Plataforma bioanalítica híbrida baseada em cultura celular 3D para imagem óptica utilizando esponjas de fibroína de seda

Resumo

O artigo descreve uma metodologia simples, acessível e reprodutível para a produção e cultivo de andaimes de seda de células de câncer de mama 4T1-iRFP720 sob condições de fluxo controlado, para apoiar a cultura dinâmica. O crescimento e a migração celular foram avaliados como prova de conceito usando um instrumento de imagem óptica in vivo como principal leitura não invasiva.

Resumo

Apresentamos uma inovadora plataforma híbrida bioanalítica projetada para a avaliação pré-clínica das características celulares. O sistema combina uma cultura celular tridimensional (3D) cultivada em uma matriz extracelular artificial com uma configuração de matriz inspirada em cromatografia. Esponjas, feitas da proteína estrutural fibroína seda, servem tanto como matriz extracelular biomimética quanto como fase estacionária. As esponjas de fibroína de seda eram produzidas internamente usando um processo em múltiplas etapas envolvendo a remoção das proteínas inerentes da sericina das fibras de seda bruta, seguida de dissolução e diálise para purificar a solução de fibroína, dissolução em solvente orgânico e subsequente colagem em leito de sal para gerar esponjas à base de seda com porosidade/poros controlados de 500–800 μm. Linhagens celulares de câncer de mama geneticamente modificadas 4T1-iRFP720 e 4T1-wt (controle não fluorescente) foram cultivadas em andaimes de seda usando um fluxo contínuo de meio via bomba, e seu crescimento e características celulares foram analisados de forma não invasiva usando técnicas de imagem óptica (instrumento de imagem óptica in vivo ). Ao unir as principais vantagens dos sistemas cromatográficos (automatização, reprodutibilidade) com a relevância biológica de culturas celulares avançadas em 3D, a plataforma possibilita a modelagem in vitro da arquitetura e morfologia semelhantes a tecidos, ao mesmo tempo em que facilita o monitoramento do comportamento celular dinâmico. Paralelamente, a aplicação da tecnologia de imagem médica permite monitoramento em tempo real e prolongado da migração e crescimento celular, entre outros fatores. Essa abordagem oferece um potencial substancial para investigar comportamentos celulares em escala macroscópica em um sistema de fluxo semelhante a laminar. Ao melhorar a relevância fisiológica dos modelos in vitro , esse método pode ajudar a preencher a lacuna translacional para estudos in vivo e é consistente com o modelo de reduzir, substituir, refinar (3R) para experimentação animal.

Introdução

Nos tecidos vivos, a migração e o crescimento celular ocorrem dentro de uma matriz extracelular (ECM) tridimensional e heterogênea, guiada por sinais biofísicos e bioquímicos, como o fluxo intersticial de fluidos e interações célula-célula. Esses fatores regulam a polaridade celular, a mecanotransdução e o movimento coordenado, sustentando processos biológicos-chave como reparo de tecidos e invasão do câncer 1,2,3,4.

Apesar de sua importância, a maioria dos ensaios de migração in vitro, como os ensaios scratch e Transwell, avalia o movimento de células únicas em substratos planos e estáticos. Embora simples e econômicas, essas abordagens 2D reproduzem mal as características estruturais e dinâmicas do microambiente in ^{vivo 5,6}. Essa limitação se torna particularmente crítica no contexto da metástase do câncer, onde células tumorais migram coletivamente através de matrizes teciduais mecanicamente e quimicamente^{diversas 3,7,8}. Embora os ensaios 2D scratch continuem populares por serem fáceis de realizar, eles não refletem a complexidade do ECM nem os efeitos do fluxo^{de fluido 6}. Abordagens baseadas em transwell fornecem leituras quantitativas, mas apenas em pontos finais fixos, impedindo a observação contínua da^{migração 6,9}.

Estudos recentes mostraram que o fluxo intersticial aumenta o potencial metastático, enquanto a rigidez e composição da ECM promovem a transição epitelial-mesenquimal e a migração^{coletiva 4,10}. Sistemas 3D mais avançados, como esferoides e organoides, aproximam melhor ambientes nativos de ECM; no entanto, seu uso é frequentemente limitado por variabilidade, acessibilidade experimental limitada e dificuldades na análise^{padronizada 11,12}. Plataformas microfluídicas oferecem controle superior sobre condições mecânicas e fluídicas, mas sua dependência de métodos e equipamentos especializados limita seu uso^{generalizado 13}. Portanto, recriar esses sinais integrados in vitro de forma controlada, acessível, não invasiva e econômica continua sendo um grande^{desafio 5,14}.

Para enfrentar esses desafios e preencher a lacuna entre ensaios 2D convencionais e modelos complexos in vivo , desenvolvemos uma plataforma celular 3D simples habilitada para fluxo, baseada em um andaime de esponja de fibroína de seda. O sistema emprega uma esponja de seda com propriedades mecânicas ajustáveis como um andaime semelhante a um ECM. A seda foi selecionada por sua estrutura porosa, que permite uma perfusão suave e sustenta um fluxo intersticial fisiologicamente^{relevante 15}. Sua biocompatibilidade e uso estabelecido em engenharia biomédica e de tecidos o tornam um material adequado para essa aplicação. Uma publicação recente demonstrou ainda mais o potencial de sustentabilidade ambiental e reciclagem do^{andaime 16}. Em outro estudo, demonstramos ainda mais sua adaptabilidade em diferentes modalidades de imagem, como a tomografia por emissão^{de pósitrons 17}. Esse trabalho anterior serviu como base para a descrição metodológica atual, na qual construímos sobre o mesmo conceito de plataforma em uma configuração simplificada baseada em imagem óptica in vivo . Juntos, esses estudos demonstram o potencial do sistema para avaliação multimodal baseada em imagem de construções teciduais engenheiradas e apoiam seu uso como uma plataforma experimental versátil para integrar cultura in vitro e leituras relevantes in vivo entre diferentes modelos de células cancerígenas.

Como prova de conceito, cultivamos células de câncer de mama 4T1 triplo negativo marcadas com iRFP720 dentro do andaime sob duas condições de fluxo de baixo estresse de cisalhamento por cinco dias. O monitoramento óptico não invasivo in vivo revelou padrões distintos de crescimento direcionado pelo fluxo e mudanças significativas na dinâmica da população celular em comparação com controles estáticos. Ao enfatizar a simplicidade e reprodutibilidade da engenharia, esse modelo oferece uma ponte prática entre ensaios 2D e estudos in vivo , permitindo que pesquisadores examinem, em escala macroscópica e não invasiva, características celulares mediadas por fluxo em um formato fisiologicamente relevante, porém acessível. Diferentemente de metodologias anteriores, que frequentemente dependem de análises destrutivas de endpoints ou não possuem critérios padronizados de seeding, esse protocolo introduz uma estrutura sistemática para otimizar a produção de andaimes e, em seguida, a seed e a imagem de células. Essa abordagem aprimora a robustez experimental e oferece uma visão mais abrangente e longitudinal da dinâmica celular coletiva dentro de matrizes 3D, representando um refinamento significativo em relação aos métodos existentes para monitoramento de crescimento e migração.

Protocolo

A primeira seção descreve a preparação de andaimes de fibroína de seda com base em trabalhos publicados^{anteriormente 16}. As seções seguintes descrevem a otimização da densidade de semeadura celular, integração do fluxo e imagens ópticas para monitoramento do movimento e crescimento celular. Este estudo utilizou exclusivamente linhagens celulares estabelecidas de câncer de mama murino (4T1-wt e 4T1-iRFP720) e não envolveu participantes humanos, amostras de pacientes, tecidos primários ou animais vivos. De acordo com as diretrizes institucionais e nacionais, não era necessária aprovação ética. Uma visão geral esquemática do fluxo de trabalho é mostrada na Figura 1.

1. Preparação da esponja de fibroína de seda

1. Limpeza e desembudamento de casulos.
   1. Corte os casulos do bicho-da-seda Bombyx mori L. usando um bisturi de segurança.
   2. Remova as larvas e extraia a camada mais interna do casulo (camada compacta que envolve diretamente a cavidade larval) usando uma agulha de dissecação padrão.
   3. Encha um béquer com 1,6 L de água duplamente destilada (ddH₂O).
   4. Adicione uma barra magnética e leve a água até ferver enquanto mexe; Cubra o béquer com papel alumínio para acelerar o aquecimento e reduzir a perda de água.
   5. Adicione 3,4 g de Na₂CO₃ quando a temperatura da água atingir aproximadamente 70 °C.
   6. Quando a mistura começar a ferver, coloque 4 g de casulos preparados na solução e mexa com uma vara de vidro.
   7. Ferva os casulos por 30 minutos, mexendo com uma vareta de vidro a cada 10 minutos para garantir a exposição adequada.
   8. Remova a seda da solução e enxágue várias vezes com água da torneira para remover o restante da sericina.
   9. Esprema água em excesso e espalhe as fibras de seda em uma panela de papel alumínio pronta.
   10. Seque as fibras de seda em um forno pré-aquecido a 50 °C até que estejam completamente secas (aproximadamente 18 h).
2. Dissolução e diálise
   1. Use etanol absoluto e_{CaCl 2} anidro para as etapas seguintes. A matriz de dissolução consiste em 1 parte de CaCl₂, 2 partes de etanol e 8 partes de_{ddH 2}O. A proporção de seda seca desgomada para matriz de dissolução é 1:10 [p/w].
   2. Pese a seda seca e, consequentemente, calcule as quantidades corretas dos componentes para a matriz de dissolução.
   3. Encha a quantidade correspondente de_{CaCl 2} em um frasco de fundo arredondado equipado com barra de mexer.
   4. Meça a quantidade necessária de etanol e_{ddH 2O}e combine os dois.
   5. Adicione a mistura de etanol-ddH₂O ao_{CaCl 2} enquanto mexe.
   6. Monte um aparelho de refluxo e aqueça a mistura a 100 °C em um banho de óleo, permitindo que o CaCl₂ se dissolva e levando a mistura até ferver.
   7. Quando a mistura começar a ferver, adicione a seda seca e aqueça sob refluxo por 45 minutos.
   8. Prepare tubos de diálise de celulose de 3,5 kDa com 15 cm de comprimento, enxaguando-os várias vezes com água para reidratar, depois prenda uma extremidade enrolada em uma haste de vidro com um clipe de vedação.
   9. Após ferver, transfira a solução de seda quente para o tubo e fele a outra extremidade com um clip, deixando um espaço de 2–3 cm entre o líquido e o clipe de vedação, sem envolvimento de ar.
   10. Coloque o tubo de diálise cheio em um béquer de 2 L cheio de ddH_2Oe realize a diálise em temperatura ambiente por 72 horas, trocando a água duas vezes ao dia para garantir uma purificação eficaz.
   11. Centrifuge a solução a 4500 × g por 10 minutos em temperatura ambiente.
   12. Despeje suavemente o sobrenadante em tubos centrífugas sem mexer no pellet, e armazene os tubos a -20 °C.
       NOTA: Encha os tubos da centrífuga até no máximo metade da capacidade e congele-os na posição horizontal.
3. Liofilização
   1. Pré-aqueça a bomba de vácuo por 20 minutos e opere o liofiliador conforme as instruções do fabricante.
   2. Coloque os tubos congelados da centrífuga diretamente fora do freezer em um frasco de fundo arredondado.
   3. Prenda o frasco ao liofilizador e liofilize por 24 horas.
   4. Até o uso adicional, armazene a fibroína sedosa liofilizada em um local seco em temperatura ambiente.
4. Fundição de solventes e lixiviação de partículas
   1. Adicione a quantidade necessária de seda liofilizada ao 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol (HFIP) em um recipiente de amostra de urina sob uma exaustão para obter uma solução de 16% [p/v] com volume final de 30 mL, e feche o recipiente com uma tampa.
      ATENÇÃO: HFIP é corrosivo e prejudicial se inalado, ingerido ou absorvido pela pele; Manuseie o solvente em uma exaustão enquanto use o equipamento de proteção individual (EPI) adequado, evitando contato com pele, olhos e vapores. Em caso de vazamento, recolha o líquido usando materiais absorventes e limpe as áreas afetadas. Transfira materiais contaminados para recipientes designados para resíduos perigosos.
   2. Feche o recipiente bem e coloque-o no agitador orbital a 70 rpm por 18 horas para permitir que a seda se dissolva.
   3. Peneirar NaCl usando diferentes malhas e reservar a fração de 500–800 μm.
   4. Encha uma placa de Petri (9 cm de diâmetro, 8,5 cm de diâmetro do fundo) com 100 g do sal peneirado (fração de 500–800 μm), resultando em uma altura de 1,2 cm. Certifique-se de que a superfície esteja nivelada de forma uniforme.
   5. Despeje suavemente 25,5 mL da solução de seda preparada sobre a cama de sal (porogênio para formação de poros esponjosos).
   6. Cubra a placa de Petri com a tampa e coloque-a sobre um shaker orbital por 10 minutos a 70 rpm para uma infiltração uniforme da solução de seda no leito de sal.
   7. Incube a placa de Petri a 37 °C por 1 hora com a tampa fechada; em seguida, incubar a placa de Petri descoberta a 37 °C por mais 18 horas.
   8. Para induzir a formação de folhas beta, mergulhe o compósito de seda em um béquer contendo metanol por 20 minutos, depois retire-o e seque em forno a 50 °C (aproximadamente 1 hora).
      ATENÇÃO: O metanol é altamente tóxico; Manuse-se em uma exaustão enquanto usa o EPI adequado, evite contato com a pele e exposição ao vapor. Em caso de vazamento, recolha o líquido usando materiais absorventes e limpe as áreas afetadas. Transfira materiais contaminados para recipientes designados para resíduos tóxicos.
   9. Remova o NaCl porogênico mergulhando o compósito de seda em um béquer contendo água morna da torneira por pelo menos 3 horas, com troca de água a cada 20–30 minutos até que o material adquira uma textura macia e esponjosa, sem partes duras restantes.
   10. Armazene a esponja de seda em etanol 70% para desinfecção e preservação de curto prazo a 4 °C.
       NOTA: Soluções contendo HFIP foram coletadas como resíduos solventes halogenados, enquanto resíduos de metanol foram descartados separadamente como resíduos de solventes orgânicos não halogenados, conforme as diretrizes institucionais de segurança química. Para a descontaminação pós-uso, recipientes e superfícies de trabalho expostos ao HFIP ou metanol foram enxaguados com um solvente compatível e limpos com uma solução detergente. As lavagens iniciais e os consumíveis contaminados foram coletados como resíduos químicos perigosos.

2. Preparação e equilíbrio de andaimes de seda

1. Corte esponjas de fibroína de seda usando um punção de biópsia de 6 mm de diâmetro para obter andaimes cilíndricos de 6 mm de diâmetro e 12 mm de altura.
   NOTA: Andaimes de esponja de fibroína de seda preparados podem ser armazenados em etanol de 70% a 4 °C até 4 meses; Para armazenamento prolongado, recomenda-se a substituição periódica por etanol novo. Andaimes equilibrados podem ser armazenados em meio de cultura celular a 4 °C por até 1 mês.
2. Coloque as amostras nos tubos da centrífuga com etanol a 70% para desinfecção.
3. Realize as etapas seguintes em um gabinete certificado de segurança biológica para evitar contaminação.
4. Aspire etanol usando uma pipeta enquanto pressiona a esponja com uma pinça.
5. Coloque as esponjas em uma placa de Petri contendo 10–20 mL suplementado com meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 para imergi-las completamente.
6. Troque a mídia três vezes com um pequeno sacudido entre cada troca.
7. Após a terceira lavagem, adicione um novo substrato, feche bem a tampa e enrole com filme de parafina.
8. Guarde as esponjas por pelo menos uma semana na geladeira a 4 °C antes de usarem para cultura celular. Durante esse período, troca de mídia 4 a 5 vezes.
   NOTA: Garanta a remoção completa do etanol, pois o etanol residual é citotóxico e prejudica a fixação e viabilidade celular.

3. Medição de fundo e otimização de imagens

1. Transporte tubos de filtração vazios opticamente transparentes e tubos de filtração opticamente transparentes contendo andaimes de seda não semeados para a imagem óptica in vivo .
   NOTA: A imagem foi realizada usando imagem óptica in vivo em modo epifluorescência 2D.
2. Realize imagens em diferentes pares de filtros (excitação: 675 nm, 745 nm; emissão: 720 nm, 800 nm), tempos de exposição (4–60 s), números de f-stop (1–8), campo de visão (13,5–22,5 cm) e níveis variáveis da lâmpada (baixo e alto).
3. Avalie a autofluorescência imaginando ambas as plataformas sob condições idênticas antes de usar andaimes com semeadura celular.
4. Substitua a entrada Luer-lock macho por um conector Luer-lock fêmea de corte para configurações apenas de imagem, eliminando artefatos de autofluorescência de alta intensidade do conector Luer-lock macho. Se os materiais forem os mesmos para todos os experimentos, essa etapa é necessária apenas uma vez.
    

4. Preparação de suspensões celulares e semeadura em andaimes de fibroína de seda

NOTA: Realize todas as etapas subsequentes em um armário de segurança biológica sob condições estéreis, pois esses procedimentos envolvem o manuseio de células vivas e amostras contendo células.

1. Monitore regularmente células de câncer de mama triplo triplo de mama murinos 4T1 (4T1-iRFP720) e 4T1-iRFP720 para contaminação e estabilidade da expressão de iRFP720.
2. Mantenha células de câncer de mama murino triplo negativo 4T1-wt e 4T1-iRFP720 em meio RPMI-1640 suplementados com 10% de soro fetal para panturro, 1% de L-glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂.
3. Células de passagem em aproximadamente 80% de confluência usando 0,25% de tripsina-EDTA, seguindo procedimentos padrão de cultura asséptica de células.
4. Use números de passagens idênticos e condições de cultivo para células 4T1-wt e 4T1-iRFP720 em todos os experimentos comparativos.
5. Prepare uma densidade de semeadura de células variando de 5 × 10⁴ a 5 × 10⁷ células/mL (correspondente a uma faixa de 1 × 10⁴ a 1 × 10⁷ células por 200 μL). Prepare as seguintes concentrações para análise por imagem para avaliar a intensidade do sinal entre diferentes densidades celulares e determinar a concentração ideal: 5 × 10⁴, 3,38 × 10⁵, 6,25 × 10⁵, 1,25 × 10⁶, 2,5 × 10⁶, 3,75 × 10⁶, 5 × 10⁶, 1,25 × 10⁷, 2,5 × 10⁷ e 5 × 10⁷ células/mL.
6. Prepare suspensões correspondentes de células 4T1-wt na mesma faixa de concentração das células 4T1-iRFP720 para servir como controles não fluorescentes.
7. Coloque andaimes individuais (preparados na Seção 2) em placas de Petri estéreis e não tratadas.
   NOTA: Use placas de Petri não tratadas para minimizar a fixação celular na superfície plástica e promover a ligação celular ao andaime de seda.
8. Remova o excesso de meio ao redor de cada andaime e do andaime usando uma pipeta, tomando cuidado para não deformar a estrutura.
9. Pipete 200 μL da suspensão da célula apropriada diretamente sobre a superfície superior de cada andaime, garantindo que todo o volume seja absorvido pelo andaime.
10. Incube andaimes por 4 horas a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de_CO-2 sem perturbar os pratos para permitir a fixação celular.
11. Após 4 h, transfira cuidadosamente cada andaime com semente celular para um poço de uma placa de 24 poços contendo 1 mL de meio completo pré-aquecido.
12. Incube andaimes durante a noite (16–24 h) a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂.

5. Montagem de plataformas de calibração com frits

NOTA: Realize todas as etapas de montagem em um gabinete de segurança biológica usando luvas estéreis, pinças estéreis e ferramentas estéreis.

1. Remova andaimes de seda com semente celular das placas de 24 poços usando pinças estéreis, apoiando cada andaime suavemente para evitar compressão.
2. Insira um andaime com semeadura celular na parte inferior de um tubo de extração em fase sólida opticamente transparente usando uma haste de empurrar estéril.
3. Coloque uma frita de polietileno estéril diretamente acima do andaime usando a haste de empurrar.
   NOTA: Use fritas de polietileno apenas durante a otimização do sinal, pois seu tamanho de poros é menor que o diâmetro da célula e impede a migração da célula ou qualquer outro contato célula-célula. Isso também permite a separação clara do sinal, possibilitando a identificação da concentração exata das células correspondente a cada sinal.
4. Repita a sequência de empilhamento, um andaime seguido por um frit, até que cinco andaimes com seed de células e cinco frits sejam inseridos.
5. Feche a parte inferior do tubo de filtragem com um conector Luer-lock fêmea estéril.
6. Feche a parte superior do tubo de extração com um conector Luer-lock macho estéril.

6. Otimização de sinal por instrumento de imagem óptica in vivo usando plataformas de calibração com frits (apenas uma vez para validação do sistema)

1. Transportar plataformas com semeadura celular para calibração para a sala de imagem óptica in vivo dentro de uma caixa escura à prova de luz para proteger as células fluorescentes do fotobranqueamento.
2. Prepare a imagem óptica in vivo de acordo com a segurança institucional e os procedimentos operacionais.
3. Coloque plataformas montadas e semeadas por células na etapa de imagem.
4. Adquirir imagens de epifluorescência 2D usando excitação a 675 nm e emissão a 720 nm e otimizar parâmetros de imagem, incluindo tempo de exposição, fator de binning e número f, para alcançar a máxima intensidade do sinal dentro da faixa linear de detecção (ver Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2).
5. Incluir pelo menos um tubo de extração opticamente transparente contendo andaimes semeados com células 4T1-wt em densidades celulares correspondentes como controle de referência não fluorescente.
6. Adquira imagens de todas as amostras usando configurações idênticas de aquisição para permitir a comparação quantitativa da intensidade de fluorescência (veja Figura Suplementar 3 e Figura Suplementar 4).
7. Quantifique sinais de fluorescência usando software de análise de imagem óptica in vivo e determine a densidade ótima de semeadura celular (ou seja, 5 × 10⁶ células por andaime) que forneça o máximo sinal sem saturação (veja a Figura Suplementar 5).
   NOTA: As configurações finais do sistema de imagem óptica in vivo foram selecionadas com base em experimentos de otimização para garantir a aquisição de sinal dentro da faixa dinâmica linear do sistema, evitando a saturação da capacidade de andaime e mantendo uma relação sinal-fundo estável entre as condições experimentais e de controle. Com base em configurações otimizadas, semear todos os biorreatores experimentais com 5 × 10⁶ células/andaimes. Realize imagens em modo epifluorescência 2D com as seguintes configurações: excitação: 675 nm (largura de banda 30 nm); emissão: 720 nm (largura de banda 20 nm), tempo de exposição: 10 s, fator de binning: 8, número f: 8.

7. Montagem experimental de plataforma (sem frits)

1. Após a otimização do sinal, sementes andaimes experimentais com a densidade ideal de células determinada (ou seja, 5 × 10⁶ células/200 μL, veja a seção 4).
2. Montar a plataforma experimental usando um total de cinco esponjas de seda: um andaime com semente celular e quatro andaimes vazios sem fritas de polietileno para permitir a comunicação celular.
3. Sele o topo do tubo de filtragem com um conector Luer-lock macho estéril.
4. Configure o sistema de cultura para condições de cultura estáticas ou dinâmicas
   1. Cultura estática: Sele a porta inferior com um conector Luer-lock fêmea estéril. O sistema é então colocado em um tubo centrífugo com uma tampa mal ajustada.
      NOTA: Como o Luer-lock macho possui uma abertura, essa configuração permite a troca de gases enquanto minimiza o risco de contaminação. Nesse sistema, a mídia é trocada manualmente no capô uma vez por dia.
   2. Cultura dinâmica: Conecte a porta inferior a um tubo estéril e conecte a linha de entrada ao Luer-lock macho na porta superior para permitir a cultura por perfusão. Forneça e remova continuamente o meio usando um sistema de bombas peristálticas (Figura Suplementar 6).

8. Cultura dinâmica na plataforma

1. Comece a desinfecção da bomba e dos tubos associados lavando com etanol a 70% no fluxo máximo por 10 minutos.
2. Enxágue a bomba e o tubo com meio completo estéril por pelo menos 10 minutos para remover o etanol residual. Substitua por meio fresco e continue a perfusão por mais 10 minutos para garantir o equilíbrio completo do sistema antes do uso.
   NOTA: Certifique-se de que todos os componentes estejam totalmente cheios com meio e livres de bolhas de ar antes da semeadura das células.
3. Conecte a entrada Luer-lock macho (topo) do reator montado à linha de saída da bomba usando tubos estéreis e conectores Luer-lock.
4. Conecte a entrada da bomba a um reservatório estéril contendo meio completo.
5. Conecte a saída do reator (inferior) ao reservatório do meio para estabelecer um circuito de perfusão de recirculação. Essa configuração permite a perfusão contínua do meio através do andaime, mantendo um sistema em malha fechada.
   NOTA: Neste protocolo, a perfusão é realizada usando uma configuração de recirculação, onde o meio é continuamente alternado entre o reservatório e o reator. Essa abordagem minimiza o consumo de meio enquanto mantém o fluxo contínuo.
6. Defina a vazão desejada na bomba para atingir a tensão nominal de cisalhamento da parede (por exemplo, 1 dyn/^{cm 2} e 4 dyn/cm²), usando o raio interno do canal ( = 3 mm) com base na suposição do escoamento de Poiseuille¹⁹:
   
   onde τ é a tensão de cisalhamento da parede (dyn/cm²), e Q é a vazão volumétrica (cm³/s), é a viscosidade do fluido do meio RPMI-1640 (0,958 × 10-3 N·s/^{m 2} a 37 °C)²⁰. Embora o sistema real contenha um andaime de seda poroso e, portanto, se desvie dessa geometria idealizada, os valores calculados foram usados como referências operacionais padronizadas para permitir comparações reprodutíveis entre condições de fluxo. As vazões correspondentes eram de 0,133 mL/min e 0,531 mL/min e eram usadas como condições de perfusão para o cultivo.
7. Inicie a perfusão e monitore o sistema para vazamentos, formação de bolhas e fluxo estável.
8. Inicie a perfusão com inibidor de migração ou um composto de teste (por exemplo, Cucurbitacina E (CuE) a 0,05 μmol/L em meio completo) ou sem (controle) e mantenha todo o conjunto a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ até cinco dias. Portanto, conecte a entrada da bomba a um reservatório estéril contendo meio completo, incluindo o respectivo composto de teste, e inicie a bomba com configurações semelhantes às usadas anteriormente.
   NOTA: Garanta a remoção completa do etanol da bomba e dos tubos realizando as etapas definidas de lavagem do meio. Descarte a fração inicial do meio após o enxágue antes de conectar aos reatores com semente de células e certifique-se de que o sistema esteja totalmente preenchido com meio fresco e livre de bolhas de ar.

9. Imagem de fluorescência da plataforma experimental

1. Pare a bomba, desconecte todos os tubos mantendo condições estéreis.
2. Sele a parte inferior do tubo SPE usando um conector Luer-lock fêmea, coloque todo o sistema em um tubo centrífugo estéril de 50 mL e feche o tubo de forma segura.
3. Transfira o sistema para um gabinete de biossegurança para continuar todas as etapas subsequentes. Dentro do capô, substitua o conector Luer-lock macho por um conector Luer-lock fêmea cortado para fechar completamente o sistema.
4. Coloque o sistema selado de volta em um tubo centrífugo estéril de 50 mL e feche o tubo com segurança para transporte.
   NOTA: Dependendo das condições laboratoriais, o fluxo não precisa ser interrompido para a obtenção de imagens quando o sistema está apertado. No entanto, isso não era possível sob os contextos experimentais fornecidos.
5. Transporte reatores selados para a sala do sistema de imagem óptica in vivo , dentro de uma caixa escura à prova de luz, para proteger as células fluorescentes do fotobranqueamento.
6. Coloque os reatores no palco do sistema óptico de imagem in vivo , no suporte apropriado.
7. Adquira imagens de epifluorescência 2D usando os parâmetros previamente otimizados (ou seja, excitação 675 nm, emissão 720 nm, tempo de exposição 10 s, binning 8, número f 8).
8. Inclua controles de reator com semeamento 4T1-wt, não semeado e controles de reator vazios para cada sessão de imagem.
9. Quantifique sinais de fluorescência usando análise de imagem óptica in vivo .
10. Plote os resultados quantitativos dos grupos controle e de tratamento e gere gráficos comparativos para visualizar o efeito do composto de teste no resultado medido.

10. Análise de imagens da plataforma experimental

1. Adquira imagens de fluorescência nos dias 0, dia 3 e dia 5 e analise usando software de análise de imagens.
2. Para cada imagem, realize calibração espacial antes da análise. Meça o comprimento físico conhecido da plataforma experimental em pixels usando a ferramenta linha e insira a distância correspondente do mundo real (85 mm) via Analyze > Set Scale para definir a conversão de pixel para comprimento.
3. Após a calibração, quantifique a área fluorescente delineando manualmente a região de interesse (ROI) usando a ferramenta de seleção à mão livre.
4. Para minimizar o viés do usuário, delinee os ROIs usando critérios visuais consistentes baseados na intensidade do sinal de fluorescência em relação ao fundo. Realize todas as análises sob configurações idênticas e, sempre que possível, tenha um único operador treinado para realizar a análise.
5. Identifique o sinal fluorescente como regiões brilhantes claramente distinguíveis do fundo escuro nas imagens de análise de imagem óptica in vivo e use esses sinais para guiar a segmentação manual consistente.
6. Meça as regiões selecionadas usando Analisar > Medir e registrar os valores da área para cada ponto de tempo. Repita esse procedimento para todas as imagens de todos os grupos experimentais.
7. Normalize as medições de área para o valor correspondente do Dia 0 para cada amostra usando um software de planilha para considerar diferenças no tamanho inicial e expresse os resultados como variação de dobra em relação à linha de base (Dia 0 = 1).

11. Análise estatística

1. Realize todos os experimentos pelo menos em triplicado.
2. Repita todos os experimentos pelo menos três vezes (n = 3), determine os valores médios, bem como os desvios padrão (DS).
3. Determine significância estatística usando ANOVA bidirecional seguida do teste de comparação múltipla de Tukey com α = 0,05.

Resultados

Este protocolo descreve uma plataforma amigável e de baixo custo para observação macroscópica do crescimento e movimento celular em um ambiente 3D fisiologicamente relevante. O método utiliza esponjas de fibroína de seda como imitador de ECM e incorpora fluxo intersticial controlado para modelar condições dinâmicas dos tecidos. Uma visão geral esquemática dos procedimentos passo a passo, desde a fabricação de esponja de seda e andaimes até a semeadura de células e montagem experimental d...

Discussão

O processo de produção de esponjas de seda descrito neste protocolo é padronizado, garantindo a fabricação reprodutível de andaimes, conforme relatado em um estudo^{anterior 16}. A produção de esponjas sob condições totalmente padronizadas, como altura/quantidade do leito de sal, volume de solução de seda e incubação de metanol, é crucial para obter esponjas uniformes e comparáveis. As esponjas produzidas precisam seguir os critérios do protocolo de controle de quali...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol (HFIP)	Sigma-Aldrich	8.04515	Cuidado: Perigoso. Usado para dissolução de seda liofilizada
24-Well plate	Cellstar, Greiner Bio-One	662102	Armazenamento de scaffolds com células durante a incubação
4T1-iRFP720 murine triple-negative breast cancer cells	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), University of Vienna	N/A	Experimentos de cultura celular; 4T1-iRFP720 foi derivado internamente a partir da linhagem 4T1 (ATCC: CRL-2539)
4T1-wt murine triple-negative breast cancer cells	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), University of Vienna	ATCC: CRL-2539	Experimentos de cultura celular
Bruker Alpha Compact FTIR with Platinum-ATR Sampling Module	Bruker	A220/D-01	Análise FT-IR
Calcium chloride, anhydrous, >93% reagent grade	Sigma-Aldrich	902179	Para a preparação da matriz de dissolução
Cell culture flask, T25	Cellstar, Greiner Bio-One	690175	Consumíveis; para cultivo celular
Cell culture flask, T75	Cellstar, Greiner Bio-One	658175	Consumíveis; para cultivo celular
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	5805000010	Usado para separação de amostras por centrifugação
Combi-stopper (female Luer-lock connector)	Braun Melsungen AG	4495101	Usado para a montagem da plataforma
Cucurbitacin E	Sigma-Aldrich	SML0577	Inibidor de migração celular
Dermal biopsy puncher, Ø 6 mm	Dahlhausen	1190001006	Usado para obtenção de scaffolds esponjosos cilíndricos
Dialysis tubes (3.5 kDa, cellulose)	Spectra/Por by Spectrum Labs	SPEC132724	Para diálise da solução de fibroína de seda
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Para manutenção de células
Ethanol, absolute	Merck	1.07017	Para a preparação da matriz de dissolução
Excel	Microsoft	v2604	Organização de dados, cálculos básicos e plotagem
Fetal calf serum (FCS) heat inactivated	Biowest	S181H-500	Suplemento para meio de cultura celular
Fiji (former ImageJ)	Open source (https://imagej.net/software/fiji/)	N/A	Processamento e análise de imagens
GraphPad Prism	GraphPad Software	v8.2.1	Análise estatística e geração de gráficos
HPLC pump Hitachi L-7120 LaChrom	Merck	K-5244	Para condições de cultura dinâmica na plataforma montada
IVIS 200 Spectrum CT system	PerkinElmer	128201	Sistema de imagem óptica com capacidade de TC
IVIS Living Image Software	PerkinElmer	v4.5.2	Software para aquisição, visualização e análise quantitativa de dados de imagem IVIS
JEOL JSM-6510 Scanning electron microscope	JEOL GmbH	JSM-6510	Imagens SEM
L-glutamine, 200 mM solution, suitable for cell culture (L-Glu)	Sigma-Aldrich	G7513	Suplemento para meio de cultura celular
Lyophilizer Alpha 2-4 LD Plus	Martin Christ	101542	Para liofilização de fibroína de seda
Male Luer-lock connector	Supelco (Sigma-Aldrich)	57020-U	Adaptador para reservatórios de amostras
Methanol, >99.9 %, HPLC Gradient Grade	Carl Roth	7342.1	Cuidado: Tóxico. Indução da formação de beta-folhas em compósitos de seda
Optically transparent Solid Phase Extraction (SPE) tubes without frits	Sigma Aldrich	57240-U	Usado para montagem da plataforma
OPUS Spectroscopy software	Bruker	v7.5	Análise FT-IR
Orbital and Linear Shaker MI0103002	Four E’S Scientific	MI0103002	Distribuição/mistura uniforme
Parafilm PM996	Sigma-Aldrich	P7793	Para vedar/embrulhar placas e recipientes para armazenamento (por exemplo, refrigeração)
Penicillin-Streptomycin, liquid, suitable for cell culture (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	Suplemento para meio de cultura celular
Petri dish, 9 cm	VWR	391-0598	Para moldagem de esponja em leito de sal; para semeio em scaffolds de seda
Polyethylene frits for 1 mL SPE tubes	Supelco (Sigma Aldrich)	57244	Usado para montagem da plataforma
RPMI-1640 Medium, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	R0883	Meio suplementado é usado para equilíbrio da esponja de seda, manutenção de cultura celular e experimentos relacionados
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt	86.1254.025	Consumíveis; para manutenção de células
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt	86.1685.020	Consumíveis; para manutenção de células
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt	86.1253.025	Consumíveis; para manutenção de células
Silk cocoons of Bombyx mori L.	Sericulture and Agriculture Experimental Station, Vratsa, Bulgaria	N/A	Matéria-prima para a produção de esponja de fibroína de seda
Sodium carbonate, anhydrous, >99.5% ACS	VWR	11552.A3	Usado para degomagem química, ou seja, remoção de sericina
Sodium chloride, >98%, technical	VWR	27788.366	Para moldagem de esponja em leito de sal
SPE Column Push Rod	Carl ROTH	36P9.1	Usado para montagem da plataforma
Stainless steel analytical sieves, 500 μm (ISO 3310-1)	ATECHNIK GmbH	200.050.222-046	Para peneiragem de NaCl
Stainless steel analytical sieves, 800 μm (ISO 3310-1)	ATECHNIK GmbH	200.050.222-051	Para peneiragem de NaCl
Sterile injectomat line (Tubing), 150 cm, PE	Fresenius Kabi	9004132	Usado para condições de cultura dinâmica
Trypsin - EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3