poder estatístico por meio da conclusão do estudo, levando em conta a mortalidade esperada.

O encurtamento do cólon é uma característica associada à gravidade da colite em modelos murinos. Na colheita, tanto camundongos machos quanto fêmeas com IL-10-KO alimentados com dieta com piroxicam apresentavam cólon mais curto do que aqueles alimentados com comida comum (Figuras 2A–B). Após avaliação histológica, os cólons do grupo alimentado com piroxicam apresentaram dano epitelial e aumento da infiltração de células imunológicas, mudanças associadas à colite (Figura 2C). Esses achados resultaram em uma pontuação histológica mais alta (Figura 2D). Além disso, os níveis transcricionais de citocinas pró-inflamatórias envolvidas em modelos de DII humana e murinos de colite foram^{avaliados 23}. De acordo com relatos anteriores, cólons de camundongos alimentados com piroxicam com IL-10-KO apresentaram uma regulação significativa para cima das citocinas pró-inflamatórias no nível dos transcritos (Figura 3A–D). Vale ressaltar que essa alteração transcricional não foi observada em camundongos IL-10-KO recebendo comida regular ou em ratos WT recebendo dieta fortificada com piroxicam, indicando que a assinatura transcricional foi impulsionada por uma combinação de deficiência de IL-10 e piroxicam, e não apenas por qualquer um dos fatores. Por fim, os autores confirmaram que a assinatura transcricional observada no cólon em camundongos tratados com piroxicam estava associada ao aumento da coloração por calprotectina na mucosa do cólon (Figura 3E)^24,25.

Figura 1: Enterocolite acelerada por Piroxicam em camundongos IL-10-KO. (A) Visão geral esquemática do protocolo experimental. (B) Peso corporal, (C) ingestão de alimentos, (D) índice de atividade da doença (DAI) do dia 7, (E) curva de sobrevivência em camundongos machos de 8 semanas e fêmeas de 8 semanas com IL-10-KO recebendo dieta fortificada com piroxicam ou dieta regular. Controle masculino: n = 5, piroxicam masculino: n = 5, controle feminino: n = 6, piroxicam feminino: n = 6 em (B), (C) e (D). Controle masculino: n = 6, piroxicam masculino: n = 10, controle feminino: n = 6, piroxicam feminino: n = 7 pol (E). * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 por comparação par a par de camundongos machos (asteriscos superiores) e fêmeas (asteriscos inferiores) em (B). Análises estatísticas foram realizadas usando um teste t não pareado de duas caudas em (B), (C) e (D), e um teste log-rank em (E). Valores de média e barras de erro representando o erro padrão da média (SEM) são representados. Em gráficos de barras, medições individuais são representadas por gráficos de jitter. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Encurtamento do cólon e avaliação histológica. (A) Amostras representativas de cólon de camundongos machos e fêmeas de 8 semanas de interleucina-10-knockout (IL-10-KO) recebendo dieta com piroxicam (em cima) ou dieta regular (em baixo) por 7 dias. Barra da balança = 1 cm. (B) Comprimento do cólon no dia 7 (controle masculino: n = 5, piroxicam masculino: n = 5, controle feminino: n = 6, piroxicam feminino: n = 6). (C) Imagens representativas do cólon tingido com HE. Barra da balança = 100 μm. (D) Pontuação histológica no dia 7. Teste t sem pareamento de duas caudas em (B) e (D). Valores médios e barras de erro representando o SEM são representados. Em gráficos de barras, medições individuais são representadas por gráficos de jitter. Não significativo (NS), * p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001 em comparação par a par. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Alterações inflamatórias na enterocolite acelerada por piroxicam. Resultados quantitativos de RT-PCR de (A) Tnf, (B) Il6, (C) Il1b e (D) Ifng em tecido colônico de camundongos machos selvagens (WT) e interleucina-10-knockout (IL-10-KO) de 8 semanas no momento da colheita. Para painéis A–D, WT piroxicam n = 7, KO piroxicam n = 6, KO controle n = 3. (E) Coloração representativa por imunofluorescência por calprotectina no tecido do cólon de camundongos IL-10-KO de 8 semanas de idade no momento da colheita. Análises estatísticas foram realizadas usando um teste t sem pareamento de duas caudas. Valores de média e barras de erro representando o erro padrão da média (SEM) são representados. Em gráficos de barras, medições individuais são representadas por gráficos de jitter. Barra de escala em (E) = 200 μm. Não significativo (NS), * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 em comparação par a par. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Domínio	Pontuação
Peso	0 – Inalterado
	1 – Perda de 1–5%
	2 – Perda de 6–10%
	3 – Perda de 11–20%
	4 – ; Perda superior a 20%
Consistência das fezes	0 – Normal ;
	1 - Macios, mas formados
	2 – Fezes soltas (não aquosas)
	4 – Diarreia (fezes líquidas)
Sangramento	0 – Nenhum
	2 – Fezes positivas para hematoocultismo
	3 – Sangue visível nas fezes
	4 – Sangramento grosseiro por reto
Prolapso Retal	0 – Ausente
	1 – Presente
Pontuação Total	Pontuação Total: Soma de (Pontuações de domínio) para cada domínio

Tabela 1: Pontuação de atividade da doença (DAI). Um sistema de pontuação para determinar a atividade da doença por perda de peso, consistência das fezes, sangue nas fezes e prolapso retal. Adaptado de Sifuentes-Dominguez, et al²⁶.

Dano tecidual					Infiltração de células inflamatórias da lâmina própria
Características		Envolvimento			Características		Envolvimento
0	Nenhum	1	1–25% da superfície		0	Infrequente	1	1–25% da superfície
1	Infrequente;	2	26–50% da superfície		1	Aumentou, alguns neutrófilos	2	26–50% da superfície
2	Erosões e ulcerações mucosas	3	51–75% da superfície		2	Presença submucosa de aglomerados celulares inflamatórios	3	51–75% da superfície
3	Danos extensos profundamente na parede intestinal	4	76–100% da superfície		3	Infiltrações de células transmurales	4	76–100% da superfície

Tabela 2: Sistema de pontuação histológica. Sistema de pontuação para determinar alterações histológicas e danos. Adaptado de Sifuentes-Dominguez, et al²⁶.

Discussão

A doença inflamatória intestinal é um distúrbio poligênico complexo onde modelos pré-clínicos servem como ferramentas inestimáveis para dissecar vias que contribuem para a patogênese da DII e desenvolver novas estratégias diagnósticas e terapêuticas. Atualmente, muitos modelos pré-clínicos de DII dependem da exposição química, como sulfato de dextrano sódico (DSS), oxazolona e ácido sulfônico trinitrobenzeno (TNBS), devido à facilidade de uso. Modelos genéticos que desenvolvem colite espontânea também estão disponíveis. Entre eles, o modelo IL-10-KO é particularmente valioso porque variações genéticas na via IL-10 são conhecidas por causar inflamação intestinal em humanos, e camundongos IL-10-KO desenvolvem enterocolite crônica espontânea que se assemelha a uma doença humana. No entanto, uma limitação importante desse modelo é sua incapacidade de explicar a variabilidade fenotípica. Embora a enterocolite se forme espontaneamente, seu início pode variar dependendo do histórico de cepa e das condições do vivário²⁷.

Ao combinar exposição química com um modelo genético, o protocolo descrito aqui fornece um modelo murino confiável e reprodutível de colite experimental. A enterocolite é acelerada em camundongos IL-10-KO pelo piroxicam, com início da doença em até 7 dias após a exposição à dieta fortificada com piroxicam. Esse protocolo permite a sincronização do desenvolvimento da colite. O modelo recapitula características observadas em outros modelos murinos comumente usados de colite, incluindo perda de peso, sangue nas fezes, diarreia, encurtamento do cólon, danos histológicos e alterações transcricionais. Além disso, esse modelo é reproduzível na amplamente utilizada cepa C57Bl/6J, que facilita a análise de defeitos gênicos adicionais associados à DII pela relativa facilidade de geração de camundongos portadores de mutações adicionais nessa cepa.

O modelo descrito aqui fornece uma ferramenta útil para estudar as mudanças metabólicas durante a inflamação intestinal. Neste modelo, camundongos expostos ao piroxicam que desenvolvem enterocolite acelerada continuam se alimentando normalmente sem uma diminuição significativa na ingestão diária. Isso indica que a perda de peso nesse modelo não se deve a uma alimentação comprometida, mas sim a fatores adicionais. Estudos adicionais são necessários para determinar se esses resultados se devem ao aumento do gasto calórico devido à inflamação, perda excessiva de calorias por diarreia ou termogênese comprometida. Além disso, camundongos machos e fêmeas apresentam padrões semelhantes de gravidade da doença, um achado que contrasta com observações anteriores feitas nos modelos IL-10-KO e^DSS 28,29,30.

Existem vários passos importantes para solucionar problemas e garantir a reprodutibilidade desse modelo. Primeiro, os camundongos devem estar acostumados ao manuseio e observação diária por uma semana antes da exposição ao piroxicam. Isso previne a perda de peso associada ao estresse. Segundo, as gaiolas devem conter no máximo três camundongos, e apenas camundongos que estejam alojados harmoniosamente devem ser incluídos no experimento. Ratos que apresentam comportamento de luta ou feridas de luta são mais suscetíveis ao desenvolvimento de colite e podem sucumbir antes da^{colheita 31,32}. Terceiro, se a ingestão de alimentos for monitorada durante todo o experimento, os camundongos devem ser alojados individualmente para permitir uma medição precisa do consumo de comida. Além disso, apenas pellets alimentares grandes e intactos devem ser colocados nos funis de alimentação para evitar que se desfaçam na cama, o que pode afetar as medições. Os métodos para quantificar a ingestão de alimentos descritos aqui estão alinhados com as diretrizes publicadas de consumo de alimentos^{para roedores 33}. Por fim, mudanças na gaiola devem ser evitadas durante o experimento, pois mudanças ambientais repentinas podem reduzir a ingestão de alimento por 1–2 dias, especialmente em camundongos jovens.

Esse protocolo possui várias limitações. Primeiro, a avaliação das alterações metabólicas se limita ao peso corporal e à ingestão de alimentos, enquanto outras medidas do metabolismo sistêmico, como razão de troca respiratória (RER), gasto energético e atividade física, não foram avaliadas. Além disso, os mecanismos subjacentes à perda de peso não foram investigados; Portanto, as contribuições relativas para a redução da ingestão de alimentos, alteração do gasto energético, má absorção e outros fatores associados à inflamação intestinal permanecem incertas. Segundo, apenas tecido cólon foi coletado e analisado, enquanto outros órgãos envolvidos na regulação metabólica, incluindo tecido adiposo, fígado e músculo esquelético, não foram examinados. Terceiro, esse protocolo foi desenvolvido usando camundongos C57BL/6 IL-10-KO, que podem apresentar suscetibilidade diferente à colite em comparação com outros contextos genéticos. Apesar dessas limitações, o protocolo pode ser facilmente adaptado para incorporar fenotipagem metabólica adicional e análise de tecidos extraintestinais, permitindo investigar os mecanismos subjacentes à perda de peso, bem como a relação entre inflamação intestinal e alterações metabólicas^{sistêmicas 34}, ou avaliação de novos nanomateriais^{anti-inflamatórios 35}. Além disso, a abordagem deve ser aplicável a outras cepas de camundongos IL-10-KO, embora estudos adicionais de validação sejam necessários.

Em resumo, os autores relatam um protocolo eficiente e reprodutível que simultaneamente induz enterocolite em múltiplos camundongos IL-10-KO e permite a avaliação do comportamento alimentar. Estudos adicionais são necessários para investigar os efeitos da enterocolite sobre o gasto energético e a composição corporal neste modelo, revelando assim conexões mais amplas entre a DII e o metabolismo do hospedeiro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10% buffered formalin	StatLab	28600-1	1 Galllon
27 G needles	BD	305109
Anti-S100A8 + S100A9 antibody	Abcam	AB288715
Balance	Fisher scientific	S94792D	Fisher Science Education Portable Balances, 300 g
Citrate buffer	Sigma Aldrich	C9999-1000mL
DI water	Fisher scientific	STLSL301
Dissecting forceps	Fisher scientific	22-327379
Ethanol, 100% 200 proof	Fisher scientific	NC1675398	Pharmco Products ETHYL ALCOHOL 200 PROOF
Ethanol, 190 proof, 95%	Fisher scientific	AC615110010
Ethanol, 80%	Fisher scientific	T08204K7
EZ-Quick Slide Staining Dish	IHC world	IW-2511	Staining jar
EZ-Quick Slide Staining Rack	IHC world	IW-2512	Slide rack
Feeding needle	Fisher scientific	NC9924986	22 gauge, 25 mm
Fine scissors	Fisher scientific	14060-11
Flat forceps	Fisher scientific	21-125-109
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555	Thermo Fisher	AB_2535849
Handheld homogenizer	Fisher scientific	15-340-167
HemoCue	Danlee Medical Products, Inc.	BCK 64151A	Hemoccult Dev/ Single Slide Test Cards - CLIA Waived
Hoechst 33342	Invitrogen	62249
IL-10 KO Mice	The Jason Laboratory	Strain #: 002251	IL10-KO mice, genotype: B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J
IVC mouse caging	Allentown	Mouse 500
Liquid nitrogen	Airgas	NI UHP300
Microscope cover glass	Fisher scientific	12541033
Nanodrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Normal Goat serum	Vector labs	S-1000-20
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Petri dishes	Fisher scientific	FB0875713
Piroxicam	Sigma Aldrich	P0847	supply to inotiv for preparation of custom animal diet
Piroxicam-fortified chow	Inotiv	Custom	200 ppm
Primer: Mouse GAPDH forward	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3' forward
Primer: Mouse GAPDH reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3' reverse
Primer: Mouse IFN-G forward	Sigma Aldrich	N/A	5' ACTGGCAAAAGGATGGTGAC 3' forward
Primer: Mouse IFN-G reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGAGCTCATTGAATGCTTGG 3' reverse
Primer: Mouse IL-10 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' CTTGCACTACCAAAGCCACA 3' (common)
Primer: Mouse IL-10 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTATTGTCTTCCCGGCTGT 3' (Wild type reverse)
Primer: Mouse IL-10 reverse (2)	Sigma Aldrich	N/A	5' CCACACGCGTCACCTTAATA 3' (Mutant reverse)
Primer: Mouse IL-1B forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCTGAAAGCTCTCCACCTCA 3' forward
Primer: Mouse IL-1B reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGCCACAGGTATTTTGTCG 3' reverse
Primer: Mouse IL-6 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTCTCTGGGAAATCGTGGA 3' forward
Primer: Mouse IL-6 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TTTCTGCAAGTGCATCATCG 3' reverse
Primer: Mouse TNF forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCAGGTTCTGTCCCTTTCAC 3' forward
Primer: Mouse TNF reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGTGCCTCTTCTGCCAGTTC 3' reverse
QuantStudio 7 Pro	Thermo Fisher	A43183
RNAlater solution	Invitrogen	AM7020	RNA Stabilization Solution, 100 mL
Rneasy mini kit	Qiagen	74104
SHURDry SD-II Slide Dryer	General data	SD-ll-120
Simport Scientific EasyDip Slide Staining Rack	Fisher scientific	22-038-494	Staining rack
SlowFade Gold antifade reagent	Invitrogen	S36936
Staining dish support	BioSB	BSB7086
Staintray IHC slide staining system	IHC world	M918-1	Humidified chamber for IHC
SuperScript VILO	Invitrogen	11755050
SYBR Green Master mix	Applied Biosystems	A46109
Tintoretriever pressure cooker	BioSB	BSB7008
Tissue cassettes	Fisher scientific	50-197-8152	Research Products International Corp Tissue Processing Cassette, Pink, 500 per Case
Xylene	Pharmco	399000000	1 Gallon