Artigo de método

Hibridização in situ de mRNA fluorescente multiplex em tecidos craniofaciais em amostras de camundongos com FFPE

DOI:

10.3791/71475

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8 de maio de 2026

 ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School, 3Shriners Hospital for Children, 4Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

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A hibridização convencional in situ tem dificuldade em visualizar o mRNA em tecidos craniofaciais devido à arquitetura complexa, alto fundo, especificidade limitada da sonda e sensibilidade. Este protocolo descreve um método multiplex de hibridização in situ de RNA fluorescente para a detecção sensível e específica de múltiplos alvos de mRNA em tecidos craniofaciais embrionários de camundongos FFPE, superando limitações anteriores.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O desenvolvimento craniofacial depende da atividade coordenada de populações celulares diversas e especializadas que interagem dentro de arquiteturas tecituais intrincadas para formar e manter a estrutura e a função normais do tecido. Compreender como essas células se comunicam entre si e com seu microambiente local é essencial para definir os mecanismos moleculares que regulam sua formação e homeostase. A interrupção desses processos pode levar a condições craniofaciais congênitas, incluindo agenesia dentária, fenda palatina e lábio leporino, seja isoladamente ou como parte de distúrbios sindrômicos. Embora técnicas quantitativas como a RT-PCR ofereçam alta sensibilidade e faixa dinâmica, elas exigem extração de RNA de tecidos homogeneizados, resultando em perda de contexto espacial e celular, uma limitação especialmente crítica para tecidos craniofaciais heterogêneos, onde a origem celular dos transcritos não pode ser resolvida. A hibridização in situ de RNA fluorescente multiplex supera essa limitação ao permitir a detecção sensível e específica de múltiplos transcritos de mRNA, mantendo a arquitetura tecidual. Essa abordagem avançada permite a localização precisa da expressão gênica no nível celular, fornecendo insights valiosos sobre a regulação espacial dos processos de desenvolvimento e dos mecanismos de doenças na biologia craniofacial.

Introdução

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A reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) é o padrão ouro para análise de expressão gênica devido à sua alta sensibilidade e ampla faixa dinâmica; no entanto, requer RNA extraído de tecidos homogeneizados, resultando na perda do contexto espaciale celular 1. Essa limitação é particularmente problemática para tecidos heterogêneos, como os tecidos craniofaciais durante o desenvolvimento embrionário, onde a fonte celular dos transcritos detectados não pode ser resolvida. A hibridização in situ de RNA (ISH), uma técnica pioneira em 1968 por Joseph Gall e Mary Lou Pardue, supera essa limitação ao permitir a localização da expressão de mRNA dentro da arquitetura tecidularintacta 2. No entanto, o RNA convencional ISH é tecnicamente exigente e altamente dependente da fixação ótima do tecido e preparação da amostra para preservar a integridade doRNA 3. Esses desafios se agravam em tecidos altamente calcificados, que exigem procedimentos de descalcificação que frequentemente envolvem produtos químicos agressivos ou processamento prolongado, levando à degradação do RNA. Consequentemente, o RNA ISH nos tecidos craniofaciais, que compreendem misturas complexas de tipos celulares, requer otimização cuidadosa e expertise técnica, é demorado e apresenta um risco substancial de coloração subótima. O desafio de visualizar a expressão do mRNA é ainda mais pronunciado nos tecidos dentários, que possuem uma estrutura e composição altamente complexas. Os dentes são compostos por componentes mineralizados como esmalte, dentina, cémulo e osso ao redor, além de tecidos mais macios, incluindo a polpa e o ligamento periodontal. Esses tecidos são povoados por uma variedade diversa de tipos celulares que desempenham papéis cruciais no desenvolvimentodentário 4. Essas características exigem padronização cuidadosa para garantir detecção confiável de sinais. Como resultado, o protocolo descrito é particularmente adequado para investigar a expressão gênica durante as etapas de desenvolvimento e pós-natais da formação dentária.

Existem técnicas de hibridização in situ (FISH) por fluorescência múltipla para detecção espacial de RNA, incluindo RNA amplificado baseado em sondaFISH 5,6,7,8,9, reação em cadeia de hibridaçãoFISH 6, RNA de molécula únicaFISH 10, amplificação de sinal por reação de trocaFISH 5 e plataformas FISH altamente multiplexadas como MERFISH11 eseqFISH 12.13. Entre estes, o RNA fluorescente multiplexISH 7,8,9 é amplamente utilizado devido à sua alta sensibilidade na detecção de uma única molécula de RNA resultante do design de sonda dupla Z, no qual duas sondas adjacentes precisam hibridizar com a sequência alvo para iniciar a amplificação do sinal. Esse design de reconhecimento duplo melhora muito a especificidade e reduz o sinal fora do alvo. O método suporta a detecção multiplex de 2 a 4 alvos (expansíveis até 12 ou mais alvos usando técnicas semelhantes), preserva a morfologia dos tecidos e é compatível com tecidos com parafina fixada em formalina (FFPE)7,8,9, frescos congelados e tecidos calcificados selecionados, tornando-o adequado para amostras complexas como as encontradas no desenvolvimento craniofacial e odontológico. O método é padronizado, reproduzível, apoiado por bibliotecas de sondagens bem estabelecidas e amplamente validado, garantindo resultados acessíveis e confiáveis em diversos laboratórios.

O ISH de RNA fluorescente multiplex utiliza múltiplas sondas direcionadas a regiões distintas do mesmo transcrito, combinadas com amplificação aprimorada do sinal, permitindo detecção altamente sensível e específica mesmo para mRNAs de baixa abundância ou parcialmentedegradados 14,15. Embora o RNA fluorescente multiplexado tenha sido aplicado com sucesso em amostras ósseasdescalcificadas 16, e seu uso em tecidos craniofaciais complexos já foirelatado anteriormente 7,8,9; no entanto, um protocolo detalhado passo a passo que descreva sua aplicação nesse contexto ainda não foi divulgado.

As estruturas craniofaciais compreendem arquiteturas teciduais intrincadas com diversos tipos celulares, incluindo osteoblastos, osteoclastos, osteócitos, ameloblastos, odontoblastos, fibroblastos, células-tronco, células imunológicas, vasculaturas e neurônios sensoriais, cujas interações espacialmente coordenadas são essenciais para a formação, função, regeneração e proteção imunológicados tecidos 4. Estudar expressões gênicas localizadas nesses tecidos é, portanto, fundamental, e o ISH de RNA fluorescente multiplex representa uma abordagem líder para tais análises.

Neste estudo, descrevemos como o RNA ISH fluorescente multiplexado baseado em sondas e tecnologia de RNAscópio poderia ser aplicado para estudar tecidos craniofaciais complexos (Figura 1). Além disso, estabelecemos um fluxo de trabalho otimizado de seccionamento FFPE que preserva a integridade do RNA e possibilita uma análise de expressão gênica de alta qualidade e espacialmente resolvida.

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Protocolo

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Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) dos Institutos Nacionais de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (IACUC), sob o Protocolo de Estudo Animal #24-031.

1. Acasalamento cronometrado e coleta de tecidos embrionários

  1. Organize acasalamentos programados.
    1. Combine um macho saudável e fértil Mus musculus no final da tarde. Na manhã seguinte, verifique a presença de um tampão vaginal. Designe o dia em que um tampão é observado como dia embrionário (E) 0,5.
  2. Eutanasiar a fêmea grávida.
    1. No estágio de desenvolvimento desejado, eutanasie a fêmea grávida por inalação de CO₂ seguida de luxação cervical, de acordo com as diretrizes institucionais de cuidado animal.
    2. Posicione o rato de costas sobre uma superfície absorvente estéril. Desinfete a área abdominal com etanol 70% ao longo do local da incisão pretendido.
  3. Expõe e isola os chifres uterinos.
    1. Faça uma incisão abdominal na linha média com uma tesoura cirúrgica estéreis e, em seguida, abra a parede peritoneal com tesouras microcirúrgicas para expor os chifres uterinos.
    2. Use pinças contundentes para exteriorizar suavemente a cadeia uterina. Libere o tecido uterino ao longo do miométrio e corte o oviduto e a ligação mediana do chifre uterino para isolar os embriões.
  4. Transfira embriões inteiros.
    1. Transfira imediatamente a cadeia uterina contendo embriões para uma placa de Petri de 10 cm contendo 1× PBS estéril e gelado (pH 7,4).
  5. Dissecar embriões individuais.
    1. Separe cuidadosamente cada embrião das membranas uterina, amniótica e coriônica ao redor.
    2. Transfira os embriões limpos para um recipiente fresco de 10 cm contendo PBS gelado e estéril.
  6. Dissecar cabeças embrionárias de camundongos.
    1. Usando uma lâmina cirúrgica estéril, disseque as cabeças e enxágue as cabeças dissecadas uma vez em PBS gelado antes de processar novamente.
      NOTA: Colete e disseque os camundongos neonatais no estágio de desenvolvimento desejado, de acordo com o protocolo animal.

2. Fixação e processamento do tecido

  1. Conserte o lenço.
    1. Imerga imediatamente o tecido dissecado em formalina tamponada neutra a 10% e fixe durante a noite em temperatura ambiente em um shaker.
      NOTA: A preservação adequada do RNA é crucial para o sucesso das análises de hibridização in situ. Numerosos estudos mostraram que a abordagem padrão — fixar amostras de tecido em formalina tampão neutra a 10% por durações que variam de 6 a 48 horas, dependendo do tamanho e idade específicos do tecido — produz resultados confiáveis para preservaçãode RNA 16,17,18,19. Para estágios embrionários mais antigos (E12.5 e abaixo), a penetração do fixador é rápida, e o tempo de fixação deve ser reduzido de acordo para evitar a superfixação. A partir do dia embrionário 17,5 (E17,5), assim como em amostras pós-natais, a penetração do fixador pode ser menos eficiente devido à presença de pele na cabeça, que atua como barreira física. Portanto, a pele deve ser removida de toda a cabeça para permitir uma penetração eficiente da solução de fixação. A descalcificação pode ser realizada em 0,5 M EDTA (pH 8,0) contendo 0,5% de formaldeído livre de metanol a 4 °C 7. A duração da descalcificação pode ser monitorada por meio de uma rápida microtomografia computorizada e pode ser ajustada dependendo do grau de mineralização e do tipo específico de tecido; para embriões E18,5, 24–48 h geralmente é suficiente.
  2. Enxágue e processe o tecido.
    1. Remova o fixador e enxágue as amostras em PBS. Transfira o tecido para 70% de etanol e armazene a 4 °C até o processamento posterior (1–4 semanas)20. Realize desidratação, limpeza e infiltração de parafina usando um processador de tecidos automatizado, conforme as instruções do fabricante.
      NOTA: O protocolo típico de processamento de tecidos é o seguinte: 70% de etanol por 30 minutos, seguido de 95% de etanol por 30 minutos (2 vezes) e 100% de etanol por 30 minutos (3 vezes) para desidratação; limpando no xileno por 1 h (3 vezes), e subsequentemente infiltração com cera de parafina a 60 °C por 1 h (3 vezes) antes de ser incorporado em blocos de tecido de parafina.
  3. Incruste o tecido.
    1. Mergulhe as cabeças em parafina e oriente as amostras no plano coronal ou sagital, dependendo dos requisitos experimentais.
    2. Transfira os blocos embutidos para uma placa fria de bloco de parafina para permitir que a cera endureça por aproximadamente 30 minutos, com o tempo ajustado conforme necessário conforme o tamanho do bloco.
  4. Guarde os blocos de FFPE.
    1. Deixe a parafina solidificar completamente. Tire os blocos dos moldes, coloque-os em recipientes herméticos ou sacos zip-lock rotulados e guarde a 4 °C até estarem prontos para separar.
      NOTA: Blocos de FFPE com RNA bem preservado podem ser armazenados por vários anos antes da secção sem comprometer a integridade do tecido.

3. Processamento de tecido FFPE para multiplex de RNA fluorescente ISH

  1. Prepare um espaço de trabalho livre de RNase.
    1. Desinfete todas as superfícies de trabalho e instrumentos com 70% de etanol. Trate superfícies, ferramentas e luvas com uma solução descontaminante de RNase para minimizar a degradação do RNA.
    2. Monte o microtomo e instale uma nova lâmina. Ajuste o ângulo de folga para 10°. Trate pinças e escovas com solução descontaminante de RNase antes do uso.
      NOTA: Sempre use uma lâmina nova para seccionar e obter fatias de tecido precisas. O ângulo da lâmina afeta significativamente a qualidade da secção, a integridade do tecido, a uniformidade da espessura e a preservação das características morfológicas.
  2. Prepare o banho-maria.
    1. Encha um banho-maria de flutuação com água ultrapura de grau laboratorial.
    2. Ajuste a temperatura entre 40 e 43 °C conforme necessário, dependendo do estágio embrionário e das características do tecido.
  3. Aparar e montar o bloco de FFPE.
    1. Elimine o excesso de parafina ao redor do tecido embutido. Resfrie o bloco de FFPE no gelo e o monte no estágio de microtomo frio.
  4. Corte para a região de interesse.
    1. Alinhe a face do bloco de parafina com a lâmina do microtomo e corte em passos de 12 μm até que a região de interesse (por exemplo, a adjacente ao molar ou ao dente incisivo) apareça nas seções coronais.
    2. Reposicione o bloco e a lâmina conforme necessário para seções coronal ou sagital simétricas e devidamente orientadas de toda a cabeça.
  5. Corte o lenço.
    1. Uma vez alcançada a região de interesse, corte seções de 5–7 μm. Flutue as seções no banho-maria para permitir um relaxamento suave e achatamento antes de transferi-las para os escorregadores.
  6. Monte e seque as seções.
    1. Monte as seções em slides de vidro carregados positivamente. Examine as lâminas sob um microscópio óptico para confirmar a orientação correta e a integridade dos tecidos.
    2. Seque as lâminas em um aquecedor de lâminas a 40 °C durante a noite antes de realizar o ensaio multiplex de RNA fluorescente ISH.

4. Dia 1: Desparafinização e reidratação

  1. Asse os slides.
    1. Asse os slides com seções de FFPE por 1 hora a 60 °C.
      NOTA: Se a lâmina não for usada imediatamente, armazene-a não assada em temperatura ambiente (RT) com dessecantes por 1 a 4 semanas. O armazenamento prolongado pode resultar na degradação do RNA.
  2. Equilibre os slides.
    1. Deixe o lâmina de tecido FFPE se equilibrar em temperatura ambiente (RT) por 10 minutos.
  3. Desparafinize e reidrate as seções.
    1. Imerga as lâminas em xileno ou substituto de xileno com agitação suave por 5 a 10 minutos em RT. Repita esta etapa uma vez para garantir a remoção completa da parafina.
      NOTA: O trabalho com xileno deve ser realizado em uma exaustão química. Se um substituto de xileno de baixa toxicidade for usado, ele pode ser usado fora da exaustão química.
    2. Transfira as lâminas para etanol 100% e incube por 2 minutos em RT. Repita uma vez para remover xileno residual. Reidrate as seções com etanol a 70% por 2 minutos.
    3. Enxágue as seções 3 vezes com PBS. Depois, adicione uma gota de PBS suficiente para cobrir completamente as seções e imediatamente prossiga para a próxima etapa.

5. ISH de RNA fluorescente multiplexado em seções de tecido FFPE

NOTA: Este estudo seguiu as instruções do fabricante para realizar o multiplex ISH de RNA fluorescente em seções de tecido FFPE usando a tecnologiaRNAscope 21.

  1. Dia 1: Pré-tratamento e hibridização com sonda
    1. Desenhe uma barreira hidrofóbica.
      1. Usando uma caneta barreira, desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor de cada seção de tecido. Deixe os slides secarem ao ar por aproximadamente 10 minutos em temperatura ambiente (RT).
      2. Certifique-se de que as seções do tecido permaneçam sempre cobertas com PBS para evitar ressecamento.
        NOTA: Use um lenço lenço sem fiapos (lenço de lente) para secar a lâmina ao redor do tecido enquanto mantém o tecido hidratado. Certifique-se de que a tinta da caneta barreira não entre em contato com a seção de tecido.
    2. Realize o pré-tratamento.
      1. Aplique o reagente de pré-tratamento personalizado para cobrir completamente cada seção. Incube as lâminas por 30 minutos a 40 °C em uma câmara umidificada colocada dentro de um forno de hibridização.
        NOTA: Para todos os reagentes fornecidos em frascos conta-gotas, adicione gotas suficientes para cobrir completamente a seção dentro da barreira. Certifique-se de que todos os reagentes sejam levados ao RT antes do uso.
    3. Enxágue as seções.
      1. Enxágue as seções várias vezes com PBS e depois incube em PBS fresco por 2 minutos em tempo de descanso.
        NOTA: Use uma pipeta de transferência de 5 mL para lavar cada lâmina individualmente com PBS. Durante a lavagem de 2 minutos, certifique-se de que as seções permaneçam totalmente cobertas com PBS.
    4. Extinguir a atividade endógena da peroxidase.
      1. Aplique peróxido de hidrogênio a 3% em cada seção e incube em RT por 10 minutos para bloquear a atividade endógena da peroxidase.
    5. Repita a lavagem.
      1. Lave as lâminas em PBS por 2 minutos em tempo de descanso. Repita duas vezes.
    6. Prepare as sondas.
      1. Pré-aqueça as sondas a 40 °C por 10 minutos. Deixe as sondas resfriarem para RT antes do uso.
    7. Prepare a mistura da sonda.
      1. A sonda C1 é fornecida como uma solução de trabalho 1×; Use isso diretamente.
      2. Em contraste, as sondas C2, C3 e C4 são fornecidas como concentrados de 50×; dilua essas sondas com a solução da sonda C1. Se a sonda C1 não for utilizada, dilua as sondas C2, C3 e/ou C4 com o diluiente fornecido pelo fabricante.
    8. Hibridize as sondas.
      1. Aplique 30–40 μL de mistura de sonda em cada seção de tecido, garantindo cobertura total. Incube as lâminas por 2 horas a 40 °C em uma câmara umidificada no forno de hibridização.
        NOTA: Ao aprender a técnica RNAscópio, recomenda-se incluir tanto sondas controle negativas quanto positivas durante os testes. Essa abordagem ajuda a validar o ensaio e confirmar a qualidade do procedimento. Uma possível limitação a se estar atento é que algumas sondas de controle positivo fornecidas pelo fabricante podem não ser expressas no tecido de interesse. Para resolver isso, podem ser usadas sondas específicas para o tipo de célula. Por exemplo, o Col1a1 é um controle positivo confiável para tecidos conjuntivos. A coloração para Col1a1 (ou outro gene com alta expressão conhecida) pode ser realizada como um primeiro passo para avaliar a preservação do RNA e a morfologia tecidular nas amostras. Uma vez alcançada a proficiência com a técnica, os controles negativos são normalmente realizados processando lâminas sem sondas, mas tratando-as com todas as outras soluções. Esse método fornece informações críticas sobre o sinal de fundo em todos os canais de detecção. O kit padrão Multiplex V2 permite coloração e imagem simultâneas de até quatro sondas diferentes. Quando os níveis de expressão gênica são estabelecidos por meio de estudos prévios de transcriptômica, é recomendável atribuir genes com baixa expressão aos canais Cy5 e Cy7. Genes altamente expressos devem ser colocados nos canais GFP e RFP para detecção ideal. Nos casos em que nenhuma das sondas tem como alvo genes com alta expressão, o canal GFP deve permanecer sem uso. Isso permite que o canal GFP sirva como referência para subtração de fundo do canal RFP, melhorando a precisão da detecção de sinais para alvos de baixa expressão.
    9. Enxágue com o buffer de lavagem.
      NOTA: O tampão de lavagem de 20× disponível comercialmente foi diluído para 1× com água livre de RNase antes do uso.
      1. Lave os slides por 2 minutos no RT no 1× Wash Buffer fornecido com o kit. Repita duas vezes.
    10. Incube em 5x tampão de soro fisiológico-citrato de sódio (SSC).
      NOTA: O tampão de 20× SSC comercialmente disponível (3 M NaCl, 0,3 M citrato de sódio, pH 7,0) foi diluído para 5× com água livre de RNase antes do uso.
      1. Após a lavagem, incube as seções durante a noite em 5× SSC buffer na RT.
  2. Dia 2: Amplificação do sinal, marcação fluorescente e montagem
    1. Lave os slides.
      1. Lave os slides em 1× Wash Buffer por 2 minutos em temperatura ambiente (RT). Repita duas vezes.
    2. Execute os passos de amplificação.
      1. Aplique um reagente de Amplificação 1 em cada seção e incube por 30 minutos a 40 °C em uma câmara umidificada.
      2. Enxágue duas vezes em 1× Wash Buffer por 2 minutos no tempo de descanso.
      3. Aplique o reagente Amplificação 2 e incube por 30 minutos a 40 °C.
      4. Enxágue duas vezes em 1× Wash Buffer por 2 minutos no tempo de descanso.
      5. Aplique o reagente Amplificação 3 e incube por 15 minutos a 40 °C.
        NOTA: Todos os três passos de amplificação são necessários independentemente de quais canais (sondas) estejam sendo desenvolvidos.
      6. Enxágue duas vezes em 1× Wash Buffer por 2 minutos no tempo de descanso.
    3. Desenvolva peroxidase de rabanete-das-das-cavalas (HRP) e fluoróforo.
      1. Calcule o volume de fluoróforo necessário (geralmente 100–200 μL por lâmina) e dilua os estoques de fluoróforo Opal.
        NOTA: A faixa de diluição recomendada para fluoróforo é de 1:300–1:1500. Nesses experimentos, Opal Polaris 780 (reagente fluoróforo) foi diluído a 1:500 em diluente de anticorpos, e todos os outros corantes foram diluídos a 1:1000 em buffer TSA. Minimize a exposição à luz dos slides sempre que possível.
      2. Aplique o reagente HRP-C1 e incube por 15 minutos a 40 °C.
      3. Enxágue duas vezes em 1× Wash Buffer por 2 minutos no tempo de descanso.
      4. Aplique 30–40 μL de corante de opala (por exemplo, Opal 570 ou Opal 690) em cada seção. Incube por 30 minutos a 40 °C.
      5. Enxágue duas vezes em 1× Wash Buffer por 2 minutos no tempo de descanso.
      6. Aplique o bloqueador de HRP e incube por 15 minutos a 40 °C.
      7. Enxágue duas vezes em 1× Wash Buffer por 2 minutos no tempo de descanso.
      8. Aplique o reagente HRP-C2 ou HRP-C3 e incube a 40 °C por 15 minutos.
      9. Enxágue duas vezes em 1× Wash Buffer por 2 minutos no tempo de descanso.
      10. Aplique 30–40 μL do segundo corante de opala e incube por 30 minutos a 40 °C.
      11. Enxágue duas vezes em 1× Wash Buffer por 2 minutos no tempo de descanso.
      12. Aplique o bloqueador de HRP e incube por 15 minutos a 40 °C.
      13. Enxágue duas vezes em 1× Wash Buffer por 2 minutos no tempo de descanso.
      14. Aplique o reagente HRP-C3 ou HRP-C4 e incube por 15 minutos a 40 °C.
      15. Enxágue duas vezes em 1× Wash Buffer por 2 minutos no tempo de descanso.
    4. Realize amplificação do sinal de tiramidas com digoxigenina (TSA-DIG) e marcação por fluoróforo (se aplicável).
      1. Aplique 30–40 μL de reagente TSA-DIG diluído por seção e incube por 30 minutos em RT.
      2. Enxágue duas vezes em 1× Wash Buffer por 2 minutos no tempo de descanso.
      3. Apresente o reagente bloqueante e incube por 15 minutos a 40 °C.
      4. Enxágue duas vezes em 1× Wash Buffer por 2 minutos no tempo de descanso.
      5. Aplique 30–40 μL de reagente fluoróforo diluído e incube por 30 minutos a 40 °C.
      6. Enxágue duas vezes em 1× Wash Buffer por 2 minutos no tempo de descanso.
    5. Realize contra-tingimento e montagem.
      1. Aplique 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e incube por 5 minutos em RT no escuro.
      2. Enxágue o DAPI e monte prontamente as seções usando um suporte anti-descoloração, aplique o revestimento suavemente e evite prender bolhas de ar. Selecione um tamanho de engolda que combine adequadamente com a cobertura de lenço.
      3. Seque os slides por 2 horas no RT no escuro, depois mantenha os slides a 4 °C para armazenamento a longo prazo.
        NOTA: A fluorescência pode ser preservada por até um ano se armazenada a 4 °C no escuro, com montagem adequada anti-desbotamento.
    6. Realize exames de imagem.
      1. Realize imagens usando um microscópio de fluorescência multicanal com iluminação LED e filtros para separação espectral (Figura 2A). Use os comprimentos de onda de excitação e emissão da seguinte forma: DAPI (353/465 nm), FITC (495/519 nm), Cy3 (548/561 nm), Cy5 (650/673 nm) e Cy7 (747/773 nm). Filtros específicos minimizam sobreposições espectrais e distinguem sinais azul, verde, laranja, vermelho e infravermelho próximo.
      2. Adquira todas as imagens usando configurações idênticas de exposição e iluminação entre as amostras, garantindo consistência e permitindo uma análise comparativa confiável.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando o protocolo descrito (Figura 1), demonstramos a detecção de transcritos ISH de mRNA fluorescente multiplexados em um camundongo com imagem de cabeça inteira em uma plataforma de microscópio Zeiss (Figura 2B). Visualizações específicas de imagens podem ser selecionadas usando a aba lateral (caixa amarela), enquanto múltiplos canais podem ser visualizados simultaneamente usando a aba de canal (caixa vermelha). Brilho, gama ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A hibridização in situ tem sido uma ferramenta fundamental para o estudo da expressão gênica por mais de quatro décadas e passou por aprimoramento contínuo. No entanto, abordagens convencionais de ISH frequentemente são limitadas por baixa sensibilidade, alto sinal de fundo e procedimentos longos e trabalhosos. Essas restrições restringiram sua aplicação mais ampla, especialmente em tecidos craniofaciais complexos, onde a resolução espacial precisa e a detecção de transcritos de...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos à equipe da instalação veterinária do NICHD pela ajuda na criação e criação de animais. Agradecemos ao Dr. Vincent Schram, do Núcleo de Microscopia e Imagem (NIH/NICHD), pela assistência com a imagem de fluorescência. O manuscrito atual é apoiado por fundos do NIH/NIDCR RO1DE033520 ao M.B., do Programa de Pesquisa Intramuros, do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (NICHD) ao E.M., e do Identificador de Bolsas de Pesquisa do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (NICHD) ZIA HD009015. O financiador não teve papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1× PBSThermo Fischer10010023Use  para realizar lavagens durante o fluxo de trabalho
20 e vezes; SSCThermo FischerJ60839. K2Use para fazer o 1&agudo; Buffer de lavagem
50 mL tubos cônicos (Ambion) livres de RNAseThermo FischerAM12502Uso para armazenar amostras em diferentes soluções
Oscilador orbital avançadoVWR6683-470Uso para agitar tecidos na solução de fixação durante a incubação
Álcool, 70%, Fisherbrand, HistoPrepFisher ScientificHC-1000-1GLUse para limpar e desinfetar todo o espaço de trabalho
Diluente de Anticorpos  Akoya BiosciencesARD1001EADiluente para TSA-DIG
Processador automatizado de tecido a vácuoLeica BiosystemsASP300SUso para limpar desidratação, reidratação e infiltração de cera em amostras
Espessura do Vidro da Cobertura 1,5, 25 mm x 25 mm  Corning2850-25Uso para montagem de slides no fluxo de trabalho Visium HD
Reagente de Pré-Tratamento PersonalizadoACD, Bio-Techne300040Otimizar a permeabilização dos tecidos e a acessibilidade dos alvos
EDTAMillipore Sigma03690Uso para descalcificar tecidos mineralizados
Etanol 100%Grupo AeroBase6505001050000Use para remover xilina e reidratar amostras durante o processamento
Banho-maria HistoCore & nbsp;Leica BiosystemsHIS2326Use para flutuar as seções a 40-43 graus; C para remover rugas das seções FFPE  
Papel umidificador HybEZACD, Bio-Techne310015Use dentro do forno HybEZ para manter a umidade e evitar que as secas de tecido durante a hibridização
Forno, Bandeja e Grelha HybEZACD, Bio-Techne310011, 310012, 310014Uso para fornecer temperatura controlada, umidade e posicionamento correto do slide durante as etapas de hibridização e incubação  
Caneta Barreira Hidrofóbica ImmEdgeLaboratório VetorialH-4000Use para desenhar limites hidrofóbicos em lâminas para confinar os reagentes à seção de tecido durante os procedimentos de coloração.
Lâminas descartáveis de perfil baixo DB80LXLeica Biosystems14035843496Use para seccionar blocos FFPE  
Formalina Tamponada Neutra 10%Azer ScientificNBF-4-GUsar para consertar os lenços
PACOTE DE REAGENTES OPAL 520Akoya Biosciences, Inc.FP1487001KTAmplificar e detectar sinais de RNA-alvo com marcação fluorescente.
PACOTE DE REAGENTES OPAL 570Akoya Biosciences, Inc.FP1488001KTAmplificar e detectar sinais de RNA-alvo com marcação fluorescente.
PACOTE DE REAGENTES OPAL 620Akoya Biosciences, Inc.FP1495001KTAmplificar e detectar sinais de RNA-alvo com marcação fluorescente.
PACOTE DE REAGENTES OPAL 690Akoya Biosciences, Inc.FP1497001KTAmplificar e detectar sinais de RNA-alvo com marcação fluorescente.
Pacote de Reagentes Opal Polaris 780Akoya Biosciences, Inc.FP1501001KTAmplificar e detectar sinais de RNA-alvo com marcação fluorescente.
Prolong DiamondThermo FischerP36970Um meio de montagem antifade para preservar sinais fluorescentes e proteger o sinal de RNAscópio durante a imagem
RNAscope 4-Plex Kit Auxiliar UI ESPECÍFICAACD, Bio-Techne323120Materiais adicionais usados no ensaio Fluorescente Multiplex v2 RNAscope
RNAscope DAPIACD, Bio-Techne320858Uma coloração nuclear fluorescente usada em ensaios de RNAscope para visualizar núcleos celulares
Kit de Reagentes Fluorescentes Multiplex de RNAscope v2ACD, Bio-Techne323100Para realizar hibridização multiplex fluorescente in situ
RNAscope Multiplex TSA BufferACD, Bio-Techne322810Um tampão usado em RNAscope para diluir corantes de opala
Reagentes tampão de lavagem RNAscopeACD, Bio-Techne310091Use para lavar as seções de tecido em lâminas durante o ensaio
Solução de Descontaminação RNase RNaseZapThermo FischerAM9782Uso para limpar e remover RNase
Microtomo Rotativo Semi-AutomatizadoLeica BiosystemsRM2245Use para seccionar blocos FFPE conforme informado nas diretrizes.
Slide BriteCiência da Microscopia Eletrônica23401-01Para a etapa de deparafinização antes do processamento do RNAscopo.
Aquecedor de Ferrolho com TampaEstreia  XH2004Uso para incubação de lâminas em diferentes temperaturas
Superfrost Plus Slides & nbsp;Fisher Scientific12-550-15 Uso para anexar seções para o Vsium HD
Paraplastos SurgipathLeica Biosystems39601006Uso para realizar infiltração de tecidos e inserção de tecidos
Cultura de tecidos DISH 100 X 20 MM 500/CSFisher Scientific877222Uso para coleta e dissecação de amostras em 1&agudo; PBS
XyleneFisher Scientific6.81001E+12Usado como agente de limpeza para remover álcool e tornar os tecidos transparentes

Referências

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