Artigo de método

Edição do Genoma em Células Primárias de Mamíferos por Eletroporação do RNA Editor

154 vistas

⸱

DOI:

10.3791/71449

⸱

31 de julho de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Institute for NanoBioTechnology, Johns Hopkins University

Neste artigo

Resumo

A entrega de editores genômicos como RNAs é um meio particularmente potente de modificar os genomas das células primárias e linhagens celulares de mamíferos. O objetivo desse protocolo é entregar editores genômicos como mRNA em células e linhagens celulares primárias de mamíferos, seguido por sequenciamento e análise direcionados da Illumina para quantificar os resultados da edição.

Resumo

Editores CRISPR, incluindo nucleases, editores de bases e editores principais, podem corrigir de forma eficiente variantes genéticas causadoras de doenças ou perturbar genes-alvo. Os resultados da edição são comumente avaliados em células primárias cultivadas, células derivadas do paciente ou linhas celulares modificadas para estudar o impacto da variação genética ou como primeiro passo antes de iniciar estudos em animais ou tradução clínica. A entrega de editores como mRNA juntamente com RNAs guia sintéticos em células de mamíferos pode melhorar a eficiência de edição em relação a abordagens baseadas em plasmídeos e evitar que problemas como integração de DNA ou edição fora do alvo sejam transmitidos de expressão sustentada. Este artigo apresenta um fluxo de trabalho para preparar mRNA do editor genômico por transcrição in vitro (TVI), incluindo co-transcrição caping e nucleotídeos quimicamente modificados, mRNA editor eletroporado e RNAs guiar RNAs em fibroblastos humanos primários, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ou linhagens celulares linfoblastoides (LCLs), e quantificar os resultados da edição por meio de sequenciamento direcionado de amplicons em uma plataforma Illumina seguido de análise usando CRISPResso2. Esse fluxo de trabalho permite benchmarking quantitativo de RNAs guia, parâmetros de eletroporação e variantes do editor, além de apoiar aplicações posteriores como clonagem de célula única, ensaios fenotípicos, estudos pré-clínicos em animais e desenvolvimento terapêutico.

Introdução

A edição eficiente do genoma em células primárias de mamíferos apoia a geração de modelos genéticos e a avaliação pré-clínica de estratégias terapêuticas candidatas. Avanços recentes em tecnologias baseadas em CRISPR, incluindo edição de bases e edição primária, possibilitam modificações precisas de nucleotídeos sem introduzir quebras de DNA de fita dupla, melhorando assim a pureza dos resultados daedição 1,2. Essas tecnologias foram aplicadas com sucesso em estudos de modelagem de doenças e edição terapêutica do genoma, incluindo estratégias para corrigir variantes que levam à doençafalciforme 3 e à fibrosecística 4.

Uma estratégia particularmente eficiente para entregar componentes de edição genômica às células de mamíferos é a eletroporação de mRNA transcrito in vitro (IVT) que codifica a enzima de edição combinada com RNAs guia sintéticos (gRNAs). A entrega de mRNA permite a expressão transitória dos editores genômicos, minimizando a atividade prolongada das nucleases e reduzindo a probabilidade de eventos de edição fora do alvo. Avanços na tecnologia de TVI melhoraram a eficiência, o rendimento e a qualidade da síntese de mRNA 4,5,6. Modelos de DNA plasmídico e modelos de DNA derivados de PCR são comumente usados para transcrição in vitro e apresentam vantagens e limitações distintas. Neste protocolo, modelos gerados por PCR são preferidos para evitar problemas associados à propagação de longos trajetos poli(A) em plasmídeos, que são propensos à recombinação e variabilidade do comprimento. No entanto, o uso de templates de PCR, conforme descrito neste protocolo, requer um primer reverso caro que abriga a cauda poli(A) de 120 nucleotídeos, e a PCR pode ser mais propensa a erros do que a propagação bacteriana de plasmídeos para sequências não codificadas nos primers. Como alternativa, provedores comerciais como Elegen e 4basebio podem fornecer modelos de DNA de alta fidelidade, oferecendo uma opção confiável, embora mais cara, para gerar modelos de transcrição.

O design cuidadoso do RNA é outro componente crítico para experimentos bem-sucedidos de edição do genoma. Diversas ferramentas computacionais foram desenvolvidas para ajudar pesquisadores a identificar sequências ótimas de gRNA com base na eficiência prevista no alvo e na atividade mínima fora do alvo. Plataformas amplamente utilizadas incluem CHOPCHOP e CRISPOR, que permitem a identificação de sequências de guias compatíveis com os requisitos de motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) das enzimas Cas e fornecem métricas de pontuação para priorizar guias candidatos com alta atividade prevista eespecificidade 7,8. Os princípios fundamentais e as melhores práticas para o projeto de RNA guia foram amplamente descritos na literaturaCRISPR 9,10,11,12,13.

A eletroporação é comumente usada para entregar reagentes de edição genômica a células de mamíferos porque pode alcançar alta eficiência de entrega em tipos celulares que normalmente são resistentes a abordagens de transfecção à base de lipídios. A eletroporação permeabiliza transitoriamente a membrana celular, permitindo que ácidos nucleicos exógenos, como mRNA e gRNAs, entrem no citoplasma. Protocolos otimizados de eletroporação foram desenvolvidos para múltiplos tipos celulares de mamíferos, incluindo células primárias, fibroblastos, linhagens celulares linfoblastoides e células-tronco pluripotentesinduzidas 14. Plataformas comerciais de eletroporação, como os sistemas Lonza 4D e Amaxa, oferecem programas e reagentes específicos para tipos de células, projetados para melhorar a eficiência da entrega enquanto mantêm a viabilidade celular. Sistemas de eletroporação de alta produtividade, como a plataforma Amax de 96 poços, permitem ainda mais experimentos escaláveis de edição genômica em múltiplas condições experimentais. O sistema de eletroporação Neon também é comumente utilizado, mas não é o foco desse protocolo.

Após a entrega dos componentes de edição do genoma, os resultados da edição são tipicamente avaliados usando sequenciamento de próxima geração (NGS) direcionado da região genômica ao redor do local de edição. Bibliotecas de sequenciamento são geradas por amplificação por PCR do locus alvo, seguida por indexação e sequenciamento de alta produtividade. As leituras de sequenciamento resultantes são analisadas usando pipelines bioinformáticos especializados projetados para experimentos de edição do genoma. Neste protocolo, os resultados da edição são quantificados usando o CRISPResso2, uma plataforma computacional amplamente utilizada que permite a análise detalhada dos resultados da edição do genoma a partir dos dados desequenciamento 15. O CRISPResso2 alinha as leituras de sequenciamento a uma sequência de referência e quantifica os resultados da edição, incluindo eficiência geral de edição, frequências de inserção-deleção (indel), substituições precisas de nucleotídeos e distribuições de edição na região alvo. O software também fornece visualizações gráficas e resumos estatísticos que facilitam a comparação entre condições experimentais e a otimização dos parâmetros de edição.

Juntos, a integração da produção de mRNA de IVT de alta qualidade, a entrega otimizada por eletroporação e a análise de sequenciamento de alta resolução fornecem um fluxo de trabalho robusto para avaliar estratégias de edição genômica em células cultivadas (Figura 1). Essa abordagem permite a otimização iterativa da eficiência da edição, especificidade e parâmetros experimentais antes de avançar estratégias de edição genômica para estudos in vivo e potenciais aplicações terapêuticas.

Protocolo

Declaração de ética:
Todos os procedimentos envolvendo linhagens celulares de origem humana foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e protocolos aprovados.

1. Gerar molde linear de DNA usando PCR

Atenção: Realize todas as etapas de RNA usando consumíveis e superfícies de trabalho livres de RNase. Considere os editores de mRNA listados e suas diferentes variantes ao selecionar o editor apropriado para a modificação genômica pretendida (Tabela 1).

  1. Monte a reação de PCR no DNA plasmídico extraído de bactérias usando um miniprep ou kit midiprep. Use 20 ng de DNA plasmídico por reação de PCR de 50 μL com a enzima NEBNext Ultra II Q5 Master Mix, montando a PCR conforme descrito na Tabela 2.
    1. Use um primer frontal que corrija o promotor T7 inativo no plasmídeo, o que impede a transcrição circular.
    2. Use um primer reverso que introduza uma cauda poly(A)₁₂₀ de 120 nts para apoiar transcrição eficiente e estabilidade do mRNA.
    3. Use N1-metil-pseudouridina no lugar do uracilo e inclua o CleanCap AG para melhorar a tradução do mRNA e reduzir a ativação imuneinata 1,2,3,4 (Figura 1).
      NOTA: Outros análogos nucleotídicos e reagentes de condensação estão disponíveis, mas estes têm apresentado alta atividade consistentemente em mRNAs de edição genômica. A entrega baseada em nanopartículas é uma alternativa adequada, mas não é discutida neste protocolo.
  2. Amplifique a sequência de codificação do editor por PCR por 30 ciclos usando primers que introduzam um promotor T7 funcional a montante da região codificadora e uma sequência poly(A) a jusante (Tabela 2 e Tabela 3).
    NOTA: A sequência de nucleotídeos do molde de TVI está sublinhada na tabela 4.
  3. Verifique e purifique o produto de PCR
    1. Execute 5 μL do produto PCR em um gel de agarose a 1% em um tampão TE a 180 V por 30 minutos. Confirme a presença de uma única banda em aproximadamente 4000-6500 pb (dependendo do editor transcrito) antes de prosseguir para a purificação do produto por PCR.
    2. Purifique o produto de PCR usando um kit de limpeza de PCR (Tabela de Materiais).
      NOTA: Se forem observadas múltiplas bandas ou má qualidade do produto PCR, otimize as condições de termociclo (Tabela 5 – Tabela de Solução de Problemas).
    3. Quantifique o DNA purificado usando um ensaio fluorométrico de dsDNA. Para a análise de dsDNA de Qubit, prepare a mistura mestre de corante tampão combinando 796 μL da solução de trabalho de alta sensibilidade do Qubit com 4 μL de corante, ambos fornecidos no kit.
    4. Em tubos separados, misture 198 μL da mistura mestre tampão-corante com 2 μL do padrão de baixa concentração S1, padrão de alta concentração S2 e a amostra. Insira cada padrão e amostra conforme solicitado no instrumento fluorômetro Qubit para medir a concentração do stock.
      NOTA: Se as amostras estiverem acima da faixa de análise, diluições podem precisar ser preparadas.

2. Transcrever o mRNA

  1. Prepare a reação IVT no gelo usando a RNA polimerase T7, NTPs, um análogo de condensação para o capping co-transcricional, e N1-metil-pseudouridina trifosfato como substituto da uridina para reduzir a ativação imuneinata 1˒5˒6.
  2. Prepare a mistura de reação de TVI conforme a Tabela 4. Use a sequência de modelos anotados fornecida na Tabela 4. Monte cada reação de transcrição em um volume final de 40 μL.
  3. Prepare de 5 a 10 tubos de reação para gerar mRNA suficiente para múltiplos experimentos. Cada reação de 40 μL gera aproximadamente 100 μg de mRNA. Com 1 μg de mRNA usado para eletroporação de edição primária e 3 μg de mRNA usado para eletroporação de edição de bases, isso é suficiente para ~33–100 eletroporações.
  4. Transcreva o RNA
    1. Misture bem a reação da TVI pipeteando. Incube a reação a 37 °C por 2 horas.
  5. Purificar o RNA
    1. Transfira para um tubo de 1,5 mL e adicione uma solução de 7,5 M de cloreto de lítio (LiCl) à reação da TVI em volume igual a metade do volume total da reação para alcançar uma concentração final de LiCl de 2,5 M. Para uma reação de IVT de 40 μL, adicione 20 μL de 7,5 M LiCl. Misture bem pipetando suavemente.
    2. Incube a reação a -20 °C por 30 minutos. Centrifuge a amostra a 16.000 × g a 4 °C por 15 minutos.
    3. Remova o sobrenadante com uma pipeta e descarte-o. Lave o pellet com 1mL de etanol 70% a 4 °C. Não é necessário perturbar a bola. Centrifuge a 16.000 × g a 4 °C por 5 minutos.
    4. Remova completamente o etanol e deixe o pellet secar ao ar livre por 1-2 minutos em um armário de biossegurança livre de RNase. Não ressalte pellets demais, pois pode ser difícil resuspendê-lo.
  6. Resuspenda e quantifique o RNA
    1. Resuspenda o RNA em água livre de nuclease. Inicialmente, resuspenda cada reação em 50 μL de água livre de nuclease e dilua ainda mais após medir a concentração de RNA. Quantifique o RNA usando um ensaio fluorométrico de RNA, como o nanodrop.
      Ponto de pausa: Após a quantificação do RNA e a aliquotação, armazene as alíquotas do mRNA a -80 °C até a eletroporação. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento; Descongele cada aliquota apenas uma vez antes do uso.
    2. Confirme que o rendimento de mRNA purificado é aproximadamente 100-400 μg por reação IVT de 40 μL. Dilua o mRNA para 2 μg·μL-1 com água sem nuclease antes de alicotar. Armazene as aliquotas a −80 °C.
      NOTA: Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Prepare alíquotas descartáveis e descarte o material descongelado não utilizado. Prepare 12,5 μL de alíquotas em tiras de PCR para 8 a 20 eletroporações por alíquota.
  7. Avaliar a integridade do RNA
    1. Avalie o tamanho e a integridade do RNA por eletroforese em gel de agarose ou eletroforese automatizada (Figura 2)
    2. Prepare um gel de agarose 0,8% contendo ouro SYBR diluído 10.000x. Use uma escada de RNA de fita simples, como o Marcador de RNA NEB.
    3. Desnature o mRNA usando 2x Gel Loading Dye de RNA e aqueça amostras a 65 °C por 10 minutos antes de carregar as amostras no gel.
    4. Confirme que o mRNA aparece como uma faixa predominante em aproximadamente 4000-6500 nt, dependendo do editor transcrito, com slapping mínimo ou produtos de baixo peso molecular. Descarte amostras de RNA que mostrem degradação substancial, borrão ou múltiplas faixas inesperadas.

3. Projeto e preparação de RNAs guia

NOTA: Identifique sequências de motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) dentro do locus genômico alvo e selecione RNAs guia que sejam compatíveis com o editor escolhido e a modificação genômica pretendida. Plataformas de design de RNAs guia, como CHOPCHOP, CRISPOR, CRISPRware, IDT Cas9 Checker, Benchling e VectorBuilder, podem ser usadas para priorizar RNAs guia com atividade e especificidade favoráveisprevistas 6,7,8,9,10,11,12,13.

  1. Identifique sítios de PAM dentro do locus genômico alvo que sejam compatíveis com a variante de nuclease selecionada, incluindo variantes compatíveis com NGN, utilizando ferramentas de design de RNA guia.
  2. Selecione RNAs guia com alta atividade prevista no alvo e baixa atividade prevista fora do alvo. Confirme a janela de edição do RNA do guia.
  3. Para aplicações de edição base ou edição principal, selecione RNAs guia que posicionem a edição pretendida dentro da janela de atividade ótima do editor selecionado.
  4. Ordem sgRNA ou pegRNA contendo análogos de 2'-O-Metil-base para os primeiros 3 e últimos 3 nucleotídeos, assim como ligação de 3' fosforotioato entre as primeiras 3 e as últimas 2 bases dos guias.
  5. Ressuspenda os RNAs-guia em água livre de nuclease ou em buffer TE (100μM). Prepare alíquotas de 5 μL e armazene as alíquotas a −80 °C. No momento do uso, descongele e dilua em um tampão de eletroporação antes da eletroporação.

4. Preparação de cultura celular

NOTA: Avalie a integridade celular por microscopia e ensaios de viabilidade antes da eletroporação.

  1. Cultive fibroblastos primários ou células HEK293T em DMEM suplementados com 10% de FBS, 4,5 g· L-1 glicose, GlutaMAX e 110 mg· L-1 piruvato de sódio. Placar as células em frascos estéreis de T75 (superfície do TC) com confluência de 20% por frasco. Mantenha as células entre as passagens 1 a 20. Divida células com 80% de confluência e use células com 70-80% de confluência para eletroporação.
  2. Cultive células-tronco pluripotentes em meios mTeSR Plus. Placar as células em frascos estéreis de T75 revestidos com Geltrex com confluência de 20% por frasco. Troque o meio diariamente e mantenha as células entre as passagens 1 a 20. Adicione o coquetel CEPT ao suporte para as 24 horas seguintes a cada passagem. Divida células com 80% de confluência e use células com 70-80% de confluência para eletroporação.
  3. Mantenha as células a 37 °C em 5% de CO₂ até que atinjam a densidade adequada para eletroporação, tipicamente 70%–80% de confluência.
  4. Remova o meio quando as células estiverem em número e confluência apropriados para a eletroporação.
  5. Adicione a Enzima TrypLE Express às células (1 mL para um frasco T75) e incube a 37 °C por 5 minutos. Pipeque suavemente as células contra o frasco para obter uma suspensão de célula única. Pare a dissociação adicionando 3 mL de meio de cultura celular e confirme a ausência de grandes aglomerados celulares antes de contar.
  6. Faça pellets nas células a 1.000 × g por 5 minutos, lave as células uma vez com 15 mL de soro salino tamponado com fosfato (DPBS) de 15 mL e centrifuge novamente as células.
  7. Avalie a concentração e viabilidade celular usando um ensaio automatizado de viabilidade, como o Nucleocontador NC-3000 com Solução 13. Combine 11,4 μL de células com 0,6 μL de Solução 13 antes da medição no Nucleocontador. Prossiga com a eletroporação somente quando a viabilidade da célula estiver em pelo menos 85%, e descarte ou reprepare as amostras abaixo desse limite.
  8. Resuspenda as células com uma densidade de aproximadamente 0,5 × 106–2 × 106 células·mL-1 em DPBS. Conte as células e avalie a viabilidade usando um hemocitômetro ou contador celular.
  9. Prossiga somente se a viabilidade da célula for ≥ 85%.
  10. Resuspenda as células no buffer de eletroporação. Resuspenda 2 × 105 células em 5 μL de tampão de eletroporação fria por reação.
  11. Prepare o tampão de eletroporação com a solução do suplemento de acordo com as instruções do fabricante imediatamente antes do uso e mantenha o tampão em gelo.
  12. Mantenha as células frias e proceda rapidamente. Mantenha as células no gelo e proceda imediatamente para a instalação de eletroporação.

5. Eletroporação

NOTA: Prepare a edição da carga em tubos de tira de PCR para facilitar a pipetagem multicanal. Após a eletroporação, ressuspenda as células em meio suplementado com coquetel CEPT para aumentar a sobrevivênciacelular 12.

  1. Prepare a carga de RNA.
    1. Prepare a carga de RNA no gelo combinando o mRNA editor e os RNAs guia em buffer de eletroporação.
    2. Para editores de bases e nucleases, prepare uma solução final de eletroporação contendo 1,5 μL (3 μg) de mRNA, 0,5 μL (50 pmol) de RNA-guia e 15 μL de tampão de eletroporação por amostra.
    3. Para editores primários, prepare uma solução final de eletroporação contendo 0,5 μL (1 μg) de mRNA, 1,5 μL (150 pmol) de RNAs-guia e 15 μL de tampão de eletroporação por amostra.
    4. Prepare as soluções de carga de RNA como uma mistura mestra de 1,2× para compensar a perda de volume durante a transferência e o manuseio da amostra. Otimize os volumes e as proporções de reagentes para cada site-alvo e variante do editor conforme necessário.
  2. Dispense as células, a carga e eletropore.
    1. Adicione 5 μL da suspensão da célula a cada poço de eletroporação.
    2. Adicione 17 μL de carga de RNA em tampão de eletroporação a 5 μL de células. Misture a suspensão pipetando duas vezes.
      Atenção: Proceda rapidamente após combinar as células e a carga de RNA, pois as RNases secretadas pelas células podem degradar rapidamente o mRNA editor. Conclua a eletroporação em até 2 minutos após misturar as células e a carga de RNA.
    3. Execute o programa de eletroporação otimizado para o tipo de célula selecionado (Tabela 6; Figura 2; Figura 3).
      1. Para fibroblastos primários da pele humana ou células HEK293T, use o sistema de eletroporação Lonza 4D com SF tampão. Adicione 200.000 células por reação a uma cuveta de eletroporação de 20 μL. Execute o programa CM-130. Adicione imediatamente 80 μL de DMEM pré-aquecido + 10% FBS, 4,5 g· L-1 glicose, 4 mM de L-glutamina e 110 mg· L-1 piruvato de sódio. Recupere as células por 10 minutos antes de diluir em placas de 96 ou 24 poços.
      2. Para células-tronco pluripotentes, utilize o sistema de eletroporação Lonza 4D com tampão P3. Adicione 200.000 células por reação a uma cuveta de eletroporação de 20 μL. Execute o programa DN-100. Adicione imediatamente 80 μL de meio mTeSR Plus pré-aquecido. Recupere as células por 10 minutos antes de diluir em placas de 24 poços.
    4. Examine as células diariamente após a blindagem para monitorar a saúde e a recuperação celular.

6. Extração de DNA genômico

NOTA: Certifique-se de que o DNA genômico seja de qualidade suficiente e livre de inibidores antes da amplificação por PCR, pois a qualidade do DNA pode afetar a preparação da biblioteca de sequenciamento e a quantificação precisa dos resultados de edição dogenoma 9,10,11.

  1. Lave e colha as células.
    1. Colete as células 2-3 dias após a eletroporação. Lave as células uma vez com DPBS e proceda imediatamente à extração genômica de DNA.
    2. Prepare o tampão de lise incompleto combinando 10 mL de 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 5 mL de solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10% (p/vol) e água sem nuclease em um volume final de 1 L. Armazene o tampão de lise incompleto em temperatura ambiente por até 6 meses.
    3. Prepare o tampão de lise completo na hora, adicionando a proteinase K em diluição 1:1.000 (vol/vol) a uma alíquota do tampão de lise incompleta. Adicione o buffer completo de lise às células para iniciar a lise. Adicione 40 μL de tampão completo de lise a cada poço contendo aproximadamente 80.000 células em uma placa de 96 poços. Não faça pipet para cima e para baixo, pois isso pode causar perda de amostras.
  2. Digere as amostras.
    1. Incubar as amostras a 37 °C por 60 minutos para completar a lise celular e a digestão da proteinase K.
  3. Iative a proteinase K.
    1. Transfira os lisados para tubos de PCR ou para uma placa de PCR de 96 poços. Incube as amostras a 80 °C por 30 minutos para inativar a proteinase K.
  4. Armazene os lisados.

Ponto de Pausa: Armazene os lisados a −20 °C até a amplificação por PCR.

7. Sequenciamento direcionado de amplicons para edição de análise

NOTA: Agrupe produtos de PCR em quantidades equimolares antes do sequenciamento. Aproximadamente 10.000 leituras de sequenciamento por amostra são geralmente suficientes para quantificar os resultados da edição genômica em massa.

  1. Projete primers específicos para o locus para gerar amplicons de aproximadamente 300 pb, abrangendo pelo menos 25 pbbs a montante e 25 pbbs a jusante do local de edição (Tabela 7).
  2. Amplifique o locus genômico alvo realizando PCR1 de acordo com as condições fornecidas na Tabela 8, Tabela 9.
  3. Adicione índices de amostra únicos por PCR usando o produto PCR1 como modelo, como com os primers mostrados na aba "Exemplo de primários de indexação de PCR" na Tabela 7 . Use as condições de PCR conforme mostrado na aba 2 da Tabela 8 e na Tabela 9.
  4. Rode os produtos PCR1 e PCR2 em um gel de agarose a 1,5% para confirmar a presença de bandas simples nos tamanhos esperados.
  5. Agrupe os produtos PCR2 em quantidades equimolares. Limpe a biblioteca PCR2 em pool usando a relação AMPure XP para estalon/amostra de 0,65:1, conforme as instruções do fabricante. Elude a biblioteca purificada em 30 μL de água livre de nuclease e confirme a remoção dos dímeros adaptadores por eletroforese em gel antes do sequenciamento.
  6. Quantifique a biblioteca final agrupada usando um ensaio fluorométrico de dsDNA. Avalie a distribuição do tamanho dos fragmentos por eletroforese capilar.
  7. Sequencie as bibliotecas usando leituras de 300 ciclos de extremidade única em um instrumento Illumina MiSeq. Dilua a biblioteca final agrupada para 4 nM. Combine 5 μL da biblioteca agrupada de 4 nM com 5 μL de 0,1 M NaOH e pipeta para misturar. Incube por 5 minutos em temperatura ambiente para desnaturar, depois adicione 990 μL de tampão HT refrigerado fornecido com o kit MiSeq para neutralizar a solução e dilua até 20 pM. Pico no controle de PhiX de 15%. Carregue a biblioteca em um cartucho Illumina MiSeq e execute sequenciamento de 300 ciclos em extremidade única usando as configurações padrão de execução do fabricante. Busque gerar aproximadamente 30.000 leituras por amostra, embora 10.000 leituras por amostra sejam suficientes para a análisede edição 12. O sequenciamento MiSeq pode ser feito por amostra em algumas empresas, como Genewiz ou Quintara.

8. Análise dos resultados da edição genômica

Nota: A análise CRISPResso2 permite quantificar a eficiência geral de edição, frequências de conversão de nucleotídeos e frequências de inserção/deleção (indel), podendo ser usada para caracterizar resultados de edição em condiçõesexperimentais 15.

  1. Desmultiplexe os dados de sequenciamento e organize os arquivos FASTQ de acordo com o locus genômico e a condição experimental.
  2. Instale o CRISPResso2 de acordo com as instruções fornecidas no repositório do Github (https://github.com/pinellolab/crispresso2).
  3. Execute a análise em lote CRISPResso2 usando arquivos batch.txt que especificam os arquivos FASTQ de entrada e parâmetros de análise (exemplos fornecidos na Tabela 7). Defina a pontuação mínima de qualidade de leitura para 30. Defina a largura da janela "w" para 20. Se usar editores de bases de citosina, alguns indels podem ser centrados em torno dos nucleotídeos editados pela base além do sítio nick. Nesse caso, ajuste o centro da janela "wc" para -10 em vez do centro padrão no local do nick para capturar melhor esses indels.
  4. Extraia saídas quantitativas, como as frequências de conversão de nucleotídeos, frequências de inserção/deleção (indel) e (se aplicável) frequências HDR ou de edição primária, a partir dos arquivos de resumo apropriados. Esses arquivos geralmente são encontrados em arquivos chamados "CRISPRessoBatch_quantification_of_editing_frequency.txt" e "Nucleotide_percentage_summary.txt", que podem ser abertos no Microsoft Excel ou em outros softwares de edição de planilhas.
  5. Exporte os valores quantitativos de edição para gráficos posteriores e interpretação de dados, como nas Figuras 3-4. Use os arquivos "alleles_frequency_table_around_sgRNA.pdf" (como mostrado na Figura 5) para avaliar os resultados da edição alélica.

Resultados

Usar um editor eficiente com um site de teste de fácil acesso, como o editor base ABE8e com o site de controle HEK3, pode frequentemente resultar em eficiências de edição acima de 90% se o sistema de entrega for adequado para as células usadas no experimento. Eficiências de edição menores podem ocorrer se houver problemas com o mRNA do editor, RNA guia, o site-alvo ou as condições de entrega que tornam qualquer um menos adequado para a edição. Usar variantes do Cas9 que acessam sequências PAM mais versáteis, mas as vinculam menos de forma mais rígida, ou direcionar editores para nucleotídeos que estão fora da janela ideal de edição, pode reduzir a eficiência da edição. MRNAs editores gerados por IVT bem-sucedidos normalmente aparecem como uma única faixa predominante com slapping mínimo ou produtos de degradação de baixo peso molecular, indicando alta integridade de transcritos adequada para eletroporação a jusante (Figura 2).

Após a eletroporação do mRNA editor e dos RNAs guias sintéticos, a maioria das células se recupera em 24–48 horas e mantém sua morfologia típica com programas adequados de eletroporação (Figura 3–4). As condições de eletroporação devem ser adaptadas ao tipo específico de célula, pois diferentes tampões podem gerar resultados marcadamente distintos. O Centro de Conhecimento Online Lonza faz recomendações para códigos de buffer e eletroporação para tipos celulares comuns, e a Lonza oferece kits de otimização separados para linhas celulares e células primárias. A comparação empírica dos buffers pode ajudar a identificar condições ideais para uma entrega eficiente. Programas inadequados podem levar à ausência total de entrega ou ser altamente tóxicos para as células (perdendo mais de 50% ou impedindo a continuação do ciclo celular). Experimentos de otimização representativa demonstraram diferenças substanciais nos resultados de edição entre condições de eletroporação, com alguns programas gerando altas eficiências de edição enquanto outros produziram edição mínima, destacando a importância da otimização empírica para cada tipo de célula (Figura 3–4).

Em iPSCs, fibroblastos e LCLs, o sequenciamento direcionado do amplicon, seguido pela análise CRISPResso2, é utilizado para quantificar a eficiência da edição e os subprodutos (Figura 4). A edição de bases de adenina do locus de teste HEK3 é mostrada aqui (Figura 4), que resultou nas conversões de nucleotídeos pretendidas com baixas frequências de indel nas amostras analisadas. A análise CRISPResso2 permite a visualização de alelos editados e não editados no locus alvo e facilita a quantificação das conversões de nucleotídeos pretendidas, frequências indel e outros subprodutos de edição, fornecendo uma avaliação abrangente dos resultados da edição (Figura 5). A eficiência de edição é quantificada medindo a frequência dessa substituição precisa de nucleotídeo único no sítio alvo. O locus HEK3 é usado como locus de modelo devido ao seu perfil de edição bem caracterizado e à reprodutibilidade em sistemas experimentais, permitindo uma avaliação robusta do desempenho de edição base sob diferentes condições. Recomendamos testar este guia como controle positivo em células humanas ao otimizar novos procedimentos de edição. A edição de bases é tipicamente enriquecida para conversões de nucleotídeos pretendidas com baixas frequências indel, enquanto a edição primária produz uma mistura de edições precisas e subprodutos de baixafrequência 3,12. As eficiências de edição variaram entre condições, com diferenças claras observadas entre tipos de células e programas de eletroporação (Figuras 3-4). Essas variações provavelmente refletem diferenças na absorção celular, viabilidade e atividade de reparo do DNA, bem como a influência dos parâmetros de eletroporação na eficiência da administração. Coletivamente, esses achados destacam a importância da otimização específica do tipo celular das configurações de eletroporação para alcançar resultados consistentes e máximos de edição.

figure-results-1
Figura 1. Preparação do mRNA do editor por transcrição in vitro.
Visão geral esquemática da geração de mRNA do editor. (Passo 1) Preparação do molde plasmídico contendo a sequência codificadora do editor e o promotor T7. (Passo 2) Amplificação por PCR para gerar um molde linear de DNA. (Passo 3) Transcrição in vitro usando a RNA polimerase T7 para sintetizar mRNA capado. (Passo 4) Purificação de mRNA para remover DNA mole, enzimas e nucleotídeos livres. O mRNA condensado resultante é adequado para entrega a jusante em células de mamíferos por eletroporação ou nanopartícula lipídica. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-2
Figura 2. Exemplo de imagem de eletroforese em gel de mRNA 
Imagem eletroforese de três mRNAs editores do genoma rodadas em um gel de agarose a 1% usando coração de ouro SYBR. A escada de ssRNA do NEB é mostrada à esquerda, com marcadores de tamanho indicados pelo comprimento. A ausência de manchas substanciais ou pequenas bandas indica que esses mRNAs são de qualidade adequada. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-3
Figura 3. Otimização das condições de eletroporação para edição genômica em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). 
São mostradas eficiências de edição obtidas sob diferentes condições de eletroporação em iPSCs. As células eram eletroporadas usando múltiplos buffers e combinações de programas, incluindo o buffer CB-150 P4, buffer CD-118 P3, buffer DN-100 P3, buffer DC-100 P3, todos no dispositivo de Nucleofecção Lonza 4D. A edição foi avaliada usando o dispositivo de eletroporação Neon com parâmetros (1600 V, 20 ms, 1 pulso). A eficiência da edição foi quantificada por análise de sequenciamento direcionada do locus editado. N=1 por amostra. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-4
Figura 4. Otimização das condições de eletroporação para edição genômica em fibroblastos.
Eficiência de edição após eletroporação usando diferentes programas de nucleofecção. Fibroblastos foram eletroporados usando múltiplos programas Lonza Nucleofector (CA-137, CM-138, DS-150, EH-100, EN-150, EO-114 e FF-113), e os resultados da edição foram quantificados por sequenciamento direcionado. Os resultados são mostrados para duas réplicas (P2, P3). Um controle negativo sem entrega do editor está incluído. A comparação dos códigos de eletroporação destaca diferenças na eficiência de edição entre as configurações de eletroporação, permitindo a identificação de parâmetros ideais para a edição do genoma dos fibroblastos. N=1 por amostra. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-5
Figura 5. Caracterização dos resultados da edição genômica no locus-alvo. 
Saída da tabela de frequência de alelos do CRISPResso2, que mostra a abundância relativa de alelos editados e não editados ao redor da região alvo do sgRNA, conforme determinado por análise de sequenciamento de alta taxa após a edição. Anotações vermelhas indicam a janela de edição da base e o polimorfismo heterozigoto pré-existente presente na linhagem celular utilizada. A sequência do espaçador de RNA guia é sublinhada em cinza. A "posição prevista de clivagem" mostrada por uma linha pontilhada é deslocada em relação à posição típica de "PAM menos 3" para SpCas9 devido à modificação do "wc" do centro da janela em nosso Arquivo de Análise (exemplo na Tabela 8). Isso não muda a verdadeira localização prevista da clivage, mas a saída é mostrada dessa forma para indicar que indels ao redor da linha pontilhada dentro de uma janela de 20 nucleotídeos serão avaliados, capturando tanto os indels centrados no verdadeiro sítio de corte quanto aqueles centrados nos nucleotídeos desaminados. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1. Editores e sequências utilizadas neste estudo 
Coluna 1: Editores de genoma disponíveis no AddGene para transcrição in vitro. Nomes e IDs de Addgene para plasmídeos disponíveis que sejam passíveis de transcrição in vitro conforme descrito neste protocolo. Coluna 2: Sequências de espaçadores de RNA-guia usados neste estudo. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2. Reagentes PCR para amplificação do molde do plasmídeo de mRNA.
A lista de reagentes e componentes de reação usados para amplificação por PCR do molde plasmídico para gerar DNA linear para aplicações posteriores, bem como a sequência dos primers de transcrição direta e reversa. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3. Condições de ciclagem de PCR para amplificação do molde de mRNA. 
Esta tabela lista as condições de termociclagem usadas para a amplificação por PCR do molde de mRNA a partir do DNA plasmídico antes das aplicações posteriores. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 4. Reagentes usados para reações de transcrição in vitro (TVI). 
Esta tabela lista os reagentes e componentes de reação usados para transcrição in vitro para sintetizar mRNA editor a partir do molde linear de DNA. Uma sequência de template de exemplo (ABE8e) é mostrada com elementos codificados por cores. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 5. Guia de solução de problemas para etapas importantes no fluxo de trabalho de edição do genoma. 
Esta tabela resume questões técnicas comuns que podem surgir durante a preparação do mRNA do editor por transcrição in vitro (TVI) e análise por sequenciamento MiSeq. Para cada etapa do fluxo de trabalho, problemas potenciais, causas possíveis e soluções recomendadas são fornecidos para ajudar a otimizar a eficiência da edição e garantir a detecção precisa dos resultados da edição. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 6. Programas ótimos de eletroporação para diferentes tipos celulares de mamíferos. 
Esta tabela lista os códigos de programa de eletroporação e as condições de buffer usadas para a entrega eficiente de mRNA editor e para guiar RNAs em diferentes tipos celulares de mamíferos. Os parâmetros listados de eletroporação foram testados para identificar condições que maximizam a eficiência da edição do genoma enquanto mantêm a viabilidade celular. O mesmo programa pode não funcionar para cada linhagem celular ou fonte de células primárias, portanto testar alternativas desta lista é recomendado caso a edição inicialmente não tenha sucesso. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 7. Parâmetros de análise CRISPResso2 para quantificação dos resultados da edição do genoma. 
A primeira aba lista um exemplo do design do primer HTS1 usado para amplificação do locus alvo. A segunda aba fornece um exemplo dos primers de indexação usados durante a preparação da biblioteca. A terceira aba ilustra um exemplo da organização de indexação usada para atribuir índices únicos a cada amostra durante o sequenciamento. A quarta aba contém um arquivo batch de entrada de exemplo para análise CRISPResso2, e a quinta aba fornece um exemplo adicional de um arquivo batch de entrada de análise CRISPResso2. Note que o "wc" do centro da janela é ajustado para editores de bases para facilitar a detecção de indels centrados nas bases desaminadas, além daquelas centradas no corte ou local da nuclease. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 8. Reagentes PCR1 (Tab 1) e PCR2 (Tab 2) para preparação da biblioteca MiSeq.
Esta tabela lista os reagentes e componentes de reação usados na Aba 1 (PCR1) para amplificar os loci genômicos alvo e na Aba 2 (PCR2) para incorporar sequências de índice específicas para amostra e adaptadores de sequenciamento Illumina, gerando bibliotecas prontas para sequenciamento para análise MiSeq. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 9. Condições de ciclo PCR1 (Tab 1) e PCR2 (Tab 2) para preparação da biblioteca MiSeq.

Esta tabela lista as condições de termociclagem usadas na Aba 1 (PCR1) para amplificar as regiões genômicas alvo e na Aba 2 (PCR2) para incorporar sequências de índice específicas da amostra e adaptadores de sequenciamento Illumina, gerando bibliotecas prontas para sequenciamento para análise MiSeq. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussão

Esse protocolo fornece um fluxo de trabalho para edição genômica em células primárias de mamíferos usando eletroporação de mRNA editor e RNAs guia sintéticos. A entrega como mRNA tende a gerar uma edição mais eficiente em relação à entrega de plasmídeos, e o mRNA tende a ser mais simples e consistente entre os lotes em relação à proteína editor ou ribonucleoproteína. Quando as formas de mRNA e ribonucleoproteína de editores de bases foram comparadas diretamente em alguns trabalhos anteriores, o mRNA obteve melhor eficiênciade edição 3. Comparado aos métodos de entrega de plasmídeos ou virais, a entrega baseada em mRNA permite a expressão transitória e reduz o risco de integração genômica, embora possa exigir otimização para diferentes tipos celulares. Além da menor eficiência de edição, o uso de DNA plasmídico para edição genômica traz risco de integração aleatória no genoma das células-alvo e pode aumentar o risco de edição fora do alvo devido à expressão prolongada do editor. A combinação de sequenciamento direcionado por amplicões e CRISPResso2 permite a quantificação padronizada da eficiência de edição e a caracterização de quaisquer desfechosalélicos 3.

Vários fatores são vitais para o sucesso. Passos críticos neste protocolo incluem manter a integridade do RNA por meio de um manuseio rigoroso sem RNase, a seleção de RNAs guia ótimos e a otimização cuidadosa das condições de eletroporação para cada tipo celular. A integridade do RNA e o controle cuidadoso da RNase influenciam fortemente os resultados, e orientar a seleção do RNA permanece como um dos principais determinantes da eficiência e dos perfis de subprodutos. Configurações de eletroporação exigem otimização empírica por tipo celular e alguns programas que produzem alta edição também podem causar toxicidade. Se for observada baixa eficiência de edição, deve ser considerada a otimização dos parâmetros de eletroporação, qualidade do RNA ou design de RNA guia. Se ocorrer toxicidade excessiva, reduzir a força de eletroporação ou a entrada de RNA pode melhorar a viabilidade celular. Estratégias adicionais de otimização incluem o teste de buffers alternativos de eletroporação e programas adaptados ao tipo de célula alvo ou modificação das concentrações de RNA editoras ou guias. Esse fluxo de trabalho oferece uma plataforma prática para benchmarkar editores e produzir células modificadas antes da clonagem de célula única, fenotipagem, estudos in vivo ou desenvolvimento translacional a jusante. Esse fluxo de trabalho é amplamente aplicável para avaliar estratégias de edição genômica em células primárias, permitindo a comparação sistemática das modalidades de edição entre contextos genômicos e tipos celulares. Ele apoia a modelagem de doenças por meio da introdução ou correção de variantes clinicamente relevantes, bem como da interrogação funcional de elementos regulatórios codificantes e não codificantes. Além disso, oferece uma plataforma para otimizar abordagens de edição terapêutica, incluindo avaliação de eficiência no alvo, atividade fora do alvo e durabilidade da edição. O fluxo de trabalho também pode ser usado para triar e priorizar RNAs e sistemas de edição, avaliar estratégias de entrega e testar variantes específicas de cada paciente em um quadro de medicina de precisão. Coletivamente, ele serve como uma ponte versátil entre a biologia genômica básica, a pesquisa translacional e o desenvolvimento pré-clínico. Uma limitação desse método é que a eficiência da eletroporação e a viabilidade da célula podem variar substancialmente entre os tipos de células, exigindo otimização empírica. Além disso, os resultados da edição podem depender do design e pureza do RNA-guia, e da acessibilidade do locus alvo, o que pode limitar a reprodutibilidade entre diferentes sistemas experimentais. Apesar dessas limitações, a otimização cuidadosa dos parâmetros experimentais e do desenho dos guias pode mitigar a variabilidade, permitindo a aplicação confiável e reprodutível dessa abordagem em diversos sistemas celulares.

Divulgações

N.W. E E.V.B. registraram pedidos de patente sobre tecnologias de edição genômica através da Universidade Johns Hopkins. A G.A.N. já registrou pedidos de patente relacionados a tecnologias de edição genômica por meio do Broad Institute e da Johns Hopkins University.

Contribuição dos autores:
M.V., J.N.W., E.V.B, D.M.E., J.D. e G.A.N. redigiram seções separadas do texto. M.V. reuniu e editou o texto final, seguido de edições de todos os autores.

Agradecimentos

Agradecemos a Beatriz Olalla Sastre pelas discussões úteis relacionadas a este protocolo. Este trabalho foi apoiado pelo prêmio Big Beat Challenge da British Heart Foundation para o CureHeart (referência do prêmio nº BBC/F/21/220106), a Fundação de Fibrose Cística (prêmio NEWBY23XX0) e os Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (R00HL163805 e DP2OD038783 ao G.A.N.). J.N.W. agradece apoio da Subvenção NIH nº T32 GM148383.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1M Tris-HCl, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15568025
Agarose Thermo Fisher Scientific R0491 Agarose UltraPure 16500500 ThermoFisher 500g
AMPure XP SPRI Beads Beckman Coulter B23317 A63880, AMPure XP Beads for DNA Cleanup, 5 mL, Beckman Coulter
ATP (100 mM) New England Biolabs N0450 
CEPT Cocktail Bio-Techne / Tocris 7200 
CleanCap AG Reagent TriLink Biotechnologies N-7113 CleanCap AG 3′ OMe CleanScript IVT Kit, 125 x 20 µL rxns, 
CTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Custom DNA Primers Integrated DNA Technologies Custom 
DNA Loading Dye New England Biolabs B7024 
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific 14190-144 D8537-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965-092 DMEM High Glucose [4,500 mg/L] with [4.0 mM] L-Glutamine and [110 mg/L] Sodium Pyruvate, 500 mL
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 
GTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Illumina Indexing Primers Illumina FC-131-2001 10uM stocks
Illumina MiSeq Sequencer Illumina SY-410-1003 
Lithium Chloride RNA Precipitation Solution Thermo Fisher Scientific AM9480 
Lonza 4D Nucleofector System Lonza AAF-1002X 
ssRNA Ladder NEBNEBN0362S5ul/ reaction
MiSeq Reagent Kit v3 (300 cycles) Illumina MS-102-3002 
N1-Methyl-Pseudouridine-5′-Triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081 
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544 
Nuclease-Free Water Thermo Fisher Scientific AM9937 
NucleoCounter NC Slide A8 ChemoMetec 941-0008 
NucleoCounter NC-3000 ChemoMetec NC-3000 10ul of cell solution and 0.4167 μL of DAPI solution 
Solution 15, Hoechst 33342, 1 mL 910-3015 ChemometecChemometec910-3013 500 μg/ml ~ 0.9 mM ~ 0.05%
Nucleocuvette Strips Lonza V4XP-3032 
P3 Primary Cell Nucleofector Solution Lonza V4XP-3032 1 x 0.675 mL P3 Primary Cell Nucleofector® Solution
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530L 
Proteinase K Thermo Fisher Scientific EO0491 Quantity: 1mL, >600 U/mL (~20 mg/mL)
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491 2,000 units/ml 100 units 
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q33230 
Qubit RNA Broad Range Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q10211 
Qubit™ Assay TubesThermo Fisher ScientificQ32856
RNA Gel Loading Dye (2x)Thermo Fisher ScientificR06415ul/ reaction
RNA Purification Kit Zymo Research R1017 
RNase Away Thermo Fisher Scientific 1236B62 
SDS, 10% solutionThermo Fisher Scientific 15553027
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainThermo Fisher ScientificS11494
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102 
Synthetic sgRNA / pegRNA Synthego / IDT Custom 2ug 
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, 250 reactionsNew England Biolabs E2040L
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 100 mL
TE buffer (Tris-EDTA)Thermo Fisher Scientific AM9849TE, pH 8.0, RNase-free Thermo
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056 1X 
Fetal Bovine Serum (FBS), Premium, 500 mLThermo Fisher ScientificA5670701
mTSER PLUS STEM cell Technologies# 100-0276
Penicillin/Streptomycin Mixture 10,000 ug/mL, 100 mL, 4-packQuality Biological120-095-721 

Referências

  1. Gao H, Gao S, Kan G, Valentovich LN, An Y. Research progress of base editing and prime editing tools based on the CRISPR/Cas system. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36.
  2. Chen PJ, Hussmann JA, Yan J, et al. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell. 2021;184(22):5635–5652. doi:10.1016/j.cell.2021.09.018.
  3. Newby GA, Yen JS, Woodard KJ, et al. Base editing of haematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice. Nature. 2022;595(7866):295-302. doi:10.1038/s41586-021-03609-w.
  4. Sousa AA, Hemez C, Lei L, et al. Systematic optimization of prime editing for the efficient functional correction of CFTR F508del in human airway epithelial cells. Nat Biomed Eng. 2024;9(1):7. doi:10.1038/s41551-024-01233-3.
  5. Mayuranathan T, Newby GA, Feng R, et al. Potent and uniform fetal hemoglobin induction via base editing. Nat Genet. 2023;55(7):1210-1217.
  6. He W, Zhang X, Zou Y, et al. Effective synthesis of high-integrity mRNA using in vitro transcription. Molecules. 2024;29(11).
  7. Popova PG, Lagace MA, Tang G, Blakney AK. Effect of in vitro transcription conditions on yield of high-quality messenger and self-amplifying RNA. Eur J Pharm Biopharm. 2024;198.
  8. Zhang F, Wang Y, Wang X, et al. RT-IVT method allows multiplex real-time quantification of in vitro transcriptional mRNA production. Commun Biol. 2023;6(1).
  9. Montague TG, Cruz JM, Gagnon JA, Church GM, Valen E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 2014;42(W1)-W407.
  10. Concordet JP, Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1)-W245.
  11. Mohr SE, Hu Y, Ewen-Campen B, Housden BE, Viswanatha R, Perrimon N. CRISPR guide RNA design for research applications. FEBS J. 2016;283(17):3232-3245.
  12. Huang TP, Newby GA, Liu DR. Precision genome editing using cytosine and adenine base editors in mammalian cells. Nat Protoc. 2021;16(2):1089-1106. doi:10.1038/s41596-020-00450-9.
  13. Doman JL, Sousa AA, Randolph PB, Chen PJ, Liu DR. Designing and executing prime editing experiments in mammalian cells. Nat Protoc. 2023;18(6):1780-1818. doi:10.1038/s41596-022-00724-4.
  14. Chicaybam L, Barcelos C, Peixoto B, et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Front Bioeng Biotechnol. 2017;4:99.
  15. Clement K, Rees H, Canver MC, et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nat Biotechnol. 2019;37(3):224-230.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

BiologiaEdi o 233Edi o 233Valor VazioEdi omRNAnucleofec oIVTiPSCsfibroblastoseditor de baseeditor prime
Edição do Genoma em Células Primárias de Mamíferos por Eletroporação do RNA Editor
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.