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Artigo de método

Imagiologia de Time-Lapse da Fagocitose de Células de Cancro da Mama Triplo-Negativo Marcadas com Proteína Fluorescente Verde por Macrófagos Mediada por Anticorpos

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DOI:

10.3791/71461

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14 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método de imagem celular viva com lapso de tempo para visualizar a fagocitose de células de câncer de mama triplo negativo marcadas com proteína verde fluorescente por macrófagos derivados de monócitos de sangue periférico, utilizando um microscópio automatizado.

Resumo

A fagocitose celular dependente de anticorpos é um mecanismo fundamental pelo qual macrófagos englobam células cancerígenas opsonizadas por anticorpos. Este protocolo descreve um método de imagem em tempo real com registro contínuo para visualizar a fagocitose mediada por macrófagos dependentes de anticorpos em células de câncer de mama triplo negativo que expressam a proteína verde fluorescente marcada e CD24. Os macrófagos são derivados de células mononucleares do sangue periférico humano, diferenciados com fator estimulador de colônias de macrófagos e polarizados com interferon gama e lipopolissacarídeo para gerar um fenótipo pró-inflamatório. As células cancerígenas são opsonizadas com um anticorpo monoclonal anti-CD24 antes da cocultura com macrófagos numa proporção definida de efetor para alvo. Os eventos fagocíticos são registrados ao longo de um período de 16 h utilizando um microscópio automatizado equipado com controle ambiental para manter condições fisiológicas. A aquisição de imagens é realizada utilizando canais de contraste de fase e fluorescência, permitindo a identificação das células cancerígenas e o monitoramento de sua internalização pelos macrófagos. Imagens representativas em sequência temporal demonstram o englobamento progressivo das células cancerígenas fluorescentes ao longo do tempo. Para permitir uma avaliação quantitativa, um ensaio paralelo de ponto final é realizado sob condições idênticas de cocultura, no qual as células cancerígenas não internalizadas são removidas antes da aquisição de imagens, permitindo uma medida precisa dos eventos fagocíticos. Este método fornece uma abordagem padronizada e reprodutível para visualizar a fagocitose mediada por macrófagos impulsionada por anticorpos in vitro. Importante, a integração da imagem em tempo real com a quantificação baseada em ponto final permite uma avaliação complementar da cinética e da magnitude da fagocitose. Este protocolo auxilia na avaliação de anticorpos terapêuticos e imunoterapias contra o câncer direcionadas a macrófagos em um ambiente in vitro controlado.

Introdução

O câncer de mama é a neoplasia mais frequentemente diagnosticada entre as mulheres em todo o mundo, correspondendo a aproximadamente 2,3 milhões de novos casos anualmente1. A doença é clinicamente heterogênea e é classificada em pelo menos quatro subtipos moleculares principais com base no status dos receptores hormonais — receptor de estrogênio (RE) e receptor de progesterona (RP) — e na expressão do oncogene do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2)2. Os tumores luminais A expressam RE e/ou RP sem superexpressão de HER2 (RE/RP+ e HER2−); os tumores luminais B coexpressam RE/RP e HER2 (RE/RP+ e HER2+); os tumores HER2+ são caracterizados por alta expressão de HER2, independentemente do status dos receptores hormonais; e o câncer de mama triplo negativo (CMTN) não expressa nenhum dos três marcadores (RE−, RP− e HER2−)2,3. Dentre esses subtipos, o CMTN representa a forma clinicamente mais desafiadora e corresponde a aproximadamente 15%–20% de todos os cânceres de mama. Pacientes com CMTN apresentam o curso da doença mais agressivo, com o pior prognóstico e menor sobrevida global em cinco anos, devido à baixa resposta à quimioterapia convencional e à ausência de terapias direcionadas eficazes3,4. Além disso, o CMTN exibe uma propensão significativamente alta à metástase visceral, particularmente para os pulmões dentro de cinco anos do diagnóstico, e pacientes com CMTN avançado ou metastático (CMTNM) apresentam uma sobrevida mediana que raramente ultrapassa dois anos5,6. Essas estatísticas destacam a necessidade crítica e não atendida de novas estratégias terapêuticas para o CMTN.

O microambiente tumoral (MAT) desempenha um papel fundamental na progressão do câncer de mama e na evasão imunológica. Os macrófagos associados ao tumor estão entre as células imunes mais abundantes dentro do MAT e recentemente foram reconhecidos como mediadores críticos da imunidade inata contra o tumor7,8,9. Embora os MTAs tenham sido historicamente divididos em estados pró-inflamatórios “M1” e pró-tumorais “M2”, esse modelo binário não consegue capturar a verdadeira extensão da heterogeneidade dos macrófagos. Em vez disso, os MTAs ocupam um espectro funcional dinâmico, evoluindo em resposta aos diversos sinais bioquímicos presentes no MAT. Nessa paisagem complexa, as células tumorais subvertem ativamente a atividade dos macrófagos por meio de várias estratégias de evasão imunológica, notadamente a superexpressão de sinais de “não me coma”. O eixo CD47/SIRPα foi o primeiro ponto de controle imunológico inato identificado nesse contexto6,10, e mais recentemente, o CD24 emergiu como um novo e potente sinal anti-fagocítico11,12. O CD24 é uma glicoproteína de tipo mucina pequena e altamente glicosilada, ancorada à membrana celular por meio de uma ligação glicosilfosfatidilinositol13. Ele é expresso em várias linhagens de células imunes em condições fisiológicas, mas é frequentemente superexpresso em tumores sólidos, incluindo cânceres de mama, ovário, pâncreas e colorretal14. Em células tumorais, o CD24 interage com o receptor inibitório sialic acid–binding immunoglobulin-like lectin 10 (Siglec-10) expresso nos macrófagos. Essa interação desencadeia a fosforilação dos domínios de motivo inibitório baseado em tirosina do receptor imunológico na cauda citoplasmática do Siglec-10, ativando as fosfatases SHP-1 e SHP-2 que suprimem a sinalização fagocítica downstream11. A bloqueio da interação CD24/Siglec-10 com anticorpo monoclonal demonstrou aumentar robustamente a fagocitose de tumores humanos que expressam CD24 pelos macrófagos. Nosso estudo recente também mostrou que a eliminação do CD24a em células de câncer de mama aumenta sua suscetibilidade à fagocitose por macrófagos em um modelo murino de câncer de mama triplo negativo9.

A fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP) é um mecanismo fundamental pelo qual os anticorpos direcionam os macrófagos a fagocitar células tumorais15,16. Após se ligarem a antígenos expressos pelas células tumorais, as regiões Fc dos anticorpos interagem com os receptores Fcγ (FcγRs) presentes nos macrófagos, desencadeando cascatas de sinalização intracelular que resultam no rearranjo do citoesqueleto, na formação da cúpula fagocítica e na internalização da célula-alvo17.

Neste estudo, desenvolvemos e validamos um protocolo de imagem celular vital com lapso de tempo para medir a fagocitose mediada por anticorpos de células de câncer de mama por macrófagos. O método utiliza macrófagos derivados de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de doadores humanos saudáveis, diferenciados com fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) e posteriormente estimulados com lipopolissacarídeo (LPS) e interferon gama (IFN-γ). A análise por citometria de fluxo confirmou a superexpressão de CD80 dentro da população CD11b⁺ após a estimulação (Figura 1), sustentando o fenótipo classicamente ativado. Esse estado de ativação confere uma capacidade robusta de fagocitose mediada por anticorpos, tornando-o adequado para avaliar a fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP). Células de câncer de mama positivas para CD24 marcadas com GFP servem como células-alvo e são opsonizadas com um anticorpo monoclonal terapêutico anti-CD24 antes da cocultura. Os eventos fagocíticos são registrados ao longo de um período de 16 h usando um microscópio automatizado sob condições ambientais controladas. Para permitir uma avaliação quantitativa em paralelo com a visualização dinâmica, um ensaio de ponto final separado é realizado sob condições idênticas de cocultura, permitindo uma medição rigorosa da fagocitose após a remoção das células-alvo não internalizadas. Este protocolo fornece uma plataforma padronizada, reprodutível e visualmente informativa para avaliar a ADCP mediada por um anticorpo anti-CD24. Importante, a integração da imagem com lapso de tempo com uma estratégia complementar de quantificação baseada em ponto final permite a avaliação simultânea da cinética e da magnitude da fagocitose. O método pode ser adaptado para investigar outros alvos imunoterapêuticos direcionados a macrófagos. Este protocolo é mais adequado para avaliar a ADCP mediada por anticorpos monoclonais terapêuticos contra antígenos de superfície em células cancerígenas. É especialmente indicado para triagem comparativa de anticorpos candidatos, caracterização de resposta à dose e estudos mecanicistas do engajamento Fc–FcγR, incluindo os efeitos do bloqueio do sinal “não me coma” (por exemplo, CD47–SIRPα). Como o ensaio utiliza macrófagos humanos primários, também é apropriado para estudos translacionais que exigem avaliação da variabilidade entre doadores antes do desenvolvimento clínico.

Diagrama de isolamento de células mononucleares do sangue periférico com citometria de fluxo para análise de macrófagos.
Figura 1. Geração e validação por citometria de fluxo de macrófagos estimulados com IFN-γ/LPS derivados de células mononucleares do sangue periférico. Painel superior: Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são isoladas de doadores saudáveis por meio de centrifugação em gradiente de densidade utilizando solução de Ficoll a 400 × g durante 30 min a 20°C, com todos os reagentes previamente equilibrados a 20°C ± 2°C. Os PBMCs isolados são cultivados em meio ImmunoCult-SF suplementado com 100 ng/mL de fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) por 7 dias para induzir a diferenciação em macrófagos (Dia 0–7), com reposição do meio no Dia 5. No Dia 8, os macrófagos diferenciados são estimulados com 100 ng/mL de IFN-γ e 1 µg/mL de LPS por 48 h (Dia 8–10). As células são então submetidas à análise por citometria de fluxo. Painel inferior: Análise por citometria de fluxo de macrófagos. As células foram marcadas com um painel de superfície composto por CD11b-FITC, CD80-PE e CD206-PerCP-Cy5.5, seguido pela adição de DAPI antes da aquisição para exclusão de células mortas. Estratégia de seleção: Primeiramente, as células foram selecionadas com base na viabilidade (DAPI⁻), seguido pela identificação de CD11b⁺ em um gráfico de CD11b-FITC versus FSC-A para confirmar a identidade de macrófago. Os eventos viáveis CD11b⁺ foram então analisados em um gráfico de dispersão de CD80 versus CD206 para confirmar a população CD80⁺CD206⁻ induzida pela estimulação com IFN-γ/LPS. À direita: Gráfico de dispersão representativo de CD11b-FITC versus FSC-A mostrando que 99,8% das células selecionadas foram CD11b⁺, confirmando a identidade de macrófago. À esquerda: A maioria das células CD11b⁺ estava dentro do quadrante CD80⁺CD206⁻ (Q1: 95,2%), indicando o fenótipo pró-inflamatório esperado sob as condições de estimulação aplicadas. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Os usuários devem considerar várias limitações ao aplicar esta técnica. Primeiro, a variabilidade entre doadores em macrófagos derivados de PBMCs pode introduzir uma variação substancial na atividade fagocítica, e recomendamos o uso de múltiplos doadores (n ≥ 3), com os dados individuais de cada doador relatados juntamente com os resultados agrupados. Segundo, o formato de co-cultura em 2D não recapitula o microambiente tumoral, e os achados devem ser validados em modelos tridimensionais ou in vivo antes de qualquer inferência clínica. Terceiro, a janela de imagem de 16 horas capta eventos fagocíticos iniciais, mas não reflete processos de longo prazo, como a apresentação de antígenos ou a ativação imune secundária. Assim, o uso combinado de imagem em tempo real e quantificação no ponto final fornece um arcabouço complementar que aumenta tanto a interpretabilidade quanto a reprodutibilidade das medidas de ADCP.

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Protocolo

Este protocolo envolve o uso de macrófagos primários derivados de amostras de sangue de doadores saudáveis. A coleta e o processamento das amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa (IRB) da Universidade Médica da China.

1. Preparação de Macrófagos Derivados de PBMC

OBSERVAÇÃO: Realize todos os procedimentos envolvendo sangue humano sob aprovação do comitê de ética institucional (por exemplo, CMUH IRB). Obtenha consentimento informado de doadores saudáveis antes da coleta de sangue.

ATENÇÃO: Manipule todos os produtos sanguíneos humanos sob condições de Nível de Biossegurança 2 utilizando precauções universais.

  1. Coleta de sangue
    1. Coletar sangue total de um doador saudável em tubos vacutainer revestidos com ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) de 10 mL.
  2. Diluição do sangue
    1. Diluir o sangue total em uma proporção de 1:1 com solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS; sem Ca2⁺/Mg2⁺) (por exemplo, 10 mL de sangue + 10 mL de PBS).
    2. Misturar invertendo o tubo três a cinco vezes.
      NOTA: Manter o PBS em gelo antes do uso. A baixa temperatura ajuda a preservar a viabilidade celular durante o processamento.
  3. Camada de gradiente de densidade
    1. Aplicar cuidadosamente o sangue diluído sobre o Ficoll–Paque PLUS em uma proporção volumétrica de 2:1 (v/v) em um tubo cônico (por exemplo, 8 mL de sangue sobre 4 mL de Ficoll em um tubo de 15 mL, ou 30 mL sobre 15 mL em um tubo de 50 mL).
    2. Equilibrar tanto o sangue diluído quanto o Ficoll–Paque PLUS a 20°C ± 2°C antes da aplicação.
    3. Remover o Ficoll–Paque PLUS do armazenamento a 4°C pelo menos 30 minutos antes do uso, ou aquecê-lo brevemente em banho-maria a 20°C ± 2°C.
    4. Não utilizar reagentes frios, pois a densidade do Ficoll é calibrada para 20°C ± 2°C, e desvios comprometerão a eficiência da separação e o rendimento de PBMCs.
      NOTA: Inclinar o tubo em um ângulo de 45° e pipetar o sangue lentamente ao longo da parede para manter uma interface nítida. Não perturbar a camada de Ficoll.
  4. Centrifugação
    1. Centrifugar a 400 × g por 30 minutos a 20°C com o freio desligado (Figura 1).
      NOTA: O uso do freio perturbará o gradiente de densidade e reduzirá o rendimento de PBMCs.
  5. Coleta de PBMCs
    1. Aspirar cuidadosamente apenas a camada do "buffy coat" (a interface esbranquiçada entre as camadas de plasma e Ficoll), sem perturbar o plasma acima nem a camada de Ficoll abaixo, utilizando uma pipeta serológica.
    2. Transferir a camada coletada para um novo tubo cônico de 50 mL.
  6. Lavagem de PBMCs
    1. Adicionar PBS para atingir um volume total de 25 mL em um tubo cônico de 50 mL.
    2. Utilizar um tubo de 50 mL para garantir uma centrifugação e balanceamento adequados.
    3. Centrifugar a 300 × g por 10 minutos.
  7. Lise de hemácias
    1. Descartar o sobrenadante.
    2. Res suspender o pellet em 5 mL de tampão de lise de hemácias (RBC) pipetando suavemente para cima e para baixo com uma pipeta serológica até que o pellet esteja completamente disperso e não haja grumos visíveis.
    3. Incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
      CAUTELA: A dispersão completa é necessária para garantir uma lise uniforme; no entanto, evitar pipetagem vigorosa ou vortex, o que pode danificar os PBMCs. Não exceder 5 minutos de incubação com o tampão de lise de hemácias, pois exposição prolongada pode comprometer a viabilidade dos PBMCs.
  8. Pelotização de PBMCs
    1. Centrifugar a 500 × g por 5 minutos para pelotizar os PBMCs e remover os detritos de hemácias lisadas.
  9. Res suspensão final
    1. Descartar o sobrenadante.
    2. Res suspender o pellet em 5 mL de meio macrofágico ImmunoCult-SF.
      NOTA: Em condições padrão, 10 mL de sangue total normalmente produzem 1,5–2,0 × 107 PBMCs.

2. Diferenciação de Macrófagos (Dias 0–7)

OBSERVAÇÃO: Utilize placas de Petri não tratadas para cultura de tecidos (TC) para selecionar macrófagos diferenciados derivados de monócitos por aderência. Os linfócitos não aderentes serão removidos durante a cultura subsequente.

  1. Dia 0: Semeadura celular
    1. Realize a contagem celular e semeie 1 × 107 PBMCs em uma placa de Petri de 10 cm não tratada para cultura celular (não-TC).
    2. Complete o volume total para 10 mL utilizando meio macrofágico ImmunoCult-SF suplementado com 100 ng/mL de M-CSF (preparado pela adição direta do estoque de M-CSF ao meio completo imediatamente antes do uso e misturado por inversão suave).
      NOTA: O protocolo pode ser escalonado proporcionalmente para acomodar variações no rendimento de PBMCs do doador, utilizando uma densidade de semeadura a partir de 1 × 106 células/mL como referência.
  2. Incubação e monitoramento
    1. Incube a 37°C com 5% de CO₂ em incubadora umidificada.
    2. Monitore diariamente a formação de agregados de monócitos em suspensão e o aparecimento de células aderentes.
      NOTA: Os monócitos aumentarão gradualmente de tamanho e formarão agregados à medida que a diferenciação progrida. Algumas células começarão a aderir à placa. Nenhuma intervenção é necessária nesta etapa.
  3. Dia 5: Suplementação do meio
    1. Adicione cuidadosamente 5 mL de meio macrofágico ImmunoCult-SF fresco suplementado com 100 ng/mL de M-CSF à placa, tomando cuidado para não perturbar os macrófagos aderentes.
    2. Continue o cultivo por mais 2 dias (até o dia 7).
      CAUTELA: Adicione o meio fresco suavemente ao longo da parede da placa para evitar perturbar os macrófagos aderentes, pois a perturbação mecânica pode afetar a eficiência da diferenciação e o rendimento celular.
      NOTA: Evite substituir o meio para preservar fatores autócrinos/parácrinos que apoiam a diferenciação macrofágica.
  4. Dia 7: Avaliação morfológica
    1. Analise a eficiência da diferenciação macrofágica em microscópio invertido.
    2. As células aderentes exibem morfologia característica de macrófagos: grandes, achatadas e com formato irregular, apresentando pseudópodes visíveis.
    3. No dia 7, macrófagos bem diferenciados devem estar visíveis.
      CAUTELA: A avaliação morfológica no dia 7 serve como pré-requisito crítico para a validação subsequente por citometria de fluxo. Macrófagos bem diferenciados devem ser claramente visíveis ao microscópio, e uma proporção maior de células aderentes com morfologia macrofágica reflete maior eficiência de diferenciação (aproximadamente 70% de confluência de macrófagos aderentes com morfologia característica é considerada indicativa de diferenciação bem-sucedida). Cultivos com pouca aderência, células predominantemente arredondadas ou diferenciação morfológica insatisfatória provavelmente não gerarão resultados confiáveis em citometria de fluxo e não devem avançar para estimulação e coloração.

3. Polarização de Macrófagos (Dias 8–10)

  1. Coleta e clarificação do meio condicionado
    1. No Dia 8, aspire cuidadosamente os 15 mL de meio do recipiente de cultura sem perturbar os macrófagos aderentes e transfira para um tubo cônico estéril de 50 mL.
    2. Centrifugue o meio coletado a 400 × g durante 5 min para sedimentar os detritos celulares.
    3. Retenha o sobrenadante clarificado para o próximo passo.
  2. Estimulação com interferon gama (IFN-γ) e lipopolissacarídeo (LPS)
    1. Transfira os 15 mL de sobrenadante clarificado para um novo tubo estéril e acrescente 100 ng/mL de IFN-γ e 1 µg/mL de LPS.
    2. Misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo (5–10 vezes) para garantir uma distribuição uniforme das citocinas sem introduzir bolhas.
    3. Retorne os 15 mL completos do meio suplementado com citocinas ao recipiente de cultura original, pipetando suavemente ao longo da parede interna para evitar perturbar os macrófagos aderentes.
    4. Incube a 37°C com 5% de CO₂ por 48 h (Dia 8 ao Dia 10).
      NOTA: Utilize meio condicionado (antigo) para preservar fatores autócrinos/parácrinos. Essa combinação de IFN-γ e LPS é usada para polarizar os macrófagos em um fenótipo pró-inflamatório. Nas condições de estímulo com IFN-γ (100 ng/mL) e LPS (1 µg/mL) utilizadas neste protocolo, os macrófagos exibem alterações morfológicas características, incluindo lamelipódios alongados compatíveis com um estado ativado pró-inflamatório, bem como expressão de CD11b e CD80.
      CAUTELA: Manipule o LPS seguindo os procedimentos adequados de segurança em laboratório, pois é um endotoxina bioativa que pode causar respostas inflamatórias após exposição.

4. Confirmação dos Marcadores do Fenótipo Inflamatório de Macrófagos Estimulados por IFN-γ e LPS por Citometria de Fluxo

  1. Coleta de células
    1. Colete um subconjunto de macrófagos polarizados no Dia 10 para fenotipagem.
    2. Adicione 10 mM de EDTA em PBS e incube por 10–15 min a 37°C.
    3. Desprenda as células por pipetagem suave.
      NOTA: Prolongue a incubação com EDTA por mais 30 min a 37°C caso as células permaneçam aderentes, e repita a pipetagem suave. Evite pipetagem vigorosa ou raspagem mecânica para preservar a viabilidade celular e a integridade dos marcadores de superfície.
  2. Preparação da marcação com anticorpos
    1. Marque as células com anticorpos conjugados a fluorocromos contra CD11b (marcador de linhagem pan-macrófago), CD80 (marcador inflamatório) e CD206 (marcador anti-inflamatório utilizado como marcador de exclusão negativa para identificação do fenótipo inflamatório).
  3. Procedimento de marcação
    1. Transfira 5 × 105 macrófagos destacados para um tubo de citometria de fluxo contendo 100 µL de PBS frio.
    2. Adicione os anticorpos CD11b-FITC, CD80-PE e CD206-PerCP-Cy5.5 a uma concentração final de 1 µg/mL cada.
    3. Misture a suspensão celular por pipetagem suave.
    4. Incube as amostras no gelo por 1 h, protegidas da luz.
    5. Centrifugue as amostras a 300 × g por 1 min a 4°C.
    6. Aspire cuidadosamente o sobrenadante.
    7. Adicione 0,5 mL de PBS frio para lavar o pellet celular.
    8. Centrifugue as amostras a 300 × g por 1 min a 4°C.
    9. Descarte o sobrenadante.
    10. Resuspenda o pellet celular em 200 µL de PBS frio.
    11. Adicione DAPI a uma concentração final de 1 µg/mL.
      NOTA: Inclua controles de isotipos apropriados e um corante de viabilidade (por exemplo, DAPI ou corante fixável Viobility 405/452).
  4. Análise por citometria de fluxo
    1. Adquira as amostras marcadas utilizando um citômetro de fluxo.
    2. Confirme a expressão de CD11b e CD80 na população de macrófagos.
    3. Prossiga para o ensaio de fagocitose somente após confirmar a expressão dos marcadores compatível com um fenótipo inflamatório.
  5. Aquisição e configuração da citometria de fluxo
    1. Configuração do instrumento
      1. Configure o citômetro de fluxo utilizando os seguintes canais: Pacific Blue/V450 (DAPI), FITC (CD11b), PE (CD80) e PerCP-Cy5.5 (CD206).
      2. Defina o parâmetro de aquisição para coletar 10.000 eventos por amostra dentro do gate pai definido.
    2. Calibração de limiar e ganho
      1. Abra quatro gráficos de dispersão exibindo FSC no eixo x e um canal de fluoróforo no eixo y.
      2. Prepare células marcadas com anticorpos de controle de isotipo correspondentes a cada fluoróforo.
      3. Adquira as amostras de controle de isotipo.
      4. Ajuste o ganho de cada canal para posicionar a população de controle de isotipo abaixo de 101 na escala logarítmica.
      5. Utilize este limiar para definir os níveis de sinal de fundo.
        NOTA: Utilize uma faixa de escala logarítmica de 101 a 101·5 para estabelecer uma separação confiável entre o sinal de fundo e o sinal específico.
    3. Compensação
      1. Adicione uma gota de microesferas de compensação em um tubo microcentrífugo de 1,5 mL.
      2. Adicione o anticorpo conjugado ao fluoróforo correspondente a uma concentração final de 1 µg/mL.
      3. Incube por 30 min no gelo, protegido da luz.
      4. Centrifugue a 400 × g por 1 min.
      5. Descarte o sobrenadante.
      6. Resuspenda as microesferas em 200 µL de PBS frio.
      7. Adquira os controles monocromáticos.
      8. Aplique compensação espectral para corrigir o vazamento dos fluoróforos.
    4. Estratégia de gating
      1. Seleção de células viáveis
        1. Exiba Pacific Blue/V450 (DAPI) no eixo y e FSC no eixo x.
        2. Gateie eventos DAPI-negativos (abaixo de 101) para selecionar células viáveis.
      2. Identificação de macrófagos
        1. Defina a população de células viáveis como o gate pai.
        2. Exiba FITC (CD11b) no eixo y e FSC no eixo x.
        3. Gateie eventos CD11b⁺ (acima de 101).
      3. Identificação do fenótipo inflamatório
        1. Defina a população CD11b⁺ como o gate pai.
        2. Exiba PE (CD80) no eixo y e PerCP-Cy5.5 (CD206) no eixo x.
        3. Aplique o gating em quadrantes no valor de 101.5 em ambos os eixos.
        4. Identifique células CD80⁺CD206⁻ no quadrante superior esquerdo (Q1).
  6. Critérios de aceitação
    1. Confirme que ≥90% das células dentro do gate pai CD11b⁺ sejam CD80⁺CD206⁻.
    2. Prossiga para o ensaio de fagocitose somente quando este limiar for atingido.
    3. Repita o isolamento de PBMC, diferenciação com M-CSF e estimulação com IFN-γ/LPS caso as amostras não atendam a este critério.

5. Ensaio de Fagocitose Dependente de Anticorpo

OBSERVAÇÃO: Verifique a expressão estável de GFP em células cancerígenas antes da montagem do ensaio. Confirme a expressão de CD24 em células-alvo antes do ensaio. Utilize células cancerígenas com positividade para CD24 entre 50% e 100% para desempenho ideal. As células MDA-MB-468 utilizadas neste protocolo exibem positividade de 100% para CD24.

  1. Platamento de macrófagos
    1. Plante macrófagos estimulados com IFN-γ e LPS, conforme validado na Etapa 4, na densidade de 2 × 105 células por poço em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.
    2. Incube a placa a 37°C em condições estáticas com 5% de CO₂ por 12–16 h para permitir a aderência celular (Figura 2A).
      NOTA: Certifique-se de que os macrófagos estejam firmemente aderidos antes de prosseguir. Macrófagos mal aderidos podem se destacar durante a aquisição de imagens e comprometer os resultados.
  2. Preparação das células cancerígenas
    1. Cultive células de câncer de mama marcadas com GFP e positivas para CD24 (MDA-MB-468) até atingirem confluência de 70%–80%.
    2. Aspire o meio de cultura.
    3. Lave a monocamada celular uma vez com PBS.
  3. Desprendimento das células cancerígenas
    1. Adicione 10 mM de EDTA em PBS ao recipiente de cultura.
    2. Incube as células a 37°C por 5–10 min.
    3. Desprenda as células por pipetagem suave para obter liberação completa das células.
      NOTA: Evite o uso de tripsina para o desprendimento celular. A digestão enzimática pode clivar o CD24 da superfície celular e comprometer a ligação do anticorpo.
  4. Coleta e contagem das células cancerígenas
    1. Colete as células destacadas em um tubo de centrífuga.
    2. Centrifugue as células a 300 × g por 5 min.
    3. Descarte o sobrenadante.
    4. Resuspenda o pellet celular em meio RPMI completo.
    5. Conte as células viáveis.
  5. Opsonização com anticorpo das células cancerígenas
    1. Resuspenda as células cancerígenas na densidade de 2 × 105 células/mL em 0.5 mL de meio RPMI completo.
    2. Adicione o anticorpo monoclonal anti-CD24 até uma concentração final de 1 µg/mL.
    3. Misture a suspensão celular por pipetagem suave para garantir distribuição uniforme do anticorpo.
    4. Incube as células a 37°C por 30 min em condições estáticas.
      NOTA: Inclua um controle de IgG de isotipo correspondente na mesma concentração como controle negativo para fagocitose dependente de anticorpo.
  6. Preparação para co-cultura
    1. Não lave as células após a opsonização.
    2. Prossiga diretamente para a co-cultura para manter o revestimento de anticorpo na superfície celular.
  7. Montagem da co-cultura
    1. Adicione 1 × 105 células de câncer de mama marcadas com GFP e opsonizadas com anticorpo a cada poço contendo macrófagos.
    2. Mantenha uma proporção efetora-alvo de 2:1.
      NOTA: Ajuste a proporção efetora-alvo conforme o desenho experimental. Utilize proporções mais altas de macrófagos em relação às células cancerígenas do que a proporção descrita de 2:1 (por exemplo, 3:1 ou 5:1) para aumentar a frequência de contato célula-célula e melhorar a detecção de eventos fagocíticos.

Diagrama de lapso de tempo da interação entre macrófagos e células marcadas com GFP no experimento de imagem.
Figura 2. Imagem de lapso de tempo da fagocitose celular dependente de anticorpos. (A) Visão esquemática do sistema de co-cultivo e da configuração para a aquisição de imagens de lapso de tempo. Os parâmetros de imagem incluíram intervalos de 10 min durante um tempo total de aquisição de 16 h (97 quadros), utilizando uma objetiva de 10× com contraste de fase e canais GFP. (B) Imagens representativas de lapso de tempo de 1 h a 16 h mostrando eventos fagocíticos caracterizados pela internalização de células cancerígenas GFP-positivas por macrófagos ao longo do tempo. Círculos tracejados amarelos destacam eventos fagocíticos representativos. No canal de contraste de fase, as células cancerígenas englobadas aparecem como estruturas intracelulares claras no citoplasma do macrófago (setas brancas). No canal GFP, a fluorescência localizada dentro dos macrófagos confirma a internalização. (C) Ampliações de eventos fagocíticos representativos em 0, 1, 4 e 16 h, ilustrando o processo sequencial de englobamento mediado por macrófagos de células cancerígenas marcadas com GFP. A sequência de imagens foi selecionada como representativa com base na visualização clara de eventos fagocíticos mediados por macrófagos. Setas brancas indicam macrófagos interagindo com e internalizando células-alvo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

6. Imageamento com lapso de tempo (sistema automatizado de imageamento de células vivas)

OBSERVAÇÃO: Configure o protocolo de imagem usando um sistema automatizado de imagem de células vivas Lionheart e o software Gen5 de imagem de células vivas automatizado antes do ensaio. Obtenha o treinamento adequado antes de operar o sistema de imagem para garantir uma configuração precisa, desempenho ideal e uso seguro.

  1. Preparação do instrumento
    1. Ligue o sistema de imagem, o módulo de controle ambiental e o suprimento de gás CO₂ pelo menos 1 h antes da aquisição de imagens.
    2. Abra o painel de Controle de Ambiente no software automatizado de imagem de células vivas.
    3. Defina a temperatura em 37°C e o CO₂ em 5%.
    4. Confirme que a temperatura da câmara estabilizou dentro de ± 0,2°C e o CO₂ em 5,0% ± 0,1% antes de carregar a placa.
  2. Preparação da placa
    1. Coloque a placa de 24 poços na câmara de imagem do sistema de aquisição.
  3. Configuração inicial
    1. Abra o Gerenciador de Tarefas do software automatizado de imagem de células vivas.
    2. Selecione [Modo manual do imagemador].
    3. Clique em [Capturar agora] para inicializar os parâmetros de imagem.
    4. Selecione uma objetiva de 10×.
    5. Selecione microplaca como configuração de filtro.
    6. Selecione uma placa de 24 poços na biblioteca de placas do software automatizado de imagem de células vivas.
  4. Foco e configuração de imagem
    1. Selecione o canal de Contraste de Fase.
    2. Selecione um poço representativo (por exemplo, A1).
    3. Ative o autofoco antes da aquisição em lapso de tempo.
    4. Capture uma imagem usando o ícone da câmera.
    5. Confirme a morfologia celular e a qualidade do foco.
    6. Navegue até [Processar/Analisar].
    7. Selecione [Criar experimento a partir de um conjunto de imagens] para configurar o experimento.
  5. Parâmetros de aquisição em lapso de tempo
    1. Abra o painel de configurações [Procedimento].
    2. Defina a temperatura em 37°C e o CO₂ em 5%.
    3. Em [Iniciar Cinética], defina o tempo de execução para 16:00:00.
    4. Defina o intervalo de aquisição de imagens para 0:10:00.
    5. Defina o número total de leituras para 97.
    6. Utilize um intervalo de aquisição de imagens de 10–15 min para equilibrar resolução temporal e fototoxicidade durante a captura de eventos fagocíticos iniciais.
  6. Configuração dos canais de imagem
    1. Defina o Canal 1 como Contraste de Fase.
    2. Defina o Canal 2 como GFP (Ex 469/35, Em 525/39).
    3. Selecione uma objetiva de 10× para obter campo de visão e resolução ideais.
    4. Defina iluminação, tempo de integração e ganho como [Automático], ou ajuste manualmente.
    5. Utilize um tempo típico de exposição para GFP de 100–300 ms para evitar saturação do sinal.
    6. Aplicar as mesmas configurações de imagem em todos os poços.
  7. Configuração das posições de imagem
    1. Abra o menu [Definir marcadores].
    2. Desative a aquisição em Z-stack.
    3. Desative a aquisição em mosaico.
    4. Realize a aquisição de imagens em um único plano focal.
    5. Defina manualmente as posições de imagem selecionando regiões representativas e não sobrepostas em cada poço, utilizando o ícone do microscópio.
    6. Mantenha posições idênticas de imagem em todos os pontos temporais.
    7. Selecione pelo menos 4–6 campos de visão por poço.
  8. Aquisição em lapso de tempo
    1. Clique em [Play] para iniciar a aquisição automatizada de imagens em lapso de tempo.
  9. Exportação e visualização dos dados
    1. Abra o arquivo do experimento salvo após a aquisição.
    2. Selecione as posições de imagem.
    3. Exporte os dados em lapso de tempo no formato MP4.
    4. Abra a [Ferramenta de Processamento].
    5. Aplicar [Desconvolução de Imagem], se necessário, para melhorar a visualização e identificar eventos representativos de fagocitose.
      NOTA: Utilize a aquisição em lapso de tempo apenas para visualização qualitativa. Células cancerosas GFP-positivas não fagocitadas podem sobrepor-se ou associar-se transitoriamente a macrófagos, gerando sinais falsos positivos. Realize análises quantitativas utilizando um ensaio terminal separado.

7. Quantificação da Fagocitose no Ponto Final

  1. Remoção de células não internalizadas
    1. Realize o ensaio em condições de co-cultura idênticas.
    2. Encerre o experimento após 4 h.
    3. Remova o meio de cultura.
    4. Adicione 10 mM de EDTA em PBS.
    5. Incube a 37 °C por 5 min.
    6. Lave suavemente com PBS para remover as células positivas para GFP não internalizadas.
    7. Adicione meio fresco para macrófagos.
  2. Aquisição de imagens para quantificação
    1. Adquira imagens utilizando os canais de contraste de fase e GFP.
    2. Capture pelo menos 4–6 campos de visão por poço.
    3. Analise no mínimo três poços por condição.
  3. Definição de eventos fagocíticos
    1. Identifique macrófagos contendo sinais positivos para GFP totalmente delimitados dentro do contorno celular.
  4. Análise de imagem
    1. Abra as imagens no software ImageJ.
    2. Utilize o plugin Cell Counter.
    3. Conte o número total de macrófagos.
    4. Conte os macrófagos que contêm células positivas para GFP internalizadas.
  5. Cálculo do índice de fagocitose
    1. Calcule: Fórmula do índice de fagocitose; razão entre células GFP-positivas englobadas e macrófagos totais; equação.
    2. Realize a análise de maneira cega.
    3. Repita em pelo menos três experimentos independentes.
  6. Apresentação dos dados
    1. Apresente imagens representativas de lapso de tempo em ordem cronológica (Figura 2B e Figura 2C).
    2. Apresente imagens representativas do ponto final (Figura 3A e Figura 3B).

Análise da fagocitose: co-cultura de macrófagos, anticorpo monoclonal anti-CD24; imagens de microscopia, comparação de gráficos de dados.
Figura 3. Quantificação da fagocitose mediada por macrófagos dependente de anticorpos por análise de ponto final. (A) Imagens representativas de contraste de fase e fluorescência GFP de macrófagos co-cultivados com células de câncer de mama marcadas com GFP por 4 h, seguidas pela remoção das células não internalizadas mediante tratamento com EDTA. Os canais de contraste de fase e GFP foram sobrepostos para identificar macrófagos e alvos GFP-positivos internalizados. Macrófagos (contador 0) e macrófagos GFP-positivos que realizaram fagocitose (contador 1) foram contados utilizando o plugin Cell Counter no ImageJ. Na condição controle IgG, nenhum evento fagocítico foi observado, enquanto o tratamento com anticorpo monoclonal anti-CD24 resultou em sinais intracelulares claros de GFP dentro dos macrófagos, indicando fagocitose ativa. Barra de escala = 200 µm. (B) Quantificação do índice de fagocitose, definido como a porcentagem de macrófagos contendo células GFP-positivas internalizadas em relação ao número total de macrófagos. O anticorpo monoclonal anti-CD24 aumentou significativamente o índice de fagocitose em comparação com o controle IgG (0,00 ± 0,00% vs. 18,76 ± 4,01%, média ± DP; n = 6 campos por grupo; ***p < 0,001, teste t não pareado de Welch). Os dados são representativos de pelo menos três experimentos independentes. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

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Resultados

A geração e polarização bem-sucedidas de macrófagos a partir de PBMCs foram confirmadas por meio da avaliação morfológica e da análise por citometria de fluxo (Figura 1). Os PBMCs isolados por centrifugação em gradiente de densidade foram cultivados em meio suplementado com M-CSF, resultando em células aderentes com morfologia característica de macrófagos no sétimo dia. Após a estimulação com IFN-γ e LPS, as células exibiram um fenótipo compatível com ativação nas condições aplicadas. A anál...

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Discussão

Várias etapas deste protocolo são fundamentais para obter resultados confiáveis e reprodutíveis. Primeiramente, a qualidade e pureza do isolamento de PBMCs influenciam diretamente o rendimento de macrófagos e a eficiência de diferenciação. A sobreposição cuidadosa do sangue diluído sobre o gradiente de Ficoll e a centrifugação com o freio desligado são essenciais para preservar a interface da camada de buffy coat. A lise incompleta de hemácias ou incubação excessiva com o tampão de lise comprometerá a viabilidade dos PBM...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Biologia do Câncer e Terapêutica de Precisão, Universidade Médica da China, no âmbito do Programa de Centros de Pesquisa em Áreas de Destaque dentro do projeto Higher Education Sprout Project do Ministério da Educação (MOE) em Taiwan (CBPTC-PROJ-5-2).

Agradecemos ao Centro de Biologia do Câncer e Terapêutica de Precisão pelo financiamento e apoio acadêmico fornecidos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução estoque de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,5 MSigma-Aldrich (ou equivalente)E7889 (ou equivalente)Utilizado para preparar solução estoque de EDTA 10 mM em PBS para destacamento celular
Placas de cultura de tecidos de 24 poços (tratadas para cultura de tecidos)Corning (ou equivalente)3524Utilizado para co-cultivo de macrófagos e células cancerígenas durante ensaio de fagocitose
Anticorpo anti-CD206 humano (citometria de fluxo)BioLegend (ou equivalente)321122 (ou equivalente)Marcador para fenótipo alternativo de macrófago
Anticorpo monoclonal anti-humano CD24Thermo Fisher Scientific (ou equivalente)MA1-91384 (ou equivalente)Utilizado para opsonizar células cancerígenas para fagocitose dependente de anticorpos
Sistema automatizado de imagem em tempo real de células vivas com câmara de controle ambiental (por exemplo, Lionheart FX)Agilent Technologies (ou equivalente)Microscópio Automatizado BioTek Lionheart FXPermite a aquisição de imagens de lapso de tempo de longa duração sob temperatura controlada e 2 condições
Software de imagem para microscopia automatizada de células vivas (por exemplo, Gen5)Agilent Technologies (ou equivalente)N/AUtilizado para a aquisição e análise de dados de imagens com lapso de tempo
Centrífuga (rotor de balde oscilante)Thermo Fisher Scientific (ou equivalente)Multifuge X4R Pro com rotor TX-1000 (ou equivalente)Utilizado para o isolamento de PBMCs e etapas de lavagem celular
2 incubadora (37°C, 5% 2)Thermo Fisher Scientific (ou equivalente)Forma Direct Heat 2 Incubadora (ou equivalente)Mantém as condições fisiológicas para o cultivo celular
2 fonte de gás com reguladorAgilent Technologies (ou equivalente)N/AMateriais 2 para controle ambiental de incubadora e sistema de imagem
Tubos cónicos (15 mL e 50 mL)Corning (ou equivalente)352070 (ou equivalente)Utilizado para o isolamento, lavagem e etapas de centrifugação de PBMCs
Tubos de coleta de sangue revestidos com EDTA (vacutainers)BD Biosciences (ou equivalente)367863 (ou equivalente)Utilizado para a coleta de amostras de sangue total de doadores
Ficoll-Paque PLUSCytiva (ou equivalente)17144003 (ou equivalente)Meio de gradiente de densidade para isolamento de PBMCs
Citômetro de fluxo (por exemplo, FACSCanto II)BD Biosciences (ou equivalente)BD FACSCanto II Utilizado para análise fenotípica de macrófagos
Contas de compensação (citometria de fluxo)Biolegend (ou equivalente)424602Utilizado para controles de compensação de uma única cor
anticorpo FITC anti-CD11b humano (citometria de fluxo)BioLegend (ou equivalente)101205 (ou equivalente)Marcador utilizado para identificar macrófagos
anticorpo PE anti-humano CD80 (citometria de fluxo)BioLegend (ou equivalente)375410 (ou equivalente)Marcador associado ao fenótipo de macrófago ativado
Linha celular de câncer de mama que expressa GFP (MDA-MB-468)ATCC (ou equivalente)HTB-132 (ou equivalente)Células-alvo utilizadas no ensaio de fagocitose; GFP permite a visualização
Meio ImmunoCult-SF para macrófagosSTEMCELL Technologies (ou equivalente)10961 (ou equivalente)Meio livre de soro utilizado para a diferenciação de macrófagos
Dulbecco’Meio de Eagle Modificado (DMEM)Thermo Fisher Scientific (ou equivalente)12100046Utilizado para o cultivo e ressuspendimento de células cancerígenas
Anticorpo controle de isotipo (IgG)Bio X Cell (ou equivalente)BE0297 (ou equivalente)Controle negativo para o ensaio de fagocitose dependente de anticorpos
Lipopolissacarídeo (LPS)Sigma-Aldrich (ou equivalente)L2630 (ou equivalente)Estímulo utilizado para ativar macrófagos em combinação com IFN-γ
Interferon gama humano recombinante (IFN-γ)STEMCELL Technologies (ou equivalente)78020 (ou equivalente)Citoquina utilizada para ativação de macrófagos
Fator estimulador de colônias de macrófagos humano recombinante (M-CSF)STEMCELL Technologies (ou equivalente)78057 (ou equivalente)Fator de crescimento utilizado para a diferenciação de macrófagos
Pipetas de Pasteur ou pipetas serológicasJetbiofil (ou equivalente)GSP010010 (ou equivalente)Utilizado para manipulação de líquidos durante o isolamento de PBMCs e cultivo celular
PBS (Ca2+-/Mg2+-livreThermo Fisher Scientific (ou equivalente)BP399-500 (ou equivalente)Tampão utilizado para lavagem de células e etapas de diluição
Placas de Petri (100 mm, não–tratado para cultura de tecidosCorning (ou equivalente)430591Utilizado para diferenciação de macrófagos por seleção por aderência
Tampão de lise de eritrócitos (RBC)BioLegend (ou equivalente)420301 (ou equivalente)Utilizado para remover glóbulos vermelhos durante o isolamento de PBMCs
Corante Viobility 405/452 FixávelMiltenyi Biotec (ou equivalente)130-130-404 (ou equivalente)Utilizado para avaliar a viabilidade celular durante a análise de citometria de fluxo
DAPISigma-Aldrich (ou equivalente)D9542 (ou equivalente)Utilizado para exclusão de células mortas em citometria de fluxo

Referências

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