Artigo de método

Um modelo translacional de leitão prematuro para sepse neonatal

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DOI:

10.3791/71456

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10 de julho de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Comparative Pediatrics, Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen, 2BRIDGE Translational Excellence Programme, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Modelos de sepse bacteriana em recém-nascidos prematuros são essenciais, mas os modelos existentes em roedores carecem de relevância clínica. Um modelo altamente translacional de sepse neonatal foi desenvolvido usando leitões prematuros infectados com Staphylococcus epidermidis, vivos.

Resumo

Bebês prematuros são particularmente vulneráveis a infecções bacterianas que podem rapidamente evoluir para sepse potencialmente fatal, um estado de inflamação excessiva e disfunção dos órgãos. Para investigar os mecanismos da doença e avançar o desenvolvimento terapêutico, modelos translacionais robustos que repliquem a fisiopatologia complexa e a apresentação clínica da sepse neonatal são criticamente necessários. Este protocolo apresenta um modelo clínicamente relevante de sepse neonatal para leitões prematuros, induzida por infusão intra-arterial de Staphylococcus epidermidis vivo logo após o nascimento ou no terceiro dia pós-natal. Leitões nascem com 90% da gestação por cesariana e são cuidados sob cuidados neonatais de terapia intensiva. Incluem incubadoras controladas por temperatura e oxigênio e um cateter arterial umbilical permanente, que permite a administração de nutrição parenteral e amostras de sangue em série. Após a infecção por S. epidermidis, os leitões são monitorados por 24 a 48 horas. A incidência e a gravidade da sepse podem ser moduladas pela dose de bactérias e pelo fornecimento de glicose parenteral. A maior oferta de glicose parenteral acelera as respostas imunes pró-inflamatórias, levando à deterioração clínica. Sepse letal e os desfechos humanos são definidos pelos parâmetros arteriais do gasogase sanguíneo (pH ≤ 7,1) combinados com sinais clínicos de comprometimento hemodinâmico, como letargia, descoloração da pele e taquipneia. Esse modelo oferece uma plataforma única para explorar como o metabolismo energético e intervenções imunomodulatórias afetam a eliminação bacteriana, a inflamação sistêmica e a lesão tecidal durante a infecção neonatal. Possui um potencial significativo para orientar estratégias clínicas para a prevenção e o tratamento da sepse neonatal.

Introdução

A infecção neonatal é uma das principais causas de mortalidade e morbidade de longo prazo em todo o mundo, especialmente entre bebês prematuros, mas também em bebês a termo com baixo peso ao nascer ou complicaçõesperinatais 1,2. O diagnóstico precoce continua desafiador devido a sinais clínicos inespecíficos, respostas imunes imaturas e altamente variáveis, e à falta de biomarcadores sensíveis e específicos capazes de distinguir infecção de inflamaçãonão infecciosa 3,4. Como resultado, os clínicos frequentemente iniciam terapia antibiótica empírica de amplo espectro, muitas vezes antes da confirmação microbiológica, contribuindo para o uso excessivo de antibióticos, a interrupção da colonização microbiana na vida inicial e o desenvolvimento de resistênciaantimicrobiana 5.

A sepse neonatal é uma condição potencialmente fatal causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção que leva à disfunção dosórgãos 4. Embora infecção e sepse representem entidades biológicas e clínicas distintas, os termos são frequentemente usados de forma intercambiável na literatura de neonatologia. Clinicamente, a sepse neonatal é comumente classificada como sepse de início precoce ou tardio (EOS, LOS), ocorrendo antes ou depois das 72 horas de vida, respectivamente1. A EOS é tipicamente causada por patógenos transferidos durante o parto, como Escherichia coli ou Streptococcus do Grupo B. Em contraste, a LOS frequentemente apresenta sintomas inespecíficos, pode ser negativa para cultura e está associada a fatores de risco como procedimentos invasivos, nutrição parenteral e internação prolongada. Os organismos causadores mais comuns incluem estafilococos coagulases-negativos, particularmente Staphylococcus epidermidis, bem como bactérias Gram-negativas, embora infecções fúngicas e polimicrobianas tambémocorram 1,2,6. Independentemente da etiologia, infecções neonatais podem convergir para um fenótipo comum desepse 1,2. Importante destacar que bebês prematuros apresentam imaturidade do desenvolvimento tanto da imunidade inata quanto da adaptativa, juntamente com reservas metabólicas limitadas, o que pode afetar a resposta àinfecção 7.

O progresso no diagnóstico e tratamento tem sido dificultado pelas limitações dos sistemas experimentais existentes. Abordagens in vitro permitem estudos mecanicistas de vias imunes, mas não capturam a fisiologia integrada das respostas imunes complexas. Modelos de roedores, embora valiosos para estudos genéticos e moleculares sobre respostas imunes neonatais, diferem substancialmente dos humanos em ontogenia imunológica, metabolismo e tamanho 8,9. O manejo clínico da sepse é difícil de estudar nesses modelos devido às oportunidades limitadas de monitoramento intensivo, amostragens repetidas de sangue e testes de cuidados clínicamente realistas de suporte ou terapêutico.

Modelos animais grandes, especialmente leitões recém-nascidos prematuros, oferecem uma abordagem complementar poderosa. Porcos compartilham semelhanças anatômicas, fisiológicas e imunológicas próximas com os humanos, incluindo populações de células imunes comparáveis, sinalização de receptores de reconhecimento de padrões e regulaçãometabólica 10,11,12,13,14. Importante destacar que porcos são amplamente usados como modelos para a sepseadulta 13,15. A escala física dos porcos permite o uso de instrumentação clinicamente relevante, monitoramento fisiológico contínuo, bioamostragens repetidas e intervenções padronizadas de cuidados intensivos, como nutrição parenteral, terapia de fluidos, antibióticos e suporte respiratório. A infecção experimental também pode ser estudada no contexto da imaturidade do desenvolvimento, permitindo a investigação de trajetórias da doença, respostas do hospedeiro e efeitos do tratamento sob condições que se assemelham à prática clínica.

Este artigo descreve um modelo padronizado de sepse neonatal em leitões prematuros, projetado como uma plataforma translacional flexível. O modelo permite a indução controlada de uma infecção bacteriana sistêmica e a avaliação longitudinal das respostas clínicas, imunológicas e metabólicas, que podem ser usadas para explorar a fisiopatologia da sepse neonatal e avaliar a eficácia de novas intervenções preventivas e terapêuticas.

Protocolo

Todos os procedimentos detalhados foram realizados de acordo com a diretiva da UE 2010/63/UE para experimentos em animais e aprovados pela Inspetoria Dinamarquesa de Experimentos com Animais (número de licença: 2020-15-0201-00520).

1. Procedimentos relacionados ao parto

  1. Realize cesariana eletiva para o parto de leitões prematuros em 90% da gestação (dias gestacionais 106–107).
    1. Obtenha uma porca grávida (Landrace × Large White, terceira ou quarta paridade) de uma fazenda comercial Livre de Patógenos Específicos.
      NOTA: A porca deve ser engravidada por inseminação artificial (× Duroc) para garantir que o dia exato da concepção seja conhecido.
    2. Jejue a porca durante a noite (mínimo 12 horas) com acesso ad libitum à água antes da cirurgia. Induzir sedação por injeção intramuscular de um coquetel contendo atropina (2 mL por porca), butorfanol (2 mL/100 kg de peso corporal; 10 mg/mL) e Zoletil 50 Vet (3,3 mL/100 kg de peso corporal; tiletamina 25/mL e zolazepam 25 mg/mL).
    3. Após a sedação, insira um cateter na veia do ouvido e induza anestesia geral com propofol (10 mg/mL), ajustado até que a perda do reflexo palpebral e do tônus maxilar seja alcançada.
    4. Realize intubação endotraqueal sob laringoscopia direta para proteger as vias aéreas. Mantenha um plano cirúrgico de anestesia durante toda a cesariana usando isoflurano vaporizado administrado em 100% de oxigênio (1–2 L/min) por meio de um vaporizador calibrado.
    5. Inicie em 5% e mantenha-se entre 1,5 e 2,5%, ajustando a concentração para a menor dose efetiva com base na frequência cardíaca e saturação periférica de oxigênio.
      NOTA: Se ocorrer apneia, inicie a ventilação mecânica para garantir oxigenação adequada.
    6. Posicione a porca em posição lateral direita deitada. Realize uma preparação asséptica do local cirúrgico. Administrar um volume total de 120 mL de lidocaína (10 mg/mL) por infiltração subcutânea e intramuscular ao longo da linha de incisão do flanco esquerdo pretendida.
    7. Realize uma laparotomia do flanco esquerdo usando bisturi para expor e exteriorizar os chifres uterinos. Incisa os chifres do útero ao longo da curvatura maior para dar à luz leitões individualmente.
    8. Antes de seccionar o cordão umbilical, leite o cordão 2 a 3 vezes em direção ao leitão para aumentar a concentração de hemoglobina e os estoques de ferro. Coloque uma pinça no umbigo rotulada de A a Z ao redor do cordão umbilical junto com gaze para evitar sangramento, e transectoe o cordão.
    9. Imediatamente após o parto, coloque cada leitão em um saco de polietileno, deixando a cabeça exposta. O saco minimiza a perda de calor, reduzindo assim o risco de hipotermia.
    10. Administrar um volume fixo de 0,1 mL de doxapram (20 mg/mL) e 0,1 mL de flumazenil (0,1 mg/mL) intramuscularmente no pescoço. O Doxapram estimula a respiração espontânea, enquanto o flumazenil, um antagonista dos benzodiazepínicos, reverte parcialmente a anestesia transferida da porca durante a cesariana.
    11. Transferir os leitões para uma unidade de terapia intensiva neonatal.
  2. Reanimação, randomização e cateterismo
    1. Pese e determine o sexo de cada leitão após a transferência para a unidade de terapia intensiva neonatal.
    2. Para leitões que não conseguem respirar espontaneamente, realize a ressuscitação individualmente. Repita as doses de doxapram e/ou flumazenil, e forneça ventilação por pressão positiva conforme necessário para estabilizar a respiração.
    3. Quando os leitões estiverem fisiologicamente estáveis e ainda anestesiados pela anestesia materna, utilize a técnica asséptica para inserir um cateter arterial umbilical (tubo de alimentação PVC 4 Fr) em uma das artérias do cordão umbilical seccionado. Avance a ponta do cateter para a aorta dorsal. Fixe o cateter na pele com pontos e conecte-o a uma linha de infusão para fornecer nutrição parenteral.
      NOTA: No porco prematuro, a administração intraarterial é o padrão estabelecido sobre a veia umbilical para evitar a possível necrose hepática decorrente do alto risco de desposicionamento da ponta do cateter dentro do parênquima hepático em vez do ductovenoso 21.
    4. Estratifique os leitões por peso ao nascer e sexo e os designe aleatoriamente para grupos de tratamento.
  3. Condições de moradia
    1. Aloje cada leitão individualmente em uma incubadora aquecida e acolchoada com ventilação controlada.
    2. Forneça oxigênio suplementar (1–2 L/min) por até 12 horas após o nascimento para prevenir hipóxia.
    3. Monitore a temperatura retal durante as primeiras 12 horas após o nascimento. Ajuste as condições de aquecimento conforme necessário para manter uma temperatura central de 38–39 °C (alvo: 38,5 °C).
      NOTA: Espera-se um breve período de hipotermia imediatamente após o nascimento e durante a colocação do cateter.

2. Imunização passiva via infusão de plasma

NOTA: Como os porcos não transferem imunoglobulinas transplacentárias, forneça imunização passiva parcial para experimentos que durem mais de 24 horas para prevenir infecções espontâneas.

  1. Colete o sangue materno da porca após cesariana em um recipiente estéril revestido com heparina. Centrifuge o sangue em tubos Falcon estéreis a 4 °C, 2500 × g, por 10 minutos e repita uma vez. Após a separação, recolha cuidadosamente o plasma em novos tubos Falcon estéreis e armazene a 4 °C até o uso.
  2. Dentro de 12 horas após o nascimento, administre o plasma em uma dose de 8 mL/kg como uma infusão intraarterial contínua de 30 minutos usando uma bomba de infusão.

3. Indução de infecção experimental

NOTA: A infecção experimental pode ser induzida 3–4 horas após o nascimento ou no terceiro dia pós-natal.

  1. Preparação da suspensão bacteriana
    1. Descongele o frasco congelado de estoque de S. epidermidis (WT-1457, 15–25% glicerol) em temperatura ambiente. Vórtice brevemente (2–3 s) para obter uma suspensão homogênea.
      NOTA: De acordo com a classificação de grupos de risco para agentes infecciosos, S. epidermidis é classificada como um microrganismo do Grupo de Risco 1 da OMS. Microrganismos do Grupo de Risco 1 da OMS provavelmente não causam doenças humanas e não exigem considerações especiais.
    2. Prepare uma cultura durante a noite inoculando 20 mL de caldo de infusão cerebral cardíaca (BHI) com 5 μL do estoque descongelado de S. epidermmidis em um frasco Erlenmeyer estéril de 100 mL. Incubar a 37 °C com tremores orbitais a 180 rpm por ~16 horas, permitindo que a cultura atinja a fase estacionária. Inclua o controle de caldo BHI não inoculado sob condições idênticas para verificar a esterilidade do meio.
    3. Prepare uma nova cultura inoculando 20 mL de caldo BHI com 200 μL da cultura durante a noite (diluição 1:100) em um frasco Erlenmeyer estéril de 100 mL. Prepare cultura suficiente para infectar todos os leitões (veja os cálculos nos passos 3.1.4 – 3.1.6). Incubar a 37 °C com tremores orbitais a 180 rpm por 2,5 horas, até que as bactérias atinjam a fase inicial de crescimento logarítmico (Figura Suplementar 1A).
    4. Estime o volume total de cultura necessário para infectar todos os leitões com base na dose-alvo titulada, peso corporal médio, número de leitões e densidade de cultura.
    5. Assuma que a cultura atinja uma densidade óptica de 600 nm (OD) de ≥1 (Figura Suplementar 1B) após a incubação de 2,5 h e use uma taxa de conversão estabelecida de OD de 1 = 3 × 108 unidades formadoras de colônia (CFU)/mL.
    6. Inclua 15% de volume extra para compensar as perdas de manuseio. Calcule o volume estimado da cultura usando a fórmula:
      Estimativa V = [Dose-alvo (CFU/kg GB BP) × BW) × BW × N × 1,15] / 3 × 108 CFU/mL (1)
      onde:
      VEstimativa = volume total estimado de cultura necessário (mL)
      BW = peso corporal médio do leitão (kg)
      N = número total de leitões
    7. Após a incubação, determine o OD da cultura. Dilua a amostra conforme necessário para manter as leituras dentro da faixa linear do espectrofotômetro.
    8. Calcule o volume final de cultura necessário para alcançar a concentração alvo de CFU usando a fórmula:
      VFinal = OD1 · V Estimativa / OD Medido (2)
      onde:
      VFinal = volume final de cultura necessário (mL)
    9. Transfira o VFinal calculado para tubos Falcon de 50 mL e centrifuge a 3.000 × g por 10 minutos em temperatura ambiente.
    10. Descarte cuidadosamente o sobrenadante.
    11. Ressuspenda o pellet bacteriano em 3 x VFinal de soro fisiológico estéril 0,9% para preparar a administração intraarterial (3 mL/kg de peso corporal em 3 min). Certifique-se de que a solução esteja livre de agregados.
    12. Prepare seringas de infusão de 50 mL com a suspensão bacteriana.
    13. Prepare uma seringa de infusão separada de 50 mL com soro fisiológico estéril a 0,9% para controles não infectados.
  2. Procedimento de infecção
    1. Administre a suspensão bacteriana ou soro estéril a cada leitão através do cateter arterial umbilical usando uma bomba de infusão configurada para administrar a dose-alvo em 3 minutos. Mantenha um intervalo de 5 minutos entre leitões consecutivos.
    2. Imediatamente após a infecção, inicie a infusão contínua de nutrientes parenteris para limpar o cateter e garantir a administração total da dose.
    3. Confirme a dose guardando a suspensão bacteriana a 4 °C. Depois, isso pode ser diluído e colocado em placas de ágar sanguíneo para determinar a densidade bacteriana (veja o passo 8)

4. Nutrição parenteral

  1. Forneça nutrição parenteral total (NPT) aos leitões durante toda a duração do experimento. Por exemplo, use um saco de TPN humano de três câmaras, como o Kabiven 1900 kcal, modificado para atender às necessidades de macronutrientes dos leitões recém-nascidos.
  2. Prepare a solução nutricional parenteral em condições estéreis.
    1. Retire 300 mL da câmara de glicose.
    2. Remova 70 mL da câmara lipídica.
    3. Adicione 155 mL de glicose a 50% na câmara de glicose.
    4. Adicione 214 mL de Vamin à câmara de glicose.
    5. Adicione 150 mL de água estéril à câmara de glicose.
    6. Adicione 0,1 mL de heparina (5000 IE/mL) à câmara de glicose.
    7. Misture bem o conteúdo das três câmaras.
      NOTA: Isso resulta em uma solução nutricional parenteral com a composição de macronutrientes mostrada na Tabela 1. Use esta formulação como dieta controle padrão ao avaliar os efeitos de regimes nutricionais alternativos nas respostas à infecção.
    8. Armazene a nutrição parenteral a 4 °C até o uso. Prepare a solução em lotes e não a use além de 48 horas após o preparo.
      NOTA: O modelo pode ser modificado para avaliar os efeitos da alimentação enteral e da estimulação intestinal, ajustando leitões com tubos de alimentação orogástrica.
  3. Entrega da nutrição parenteral
    1. Encha seringas de infusão estéreis de 50 mL com nutrição parenteral e infunda continuamente através do cateter intra-arterial usando uma bomba de infusão.
    2. Ajuste a taxa de infusão para 6 mL/kg/h. Pese os leitões diariamente e ajuste a dose de acordo com o peso corporal atualizado.
      NOTA: Para estudos de longo prazo, se for observado edema periférico (superidratação), reduza a taxa de infusão para 4 mL/kg/h.
    3. Monitore as bombas de infusão regularmente para garantir que as seringas não fiquem vazias. Reabasteça as seringas conforme necessário.

5. Monitoramento clínico

  1. Avalie os leitões regularmente ao longo do estudo para determinar se é necessária ação. Após a infusão bacteriana, os animais devem ser monitorados a cada 1–2 horas por profissionais experientes até a eutanásia planejada.
    NOTA: A deterioração clínica, ou seja, a progressão da ausência de sintomas para desfechos humanos, pode ocorrer rapidamente, em 30–60 minutos.
    1. Observe sintomas relacionados à respiração, incluindo taquipneia, dificuldade respiratória, cianose e respiração agónica.
      NOTA: Em casos de hipóxia (saturação de oxigênio < 80%), o fornecimento de oxigênio deve ser iniciado/aumentado.
    2. Observe sintomas relacionados à circulação, incluindo descoloração, membros frios, tempo prolongado de recarga capilar, taquicardia e bradicardia.
    3. Observe sintomas relacionados à atividade, incluindo letargia, incapacidade de ficar em pé ou andar (relevante a partir do terceiro dia pós-parto) e reatividade a estímulos de dor.
    4. Observe sintomas relacionados à coagulação, como equimose ou sangramento petequial na pele. Aplique uma pressão suave nas áreas descoloridas; Se a vermelhidão não clarear, classifique o achado como sangramento cutâneo.
  2. Se sintomas clínicos forem observados, realize medições de gases no sangue para avaliar pH, lactato, saturação de oxigênio e pressão parcial de dióxido de carbono em relação aos valores de base (veja o passo 6.3).
    NOTA: O monitoramento clínico contínuo (por exemplo, de pressão arterial, frequência cardíaca e frequência respiratória) pode ser utilizado, mas não é rotineiramente empregado nesses experimentos.

6. Coleta de sangue

NOTA: A coleta de sangue longitudinal pode ser realizada em leitões por meio do cateter intra-arterial ou por venopunção jugular. O volume sanguíneo total amostrado não deve exceder 7,5% do volume sanguíneo total estimado (~7% do peso corporal). Todos os procedimentos de coleta de sangue devem seguir as diretrizes éticas locais.

  1. Coleta de sangue intraarterial no cateter
    1. Com mãos limpas e enluvadas, acesse cuidadosamente a porta do cateter. Desinfete o local de acesso com etanol antes da abertura. Evite contaminação da linha de infusão.
    2. Retire no mínimo 2 mL de sangue e reserve-o, pois esse volume pode estar contaminado com nutrição parenteral da linha de infusão. Mantenha a esterilidade da amostra retirada.
    3. Colete o volume sanguíneo necessário para análise. Por exemplo, o sangue para análises hematológicas deve ser coletado em tubos revestidos com EDTA, enquanto amostras para análises de gasometria devem ser obtidas usando seringas revestidas com heparina.
    4. Após a conclusão da amostra, reinfunde os 2 mL de sangue inicialmente retirados no leitão e reconecte cuidadosamente o cateter à linha parenteral de infusão nutricional.
  2. Coleta de sangue por punção jugular
    1. Retire o leitão da incubadora e coloque-o em reclinação dorsal para expor a região do pescoço. Prenda o leitão com segurança para evitar o movimento e permitir acesso seguro à veia jugular.
      NOTA: A venpuntura jugular está associada a riscos potenciais, incluindo hemorragia, formação de hematomas e comprometimento das vias aéreas. A decisão de realizar esse procedimento deve ser cuidadosamente ponderada em relação à importância científica dos resultados.
    2. Identifique a localização anatômica aproximada da veia jugular e desinfete o local da perfuração com etanol.
    3. Realize a venpunctura jugular usando um sistema Vacutainer e colete o volume sanguíneo necessário. Por exemplo, colete 0,2 mL de sangue e armazene a amostra a 4 °C até a formação bacteriana.
    4. Aplique pressão no local da venponção até que a hemostasia seja alcançada. Depois, devolva o leitão à incubadora.
    5. Continue monitorando o leitão em busca de sinais de sangramento renovado. Se ocorrer hemorragia significativa, eutanasie o leitão. Também monitore a formação de hematoma subcutâneo ou hemorragia interna que possa comprometer as vias aéreas.
  3. Medições de gases sanguíneos
    1. Inspecione a amostra de sangue na seringa heparinizada para detectar bolhas de ar. Se houver bolhas, expulse-as suavemente ou desloque-as batendo na seringa para evitar alterar as medições de gás.
    2. Transporte a amostra para o analisador de gases sanguíneos e siga as instruções do fabricante. Certifique-se de que a amostra seja processada rapidamente para manter a precisão.

7. Critérios para sepse e desfechos humanitários

  1. Eutanasie leitões ao atingir pontos humanos pré-definidos indicativos de sepse.
    NOTA: Para outras patologias ou lesões iatrogênicas, consulte as diretrizes éticas locais para desfechos humanos.
    1. Use o pH sanguíneo como principal indicador de sepse e como principal desfecho humanitário. Eutanasie leitões com pH sanguíneo ≤ 7,1 imediatamente. Para leitões com pH sanguíneo ≤ 7,2, repita as medições de gasometria a cada 15–30 minutos e monitore os desfechos secundários e humanos.
    2. Como desfechos humanitários secundários, eutanasia leitões independentemente do pH sanguíneo na manifestação de coagulação intravascular disseminada, incluindo equimose ou sangramento petequial, parada respiratória, letargia profunda e/ou falta de resposta a estímulos dolorosos (confirmada pela ausência de reflexo de retirada após uma leve pressão do espaço interdigital com pinças anatômicas).
  2. Anestesie o leitão por meio de injeção intramuscular de uma mistura à base de Zoletil (0,1 mL/kg).
    NOTA: Reconstitua um frasco de Zoletil 50 Vet (tiletamina 125 mg, zolazepam 125 mg) em 10 mL usando 6,25 mL de xilazina (20 mg/mL), 1,25 mL de cetamina (100 mg/mL) e 2,5 mL de butorfanol (10 mg/mL). As concentrações finais são 12,5 mg/mL de tiletamina, zolazepam, xilazina, cetamina e 2,5 mg/mL de butorfanol.
  3. Confirme profundidade adequada de anestesia pela ausência de reflexo de abstinência em resposta a um estímulo doloroso (veja o passo 7.1.2).
  4. Realize a eutanásia por injeção intracardíaca de uma overdose de pentobarbital sódico (3 mL/kg; 400 mg/mL).
    NOTA: A coleta de sangue intracardíaca pode ser realizada antes da eutanásia utilizando um sistema Vacutainer.

8. Placagem bacteriana e quantificação

  1. Quantifique a densidade bacteriana no sangue usando amostras de venopunção jugular coletadas durante o experimento e amostras de punção cardíaca coletadas na eutanásia.
    NOTA: Não use sangue coletado do cateter arterial, pois pode conter bactérias residuais da infecção experimental inicial, o que pode confundir as quantificações.
    1. Prepare uma placa de ágar de sangue de ovelha para cada amostra, marque os quadrantes 0, -1, -2 e -3 na parte inferior e rotule a placa com a identificação do animal e o horário do tempo.
    2. Utilizando 50 μL de sangue de cada amostra, prepare diluições 10 vezes de 10-1, 10-2 e 10-3 em 450 μL de PBS estéril em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
    3. Marque cada placa com três gotas de 20 μL da diluição correspondente no quadrante designado, espaçando as gotas para evitar contato ou transferência e evitando a aerossolização.
    4. Incube os pratos durante a noite a 37 °C, depois armazene os pratos a 4 °C até a contagem.
    5. Conte todas as colônias bacterianas na diluição contendo aproximadamente 10 colônias por mancha. Inclua apenas colônias de S. epidermidis, que são tipicamente brancas, circulares e de bordas lisas. Inspecione e registre cuidadosamente quaisquer colônias com morfologia alterada, pois isso pode indicar contaminação, por exemplo, por amostragem. Calcule a CFU/mL usando a seguinte equação:
      (CFU/mL) = [(contagem de colônias · fator de diluição)/(3 · 20 μL)] · [1000μL/mL] (3)

Resultados

Um experimento dose-resposta foi realizado em leitões prematuros criados até o quinto dia pós-natal (Figura 1). No terceiro dia pós-natal, os leitões receberam uma infusão de uma dose baixa de S. epidermidis (109 CFU/kg, n = 9), uma dose alta de S. epidermidis (5 × 109 CFU/kg, n = 9) ou soro fisiológico como controle (n = 3), e foram monitorados por 44 horas.

Após a infusão de S. epidermid , a carga bacteriana no sangue permaneceu maior durante o período de acompanhamento de 44 horas em leitões que receberam a dose alta em comparação com o grupo de baixa dose (Figura 2A, P < 0,05). Apenas leitões do grupo de alta dose (3/9) desenvolveram sepse, com início ocorrendo aproximadamente 12–15 horas após a infecção (Figura 2B). Consistente com isso, leitões que receberam a dose alta de S. epidermidis apresentaram pH sanguíneo mais baixo às 12 h (Figura 2C, P < 0,001), acompanhado por um aumento marcante na pressão parcial de dióxido de carbono (pCO₂) (Figura 2D, P < 0,01), em comparação com o grupo de baixa dose.

Durante a fase aguda da infecção (6 h), ambos os grupos infectados apresentaram excesso de base mais baixo e níveis mais altos de lactato em comparação com controles salinos, com mudanças mais pronunciadas que persistiram até 12 horas no grupo de dose alta de S. epidermidis (Figura 2E, F, P < 0,01 – 0,05). Os níveis de glicose no sangue não diferiram entre os grupos (Figura 2G).

Às 6 horas, ambos os grupos infectados também apresentaram depleção robusta de neutrófilos sanguíneos em comparação com controles não infectados (Figura 3A, ambos P< 0,001). Mais tarde no curso da infecção, observou-se reposição de neutrófilos em ambos os grupos infectados, mas foi maior no grupo de baixa dose de S. epidermidis (Figura 3A, P < 0,05). Ambos os grupos infectados desenvolveram trombocitopenia durante o experimento; no entanto, a contagem de trombocitos diminuiu mais cedo e de forma mais acentuada no grupo de dose alta de S. epidermidis em comparação tanto com o grupo de baixa dose quanto com os controles não infectados (Figura 3B, P < 0,01–0,05). Os níveis plasmáticos de TNF-α, IL-6 e IL-10 estavam elevados em ambos os grupos infectados 6 e 12 horas após a infecção em comparação com os controles (Figura 3C, P < 0,001–0,05). Às 24 horas, os níveis plasmáticos de TNF-α e IL-10 permaneceram elevados apenas no grupo de alta dose de S. epidermidis em comparação com os controles não infectados (P < 0,05), enquanto às 44 horas apenas os níveis de TNF-α permaneciam elevados (P < 0,05).

Na eutanásia, quando leitões atingiram pontos finais humanos ou foram eutanasiados no horário programado de 44 horas após a infecção, os níveis plasmáticos de reagentes negativos da fase aguda e marcadores de lesão de órgãos foram medidos (Figuras 4A–G). Entre esses, apenas o colesterol (um reagente de fase aguda negativo) foi significativamente menor em leitões infectados com a alta dose de S. epidermidis em comparação com o grupo de baixa dose (Figura 4B, P < 0,05). Os níveis médios de marcadores de lesão hepática, incluindo alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase, assim como marcadores de lesão renal como creatinina e nitrogênio ureiano no sangue, foram numericamente mais altos no grupo de S. epidermidis em doses altas do que nos controles não infectados (Figuras 4D–G).

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Figura 1: Desenho experimental. Leitões prematuros foram partos por cesariana em 90% da gestação. No terceiro dia pós-natal, os leitões receberam uma infusão intraarterial de S. epidermidis viva a 109 ou 5 × 109 CFU /kg, ou soro fisiológico como controle. Após a infecção, os leitões foram monitorados por 44 horas, com amostra longitudinal de sangue realizada em pontos de tempo definidos. Figura criada com Biorender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Carga bacteriana no sangue, sobrevivência e parâmetros de gases sanguíneos em leitões prematuros após infusão arterial com soro fisiológico (CON) ou infecção com S. epidermidis, viva. (A) Densidade de S. epidermidis em amostras de sangue coletadas 6, 24 e 44 horas após a infecção. (B) Curvas de sobrevivência mostrando o tempo até o desfecho humano ou eutanásia agendada em 44 horas após a infecção. (C–G) Parâmetros de gases arteriais em 0, 6, 12, 24 e 44 horas após a infecção. Os dados são apresentados como média ± SD. (A), curvas de sobrevivência (B) ou gráficos de pontos de violino, incluindo mediana (linha sólida) e IQR (linhas pontilhadas) (C–G). n = 9 para cada grupo infectado; n = 3 para o controle não infectado. Os dados foram analisados usando um modelo linear de efeitos mistos, incluindo interações de tempo × grupo (A, C–G) ou um modelo de risco proporcional de Cox (B). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Abreviações; CON = controle; pCO2 = pressão parcial de CO2; SE = S. epidermidis. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Marcadores inflamatórios circulantes em leitões prematuros após infusão arterial com soro fisiológico (CON) ou infecção com S. epidermidis, viva. (A, B) Contagens circulantes de neutrófilos e plaquetas em 6, 12, 24 e 44 horas após a infecção. (C) Níveis plasmáticos de TNF-α, IL-6 e IL-10 em 6, 12, 24 e 44 horas após a infecção. Os dados são apresentados como gráficos de pontos de violino, incluindo mediana (linha contínua) e IQR (linhas pontilhadas) (A–C). n = 9 para cada grupo infectado; n = 3 para o controle não infectado. Os dados foram analisados usando um modelo linear de efeitos mistos, incluindo interações de tempo × grupo (A–C). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Abreviações; CON = controle; IL = interleucina; SE = S. epidermidis; TNF = fator de necrose tumoral. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Parâmetros bioquímicos plasmaticais em leitões prematuros após infusão arterial com soro fisiológico (CON) ou infecção com S. epidermidis vivo (109 ou 5 × 109 UFC/kg). (A–G) Níveis plasmáticos de albumina, colesterol, ALP, ALAT, ASAT, creatinina e BUN no ponto final humano ou na eutanásia programada 44 horas após a infecção. Os dados são apresentados como gráficos de bigode mostrando a faixa completa (do mínimo ao máximo) (A–G). Pontos de dados individuais em roxo escuro indicam leitões que desenvolveram sepse. n = 9 para cada grupo infectado; n = 3 para o controle não infectado. Os dados foram analisados usando um modelo de regressão linear múltipla (A–G). *P < 0,05. Abreviações; ALAT = alanina aminotransferase; ALP = fosfatase alcalina; ASAT = aspartato aminotransferase; BUN = nitrogênio ureia no sangue; CON = controle; SE = S. epidermidis. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Valor TotalConcentração
Energia7762kJ3525kJ/L
Macronutrientes
Aminoácidos92g42g/L
Gordo66g30g/L
Glicose221g100g/L
Micronutrientes
Na64MMOL29mmol/L
K48MMOL22mmol/L
Mg8MMOL4mmol/L
Ca4MMOL2mmol/L
PO418MMOL8mmol/L
SO48MMOL4mmol/L
Cl93MMOL42mmol/L
Acetato78MMOL35mmol/L

Tabela 1: Composição da nutrição parenteral total modificada. As quantidades e concentrações totais de energia, macronutrientes (aminoácidos, gordura e glicose) e micronutrientes na solução nutritiva parenteral.

Figura suplementar 1: Cinética de crescimento de S. epidermidis WT-1457. Bactérias foram cultivadas em caldo de infusão cerebral e coração a 37 °C com tremores orbitais a 180 rpm. A densidade óptica foi medida em 600 nm ao longo do tempo. Os dados são apresentados em escalas logarítmica (A) e linear (B) (n = 3 experimentos independentes). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Um modelo padronizado de sepse neonatal em leitões prematuros foi projetado para estudar uma infecção bacteriana sistêmica sob condições clinicamente relevantes de imaturidade neonatal. O modelo combina controle da idade gestacional, reanimação e suporte de terapia intensiva, momento da infecção e amostragem de sangue longitudinal. Essa abordagem visa preencher a lacuna entre os sistemas experimentais de roedores e in vitro e a fisiologia complexa encontrada em recém-nascidos infectados. Importante, esse modelo foi usado para confirmar a associação conhecida entre sexo, baixo peso ao nascer e idade gestacional, com sensibilidade à sepse observada em bebês humanosprematuros 16, 17, 18.

Os porcos são um modelo altamente relevante para grandes animais em pesquisas de infecção devido às semelhanças substanciais com os humanos na função imunológico e fisiologia. Componentes-chave do sistema imunológico inato, incluindo subconjuntos de leucócitos, sinalização de receptores de reconhecimento de padrões e respostas de citocinas, mostram correspondência próxima entre porcos e humanos. As principais diferenças imunológicas entre leitões recém-nascidos e humanos estão nas respostas imunes adaptativas. Como não há transferência transplacentária de imunoglobulina G (IgG) durante a gestação suína, leitões recém-nascidos nascem ingênuos nesseaspecto 19. Da mesma forma, enquanto as células B dos bebês não sofrem deslocamento isoforme de IgM para IgG antes dos 3 a 6 meses de idade, as células B suínas são capazes de apresentar respostas de IgG logo após onascimento 20.

Nesse sistema-modelo, essas diferenças são mitigadas induzindo infecção logo após o nascimento, antes que respostas imunes adaptativas possam ocorrer, e pelo fornecimento de imunoglobulinas maternas por transfusão plasmática. Essa abordagem resulta em níveis circulantes de IgG semelhantes aos de recém-nascidos muito prematuros, sujeitos à interrupção da transferência transplacentária de IgG devido ao nascimentoprematuro 17. Além disso, o tamanho corporal relativamente grande ao nascer (~800 g) fortalece ainda mais o modelo, em comparação com camundongos recém-nascidos (~3 g). Como resultado, influências ambientais como temperatura, umidade e tensão de oxigênio se assemelham mais às experimentadas por neonatos humanos. Essa escala também permite o uso de equipamentos de nível clínico, monitoramento invasivo e modalidades de cuidado de suporte, como acesso vascular, suporte respiratório e monitoramento fisiológico contínuo, que não são viáveis em modelos de roedores neonatais. Especificamente, o acesso vascular para infusões, como nutrição parenteral, no modelo de porco prematuro, é alcançado por meio de um cateter arterial umbilical. Embora isso contraste com a via intravenosa padrão usada em neonatologia clínica, é necessário devido às restrições anatômicas dos leitões prematuros, onde cateteres da veia umbilical raramente atravessam espontaneamente o ducto venoso e, em vez disso, se malposicionam dentro do parênquimahepático 21. A administração intraarterial oferece uma rota confiável e reprodutível para infusão contínua sem o alto risco de necrose hepática associada à deslocação da veia umbilical. Da mesma forma, isso permite que o sangue arterial seja coletado para análise de gasometria.

A infecção sistêmica neste modelo é induzida pela infusão intra-arterial de S. epidermidis, uma das principais causas de sepse de início tardio nas unidades de terapia intensivaneonatal 1,2. No entanto, um conjunto diversificado de patógenos causa sepse neonatal, e estafilococos coagulases negativos, como S. epidermidis, também são conhecidos por causar infecções menos graves e menor risco de sepse do que outros patógenos mais virulentos, como E. coli 1,2. Embora o modelo utilize um patógeno de baixa virulência, a deterioração clínica observada, ativação inflamatória e instabilidade fisiológica refletem características fundamentais da sepse neonatal. O grupo controle não infectado (n = 3) neste estudo serve como referência de referência para demonstrar o estado fisiológico de leitões prematuros "saudáveis" sob condições idênticas de terapia intensiva. Embora isso resulte em um desequilíbrio de projeto, essas comparações têm como objetivo representar a resposta do hospedeiro à infecção. Como mostrado na Figura 2, houve uma relação dose-resposta clara com o aumento das doses de S. epidermid, consistente com achados anteriores em leitões infectados no dia 1 davida 22. Apenas leitões que receberam a maior dose de S. epidermidis se deterioraram para os desfechos humanos, exigindo eutanásia. No entanto, ambos os grupos infectados desenvolveram acidose metabólica, enquanto um componente respiratório substancial (pCO₂ elevado) foi observado apenas no grupo de S. epidermidis em doses altas. De forma semelhante, ambos os grupos apresentaram neutropenia marcada às 6 horas após a infecção, seguida por reposição de neutrófilos às 24 horas, maior no grupo de baixa dose. Trombocitopenia também esteve presente em ambos os grupos, acompanhada por aumento nas citocinas plasmáticas e marcadores de lesão de órgãos, com respostas mais pronunciadas em leitões que receberam a maior dose de S. epidermid.

Em leitões prematuros, a infecção por S. epidermidis no primeiro dia pós-natal induz os mesmos sinais paraclínicos de sepse neonatal (acidose metabólica, leucopenia, trombocitopenia, inflamação), além de letargia, coagulopatia e consumo decomplemento 17,22,23. A infecção também causa distúrbios sistêmicos no metabolismo energético, notadamente a redução da fosforilação oxidativa mitocondrial, juntamente com alterações no proteoma e metaboloma plasmáticos semelhantes às relatadas em pacientes com sepseneonatal 24,25,26. Além disso, leitões prematuros (90% de gestação) têm muito mais probabilidade de desenvolver sepse do que leitões nascidos atermo 17. A composição nutricional afeta ainda as respostas clínicas e imunológicas. A NPT baseada em glicose impulsiona o metabolismo glicolítico, que amplifica as respostas imunes pró-inflamatórias, enquanto prejudica a tolerância à doença nos tecidosperiféricos 24,26. A combinação dessas respostas está associada a lesão de órgãos e progressão em direção ao fenótipo27 da sepse. A modulação da composição da NPT, seja reduzindo o teor de glicose ou substituindo-a por macronutrientes alternativos como galactose, aminoácidos glucogênicos ou β-hidroxibutirato28,29, atenua a resposta inflamatória e preserva a tolerância tecidual à doença. A suplementação de glicose alta via NPT também resulta em hiperglicemia (≈10–20 mM). No entanto, ainda não está claro até que ponto as respostas inflamatórias observadas ligadas à glicólise são diretamente mediadas por níveis elevados de glicose no sangue.

Observações experimentais indicam diferenças claras nas respostas clínicas dependendo do dia pós-natal da infecção. Tanto o risco de desenvolver sepse quanto a gravidade dos sintomas clínicos são maiores quando a infecção é induzida logo após o nascimento. A indução da infecção no terceiro dia pós-natal leva a um fenótipo de sepse mais leve, com comportamentos de doença, acidose respiratória e metabólica nas primeiras 24 horas após a indução, seguida de recuperação clínica apesar dos marcadores elevados de lesões de órgãos. Os mecanismos subjacentes a essas diferenças entre indução precoce e tardia são atualmente desconhecidos e representam uma área de investigação em andamento. No entanto, a homeostase da glicose após o início da nutrição parenteral melhora nos três primeiros dias pós-natais em leitões prematuros, resultando em redução da hiperglicemia apesar da ingestão semelhante de glicose. No geral, variar o dia pós-natal da infecção e a provisão de glicose permite que o modelo capture características tanto de sepse aguda grave quanto de risco de vida ou fenótipo mais leve. Juntos, esses ajustes possibilitam o teste de intervenções direcionadas adaptadas a fenótipos específicos de doenças. A aplicabilidade clínica desse modelo pode ser ainda mais fortalecida ao alinhá-lo com sistemas de pontuação neonatal já estabelecidos relacionados à sepse, como a Avaliação Sequencial de Insuficiência Orgânica neonatal (nSOFA). Um sistema de pontuação baseado em nSOFA em tempo real não foi implementado no estudo atual devido à inviabilidade do monitoramento contínuo da pressão arterial arterial e das contagens imediatas de plaquetas necessárias para pontuação cardiovascular e hematológica. Futuras melhorias do protocolo poderiam incorporar uma estrutura nSOFA adaptada para melhor categorizar a gravidade da doença.

Apesar de suas forças translacionais, esse modelo apresenta várias limitações importantes. Esses experimentos são intensivos em recursos, exigindo instalações especializadas e pessoal altamente treinado para realizar cesariana, ressuscitação neonatal, alojamento pós-natal e cuidados com leitões prematuros. Experimentos de infecção ainda exigem monitoramento contínuo e prático por dois a três funcionários experientes para garantir o bem-estar animal e a coleta confiável de dados, e o acompanhamento a longo prazo aumenta os custos. Comparado aos modelos de roedores, a disponibilidade de reagentes específicos para espécies é mais limitada, especialmente para imunohistoquímica e citometria de fluxo, embora muitos anticorpos humanos possam ser usados com sucesso após validação adequada. Além disso, a natureza de criação externa dos porcos resulta em considerável variação biológica dentro e entre as ninhadas, exigindo grupos maiores para detectar diferenças modestas nas respostas de infecção. Embora essa variabilidade aumente a complexidade experimental, ela também reflete mais de perto a heterogeneidade observada em populações neonatais clínicas, aumentando assim a relevância translacional do modelo. Em conclusão, este protocolo validado para sepse neonatal será uma ferramenta útil para futuras investigações em neonatologia e para testar novas intervenções preventivas e terapêuticas.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pela equipe do grupo de Pediatria Comparada da Universidade de Copenhague e financiado pela Fundação Novo Nordisk (NNF23OC0085457 e NNF22OC0078747).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
 0.1–10 μL pipette tips “Optifit”Sartorius790010
1 mL disposable syringes (sterile)e-power150001S
1 mL syringe with 25 G X 16 mm needle (sterile)B. Braun Melsungen AG9161465V
1.5 mL tubesEppendorf30125215
10 mL disposible syringe (sterile)e-power150010S
100 mL Erlenmeyer flasksDuran Wheaton Kimble212162403
1000 μL pipetteSartorius 46880171
12 G “Intraflon 2” needles (sterile)Vygon122.27
16 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300637
18 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson303262
19 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG466 5112
2 mL disposible syringe (sterile)e-power150002S
2-0 70 cm suture “ Vicryl plus” (sterile)Johnson & Johnson  VCP453
20 G X 25 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson304827
20 mL disposable syringe (sterile)e-power150020S
20 μL pipetteSartorius46886095
200 μL pipetteSartorius39486615
20G Venflon "Pro" 1.1 x 32 mmBeckton Dickinson393255
21 G x 25 mm Vacutainer blood collection needles (sterile)Becton Dickinson301746
21 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG4665643
22 G X 50 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300094
23 G X 25 mm “Medoject” needles (sterile)Chirana T. InjectaCH23100
25 G X 16 mm “Microlance 3” needles (sterile)Beckton Dickinson300600
25 G X 25 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG9186158
25 mL plastic pipettes (sterile)LP Italian Spa162510
30 mL disposible syringes (sterile)e-power150030S
4L plastic freezer bagsCater.LineABN-105004
5–350 μL pipette tips “Optifit”Sartorius790350
5 mL disposible syringe (sterile)e-power150005S
5 mL syringe (sterile) B. Braun Melsungen AG4617053V
50–1200 μL pipette tips “Optifit”Sartorius791200
50 mL Luer Lock Original Perfusor Syringe B. Braun Melsungen AG8728844F-06
50 mL tubes (sterile)Sarstedt AG and Co. KG62.547.254
82% ethanol + 0.5% chlorhexidine disinfection wipesMediq527497
Atropine "ATROpin" 1 mg/mLAmgros741124
Bandage scissors, stainless steel, 180 mmB. Braun Melsungen AGBC849R
Blood gas machine ABL90Radiometer994-667 (service manual)
Brain Heart Infusion broth (BHI/B)Produced in-houseN.A. Commercially available equivalent product: Brain Heart Infusion Broth (Merck, Cat. No. 53286)
Butorphanol "Butomidor vet" 10 mg/mLVetViva Richter53 19 43
Cell incubator “HeraCell 150i”Thermo Fisher Scientific51032719
Centrifuge, Rotina 380 RHettich 1701
Clinical chemistry system “Advia 2120i”Siemens Healthcare GmbH10488923
Closing cones “Combi-Stopper” (sterile)B. Braun Melsungen AG4495101
Columbia agar + 5% sheep blood platesBioRad63784
Disposable soft underpads, Abri-Soft classicAbena4115
Doxapram-V 20 mg/mLDechra34144/G
EDTA 3 mL collection tubes (sterile)Becton Dickinson368856
Endotracheal tube (12 mm x 55 cm, 150 cc), Silicone, cuffedMilaGVPmL-METC955
Enteral feeding tube 04Fr-L.40cm - PVC (sterile)Vygon310.04Used as umbilical arterial catheter
Ethanol 70% VWR83801.36
Extension line “Q-Style” (sterile)Becton Dickinson385151
Flowmeter for oxygenDamecaP/N 32018-00
Flumaznil 0.1 mg/mLHamelm pharmacy gmbh33659
Gloves, “Gentle Skin” (sterile)Meditrade9021

Referências

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