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Quantificação de Fluoreto em Soro, Osso e Dentes em um Modelo Murino Utilizando Difusão Facilitada por Hexametildisiloxano e Medições com Eletrodo Seletivo de Íons

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DOI:

10.3791/71488

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28 de agosto de 2026

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1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a preparação de placas de difusão facilitada por hexametildissiloxano (HMDS), seguida por medições com eletrodo seletivo de íons para quantificar a massa de íons fluoreto no soro, osso e dentes de camundongos. O método fornece uma abordagem sensível, baseada em calibração, para avaliar o acúmulo de fluoreto em espécimes biológicos.

Resumo

A quantificação dos níveis de fluoreto em tecidos biológicos é essencial para compreender a exposição, o metabolismo e a toxicidade do flúor. Este protocolo descreve um método sensível e reprodutível para medir a massa de íons fluoreto em soro, osso e dentes, utilizando difusão facilitada por hexametildisiloxano (HMDS) seguida de análise por eletrodo seletivo a íons (ISE). Espécimes biológicos, incluindo soro, osso femoral e incisivos mandibulares, são coletados de camundongos expostos a tratamentos controlados de fluoreto. Os espécimes de osso e dente são calcinados, moídos e hidratados, enquanto o soro é processado diretamente. Cada espécime é transferido para uma cápsula de difusão contendo água ultrapura e selada com uma tampa revestida de petrolato, contendo gotículas de hidróxido de sódio que funcionam como armadilhas para o fluoreto. A injeção de ácido sulfúrico saturado com HMDS inicia a liberação e difusão do fluoreto, permitindo que os íons fluoreto liberados sejam capturados quantitativamente nas armadilhas. Após a difusão durante a noite, as gotículas das armadilhas de fluoreto são combinadas em uma única amostra, acidificadas para a faixa de pH requerida e ajustadas para um volume definido para medição por ISE. Cápsulas de difusão de calibração, preparadas com massas conhecidas de fluoreto, geram uma curva padrão para quantificação, e amostras de controle de qualidade verificam a estabilidade do eletrodo. Resultados representativos de camundongos adolescentes e adultos expostos a 0 ou 125 ppm de fluoreto demonstram a capacidade do método de detectar diferenças dependentes da idade e da dose nos níveis de fluoreto no soro, osso e dentes. Este protocolo fornece uma abordagem robusta, baseada em calibração, para quantificar fluoreto em diversas matrizes biológicas e é especialmente adequado para estudos que investigam exposição ao fluoreto, deposição tecidual e efeitos toxicológicos em modelos murinos. Uma vantagem fundamental deste método é sua capacidade de quantificar com precisão o fluoreto em espécimes extremamente pequenos, incluindo os 3–5 mg de cinza obtidos de incisivos individuais de camundongo, pois o processo de difusão concentra todo o fluoreto liberado em um volume mensurável inferior a 100 µL.

Introdução

O fluoreto é um ânion que ocorre naturalmente, e o nível ideal de fluoreto é eficaz na prevenção de cáries dentárias1,2,3,4,5. Nos Estados Unidos (EUA), a fluoretação da água de abastecimento público com 0,7 ppm tem sido implementada como uma estratégia de saúde pública para reduzir a incidência de cáries e promover a saúde bucal6. No entanto, a ingestão prolongada de quantidades excessivas de fluoreto pode afetar adversamente diversos tecidos. A exposição elevada a fluoreto interrompe a formação do esmalte7,8,9, altera a formação óssea10 e compromete a integridade esquelética11.

No nível celular, a exposição ao flúor induz diversas perturbações metabólicas, incluindo estresse oxidativo12, estresse do retículo endoplasmático13, modificações epigenéticas que alteram a expressão gênica14 e apoptose em ameloblastos15,16,17,18. Globalmente, concentrações elevadas de flúor em águas subterrâneas (>1,5 ppm) representam uma preocupação significativa para a saúde. Um estudo recente de modelagem preditiva estimou que aproximadamente 180 milhões de pessoas em todo o mundo podem estar afetadas pela exposição excessiva ao flúor, com a maior carga ocorrendo na Ásia e na África1. Além da água potável, a exposição ao flúor também ocorre por meio de alimentos (por exemplo, frutos do mar; ~1,9 ppm), bebidas (por exemplo, chá; 0,5–6 ppm19) e produtos odontológicos, como creme dental20 (1.000–1.500 ppm).

Portanto, compreender a exposição, o metabolismo e a deposição tecidual do flúor é essencial para avaliar tanto seus benefícios terapêuticos quanto suas possíveis consequências toxicológicas. A quantificação precisa de flúor em espécimes biológicos — incluindo urina, soro, osso e dentes — é um componente crítico desse trabalho. No entanto, a medição é analiticamente desafiadora devido ao comportamento químico do flúor e à sua forte afinidade por matrizes ricas em cálcio. Aproximadamente 99% do flúor no organismo está presente em tecidos mineralizados, como osso e dentes21. Para enfrentar esses desafios, diversas técnicas analíticas foram desenvolvidas, incluindo potenciometria com eletrodo seletivo a íons (ISE), cromatografia iônica, ensaios colorimétricos, procedimentos titrimétricos e métodos nucleares ou baseados em ativação22. Dentre essas, a técnica de difusão facilitada por hexametildisiloxano (HMDS) combinada com medição por eletrodo seletivo a flúor emergiu como uma das abordagens mais confiáveis e amplamente utilizadas para matrizes biológicas, devido à sua sensibilidade, reprodutibilidade e compatibilidade com diversos tipos de amostras23,24,25,26,27,28,29.

Apesar da disponibilidade de múltiplos métodos analíticos, cada abordagem possui limitações que podem restringir seu uso em pesquisas experimentais ou clínicas. A cromatografia iônica oferece alta sensibilidade e seletividade, mas exige instrumentação especializada e preparação extensiva das amostras30,31. Ensaios colorimétricos, como o método SPADNS (sulfonato de sódio 2-(parassulfofenilazo)-1,8-dihidroxinaftaleno-3,6-disulfônico), são simples e baratos, mas são suscetíveis à interferência da turbidez e de cromóforos endógenos, o que limita sua confiabilidade em amostras biológicas complexas22,32,33. Métodos titrimétricos são econômicos e diretos, mas carecem da sensibilidade necessária para a detecção de traços de fluoreto na maioria dos espécimes biológicos34. Técnicas nucleares ou baseadas em ativação oferecem sensibilidade excepcional, mas exigem acesso a reatores ou fontes de nêutrons baseadas em aceleradores, tornando-as impraticáveis para uso rotineiro em laboratório35. Em contraste, a difusão facilitada por HMDS seguida de medição por ISE fornece um equilíbrio prático entre sensibilidade, custo e acessibilidade, garantindo a liberação completa do fluoreto tanto de tecidos moles quanto mineralizados. Isso é particularmente vantajoso em estudos com animais pequenos, nos quais a disponibilidade de tecido é limitada e estruturas mineralizadas, como os incisivos de camundongo, produzem apenas 3–5 mg de cinza por dente.

A capacidade do método de ISE por difusão de concentrar todo o flúor liberado em um pequeno volume definido permite a quantificação precisa, mesmo em amostras extremamente pequenas. Isso torna o método particularmente adequado para estudos toxicocinéticos, experimentos de dose-resposta e investigações do metabolismo do flúor em diferentes estágios de desenvolvimento. Roedores pequenos, especialmente camundongos C57BL/6J, têm sido amplamente utilizados como modelos animais para estudar os efeitos do flúor7,9,12,29,36 .

Neste protocolo, os autores aplicam a técnica de difusão facilitada por HMDS seguida da medição com eletrodo seletivo a fluoretos para quantificar o flúor em soro, osso e dentes coletados de camundongos expostos a uma dose elevada de flúor (125 ppm) em comparação com controles não tratados. Os autores também comparam o acúmulo de flúor em camundongos adolescentes (6 semanas no início do tratamento) e maduros (18 semanas no início do tratamento) para avaliar as diferenças dependentes da idade no metabolismo e deposição tecidual do flúor. Os incisivos mandibulares foram selecionados como tecido dentário representativo porque os incisivos de roedores erupcionam continuamente e atingem um equilíbrio em estado estacionário entre erupção e desgaste oclusal por volta das 7 semanas de idade. Esse padrão de crescimento contínuo fornece um gradiente consistente e acessível de desenvolvimento do esmalte, tornando os incisivos de camundongos um modelo amplamente utilizado e bem validado para investigar a formação do esmalte e a fluorose dentária.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentações para o uso de animais vertebrados aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Nova do Sudeste (Protocolo Nº 2023.02.MSuz1), que é credenciada pela Associação para Avaliação e Credenciamento do Cuidado com Animais de Laboratório Internacional (AAALAC). Todo o trabalho com animais cumpriu as orientações para o cuidado e uso de animais de laboratório e as Diretrizes da Associação Médica Veterinária Americana (AVMA) para a eutanásia de animais. Todos os materiais utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Animais e preparação e administração de fluoreto de sódio em um modelo murino

  1. Animais: Designe camundongos machos C57BL/6J em duas categorias etárias: adolescentes, com 6 semanas no início do tratamento, e maduros, com 18 semanas no início do tratamento.
    1. Forneça a cada grupo água deionizada livre de flúor (0 ppm F⁻) ou água de beber suplementada com fluoreto de sódio (125 ppm F⁻) por um período de exposição de 6 semanas.
    2. Inclua cinco animais em cada condição de idade e tratamento (N = 5/grupo).
    3. No final do período de exposição, colete soro, fêmures e incisivos mandibulares, e prepare todas as amostras coletadas para análises posteriores.
      ​NOTA: Espécime: Material processado, como osso calcinado, dente calcinado e soro.
  2. Manutenção e dieta dos animais: Mantenha os camundongos em condições laboratoriais padrão com acesso ad libitum a alimento e água.
    1. Forneça uma dieta livre de flúor a partir de uma semana antes da coleta de dentes, ossos e soro, para minimizar os níveis basais de flúor.
  3. Água de beber com fluoreto de sódio
    1. Para preparar a água de beber suplementada com flúor, dissolva fluoreto de sódio (NaF) em água deionizada para atingir a concentração desejada de flúor (por exemplo, 125 ppm F⁻).
    2. Filtre a solução através de um filtro de vácuo de 0,2 µm em um frasco autoclavado. Prepare uma solução fresca a cada 2 dias.
      CAUÇÃO: O NaF é tóxico se ingerido e pode causar irritação na pele e nos olhos. Manipule em capela de exaustão, usando jaleco de laboratório, luvas de nitrila e óculos de segurança.
  4. Para a água controle livre de flúor, filtre água deionizada através de um filtro de vácuo de 0,2 µm em um frasco autoclavado. Prepare água fresca a cada 2 dias.
  5. Forneça água de beber suplementada com flúor ou livre de flúor ad libitum durante o tempo desejado para o tratamento com flúor. Monitore os níveis de água diariamente e substitua os frascos a cada 2 dias.
  6. No final do período de exposição, eutanize os animais por inalação de dióxido de carbono (CO₂), seguida por decapitação. Os procedimentos de eutanásia foram realizados de acordo com as Diretrizes da AVMA para a Eutanásia de Animais e foram aprovados como parte do protocolo institucional do IACUC.
    CAUÇÃO: O CO2 é um asfixiante. Realize os procedimentos em local bem ventilado e certifique-se de que a câmara esteja funcionando corretamente. Evite exposição direta por inalação.

2. Preparação da amostra para medição de fluoreto

  1. Coleta de sangue
    1. Eutanizar camundongos por inalação de CO₂ e coletar imediatamente o sangue por punção cardíaca terminal usando uma seringa tuberculínica de 1 mL. Transferir o sangue para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Descartar todas as agulhas e seringas usadas em um recipiente aprovado institucionalmente para resíduos perfurocortantes.
      ATENÇÃO: As agulhas de seringa são afiadas e podem causar lesões por perfuração; manuseie com cuidado.
    2. Armazenar o sangue por 30 min à temperatura ambiente, depois centrifugar por 10 min a 2.000 × g.
    3. Transferir o sobrenadante (soro) para um tubo de microcentrífuga e armazenar a −80 °C.
      ATENÇÃO: Os congeladores ultracongelados apresentam risco de congelamento. Use luvas isoladas ao manipular os tubos e evite contato prolongado da pele com superfícies frias.
  2. Osos
    1. Extração dos fêmures: Após a eutanásia, dissecar as patas traseiras nas articulações do quadril.
    2. Remover cuidadosamente todos os tecidos moles dos fêmures. Lavar os tecidos três vezes em água desionizada. Armazenar os ossos a -80 °C até o processamento posterior. Descartar os tecidos moles removidos e quaisquer materiais contaminados no fluxo de resíduos biológicos institucional.
      NOTA: Os tecidos podem ser fixados em paraformaldeído 4% com sacarose 2% por 12–16 h para armazenamento de longo prazo em etanol 70%. Este procedimento de fixação não altera a precisão da quantificação subsequente de fluoreto.
    3. Lavar os ossos completamente com água desionizada. Remover o excesso de umidade com um papel toalha sem fiapos.
    4. Transferir os ossos para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com tampas abertas para permitir a evaporação e colocá-los em uma estufa de secagem a 60 °C por 12–16 h.
      ATENÇÃO: A estufa de secagem pode causar queimaduras. Use luvas resistentes ao calor ao manipular as amostras.
    5. Calcinação dos ossos: Transferir os ossos secos para cadinhos de alumina. Colocar os cadinhos em um forno mufla e aquecer até 600 °C a uma taxa de 150 °C/h, mantendo por 6 h. Aguardar o resfriamento do forno a abaixo de 200 °C antes de remover os cadinhos. Descartar quaisquer fragmentos residuais de osso ou consumíveis contaminados no fluxo de resíduos biológicos institucional.
      ATENÇÃO: O forno mufla e os cadinhos atingem temperaturas extremas, representando risco grave de queimadura. Sempre aguarde o resfriamento do forno antes de manipular os cadinhos. Ao remover os cadinhos, use jaleco de laboratório, óculos de proteção e luvas resistentes ao calor, e utilize pinças longas para evitar contato direto com superfícies quentes.
      ETAPA CRÍTICA: A calcinação incompleta comprometerá as análises subsequentes. Verifique se o material ósseo atingiu um estado totalmente oxidado antes de prosseguir; qualquer carbono residual interferirá nas medições subsequentes.
      ​NOTA: O osso adequadamente calcinado deve apresentar-se uniformemente cinza claro a branco. Partículas mais escuras—especialmente resíduos pretos ou semelhantes a carvão—indicam combustão incompleta. Se houver descoloração, prolongue a duração da calcinação para permitir a remoção completa do material orgânico.
    6. Armazenamento dos ossos calcinados: Imediatamente após a calcinação, transferir os ossos para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Vedar os tubos com Parafilm e armazená-los em um dessecador a vácuo até o uso.
  3. Dentes
    1. Extração dos incisivos mandibulares: Fazer um corte horizontal ao nível da articulação temporomandibular para separar a mandíbula do maxilar.
    2. Realizar cortes médio-sagitais para dividir tanto o maxilar quanto a mandíbula em metades direita e esquerda.
    3. Lavar os tecidos três vezes em água desionizada e extrair cuidadosamente os incisivos mandibulares. Armazenar os incisivos extraídos a -80 °C até o uso posterior. Descartar os tecidos moles extraídos e quaisquer consumíveis contaminados no fluxo de resíduos biológicos institucional.
      ATENÇÃO: Use instrumentos de dissecação afiados com cuidado ao realizar cortes na articulação temporomandibular e no plano médio-sagital para evitar lesões pessoais. Use EPI apropriado, incluindo luvas, jaleco de laboratório e óculos de proteção.
      NOTA: Os tecidos podem ser fixados em paraformaldeído 4% com sacarose 2% por 12–16 h para armazenamento de longo prazo em etanol 70%. Este procedimento de fixação não altera a precisão da quantificação subsequente de fluoreto.
    4. Preparação dos dentes para calcinação: Lavar os dentes completamente com água desionizada e colocá-los em peróxido de hidrogênio (H₂O₂) a 1% por 12–16 h. Descartar soluções usadas de peróxido de hidrogênio como resíduo químico perigoso.
    5. Lavar novamente com água desionizada, secar brevemente com um papel sem fiapos e transferir para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com tampas abertas. Colocar os tubos em uma estufa de secagem a 60 °C por 12–16 h.
      ATENÇÃO: O peróxido de hidrogênio é um oxidante e pode causar irritação na pele e nos olhos. Manipule em capela com jaleco de laboratório, luvas de nitrila e óculos de proteção. Evite contato com materiais combustíveis.
    6. Calcinação dos dentes: Transferir os dentes secos para cadinhos de alumina e calcinar em forno mufla a uma temperatura de patamar de 600 °C por 20 h, utilizando uma taxa de rampa de 150 °C/h.
    7. Remover os cadinhos somente após o forno ter resfriado abaixo de 200 °C.
      ATENÇÃO: O forno mufla e os cadinhos atingem temperaturas extremas, representando risco grave de queimadura. Aguarde o resfriamento do forno abaixo de 200 °C antes de manipular os cadinhos. Ao remover os cadinhos, use jaleco de laboratório, óculos de proteção e luvas resistentes ao calor, e utilize pinças longas para evitar contato direto com superfícies quentes.
      ETAPA CRÍTICA: Garantir a oxidação completa; o carbono residual interferirá nas análises subsequentes.
      NOTA: O material dentário calcinado deve apresentar-se uniformemente cinza claro a branco. Recalcine se restarem resíduos pretos.
    8. Armazenamento do espécime dentário calcinado: Imediatamente após a calcinação, transferir os dentes para tubos de microcentrífuga de fundo redondo de 2 mL.
    9. Vedar os tubos com Parafilm e armazená-los em um dessecador a vácuo até o uso.

3. Preparação de placas para difusão facilitada por HMDS

  1. Reagentes e materiais
    1. Ácido sulfúrico 6 N: Pelo menos dois dias antes de preparar as placas de difusão, prepare um estoque de ácido sulfúrico 6 N.
      NOTA: Placa de difusão: Um recipiente selado projetado para criar um ambiente fechado controlado no qual componentes liberados de um material biológico processado podem ser capturados por uma armadilha química fixada na tampa. O design selado impede a troca com o ar externo e garante que os analitos liberados sejam direcionados à armadilha para medição subsequente.
    2. Coloque um béquer plástico de 1 L com um bastão magnético sobre um agitador magnético e adicione 416 mL de água ultrapura.
    3. Usando uma pipeta serológica de 50 mL, adicione lentamente 84 mL de H₂SO₄ 36 N à água, agitando continuamente. A solução ficará quente; deixe esfriar até a temperatura ambiente. Descarte qualquer solução de ácido sulfúrico não utilizada ou residual como resíduo químico perigoso na corrente de resíduos químicos institucional.
      CAUTELA: O ácido sulfúrico é altamente corrosivo. Manipule em capela de exaustão, usando luvas resistentes a ácidos, jaleco de laboratório e óculos de proteção. Em caso de contato, lave imediatamente com água em abundância.
    4. Ácido sulfúrico 6 N saturado com HMDS: Transfira o ácido sulfúrico 6 N para um funil de separação de 2 L e adicione 15 mL de hexametildisiloxano (HMDS).
    5. Assegure-se de que a rolha e a torneira estejam firmemente fechadas, segure o funil de separação na horizontal e agite vigorosamente até que pequenas gotículas de HMDS sejam visíveis.
    6. Abra a rolha para liberar o gás acumulado e repita o processo mais duas vezes.
    7. Deixe a rolha entreaberta por várias horas. Armazene o funil de separação contendo o ácido sulfúrico 6 N saturado com HMDS em um suporte dentro da capela de exaustão. Descarte o ácido sulfúrico contendo HMDS e materiais contaminados como resíduo químico perigoso.
      CAUTELA: O HMDS é inflamável e tóxico por inalação. Manipule na capela de exaustão, usando jaleco de laboratório, luvas e óculos de proteção. Mantenha afastado de fontes de ignição.
    8. Hidróxido de sódio 0,05 N: Dissolva 1 g de pastilhas de NaOH em 25 mL de água ultrapura para preparar uma solução estoque 1 N.
    9. Misture 2 mL da solução estoque de NaOH 1 N com 38 mL de água ultrapura para obter uma solução de NaOH 0,05 N.
    10. Aliquote o NaOH 0,05 N em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para uso único, feche as tampas com Parafilm e armazene os tubos em um dessecador a vácuo para minimizar a absorção de CO₂. Descarte soluções de hidróxido de sódio não utilizadas ou residuais como resíduo químico perigoso.
      CAUTELA: O hidróxido de sódio é altamente cáustico e pode causar queimaduras graves. Use jaleco de laboratório, luvas e óculos de proteção. Manipule as soluções com cuidado para evitar respingos.
    11. Ácido acético 0,2 N: Adicione 575 µL de ácido acético glacial à água ultrapura e ajuste até volume final de 50 mL para preparar ácido acético 0,2 N. Descarte soluções de ácido acético como resíduo químico perigoso.
      CAUTELA: O ácido acético é corrosivo e pode irritar a pele, os olhos e o trato respiratório. Manipule em capela de exaustão química, usando jaleco de laboratório, luvas e óculos de proteção.
    12. Petrolato: Derreta aproximadamente 100 g de petrolato a 60 °C em uma estufa. Aspire o petrolato líquido para dentro de seringas de 10 mL e deixe esfriar e solidificar. As seringas preenchidas com petrolato podem ser armazenadas à temperatura ambiente por várias semanas.
    13. Placa de Petri: Use placas de Petri não tratadas de 60 × 15 mm para preparar as placas de difusão.
    14. Faça um pequeno orifício na tampa de uma placa de Petri usando uma agulha de seringa aquecida de 18 G.
    15. Revesta a borda interna da tampa com uma vedação contínua de petrolato usando uma seringa de 10 mL equipada com uma agulha romba de 14 G. Descarte todas as agulhas usadas em um recipiente aprovado para resíduos cortantes institucional.
      CAUTELA: As agulhas de seringa são afiadas e podem causar lesões por perfuração. Manipule com cuidado e descarte em recipientes aprovados para resíduos cortantes. Ao aquecer agulhas, use luvas resistentes ao calor e proteção ocular para evitar queimaduras.
    16. Soluções estoque de NaF para placas de difusão de calibração. Dissolva 4,19 g de NaF em 1 L de água ultrapura para preparar uma solução estoque de 100 mM. Prepare soluções estoque de 10 mM, 100 µM e 10 µM por diluições sequenciais 1:10 da solução de 100 mM.
      NOTA: Um mol de NaF fornece 19 g de F⁻; portanto, 1 µL de NaF 10 µM contém 0,19 ng de F⁻ e 1 µL de NaF 10 mM contém 190 ng de F⁻.
      ​NOTA: Placas de difusão de calibração: Placas de difusão usadas especificamente para calibração com uma massa conhecida de íons fluoreto (F¯).
  2. Preparações específicas de placas de difusão por espécime
    1. Placa de difusão de soro: Pipete 3 mL de água ultrapura no fundo da placa de Petri e adicione 75 µL de soro. Descarte quaisquer materiais contaminados com soro no fluxo de resíduos biológicos institucional. Prossiga com o passo 3.4.
    2. Placa de difusão de osso
      1. Pulverização da cinza óssea: Use uma espátula micro para moer os ossos calcinados dentro dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL até obter um pó fino. Prossiga imediatamente com o processamento da cinza óssea pulverizada. Descarte consumíveis contaminados com cinza óssea no fluxo de resíduos químicos institucional.
      2. Pesagem e hidratação da cinza óssea
        1. Coloque a parte inferior vazia da placa de Petri sobre o prato da balança analítica com precisão de pelo menos 0,1 mg.
        2. Transfira a cinza óssea moída do tubo de microcentrífuga de 2 mL para um pequeno cadinho de porcelana para minimizar a carga estática e prevenir a dispersão do pó.
        3. Usando uma espátula micro, adicione aproximadamente 5 mg de cinza óssea ao cadinho e cubra imediatamente o pó com 3 mL de água ultrapura antes de remover o cadinho da balança analítica para evitar dispersão da cinza.
        4. Registre o peso exato de cada espécime de cinza óssea. Prossiga com o passo 3.4.
    3. Placa de difusão de dente
      1. Moagem dos dentes calcinados
        1. Transfira os incisivos calcinados para tubos de microcentrífuga de fundo redondo de 2 mL e adicione uma esfera de aço inoxidável de 5 mm de diâmetro a cada tubo. Feche os tubos e fixe as tampas com Parafilm.
        2. Pulverize os incisivos calcinados em um agitador de esferas a 2.500 rpm por 10 s. Prossiga imediatamente com o processamento dos dentes moídos.
      2. Pesagem e hidratação dos dentes calcinados
        1. Despeje todo o conteúdo do tubo, incluindo a esfera de aço inoxidável, no fundo da placa de difusão posicionada sobre o prato da balança analítica. Descarte consumíveis contaminados com cinza dentária no fluxo de resíduos químicos institucional.
        2. Remova a esfera de aço inoxidável do prato e registre o peso exato da cinza dentária (normalmente 3–4 mg por incisivo mandibular).
        3. Adicione imediatamente 3 mL de água ultrapura para cobrir a cinza dentária antes de remover a placa da balança, para prevenir a dispersão da cinza causada por descarga eletrostática. Prossiga com o passo 3.4.
  3. Placas de difusão de calibração e controle de qualidade
    1. Paralelamente às placas de difusão dos espécimes, prepare dois conjuntos de placas de difusão de calibração para uma curva de 5–6 pontos e um conjunto idêntico de placas de difusão de controle de qualidade, incluindo um branco.
      NOTA: Placas de difusão de controle de qualidade: Preparadas de forma idêntica às placas de difusão de calibração, mas usadas periodicamente para verificar a estabilidade do eletrodo e garantir desempenho consistente nas medições.
    2. Pipete 3 mL de água ultrapura em cada uma de 11 ou 13 placas de Petri e adicione o estoque de NaF para abranger a faixa esperada de massa de F¯ nas amostras dos espécimes. Prossiga com o passo 3.4 para concluir a montagem das placas de difusão37.
  4. Conclusão da montagem das placas de difusão
    1. Para construir um depósito da armadilha de fluoreto, adicione 50 µL de NaOH 0,05 N em três gotas na superfície interna da tampa da placa de Petri, bem afastado da borda da tampa.
      NOTA: Armadilha de fluoreto (Armadilha F¯): Um componente das placas de difusão que retém F¯, especificamente hidróxido de sódio (NaOH).
    2. Inverta a tampa sem perturbar as gotas de NaOH e sela-a firmemente ao fundo da placa com o petrolato.
    3. Para preparar uma solução de ácido sulfúrico 3 N saturado com HMDS, misture volumes iguais de ácido sulfúrico 6 N saturado com HMDS e água ultrapura. Prepare fresco imediatamente antes do uso, pois não pode ser armazenado.
    4. Injete 3 mL da solução preparada de ácido sulfúrico 3 N saturado com HMDS através do orifício na tampa, dentro da água no fundo da placa de difusão, usando uma seringa de 10 mL equipada com uma agulha de 20 G. Tenha cuidado para não salpicar ácido na superfície interna da tampa ao inserir ou retirar a agulha da seringa.
    5. Difusão de fluoreto facilitada por HMDS: Selo imediatamente o orifício de injeção com um filete de petrolato que cubra completamente a abertura e coloque as placas de difusão em um agitador oscilante ajustado em velocidade baixa. Incube durante a noite à temperatura ambiente (Figura 1).

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Figura 1: Esquema de um recipiente de difusão óssea para extração e captura de fluoreto. A Figura 1 ilustra o design de um recipiente de difusão óssea montado em uma placa de Petri não tratada de 60 × 15 mm. A tampa possui um pequeno orifício de injeção selado com uma gota de petrolato. Na superfície interna da tampa, três gotas de NaOH são posicionadas como armadilhas para íons fluoreto (F⁻), suspensas na tampa durante a difusão. A tampa é vedada hermeticamente à base do recipiente usando petrolato. O fundo da placa de Petri contém água ultrapura, ácido sulfúrico saturado com hexametildisiloxano (HMDS) e cinza óssea, que juntos formam o ambiente reacional para a liberação de fluoreto e sua subsequente captura. Esta figura foi criada pelos autores utilizando o Biorender e está licenciada sob a licença CC BY. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

4. Medição de fluoreto com um eletrodo íon-seletivo

  1. Configurar o ISE
    1. Encha o eletrodo seletivo a fluoretos de canal duplo com a solução de preenchimento apropriada, conecte-o ao potenciômetro e fixe o eletrodo em um suporte para eletrodo.
    2. Posicione uma placa de Petri não tratada sobre um tripé de tesoura abaixo da superfície sensora do eletrodo, garantindo que a superfície sensora esteja paralela ao fundo da placa de Petri, e levante a mesa do tripé de tesoura até que a placa de Petri esteja quase tocando o eletrodo (Figura 2).
  2. Preparação das amostras para medição
    NOTA: Amostras: Apenas os produtos finais medidos com um eletrodo iônico seletivo (ISE), consistindo do coletor de F¯ após a difusão, que posteriormente foi combinado com ácido acético e água, são denominados amostras no protocolo. 
    1. Para ajustar o pH da amostra a 5, remova o recipiente de difusão do agitador e levante cuidadosamente a tampa rompendo o selo de petrolato após o período de incubação. Inverta a tampa sobre uma superfície plana, garantindo que as três gotas do coletor de F¯ permaneçam inalteradas.
    2. Adicione 15–20 µL de ácido acético 0,2 N a uma gota com uma pipeta P20, depois una as três gotas em uma única gota sem trocar a ponteira da pipeta.
      NOTA: Amostras com altas concentrações de F¯ tendem a ter um pH inicial mais baixo e, portanto, requerem menos ácido acético 0,2 N para ajustar o pH a 5, comparadas a amostras com menor quantidade de F¯. Como o volume restante da amostra após o registro do potencial do eletrodo (passo 5.3) é mínimo, utilize qualquer resíduo disponível da amostra para verificar o pH com papel indicador.
    3. Para ajustar o volume da amostra, configure uma pipeta P100 para 75 µL, aspire todo o volume do coletor de F¯ sem introduzir ar e ajuste a amostra exatamente para 75 µL usando água ultra-pura.
    4. Realize este passo com cuidado para garantir um volume preciso para os cálculos de concentração de fluoreto. Mantenha a amostra na ponteira da pipeta e prossiga imediatamente para o passo 4.3.
  3. Medição das amostras de espécime, calibração e controle de qualidade
    1. Para medir o potencial do eletrodo da amostra, dispense-a entre a superfície sensora do eletrodo seletivo a fluoretos e a placa de Petri. Certifique-se de que toda a superfície sensora do eletrodo esteja completamente submersa no líquido, sem tocar diretamente a placa de Petri. Aguarde a estabilização do potenciômetro e registre o potencial (mV) exibido pelo ISE.
    2. Determine a curva padrão de calibração medindo sequencialmente o primeiro conjunto de padrões de calibração, começando com a menor concentração de F¯ e avançando até a maior.
      1. Trace o potencial do eletrodo (mV) em função do logaritmo de F¯ (ng) para construir a curva de calibração (Figura 3). Aplique regressão exponencial para obter a equação da curva padrão e o coeficiente de determinação (R2). Aceite curvas de calibração apenas quando R2 for ≥ 0,99.
    3. Meça cada amostra de espécime e registre o potencial do eletrodo (mV).
    4. Para monitorar a estabilidade do eletrodo e detectar possíveis desvios do ensaio, meça amostras de controle de qualidade intermitentemente durante cada sequência analítica.
      1. Compare diretamente os valores das amostras de controle de qualidade com os das amostras de calibração correspondentes e confirme a concordância dentro de aproximadamente 5% para verificar o desempenho estável do eletrodo ao longo do tempo.
      2. Meça periodicamente um recipiente de difusão em branco para confirmar a ausência de contaminação por fluoreto durante o manuseio e a difusão das amostras.
  4. Para calcular a massa de F¯ (ng) em cada amostra de espécime, utilize a equação da curva padrão. Em seguida, divida essa massa pelo volume (µL) de soro ou pela massa (mg) da cinza óssea ou dentária adicionada ao recipiente de difusão.
    1. Exemplo de cálculo da concentração de F¯ na cinza óssea (ng/mg)
      1. Massa de cinza óssea adicionada ao recipiente de difusão: 5,1 mg ; Potencial do eletrodo da amostra de 75 µL: –31,6 mV
      2. Passo 1: Calcule a massa de fluoreto usando a equação de calibração
        1. Massa de F⁻ (ng) = 3505,4 x e(-0,043x-31,6)
        2. Massa de F⁻ (ng) = 13.641 ng
      3. Passo 2: Calcule a concentração de fluoreto na cinza óssea
        1. Concentração de F⁻ =  13.641 ng  /  5,1  mg
        2. Concentração de F⁻ =  2.675 ng / mg (ppm)

figure-protocol-2
Figura 2: Esquema da configuração de medição com eletrodo seletivo a íons (ISE). A Figura 2 ilustra a configuração utilizada para medições de íons fluoreto com um eletrodo seletivo a íons (ISE) de duplo canal. Uma placa de Petri é posicionada sobre um suporte articulado para permitir o ajuste preciso de sua altura em relação ao eletrodo. O ISE é conectado a um potenciômetro e orientado de modo que sua superfície sensora fique paralela ao plano da placa de Petri, mantendo uma distância de aproximadamente 1–2 mm. Após o ajuste da distância, um pequeno volume de amostra (75 µL) é pipetado no espaço entre a superfície sensora e a placa de Petri, garantindo que a amostra cubra completamente a área sensora do eletrodo durante a medição. Esta figura foi criada pelos autores utilizando o Biorender e está licenciada sob a licença CC BY. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Curva de calibração e tabela de calibração correspondente para a quantificação da massa de íons fluoreto em amostras de espécimes dentários. Painel superior: Exemplo de curva de calibração utilizada para determinar a massa de íons fluoreto em amostras de espécimes dentários. O eixo x mostra o potencial do eletrodo (mV, escala linear), e o eixo y mostra a massa correspondente de íons fluoreto (ng F⁻, escala logarítmica). Os pontos de calibração medidos são representados por uma linha contínua, e a regressão exponencial ajustada é mostrada como uma linha tracejada. Uma caixa inserida exibe a equação da curva padrão e o coeficiente de determinação (R2 = 0.99). Painel inferior: Tabela contendo os valores numéricos utilizados para gerar a curva de calibração. A primeira linha lista os cinco potenciais do eletrodo (mV) registrados para as amostras de calibração. A segunda linha fornece as massas correspondentes de íons fluoreto (ng F⁻) para cada amostra de calibração. A terceira linha lista os volumes (µL) da solução estoque de NaF 10 mM adicionados às placas de difusão de calibração; essa massa de íons fluoreto adicionada equivale à massa retida em cada amostra de calibração após a difusão. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Resultados

Para demonstrar a aplicação deste protocolo na medição de concentrações de fluoreto (F-) em materiais biológicos, amostras de espécimes foram obtidas de soro, osso e incisivos mandibulares coletados de camundongos submetidos a tratamentos controlados com fluoreto. Camundongos machos C57BL/6J foram alocados em duas categorias etárias, adolescentes (6 semanas) e adultos (18 semanas), e receberam água deionizada livre de fluoreto (0 ppm F⁻) ou água de consumo suplementada com fluoreto de sódio (125 ppm F⁻) durante um período de exposição de 6 semanas. Cada grupo etário e condição de tratamento incluiu cinco animais. Ao final do período de exposição, foram coletados soro, fêmures e incisivos mandibulares, e as amostras dos espécimes foram preparadas e analisadas de acordo com o protocolo. As concentrações representativas de fluoreto medidas no soro, osso e dentes são resumidas abaixo.

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Figura 4: Concentrações de flúor medidas no soro, osso femoral e incisivos mandibulares. Camundongos machos C57BL/6J foram divididos em duas categorias etárias, adolescentes (6 semanas, barra aberta) e adultos (18 semanas, barra preenchida), e receberam água deionizada livre de flúor (0 ppm F⁻) ou água de consumo suplementada com fluoreto de sódio (125 ppm F⁻) durante um período de exposição de 6 semanas. Ao final do período de exposição, os níveis de flúor foram medidos em (A) soro, (B) osso femoral e (C) incisivos mandibulares dos mesmos grupos tratados. Valores séricos abaixo do limite de detecção (<0,02 ppm) foram plotados para fins de visualização, mas excluídos da análise estatística. Os dados são expressos como médias ± DP. As comparações entre os grupos adolescentes e adultos foram realizadas utilizando o teste Mann–Whitney U com correção de Bonferroni–Dunn para comparações múltiplas. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/grupo). Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Concentrações de flúor no soro
Em ambos os grupos tratados com 0 ppm de flúor, as concentrações séricas de flúor estavam abaixo do limite de detecção do eletrodo seletivo a íons (<0,02 ppm). Nos grupos tratados com 125 ppm, o flúor sérico aumentou para 0,3 ± 0,2 ppm no grupo adolescente e para 0,7 ± 0,2 ppm no grupo maduro (p = 0,06). A comparação entre os grupos adolescentes e maduros tratados com 125 ppm foi realizada utilizando o teste Mann–Whitney U com correção de Bonferroni–Dunn para comparações múltiplas. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/grupo). Os grupos tratados com 0 ppm foram excluídos da análise estatística. (Figura 4A, Tabela 1).

Concentrações de flúor no osso femoral
Nos grupos tratados com 0 ppm, as concentrações de flúor no fêmur foram significativamente menores em animais adolescentes (292 ± 39 ppm) em comparação com animais maduros (896 ± 55 ppm) (p < 0,01). Em contraste, nos grupos tratados com 125 ppm, as concentrações de flúor em animais adolescentes (4.108 ± 482 ppm) foram significativamente maiores do que em animais maduros (2.966 ± 612 ppm) (p = 0,04). As comparações entre os grupos adolescentes e maduros foram realizadas utilizando o teste Mann–Whitney U com correção de Bonferroni–Dunn para comparações múltiplas. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/grupo). (Figura 4B, Tabela 1). Figura 5A mostra a variação relativa nas concentrações de flúor no fêmur entre os tratamentos com 0 ppm e 125 ppm para cada grupo etário. Os animais adolescentes apresentaram um aumento de 14 vezes nos níveis de flúor a 125 ppm, enquanto os camundongos maduros exibiram um aumento de 3 vezes.

Concentrações de flúor em incisivos mandibulares
Nos grupos com 0 ppm, as concentrações de flúor nos incisivos mandibulares foram significativamente menores em adolescentes (35 ± 4 ppm) em comparação com animais maduros (123 ± 23 ppm) (p = 0,03). Nos grupos tratados com 125 ppm, as concentrações de flúor nos incisivos aumentaram para 5641 ± 955 ppm em adolescentes e 4392 ± 1694 ppm em animais maduros. As comparações entre os grupos adolescentes e maduros foram realizadas utilizando o teste Mann–Whitney U com correção de Bonferroni–Dunn para comparações múltiplas. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/grupo). (Figura 4C, Tabela 1). Embora as concentrações absolutas de flúor em 125 ppm não tenham diferido significativamente entre os grupos etários, a variação proporcional de 0 ppm para 125 ppm foi significativamente maior em camundongos adolescentes (aumento de 161 vezes) do que em camundongos maduros (aumento de 36 vezes) (Figura 5B).

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Figura 5: Adolescentes apresentam um aumento maior na acumulação de flúor no osso e nos incisivos em comparação com camundongos adultos. Variação na concentração de flúor de 0 ppm para 125 ppm no tratamento com flúor em camundongos adolescentes (barras abertas) e adultos (barras preenchidas). (A) Osso femoral e (B) Incisivo mandibular dos mesmos grupos tratados. Os dados são expressos como média ± DP. As comparações entre os grupos adolescentes e adultos foram realizadas utilizando o teste t não pareado. * p < 0,05, (N = 5/grupo). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

AmostraSoroFêmurIncisivo Mandibular
Grupo EtárioAdolescenteMaduroAdolescenteMaduroAdolescenteMaduro
Grupo de Tratamento0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0,020,2< 0,020,8324457693330813748241613229
< 0,020,1< 0,020,8229377892433263954511272654
< 0,020,7< 0,021,0300468387737133155441126997
< 0,020,4< 0,020,5323383280725193551141034169
< 0,020,3< 0,020,528336699372192N/A72711114909
Média< 0,020,3< 0,020,7292410889629663556411234392
DPNA0,2NA0,239482556123955231694

Tabela 1: Medidas individuais de fluoreto no soro, osso femoral e incisivos mandibulares. A Tabela 1 lista as concentrações individuais de fluoreto (ppm F⁻) medidas no soro, osso femoral e espécimes de incisivos mandibulares de camundongos adolescentes e adultos expostos a 0 ppm ou 125 ppm de fluoreto. Para cada tipo de tecido, os dados são apresentados em colunas correspondentes aos quatro grupos experimentais: adolescente 0 ppm, adolescente 125 ppm, adulto 0 ppm e adulto 125 ppm. Cada coluna inclui os cinco valores individuais registrados (N = 5), seguidos pela média calculada e desvio padrão (DP). No grupo de soro de camundongos adolescentes com 0 ppm, todos os valores registrados estavam abaixo do limite de detecção do eletrodo iônico seletivo (<0,02 ppm). A tabela fornece os dados numéricos brutos que fundamentam os valores resumidos e as comparações estatísticas mostradas na Figura 4.

Discussão

As medições de fluoreto foram obtidas utilizando um eletrodo seletivo a íons de fluoreto (ISE) que incorpora fluoreto de lantânio (LaF₃) como cristal semipermeável.₃membrana cristalina38,39. Esta membrana forma ligações La–F altamente estáveis, o que resulta em uma forte preferência por íons fluoreto em relação a outros haletos. De acordo com a literatura eletroquímica estabelecida e as especificações do fabricante, o LaF₃ a membrana apresenta coeficientes de seletividade muito baixos para cloreto, indicando que os íons cloreto não produzem interferência mensurável nas condições utilizadas neste protocolo. Embora o cloreto esteja naturalmente presente nos dentes e no osso, sua atividade não influencia o potencial do eletrodo, e o sinal registrado reflete especificamente a atividade do fluoreto. O limite inferior de detecção de 0,02 ppm corresponde à concentração mínima quantificável validada pelo fabricante para o eletrodo seletivo a fluoreto Orion. Esse limite reflete a menor concentração de fluoreto na qual o eletrodo mantém uma resposta nernstiana estável e uma relação linear com a curva de calibração. Como o limite de detecção é definido pelas características da membrana do eletrodo e validado pelo fabricante, nenhuma determinação experimental adicional foi necessária para este protocolo; no entanto, em relação ao limite superior do intervalo de detecção, os autores observaram que massas de fluoreto superiores a aproximadamente 38.000 ng em um 50 µL A armadilha de NaOH resultou em uma resposta não linear do eletrodo, indicando que a curva de calibração já não é confiável em cargas muito altas de fluoreto. Essa não linearidade provavelmente se deve ao excesso da faixa ótima de força iônica e atividade para o eletrodo nas condições experimentais dadas, e não a um limite superior inerente ao próprio ISE. Para amostras que se espera conter massas de fluoreto acima desse limite, recomenda-se aumentar o volume da armadilha de NaOH para manter as medidas dentro da faixa dinâmica linear do eletrodo.

Essa consideração deve ser levada em conta ao aplicar o protocolo em amostras com teor de flúor incomumente alto. Como a etapa de difusão consome todo o volume da amostra, medições em duplicata e experimentos de recuperação com adição de padrão não puderam ser realizados nas amostras biológicas. Para garantir a exatidão e a precisão analítica, padrões de controle de qualidade (QC) contendo concentrações conhecidas de flúor foram incluídos em cada série de medições. Esses padrões de QC foram processados e medidos da mesma forma que as amostras experimentais. Em todas as execuções, as concentrações medidas de flúor nos padrões de QC estiveram consistentemente dentro de 5% dos valores esperados. Para cada série de 10 a 20 amostras de espécimes, dois conjuntos independentes de 5 a 6 amostras de calibração foram preparados em paralelo com as amostras de espécimes, e uma curva de calibração foi registrada antes de cada sessão de medição. A faixa de calibração foi ajustada para cada execução para se aproximar das massas esperadas de flúor nas amostras de espécimes, o que dependia do tipo de espécime, da massa do material adicionado ao recipiente de difusão e do grupo de tratamento e idade do animal. Para medições de soro, os padrões de calibração correspondiam a concentrações de flúor de aproximadamente 0,06–1,20 ppm na amostra. Para medições de osso e dente, os padrões de calibração correspondiam a concentrações de flúor de aproximadamente 19–7.600 ppm na amostra.

Este protocolo fornece uma abordagem sensível e reprodutível para quantificar a massa de íon fluoreto em soro, osso e dentes, utilizando difusão facilitada por hexametildisiloxano seguida de análise por eletrodo seletivo a íons. O método capta com confiabilidade o fluoreto liberado de diversas matrizes biológicas e permite a avaliação quantitativa do acúmulo de fluoreto após exposição controlada. Resultados representativos de camundongos adolescentes e adultos demonstram diferenças claras dependentes da idade e da dose na deposição de fluoreto nos tecidos, destacando a utilidade desta abordagem para o estudo do metabolismo e da toxicocinética do fluoreto in vivo.

Uma característica fundamental deste protocolo é o uso de placas de difusão que separam fisicamente a reação de liberação de fluoreto do ambiente de captura do fluoreto. O design selado com petrolato minimiza a troca com a atmosfera e garante a captura eficiente dos íons fluoreto liberados por gotículas de hidróxido de sódio na tampa. O ácido sulfúrico saturado com HMDS fornece uma força motriz forte e constante para a liberação de fluoreto de tecidos mineralizados, incluindo estruturas altamente calcificadas como ossos e dentes. A medição subsequente por ISE, calibrada com padrões compatíveis por difusão, permite a quantificação precisa em uma ampla faixa dinâmica. Outra vantagem desta abordagem é a sua capacidade de quantificar fluoreto em amostras biológicas extremamente pequenas. Tecidos mineralizados de camundongos, particularmente incisivos mandibulares, produzem apenas 3–5 mg de cinza por dente. Métodos analíticos convencionais frequentemente exigem massas de amostra maiores ou teores mais altos de fluoreto para obter detecção confiável. Em contraste, o design baseado em difusão concentra todo o fluoreto liberado a partir do espécime inteiro em um volume pequeno e definido, permitindo a quantificação precisa mesmo em amostras minúsculas com baixa massa absoluta de fluoreto. Este recurso é particularmente valioso para estudos envolvendo animais pequenos, disponibilidade limitada de tecido ou estruturas mineralizadas microdissecadas.

Uma limitação primária deste método é o limite de detecção do eletrodo íon-seletivo (EIS) utilizado neste estudo (0,02 ppm). As amostras de soro de animais controle livres de flúor frequentemente ficaram abaixo desse limite, impedindo a quantificação de concentrações extremamente baixas de flúor. Pode ser necessário um aumento na massa ou volume da amostra adicionada à cápsula de difusão, se disponível, ou o uso de técnicas analíticas alternativas ao medir concentrações traço próximas ou abaixo do limite de detecção. Além disso, o método exige difusão durante a noite e manipulação cuidadosa de reagentes corrosivos, o que pode limitar a produtividade em estudos de alto volume. Embora o EIS permita quantificação sensível do flúor total, ele não consegue avaliar a distribuição espacial dentro dos tecidos. Abordagens complementares, como microscopia eletrônica de varredura acoplada à espectroscopia de raios X por dispersão de energia (MEV-EDS) ou emissão gama induzida por partículas (PIGE), podem ser incorporadas para visualizar e mapear a distribuição de flúor na escala micro a macro. Essas modalidades baseadas em imagem permitem a avaliação do acúmulo localizado de flúor em tecidos mineralizados ou moles, complementando assim as medições por EIS e fornecendo uma avaliação mais abrangente do conteúdo tecidual de flúor.

Vários fatores técnicos recorrentes podem influenciar a precisão e a confiabilidade da difusão e medição de fluoreto neste protocolo, e nossas observações destacam como a preparação da calibração, vedação da cuba de difusão, controle de pH, desempenho do eletrodo e manipulação das amostras moldam coletivamente a qualidade dos dados. Possíveis causas para uma curva de calibração não linear (R2 < 0,99) ou leituras de amostras de tecido fora da faixa esperada incluem erros de cálculo do volume da solução estoque de NaF adicionado à cuba de difusão ou erros de pipetagem durante a preparação dos padrões de calibração. Ação recomendada: Prepare pelo menos dois conjuntos independentes de amostras de calibração para cada ensaio, de modo que um conjunto reserva esteja disponível caso uma curva de calibração caia fora da faixa esperada. Uma vedação incompleta da cuba de difusão também pode causar perda de fluoreto durante a difusão, resultando em leituras artificialmente baixas. Isso geralmente ocorre quando é aplicada quantidade insuficiente de parafina líquida na borda da tampa da cuba de difusão. Ação recomendada: Aplique uma quantidade generosa de pomada de parafina ao redor da borda da tampa da cuba de difusão e pressione firmemente para garantir uma vedação completa. Erros de pipetagem ao adicionar a solução de ácido acético ao coletor de NaOH podem deslocar o pH da amostra para fora da faixa ótima de pH 5,0, levando a uma recuperação imprecisa de fluoreto. Ação recomendada: Verifique o pH de cada amostra com papel de pH e descarte qualquer amostra que esteja fora do pH 5. As amostras de calibração também podem cair fora dos limites válidos de registro do eletrodo seletivo a fluoreto. Concentrações abaixo de 0,02 ppm estão abaixo do limite de detecção do eletrodo. Ação recomendada: Não utilize amostras de calibração contendo menos de 0,02 ppm de fluoreto. Por outro lado, amostras de calibração com concentrações excessivamente altas de fluoreto podem alterar a força iônica da solução e produzir respostas não lineares do eletrodo. Ação recomendada: No início do projeto, prepare soluções de calibração abrangendo uma ampla faixa de concentração de fluoreto para determinar a faixa de trabalho linear do eletrodo específico em uso. Se as amostras de tecido excederem essa faixa linear, reduza a massa do tecido ou aumente o volume do coletor de NaOH e ajuste o volume de ácido acético proporcionalmente para manter o pH 5. Dificuldade em obter curvas de calibração lineares na faixa de 0,02–1 ppm: uma causa comum é o envelhecimento do eletrodo. Eletrodos seletivos a fluoreto mais antigos perdem sensibilidade em concentrações muito baixas de fluoreto. Ação recomendada: Substitua o eletrodo seletivo a fluoreto. Leituras instáveis do potenciômetro (sinal flutuante ou saltos) ocorrem tipicamente quando a superfície sensora do eletrodo não está totalmente imersa na solução da amostra. Ação recomendada: Abaixe o eletrodo para que a superfície sensora fique completamente coberta pela amostra líquida.

No geral, este protocolo fornece uma abordagem robusta, baseada em calibração, para quantificar fluoreto em diversas matrizes biológicas e é especialmente adequado para estudos que investigam exposição ao fluoreto, deposição tecidual e desfechos toxicológicos em modelos murinos.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência; Bolsas de Pesquisa no Exterior JSPS 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.) e pelo Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial dos Institutos Nacionais de Saúde; R01DE027648 (M.S.) e K02DE029531 (M.S.).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido Acético, GlacialSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
Crucíveis de AluminaAdvalue Technology12 mm OD × 25 mm H, AL-6212AL-6212
Balança AnalíticaVWRVWR 124B2, d = 0,1 mg—
Batedor de PerlasBenchmarkBeadBug 6—
Agulha de Seringa com Ponta RombaAmazonAgulha Industrial com Ponta Romba, 14 G × 0,5 polegadaX001TT8KX1
Dióxido de CarbonoAirGas——
Capa de Exaustão QuímicaMott ManufacturingModelo 7421040—
Sacarose D(+)Thermo Scientific99,7% para Bioquímica177142500
Solução de Preenchimento para EletrodoThermo ScientificOrion IonPlus Filling Solution900061
Solução de Álcool EtílicoKoptec140 Provas2401
Freezer, −80 °CThermo ScientificRevco Série RDE—
Luvas Resistentes ao CalorFisher ScientificBel-Art Clavies Luvas para Autoclavagem com Risco BiológicoH13201
Hexametildisiloxano (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
Peróxido de HidrogênioVWRJ.T. Baker, 30%2204-01
Eletrodo Seletivo a ÍonsThermo ScientificOrion Fluoride ISE, Canal Duplo9609BNWP
Misturador MagnéticoVWRAgitador 360—
MicroespátulaAmazonMicroespátula para Modelagem em Cera #7A, Aço Inoxidável—
MicrocentrífugaEppendorf5427R5404000131
Fornalha MuflaThermo ScientificThermolyne Pequena Fornalha Mufla de Bancada, 1,3 L, FB1315MFB1315M
EstufaBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
Solução de Paraformaldeído em PBSThermo Scientific4% de Paraformaldeído em PBSJ19943-K2
Placa de PetriVWR60 × 15 mm, Não Tratada25384-092
PetrolatoThermo ScientificPetrolato, Branco, Puro417090010
Papel Indicador de pHFisher ScientificpH-Fix 4,5–10,092120,3
Recipiente de PorcelanaFisher ScientificCrucível Fisherbrand, 5 mL, 20 mm de Altura, Forma AltaFB-965-B
PotenciômetroThermo ScientificOrion Dual Star Medidor de pH/ISE2115102
Suporte com GarrasVWRGarra de Anel, 15 cm470104-526
Dieta para RoedoresBio-ServF1515, AIN-76A, ½ PelotasF1515
Macaco de ParafusoAmazonMacaco de Laboratório—
Funil de SeparaçãoFisher ScientificEisco, Vidro Borossilicato, 2 LS89285
Cloreto de SódioFisher ScientificCertificado ACS, CristalinoS271-1
Fluoreto de SódioFisher ScientificCertificado ACS, PóS299-100
Hidróxido de SódioFisher ScientificPelotas BrancasBP359-500
Perlas de Aço InoxidávelFisher ScientificScientific Industries, 5 mm, 100 unidadesSI-CS05
Ácido SulfúricoFisher ScientificQualidade ACSA300-500
TISAB IIThermo ScientificOrion IonPlus Application Solution940909
Dessecador a VácuoFisher ScientificBel-Art Dessecador a Vácuo Space Saver, 10 polegadasF42010-0000
Filtro a VácuoFisher ScientificFiltro de Frasco com Tampa, PES, 90 mm, 0,2 µm597-4520
Rocker VariávelMidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

Referências

  1. Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x
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