Um Protocolo de Separação Hemisférica para Observação Morfológica e Extração Combinada de RNA-Proteína em Regiões do Cérebro Murino

Resumo

Este protocolo divide ao meio cérebros de camundongos. Um hemisfério é utilizado para coloração morfológica, e o outro para extração de RNA e proteínas. A estratégia reduz o consumo de animais, segue os princípios dos 3Rs e minimiza a variação entre animais.

Resumo

Na pesquisa diária em neurociência, as colorações morfológicas e os ensaios moleculares de ácidos nucleicos/proteínas geralmente exigem animais experimentais separados, o que aumenta o uso de animais e é incoerente com o princípio de bem-estar animal das 3Rs. Este protocolo estabelece um fluxo de trabalho de alocação de tecidos para tecido cerebral murino que permite análises morfológicas e moleculares pareadas a partir de um único animal. Após perfusão transcardíaca com solução salina a 0,9%, o cérebro é dividido em dois hemisférios. Um hemisfério é fixado em paraformaldeído a 4% para imuno-histoquímica e imunofluorescência; cortes armazenados em solução de sacarose-etileno-glicol-polivinilpirrolidona (PVP) mantêm qualidade de coloração confiável por até sete anos. O hemisfério contralateral é criopreservado a -80 °C para extração combinada de RNA e proteína, com rendimentos suficientes para qPCR e Western Blot posteriores. Testado em fragmentos de 9–10 mg de córtex entorrinal, este método produz menores rendimentos de RNA e proteína do que a extração separada de RNA ou proteína individualmente, mas as biomoléculas recuperadas permanecem adequadas para detecção molecular. Este fluxo de trabalho reduz o consumo de animais e elimina as diferenças entre indivíduos nas análises morfológicas e moleculares pareadas. Ele fornece um método viável de preparação de tecidos para perfil multidimensional de sub-regiões discretas do cérebro murino.

Introdução

A pesquisa em neurociência expandiu-se dramaticamente nas últimas décadas, revelando mecanismos essenciais que regulam a fisiologia cerebral humana, o surgimento de doenças neurológicas e o desenvolvimento de terapias. Modelos animais continuam sendo indispensáveis para a investigação neurocientífica, fornecendo plataformas controláveis e reprodutíveis para explorar o desenvolvimento neural, a função fisiológica e os processos patológicos. A manipulação experimental e a observação histológica em sujeitos murinos permitem aos pesquisadores caracterizar a sinalização neuronal, a formação de circuitos neurais e as associações entre neural e comportamento. Paralelamente aos avanços técnicos, a ética em experimentação animal tornou-se uma preocupação central. Os princípios das 3Rs (Substituição, Redução e Refinamento) são hoje padrões globalmente aceitos para todos os estudos com animais^1,2, exigindo que os pesquisadores minimizem o uso de animais mantendo, ao mesmo tempo, resultados experimentais confiáveis.

Ferramentas inovadoras, como sistemas de eliminação gênica condicional, permitem manipulação genética precisa em sub-regiões discretas do cérebro de camundongos³. Esses avanços impulsionaram pesquisas intensivas em compartimentos cerebrais em microescala, como CA1, CA3 e DG do hipocampo, que regulam aprendizado, memória e humor⁴. Decodificar as funções de alto nível dessas pequenas regiões cerebrais exige medições coordenadas em nível morfológico, transcricional e proteico. Infelizmente, seu volume tecidual escasso cria grandes obstáculos técnicos para a detecção paralela com múltiplos índices.

A coloração morfológica, a quantificação de RNA e a imunodetecção proteica são três leituras centrais de rotina na neurociência. Os desenhos tradicionais de pesquisa exigem três coortes separadas de animais murídeos para realizar esses três tipos de testes. Essa prática aumenta drasticamente o número de animais utilizados e introduz uma variação biológica interanimal considerável, o que enfraquece a comparabilidade entre conjuntos de dados histológicos e moleculares. Um fluxo de trabalho unificado que obtenha sinais morfológicos e moleculares pareados a partir de um único animal resolveria amplamente essas duas limitações críticas e atenderia melhor ao princípio da Redução das 3Rs.

Aqui, relatamos um protocolo reprodutível de separação hemisférica para tecido cerebral murino. Após a perfusão sistêmica com solução salina, o cérebro inteiro é dividido em dois hemisférios: um hemisfério é fixado para exames morfológicos, e o hemisfério contralateral é criopreservado para extração simultânea de RNA e proteína. Tecidos fixados e armazenados em tampão protetor contendo sacarose-etilenoglicol-poli-vinilpirrolidona (PVP) mantêm sinais de coloração estáveis e de alta qualidade para imuno-histoquímica e imunofluorescência por até sete anos. Validamos este método utilizando pequenos fragmentos de 9–10 mg do córtex entorrinal, um tecido mais leve do que regiões comumente investigadas, como o hipocampo e o córtex pré-frontal. A detecção bem-sucedida desse pequeno fragmento tecidual indica que subregiões cerebrais menores, como o hipotálamo e a amígdala, também são compatíveis com este fluxo de trabalho. Embora o protocolo gere concentrações menores de RNA e proteína do que kits especializados de extração de finalidade única, as biomoléculas isoladas possuem qualidade adequada para suportar análises padrão de qPCR e Western blot. Este fluxo de trabalho reduz o consumo de animais e elimina as diferenças interindividuais entre análises morfológicas e moleculares pareadas. Ele fornece um método viável de preparação de tecidos para perfil multidimensional de subregiões discretas do cérebro murino.

Protocolo

Declaração de ética

Todos os experimentos com animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Universidade Médica de Dalian (Número de Aprovação AEE18026 para experimentos com ratos e Número AEE24261 para experimentos com camundongos), República Popular da China. Todos os protocolos experimentais foram implementados de acordo com as diretrizes éticas para animais de laboratório e cumpriram plenamente os princípios dos 3Rs (Redução, Substituição e Aperfeiçoamento) para experimentação animal. Ao longo de todo o processo experimental, foram adotadas medidas rigorosas para aliviar eficazmente o sofrimento e o estresse dos animais. Paralelamente, o número de animais experimentais foi limitado à quantidade mínima necessária para garantir a confiabilidade e a validade dos resultados da análise estatística. Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista completa dos reagentes, consumíveis e equipamentos utilizados neste protocolo.

1. Preparação do animal experimental e cirurgia de perfusão transcardial

1. Anestesia e preparação pré-operatória
   1. Utilize ratos Sprague-Dawley ou camundongos C57BL/6 adultos machos, de grau livre de patógenos específicos (SPF), para este protocolo. Mantenha os animais em um ambiente com temperatura controlada (22 ± 2 °C) e ciclo de luz/escuridão de 12 h. Forneça acesso ad libitum a alimento e água estéreis.
   2. Administre pentobarbital de sódio aos animais por injeção intraperitoneal na dose de 80 mg/kg para ratos ou 50 mg/kg para camundongos para induzir anestesia (veja Figura 1).
2. Procedimento de perfusão transcardial
   1. Fixe os animais anestesiados em posição supina sobre uma mesa cirúrgica.
   2. Abra a parede abdominal ao longo da linha média, desde o processo xifoide até a sínfise púbica, utilizando tesoura reta. Corte bilateralmente a parede torácica lateral para expor completamente o coração.
   3. Perfunda o animal com solução salina normal a 0,9% gelada, em fluxo constante: 100–150 mL durante 10–15 min para ratos e 20–30 mL durante 5–8 min para camundongos.
3. Coleta do cérebro e separação dos hemisférios
   1. Decapite os animais com tesoura cirúrgica grande após a conclusão da perfusão. Corte o couro cabeludo ao longo da linha média para expor o crânio.
   2. Utilize uma espátula estéril para levantar suavemente o cérebro da cavidade craniana. Transfira rapidamente o cérebro inteiro para uma placa de Petri estéril colocada sobre gelo.
   3. Utilize uma lâmina de barbear estéril, livre de RNase, para dividir simetricamente o cérebro nos hemisférios esquerdo e direito ao longo da sutura sagital.
   4. Transfira imediatamente o hemisfério esquerdo para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de solução de paraformaldeído a 4% gelada para fixação. Transfira o hemisfério direito para um tubo de criopreservação identificado e livre de RNase, congele rapidamente em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C até a extração de RNA e proteína.

2. Fixação, seccionamento e armazenamento de longo prazo de tecido cerebral

1. Fixação e desidratação
   1. Imersão completa do hemisfério esquerdo em solução de paraformaldeído a 4% e fixação do tecido a 4 °C por 24 h. Após a conclusão da fixação, transferir o hemisfério cerebral para um tubo cônico de 15 mL contendo solução de sacarose a 30% e desidratar o tecido a 4 °C.
   2. Substituir a solução de sacarose a 30% a cada 24 h até que o tecido cerebral afunde ao fundo do tubo.
2. Preparação de cortes criostáticos
   1. Remover o hemisfério cerebral desidratado da solução de sacarose e absorver o excesso de líquido com papel filtro estéril.
   2. Montar o hemisfério cerebral no estágio do criostato com meio de inclusão em temperatura ótima para corte (OCT).
   3. Seccionar cortes coronais seriados do cérebro com espessura de 30 µm utilizando um criostato. Coletar seções consecutivas em uma placa de 24 poços contendo PBS 0,01 M estéril.
3. Armazenamento prolongado de seções cerebrais
   1. Preparar com antecedência a solução de preservação crioprotetora para fatias cerebrais: adicionar 2 g de PVP400, 60 g de sacarose e 60 mL de etilenoglicol a 100 mL de PBS 0,01 M. Agitar a solução à temperatura ambiente até que todos os componentes estejam completamente dissolvidos e armazená-la a 4 °C até o uso.

3. Extração de RNA com TRIzol

1. Homogeneização tecidual e separação de fases
   1. Homogeneíze o tecido cortical entorrinal em 1 mL de reagente TRIzol utilizando um homogeneizador ultrafino e incube o homogeneizado no gelo por 15 min. Centrifugue a 8.000 × g durante 5 min a 4 °C.
   2. Adicione 200 µL de clorofórmio e vortex por 10 s. Centrifugue a 5.600 × g durante 15 min a 4 °C. Em seguida, transfira a fase aquosa superior para um tubo livre de RNase. Adicione 500 µL de isopropanol e incube a -20 °C durante a noite para precipitar o RNA. Centrifugue novamente.
2. Precipitação do RNA, lavagem e avaliação da qualidade
   1. Descarte o sobrenadante e lave o pellet de RNA com 1 mL de etanol a 75%. Centrifugue a 5.600 × g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante, seque o pellet ao ar por 10 min e dissolva o RNA em 20 µL de água tratada com DEPC por 10 min.
   2. Meça a concentração e a pureza do RNA (A₂₆₀/A₂₈₀) utilizando um espectrofotômetro. Armazene o RNA a -80 °C até a análise subsequente.

4. Extração de proteína total com o kit Minute

1. Lise e homogeneização de tecido
   1. Resfrie previamente a coluna de centrifugação e o tubo de coleta em gelo. Homogeneíze o tecido em 100 µL de tampão de lise celular utilizando um homogeneizador ultrafino. Enxágue o homogeneizador com mais 100 µL de tampão de lise celular e combine os lisados.
2. Recuperação e quantificação de proteína
   1. Transfira o homogenato para a coluna de centrifugação e incube por 2 min a temperatura ambiente.
   2. Centrifugue a 11.000–14.300 × g por 2 min.
   3. Coloque o tubo de coleta imediatamente em gelo após a centrifugação e descarte a coluna de centrifugação. Determine a concentração de proteína utilizando um ensaio BCA.

5. Extração simultânea de RNA e proteína do córtex entorrinal (9–10 mg)

1. Preparação antes do experimento e preparo dos reagentes
   1. Utilize o kit de DNA/RNA/proteína para todas as etapas de extração. Utilize apenas consumíveis certificados como livres de RNase e DNase (veja Figura 2).
   2. Prepare o tampão de lise imediatamente antes do uso: adicione o coquetel de inibidores de protease ao tampão de lise fornecido com o kit em uma diluição de 1:100.
2. Lise tecidual e separação de fases
   1. Retire o hemisfério cerebral direito congelado do armazenamento a -80 °C e coloque-o sobre gelo. Utilize um punch estéril livre de RNase para coletar 9–10 mg de tecido da região cerebral-alvo.
   2. Homogeneíze completamente o tecido em gelo utilizando um homogeneizador tecidual elétrico até que não restem fragmentos visíveis de tecido. Incube o homogeneizado em gelo por 10 min para garantir lise completa.
   3. Adicione 200 µL do reagente de separação fornecido com o kit ao homogeneizado. Agite vigorosamente o tubo em vórtex por 30 s e incube-o em temperatura ambiente por 3 min. Centrifugue o tubo a 8.000 × g por 15 min a 4 °C para obter separação completa de fases.
3. Purificação e eluição do RNA
   1. Colete cuidadosamente a fase aquosa superior utilizando uma ponteira livre de RNase. Transfira a fase aquosa coletada para um novo tubo de 1,5 mL livre de RNase. Adicione um volume igual de etanol a 100% à fase aquosa coletada e misture.
   2. Transfira 700 µL da mistura para a coluna de purificação de RNA fornecida com o kit. Centrifugue a coluna a 5.600 × g por 1 min em temperatura ambiente.
   3. Adicione 500 µL do tampão de lavagem de RNA 1 fornecido com o kit à coluna. Centrifugue a coluna a 5.600 × g por 1 min em temperatura ambiente.
   4. E adicione 500 µL do tampão de lavagem de RNA 2 fornecido com o kit à coluna, centrifugue novamente. Centrifugue a coluna vazia a 8.000 × g por 2 min em temperatura ambiente para remover completamente o etanol residual da membrana da coluna.
   5. Transfira a coluna para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mL livre de RNase. Adicione 30–50 µL de água livre de RNase (pré-aquecida a 60 °C) diretamente ao centro da membrana da coluna. Incube a coluna em temperatura ambiente por 2 min. Centrifugue a coluna a 8.000 × g por 1 min em temperatura ambiente para eluir o RNA.
4. Precipitação e dissolução da proteína
   1. Adicione 750 µL de isopropanol à fase orgânica remanescente e à interface no tubo original após a remoção da fase aquosa para extração de RNA. Incube a mistura a -20 °C por 30 min para precipitar as proteínas.
   2. Centrifugue o tubo a 8.000 × g por 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e mantenha o pellet de proteína intacto no fundo do tubo.
   3. Adicione 1 mL de etanol a 95% ao pellet de proteína. Agite brevemente o tubo em vórtex para lavar o pellet. Centrifugue o tubo a 8.000 × g por 5 min a 4 °C e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa de lavagem mais duas vezes.
   4. Seque o pellet de proteína ao ar em temperatura ambiente por 5–10 min até que o pellet fique translúcido e não haja etanol residual visível.
   5. Adicione 50–100 µL de solução de SDS a 5–10% ao pellet seco. Agite vigorosamente o tubo em vórtex por 1 min e incube-o em gelo por 10 min para dissolver completamente a proteína. Centrifugue o tubo a 8.000 × g por 5 min a 4 °C. Colete o sobrenadante como o extrato proteico final.

6. Coloração por imunohistoquímica (IHC)

1. Pré-tratamento da seção e inativação da enzima endógena
   1. Retire as seções cerebrais do armazenamento em crioprotetor a -20 °C. Utilize uma agulha de vidro para transferir as seções para uma placa de 24 poços contendo PBS 0,01 M (pH 7,4).
   2. Lave as seções três vezes com PBS 0,01 M, 5 min por lavagem, à temperatura ambiente em agitador.
   3. Incube as seções com bloqueador de peroxidase contendo 3% de peróxido de hidrogênio à temperatura ambiente por 10 min para inativar a atividade de peroxidase endógena. Repita os passos de lavagem após o bloqueio.
2. Permeabilização e bloqueio não específico
   1. Incube as seções em Triton X-100 0,5% por 30 min à temperatura ambiente em agitador para permeabilização da membrana celular. Repita os passos de lavagem.
   2. Incube as seções em albumina sérica bovina a 4% por 30 min à temperatura ambiente, seguido por incubação com um inibidor de coloração não específica por mais 30 min à temperatura ambiente.
3. Incubação com anticorpos primário e secundário
   1. Dilua os anticorpos primários em solução de BSA 1% nas seguintes diluições otimizadas: doublecortin (DCX, 1:4000), antígeno nuclear neuronal (NeuN, 1:3000), molécula adaptadora ligadora de cálcio ionizado 1 (Iba-1, 1:2000) e proteína ácida fibrilar glial (GFAP, 1:2000).
   2. Adicione 200 µL da solução de anticorpo primário diluído a cada poço, garantindo imersão completa das seções.
   3. Adicione 200 µL de anticorpo secundário marcado com biotina a cada poço. Incube as seções à temperatura ambiente por 30 min.
   4. Lave as seções três vezes com PBS 0,01 M, 5 min por lavagem. Adicione 300 µL de conjugado de estreptavidina-peroxidase a cada poço. Incube as seções à temperatura ambiente por 30 min. Repita os passos de lavagem após a incubação.
4. Desenvolvimento cromogênico com 3,3′-diaminobenzidina (DAB) e aplicação de lamínula
   1. Adicione 200 µL da solução de trabalho de DAB a cada poço. Monitore a reação cromogênica em microscópio óptico.
   2. Monte as seções em lâminas de vidro revestidas com gelatina utilizando uma agulha de vidro. Deixe as lâminas secarem completamente à temperatura ambiente.
   3. Desidrate as lâminas por meio de uma série crescente de etanol (50%, 70%, 90%, 95%, 100%, 100% de etanol, 5 min cada), seguida por clareamento em xilol duas vezes, 5 min cada.

7. Coloração por imunofluorescência (IF)

1. Pré-tratamento e permeabilização das seções
   1. Retire as seções cerebrais do armazenamento em crioprotetor a -20 °C. Transfira as seções para uma placa de 24 poços contendo PBS 0,01 M (pH 7,4).
   2. Lave as seções três vezes com PBS 0,01 M, 5 min por lavagem, à temperatura ambiente em agitador.
   3. Incube as seções em Triton X-100 0,5% por 30 min à temperatura ambiente em agitador.
   4. Lave as seções três vezes com PBS 0,01 M, 10 min por lavagem, após a permeabilização.
2. Bloqueio e incubação com anticorpo primário
   1. Incube as seções em uma solução bloqueadora contendo BSA 4% e um inibidor de marcação não específica por 1 h à temperatura ambiente em câmara umidificada.
   2. Aspire a solução bloqueadora. Dilua os anticorpos primários em solução de BSA 1% nas concentrações otimizadas e adicione 300 µL da solução diluída de anticorpo primário a cada poço. Incube as seções durante a noite a 4 °C em câmara umidificada e à prova de luz.
3. Incubação com anticorpo secundário
   1. No dia seguinte, reaqueça as seções à temperatura ambiente por 1 h no escuro. Recupere a solução de anticorpo primário e lave as seções três vezes com PBS 0,01 M, 10 min por lavagem, em agitador no escuro.
   2. Dilua os anticorpos secundários conjugados a fluoróforos em solução de BSA 1% na diluição recomendada pelo fabricante. Adicione 300 µL da solução de anticorpo secundário a cada poço. Incube as seções à temperatura ambiente por 1–2 h no escuro.
   3. Lave as seções cinco vezes com PBS 0,01 M, 5 min por lavagem, no escuro.

8. Análise de PCR quantitativa em tempo real (qPCR)

1. Remoção de gDNA e transcrição reversa de RNA
   1. Realize a transcrição reversa para sintetizar cDNA utilizando um kit de transcrição reversa, com 1 µg de RNA total por sistema de reação de 20 µL. Utilize o programa térmico recomendado pelo fabricante: 25 °C por 5 min, 50 °C por 15 min, 85 °C por 5 min, mantido a 4 °C.
   2. Dilua o cDNA sintetizado na proporção de 1:5 com água livre de RNase. Armazene o cDNA a -20 °C até a amplificação por qPCR.
2. Preparação do sistema de qPCR e amplificação
   1. Prepare o sistema de reação de qPCR no gelo, em uma capela PCR dedicada e livre de RNase. O sistema de reação de 20 µL contém: 10 µL de Master Mix para qPCR, 0,4 µL do iniciador direto (10 µM), 0,4 µL do iniciador reverso (10 µM), 2 µL do molde de cDNA diluído, 7,2 µL de água livre de RNase.
   2. Realize a amplificação por qPCR utilizando o seguinte programa: desnaturação inicial a 95 °C por 30 s; 40 ciclos de 95 °C por 10 s e 60 °C por 30 s; seguido de análise de curva de dissociação de 60 °C a 95 °C, com incrementos de 0,5 °C a cada 5 s.

9. Western blot

1. Quantificação de proteína e preparação da amostra
   1. Dilua os extratos proteicos até concentrações iguais utilizando solução de SDS a 5–10%, com base nos resultados do ensaio BCA.
2. Eletroforese em SDS-PAGE e transferência de proteínas
   1. Prepare um gel separador de 10% de SDS-PAGE e um gel de empilhamento de 5% de acordo com protocolos padrão de biologia molecular.
   2. Carregue 20 µg de proteína total por poço no gel. Em experimentos de carregamento em gradiente, carregue 15 µg, 30 µg e 45 µg de proteína por poço.
   3. Realize a eletroforese a 80 V durante 30 min até que o marcador proteico entre no gel separador, então aumente a voltagem para 120 V por 60–90 min até que o corante azul de bromofenol alcance a base do gel.
   4. Monte o "sanduíche" de transferência na seguinte ordem (do cátodo para o ânodo): esponja, papel filtro, gel, membrana de PVDF, papel filtro e esponja. Certifique-se de que não haja bolhas de ar entre o gel e a membrana.
   5. Realize a transferência úmida a 300 mA de corrente constante por 90 min em banho de gelo.
3. Bloqueio da membrana e incubação com anticorpos
   1. Lave brevemente a membrana de PVDF com tampão TBST após a conclusão da transferência. Incube a membrana em BSA a 5% por 2 h à temperatura ambiente em agitador para bloquear sítios de ligação não específicos.
   2. Dilua os anticorpos primários na solução de BSA a 5% em concentrações otimizadas. Incube a membrana com a solução de anticorpo primário durante a noite a 4 °C em agitador.
   3. Lave a membrana três vezes com tampão TBST, 10 min por lavagem, em agitador no dia seguinte.
   4. Dilua o anticorpo secundário conjugado à peroxidase do rabo-de-cavalo (HRP) na solução de leite desnatado a 5% na diluição recomendada pelo fabricante. Incube a membrana com a solução de anticorpo secundário por 2 h à temperatura ambiente em agitador.
   5. Lave a membrana três vezes com tampão TBST, 10 min por lavagem, após a incubação com o anticorpo secundário. Incube a membrana com a solução do substrato ECL por 1–2 min no escuro.

Resultados

Avaliação da concentração de RNA, eletroforese em gel de agarose e qPCR

Como mostrado, RNA total e proteína foram coextraídos a partir de fragmentos de córtex entorrinal (9–10 mg) com o kit de DNA/RNA/proteína. Amostras paralelas processadas com TRIzol (RNA) ou com o kit de extração de proteína serviram como controles. O protocolo forneceu 235 ± 12 ng µL⁻¹ de RNA, 36 % menos que o TRIzol (p < 0,05) (Figura 3A). Apesar disso, géis de agarose revelaram bandas nítidas de rRNA 28S e 18S e sinais de 5S, indicando RNA intacto (Figura 3B). A qPCR para CD86, IL-1β, TNF-α e IL-6 produziu curvas de dissociação únicas e simétricas (Figura 3C), e valores de Ct mais baixos foram observados no grupo (Figura 3D); no entanto, estudos adicionais, incluindo análises de integridade do RNA, são necessários para determinar se essas diferenças refletem melhor qualidade do RNA ou maior eficiência de extração. Embora o rendimento de RNA tenha sido menor do que o obtido com a extração por TRIzol, bandas distintas de rRNA 28S e 18S e curvas específicas de amplificação em qPCR indicaram que o RNA extraído possuía qualidade suficiente para análises downstream de qPCR.

Avaliação da concentração proteica, eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e análise por Western blot

Conforme os dados de RNA, o protocolo de extração dupla gerou concentrações totais de proteína mais baixas do que o kit de proteína (p < 0,05). No entanto, os blots ocidentais revelaram bandas imunorreativas significativamente mais intensas para todos os alvos analisados (Figura 4A). Em consonância com os resultados de quantificação de RNA, o protocolo de coextração de RNA–proteína recupera menos proteína total do que o kit de proteína dedicado e de uso exclusivo, o que pode ser observado por meio da coloração de proteínas totais com azul de Coomassie (Figura 4B–C). A proteína de controle β-Tubulina apresentou bandas claras e estáveis em ambos os métodos de extração, com intensidade de sinal comparável. A proteína ULK, de baixa abundância, também foi detectada com sucesso nas amostras coextraídas. Notavelmente, os sinais das bandas de PSD-95, p-ERK e p-NFκB p65 foram significativamente mais fortes no grupo de coextração em comparação com o kit convencional de extração única de proteína. A carga serial de proteína, de 15 µg a 45 µg, gerou gradientes de bandas dependentes da dose para todos os alvos detectados em ambos os grupos. Em conjunto, embora o rendimento total de proteína do fluxo de trabalho de extração dupla seja menor, sua qualidade proteica é suficiente para análises padrão de blot ocidental, e o desempenho geral de detecção não é inferior ao dos kits convencionais de extração única de proteína.

Imunohistoquímica e imunofluorescência

A imunohistoquímica em seções cerebrais armazenadas por 0,5–7 anos revelou marcação robusta de neurônios recém-nascidos DCX⁺, células secretoras AVP⁺ e neurônios MAP2/NeuN⁺ com morfologia e fibras intactas (Figura 5A). A imunofluorescência de seções com 5–7 anos mostrou astrócitos GFAP⁺, micróglias Iba-1⁺ e neurônios ativados FosB⁺ bem definidos (Figura 5B). Seções representativas armazenadas por 0,5–sete anos mantiveram sinais imunohistoquímicos e de imunofluorescência detectáveis nas condições testadas. Assim, a solução de preservação mantém a integridade tecidual e a antigenicidade, permitindo um armazenamento de longo prazo confiável.

Figura 1: Fluxo de trabalho integrado de separação por hemisférios para detecção morfológica e molecular do cérebro. Este esquema ilustra todo o processo experimental, incluindo a perfusão transcardial com solução salina em roedores, bissecção mediana do cérebro inteiro isolado, fixação e preparação de cortes criostáticos do hemisfério esquerdo para coloração por IHC/IF, e criopreservação do hemisfério contralateral para extração simultânea subsequente de RNA e proteína, análise de qPCR e Western blot. Todas as ilustrações de camundongos foram originalmente geradas pelo Jimeng AI. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Fluxo de trabalho para extração simultânea de RNA e proteína a partir de tecido cerebral congelado de roedores. O diagrama exibe etapas sequenciais que incluem a perfuração do tecido-alvo a partir de hemisférios congelados, lise tecidual e separação em três fases, purificação e eluição de RNA para qPCR, bem como precipitação, lavagem e solubilização de proteínas para preparar amostras para detecção por Western blot. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 3: Avaliação do rendimento de RNA, integridade do RNA e compatibilidade com qPCR utilizando amostras microescalares de córtex entorrinal de rato. (A) Concentrações de RNA quantificadas obtidas pelo kit de coextração versus método TRIzol (média ± erro padrão da média). (B) Eletroforese em gel de agarose mostrando bandas intactas de rRNA 28S e 18S de ambos os grupos de extração. (C) Curvas de dissociação únicas confirmam a amplificação específica de genes inflamatórios-alvo e de GAPDH como gene de referência. (D) Valores de Ct dos genes inflamatórios detectados com entrada idêntica de RNA entre os dois métodos de extração. *p < 0,05, **p < 0,01 em comparação com o grupo TRIzol. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 4: Avaliação por Western blot de proteínas recuperadas pelo protocolo de co-extração de RNA/proteína. (A) Carregamento gradiente de proteína (15/30/45 µg) mostrando sinais de banda dependentes da dose para proteínas sinápticas e de sinalização. (B) Detecção da proteína de alto peso molecular ULK1 com coloração total de proteínas CBB como referência de carregamento. (C) Comparação por Western blot com carregamento igual de proteínas-alvo entre dois fluxos de extração. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 5: Coloração imuno-histoquímica e imunofluorescente de seções cerebrais livres conservadas por 0,5–7 anos. (A) Microrgrafias de coloração imuno-histoquímica em campo claro obtidas com aumento de 200× e 400×. As colorações para DCX e AVP foram realizadas em amostras de tecido de camundongo, enquanto as colorações para MAP2 e NeuN foram realizadas em amostras de tecido de rato. (B) Imagens representativas de imunofluorescência obtidas de amostras de tecido de rato. GFAP marca astrócitos, IBA-1 marca micróglias e FOSB indica atividade neuronal. Todos os experimentos de coloração por imunofluorescência mostrados neste painel foram conduzidos usando amostras de rato para avaliar a expressão de marcadores neuronais e a localização celular, microrgrafias com aumento de 200×.  Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Discussão

Em pesquisas com camundongos, análises morfológicas e ensaios de ácidos nucleicos/proteínas frequentemente exigem amostras animais separadas devido aos procedimentos distintos de preparação. Isso aumenta o uso de animais e introduz variação biológica entre animais, o que pode reduzir a comparabilidade entre conjuntos de dados histológicos e moleculares. Para superar essas limitações, desenvolvemos um fluxo de trabalho que permite obter dados histológicos e moleculares a partir do mesmo animal.

O design central deste fluxo de trabalho é a alocação hemisférica do tecido cerebral após perfusão transcardíaca com solução salina a 0,9%^5,6. Um hemisfério é fixado em paraformaldeído a 4% para imunohistoquímica e imunofluorescência, enquanto o hemisfério contralateral é armazenado a −80 °C para posterior coextração de RNA e proteína, qPCR e Western blot. No entanto, as leituras selecionadas podem não ser totalmente comparáveis entre os dois hemisférios cerebrais. A lateralização estrutural e funcional já foi documentada em cérebros de roedores, e tais diferenças hemisféricas podem introduzir variabilidade quando as análises são realizadas em lados opostos^7,8. Portanto, os pesquisadores devem selecionar consistentemente tecido do mesmo hemisfério cerebral, de acordo com seus objetivos de pesquisa.

Uma vantagem proeminente deste método é a preservação de longo prazo de seções cerebrais fixadas e flutuantes. Após desidratação com sacarose a 30%, seções coronais de 30 µm são armazenadas em uma solução de preservação contendo sacarose, etilenoglicol e PVP. Estudos anteriores demonstraram que soluções crioprotetoras de sacarose–etilenoglicol–PVP ajudam a preservar a morfologia tecidual e a antigenicidade durante o armazenamento de longo prazo^9,10. No entanto, poucos estudos avaliaram durações de armazenamento que se estendem por vários anos. Os dados de nosso laboratório ampliam essas descobertas: seções representativas armazenadas por até sete anos mantiveram sinais imunohistoquímicos e de imunofluorescência detectáveis nas condições testadas. Essas observações apoiam a viabilidade do armazenamento de seções cerebrais flutuantes por vários anos para análises retrospectivas e experimentos de acompanhamento.

É notável que este fluxo de trabalho ofereça outra vantagem fundamental por meio da coextração dupla de RNA e proteína a partir de um único hemisfério cerebral congelado. Embora este protocolo de coextração forneça quantidades ligeiramente menores de RNA e proteína do que os métodos convencionais de extração para um único alvo, os biomateriais obtidos ainda são suficientes para detecção robusta por qPCR e Western blot. Criticamente, a coextração permite que a abundância de transcritos e proteínas seja quantificada a partir de amostras teciduais idênticas, eliminando a variação biológica decorrente do processamento separado de espécimes e permitindo um perfil molecular integrado altamente consistente^11,12. Além disso, esta abordagem requer apenas uma pequena massa tecidual de aproximadamente 9–10 mg, tornando-a particularmente adequada para análises de subpopulações cerebrais discretas e específicas de região, com disponibilidade limitada de amostras.

Apesar dessas vantagens significativas, este método também apresenta certas limitações que merecem reconhecimento. Primeiro, os rendimentos relativamente baixos de RNA e proteína podem restringir sua aplicabilidade em experimentos que exigem grandes quantidades de ácidos nucleicos ou proteínas, como purificação em larga escala de proteínas ou sequenciamento profundo de RNA. Segundo, embora o armazenamento de longo prazo de seções seja eficaz por até sete anos, a degradação gradual de certos antígenos lábeis ou ácidos nucleicos ainda pode ocorrer ao longo de períodos prolongados, o que poderia comprometer a intensidade da coloração ou a sensibilidade da detecção molecular. Terceiro, o método está atualmente otimizado para tecido cerebral murino e pode exigir modificações para aplicação em outros tecidos ou modelos animais alternativos, já que a composição tecidual e as características estruturais variam entre espécies e órgãos. Por fim, o SDS a 5–10% pode interferir com espectrometria de massas, ensaios de atividade enzimática e estudos de interação entre proteínas^13,14, bem como outras aplicações sensíveis ao SDS. Pode ser necessário, portanto, procedimentos adicionais de remoção do detergente ou troca de tampão.

Em conclusão, este fluxo de trabalho de alocação hemisférica permite análises morfológicas e moleculares pareadas a partir do mesmo animal, reduzindo o uso de animais e a variação entre animais. Este fluxo de trabalho seria útil em estudos que exijam análises histológicas e moleculares pareadas, especialmente quando a disponibilidade de tecido for limitada. A capacidade de armazenamento prolongado de seções também pode facilitar análises retrospectivas e o arquivamento padronizado de amostras, enquanto o uso de pequenas amostras de regiões cerebrais favorece investigações específicas de região. Suas principais limitações são os menores rendimentos de RNA e proteína, a assimetria hemisférica potencial, a restrição ao tecido cerebral murino e a compatibilidade limitada com aplicações sensíveis ao SDS. Estudos futuros devem otimizar a recuperação de biomoléculas, validar o fluxo de trabalho em outros tecidos e espécies e avaliar a estabilidade prolongada de outros alvos moleculares.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos microcentrífugos de 1,5 mL livres de RNase	Axygen	MCT-150-C-S	Coleta de fragmentos de tecido e frações para extração de RNA/proteína.
Tubos cónicos de centrífuga de 15 mL	Biofil	CFT010150	Fixação, desidratação com sacarose e armazenamento de soluções.
Placas de cultura celular de 24 poços	NEST	702001	Coleta, coloração e armazenamento a longo prazo de seções cerebrais em flutuação livre.
Solução de sacarose a 30%	Preparado no laboratório	N/A	Crioproteção de hemisférios cerebrais fixados antes da criosseção.
Solução de paraformaldeído a 4%	Biosharp	BL539A	Fixação por imersão do hemisfério cerebral designado para morfologia.
Tampão de carregamento de proteína 5×	Beyotime Biotechnology	DL101	Preparação de amostras proteicas para SDS-PAGE.
Agarose	Solarbio	Cat: A8201	Avaliação da integridade do RNA por eletroforese em gel de agarose.
Anticorpo anti-doublecortina	Abcam	ab18723	Anticorpo primário para imuno-histoquímica de doublecortina.
Anticorpo anti-ERK	Beyotime	AB2014	Anticorpo primário para Western blot de ERK total.
Anticorpo anti-GFAP	Abcam	ab10062	Anticorpo primário para imunofluorescência da proteína ácida fibrilar glial.
Anticorpo anti-Iba1	Wako	NCNP24	Anticorpo primário para imunofluorescência da molécula adaptadora ligadora de cálcio ionizado 1.
Anticorpo anti-NeuN	Millipore	A60	Anticorpo primário para coloração do antígeno nuclear neuronal.
Anticorpo anti-NF-κB p65	HUABIO	ET1603-12	Anticorpo primário para Western blot de NF-κB p65.
Anticorpo anti-ERK fosforilado	Beyotime	ET1610-13	Anticorpo primário para Western blot de ERK fosforilado.
Anticorpo anti-PSD95	HUABIO	ET1602-20	Anticorpo primário para Western blot de PSD95.
Anticorpo anti-ULK1	HUABIO	ET1704-63	Anticorpo primário para Western blot de ULK1.
Anticorpo anti-β-tubulina	ABclonal	AC021	Anticorpo primário de controle de carregamento para Western blot.
Meio de montagem antifade para fluorescência	Beyotime	P0126-5	Meio de montagem para seções coradas por imunofluorescência.
Kit de detecção de peroxidase biotina-estreptavidina	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Sistema de detecção secundário para imuno-histoquímica DAB.
Albumina sérica bovina	Qiansheng Biotech Co., Ltd.	QO3000	Tampão de bloqueio para imunomarcação e Western blot.
Camundongos C57BL/6	Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	Camundongos C57BL/6 de 4 semanas de idade	Animais experimentais para coleta de tecido cerebral de camundongo, se incluídos.
Sistema de imagem por quimioluminescência	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Detecção de sinais quimioluminescentes em Western blot.
Microscópio confocal de varredura a laser	Leica Microsystems CMS GmbH	SN: 591974	Aquisição de imagens de seções por imunofluorescência.
Solução de preservação crioprotetora	Preparado no laboratório	N/A	Armazenamento a longo prazo de seções cerebrais em flutuação livre a −20 °C.
Criostato	Leica	CM1950	Preparação de seções coronais cerebrais de 30 μm.
Kit de substrato cromogênico DAB	Sigma	SLBP7387V	Desenvolvimento cromogênico para imuno-histoquímica.
Solução de coloração nuclear com DAPI	Coolaber	SL7100	Contra-coloração nuclear para imunofluorescência.
Microscópio óptico digital	Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd.	Modelo NE910+FL-900	Monitoramento do desenvolvimento DAB e aquisição de imagens de seções coradas em campo claro.
DNase I	Vazyme	R223-01	Remoção de DNA genômico residual antes da transcrição reversa.
Anticorpo secundário de jumento anti-IgG de coelho, conjugado com 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	Anticorpo secundário fluorescente para imunofluorescência.
Anticorpo secundário de jumento anti-IgG de coelho, conjugado com 594	Abcam	ab150076	Anticorpo secundário fluorescente para imunofluorescência.
Kit E.Z.N.A. DNA/RNA/Proteína	Omega Bio-Tek	D3892-01
Fonte de alimentação para eletroforese	Bio-Rad	1645050	Fonte de alimentação para eletroforese em gel de agarose e SDS-PAGE.
Etileno glicol	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10009828	Componente da solução de preservação crioprotetora.
Sistema de imagem de géis	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Obtenção de imagens de géis de agarose para avaliação da qualidade do RNA.
Lâminas de vidro revestidas com gelatina	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.,LTD	REF: 10127105P P/N: 80312-2101	Montagem de seções cerebrais em flutuação livre coradas com DAB.
Software de análise de imagens	National Institutes of Health	ImageJ/Fiji	Análise densitométrica de bandas de Western blot e processamento de imagens.
Isopropanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	80109218	Precipitação proteica da fração orgânica/interfase.
Microcentrífuga refrigerada	Yancheng Kaite Laboratory Instrument Co., Ltd.	TGL16M	Centrifugação durante extração de RNA/proteína e etapas de lavagem.
Kit Minute de Extração de Proteína	Invent	MS-026
Meio de montagem com bálsamo neutro	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, China	Catalog No. S30509, CAS 96949-21-2	Aplicação de lamínulas em seções coradas com DAB e desidratadas.
Meio de inclusão OCT	Sakura	4583	Meio de inclusão para criosseção de hemisférios cerebrais fixados.
Placas ou tubos ópticos para qPCR	Axygen	PCR-0208-C	Recipientes para amplificação por qPCR.
Parafilm	amcor	PM996	Hermetização de placas de múltiplos poços para armazenamento prolongado de seções.
Pentobarbital sódico	Hualan Bio	57-33-0	Agente anestésico antes da perfusão transcardíaca.
Placas de Petri	Biosharp	BS-90-D	Manuseio do cérebro em gelo e separação de hemisférios.
Reagente de extração de RNA com fenol/guanidínio	Sparklade	AC0101-B	Reagente comparador para experimentos de controle de extração de RNA.
Cocktail de inibidores de fosfatase	APExBIO	K1015-100	Preservação da fosforilação durante a extração proteica.
Solução salina tamponada com fosfato	Biosharp	BL601A	Tampão de lavagem, solvente de solução de sacarose e solvente crioprotetor.
Membrana de fluoreto de polivinilideno	Millipore	IPVH08100	Membrana para transferência em Western blot.
Polivinilpirrolidona K40	Sigma	9003-39-8	Componente da solução de preservação crioprotetora.
Cocktail de inibidores de protease	Beyotime	P1045	Prevenção da degradação proteica durante a lise tecidual.
Kit de extração de proteína	Invent	MS-026	Kit comparador para experimentos de controle de extração total de proteína.
Sistema de PCR em tempo real	Amolarray	MA6000	Amplificação por PCR quantitativa e análise de curva de fusão.
Dodecilsulfato de sódio	BioFroxx	3250GR500	Dissolução do pellet proteico e preparação de amostras para SDS-PAGE.
Lâminas de barbear estéreis	Biosharp	BS-RB-11	Separar hemisférios e cortar tecido em gelo.
Conjugado estreptavidina-peroxidase	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Reagente de amplificação/detecção de sinal para imuno-histoquímica DAB.
Sacarose	Hushi	57-50-1	Solução crioprotetora e solução de preservação crioprotetora.
Master mix SYBR para qPCR	Vazyme	Q711-02	Amplificação por PCR quantitativa.
Aparelho de transferência	Bio-Rad	1703930	Transferência úmida de proteínas do gel de SDS-PAGE para membrana.
Solução salina tamponada com Tris e Tween 20	Preparado no laboratório	N/A	Tampão de lavagem da membrana em Western blot.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Permeabilização de seções cerebrais para imunomarcação.
Trizol	Sparklade	AC0101-B
Kit de Detecção Imuno-histoquímica UltraSensível SP (para anticorpos primários de camundongo/coelho)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Anticorpo secundário/reagente de detecção para imuno-histoquímica DAB.
Rato Wistar	Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	280-320 g, macho	Animais experimentais para coleta de tecido cerebral de rato, se incluídos.
Xilol	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	Clareamento de lâminas coradas com DAB antes da aplicação de lamínulas.
Meio de montagem com bálsamo neutro	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, China	Catalog No. S30509, CAS 96949-21-2	Aplicação de lamínulas em seções coradas com DAB e desidratadas.
Conjugado estreptavidina-peroxidase	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Reagente de amplificação/detecção de sinal para imuno-histoquímica DAB.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Permeabilização de seções cerebrais para imunomarcação.
Kit de Detecção Imuno-histoquímica UltraSensível SP (para anticorpos primários de camundongo/coelho)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Anticorpo secundário/reagente de detecção para imuno-histoquímica DAB.
Xilol	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	Clareamento de lâminas coradas com DAB antes da aplicação de lamínulas.