Deterioração dependente do tempo da motilidade do esperma e da integridade do DNA durante exposição prolongada ao sêmen

Resumo

A fragmentação do DNA do esperma aumentou e a motilidade diminuiu significativamente com a exposição prolongada ao sêmen após a ejaculação. Em 14 amostras normais, a fragmentação do DNA aumentou 5,5%, 11,5% e 16,1% em 1h, 2h e 4h, respectivamente, enquanto a motilidade diminuiu. Esses achados apoiam a minimização dos atrasos na coleta e processamento do sêmen fora do local.

Resumo

A fragmentação do DNA espermatozoide é conhecida por ser prejudicial à qualidade do esperma, o que pode impactar negativamente os ciclos da tecnologia de reprodução assistida (TAR). Examinar a fragmentação do DNA do esperma (SDF) no fluido seminal ao longo do tempo pode fornecer insights sobre os efeitos da exposição prolongada ao sêmen na integridade do DNA do espermatozoide. Neste estudo preliminar, um ensaio SDF foi realizado em vários momentos para simular condições de coleta de sêmen fora do local, usando o ensaio de dispersão de cromatina espermática em 14 amostras normais de sêmen. A análise estatística dos percentuais de fragmentação do DNA ao longo da duração do ensaio mostrou que a estagnação prolongada do fluido seminal, desde a ejaculação até a análise de sêmen, aumentou significativamente a fragmentação do DNA. A motilidade média dos espermatozoides foi significativamente reduzida em 7,4% em 1 hora, 14,5% em 2 horas e 18,7% em 4 horas, e a FDS média aumentou significativamente 5,5% em 1 hora, 11,5% em 2 horas e 16,1% em 4 horas após a coleta de sêmen. Essa diminuição na qualidade do esperma ao longo do tempo pode informar os protocolos das clínicas de fertilidade ao considerar a preparação do esperma para ciclos de ART, especialmente quando a coleta ocorre fora do laboratório de andrologia. Os laboratórios podem considerar estabelecer um prazo aceitável para receber sêmen proveniente de coleta fora do local.

Introdução

A Organização Mundial da Saúde (OMS) identifica uma em cada seis pessoas, ou 17,5% da população mundial, como tendo sofrido de infertilidade em algum momento de sua^{vida 1}. Aproximadamente 20% dos casos de infertilidade têm um diagnóstico exclusivo de infertilidade por fator masculino, com outros 30–40% dos casos tendo fator masculino como diagnóstico^{secundário 2}. Mesmo em homens saudáveis, os parâmetros seminais podem variar muito de pessoa para pessoa, incluindo flutuações na concentração, motilidade, morfologia e^{vitalidade 3}. Portanto, é importante entender os fatores específicos que comprometem a fertilidade masculina para fornecer o tratamento adequado em um ambiente clínico.

Uma área de pesquisa em desenvolvimento é o efeito da integridade do DNA do esperma nos ciclos 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. O manual laboratorial da OMS para exame e processamento de sêmen humano, 5ª edição, afirma que a fragmentação do DNA espermatozoide (SDF) (seja por quebra de fita simples ou dupla) pode afetar o desenvolvimento embrionário, a implantação e os desfechos da^{gravidez 14}. Muriel et al. realizaram uma análise da SDF e descobriram que o aumento da SDF resultou em taxas de fertilização, qualidade embrionária e taxas de implantação prejudicadas nos ciclos de^{ART 10}. No entanto, é necessário entender melhor o que causa a fragmentação do DNA.

Estudos anteriores relatam que o estresse oxidativo pode levar à diminuição da motilidade dos espermatozoides, deterioração da produção e função enzimática e, mais significativamente, danos ao^{DNA 8}. Esse dano ao DNA pode incluir, mas não se limita a, deleções gênicas, traduções incorretas e SDF. Atualmente, ensaios SDF são usados para avaliar a integridade do DNA do esperma. Embora estudos tenham correlacionado criopreservação, manuseio de meios e estresse oxidativo com SDF, pouco se sabe sobre SDF no período desde a ejaculação até^{a análise 4,5}. Este é um momento crítico na vida útil dos espermatozoides, dado o aumento da prevalência de coletas domésticas de espermatozoides para preparação de espermatozoides nos ciclos^{ART 15}. As cobranças domiciliares se tornaram cada vez mais populares durante a pandemia de COVID-19, pois limitam o contato direto com o paciente e aumentam o conforto e a conveniência. No entanto, não existem diretrizes específicas que sugiram um momento ideal desde a ejaculação até a análise para as coleções domiciliares. Assim, o objetivo principal do nosso estudo foi entender se a SDF muda ao longo do tempo em fluidos seminais estagnados e se tais mudanças podem ser relevantes para o manuseio de amostras de ART.

Protocolo

O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional dos Hospitais Universitários (STUDY20201371). O consentimento informado foi obtido de todos os participantes envolvidos no estudo. Quatorze amostras de sêmen foram selecionadas de pacientes em um único centro acadêmico de fertilidade no nordeste de Ohio. Todas as amostras analisadas neste experimento foram coletadas no local, em nossa instalação. Testes de dispersão de cromatina espermática foram realizados em amostras de sêmen por um andrologista totalmente treinado, de acordo com as instruções do fabricante, para minimizar a variação interpessoal. Com este kit, espermatozoides frescos intactos, não fixados foram imersos em um microgel inerte de agarose em uma lâmina pré-tratada e depois resfriados a 4 °C por 5 minutos para solidificar o microgel. Um tratamento inicial com ácido foi usado para desnaturalizar o DNA de espermatozoides com DNA fragmentado, e uma solução tampão de lise foi aplicada para remover proteínas nucleares. Após lavagem com água destilada, os slides eram desidratados em soluções de etanol graduados e secados ao ar. Quando visualizados sob microscopia óptica após a coloração com as soluções de coloração fornecidas pelo kit, espermatozoides sem fragmentação demonstraram nucleoides com um grande halo de dispersão (maior que 1/3 do diâmetro do núcleo), enquanto espermatozoides com fragmentação apresentaram um halo pequeno (menos de 1/3 do diâmetro do núcleo) ou ausência de halo. A porcentagem de espermatozoides com fragmentação do DNA foi calculada como o número de espermatozoides fragmentados e degradados e expressa como porcentagem. Um total de 300 espermatozoides foram contados em uma lâmina e foram categorizados como tendo um halo de dispersão grande ou médio ou como ausência de halo de dispersão. Essa contagem foi replicada duas vezes para avaliar a variabilidade técnica, e as duas contagens foram calculadas em média. A sensibilidade e especificidade diagnóstica do kit são de 93%, e controles positivos e negativos foram incluídos em cada experimento. As amostras de sêmen foram avaliadas em 0, 1, 2 e 4 horas (0 h foi definido como 15 minutos após o período de liquefação a 37 °C) e mantidas em temperatura ambiente (22–25 °C).

Uma análise adicional de motilidade foi realizada em cada amostra em 0, 1, 2 e 4 horas. A avaliação de motilidade foi realizada por um andrologista experiente via protocolo de contagem usando uma câmara descartável. Trezentos espermatozoides móveis foram contados por grade, e a contagem foi replicada duas vezes. Uma concentração média de espermatozoides móveis foi calculada com base nas duas contagens replicadas.

Análises estatísticas foram realizadas usando ANOVA de medidas repetidas para comparar cada grupo temporal. Quando um efeito geral significativo foi detectado, o teste de diferença honestamente significativa (HSD) de Tukey foi aplicado para comparações post hoc par a par. Um valor-p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Informações detalhadas sobre materiais são resumidas na Tabela de Materiais.

Resultados

Para avaliar o impacto da exposição prolongada ao sêmen na motilidade espermática e fragmentação do DNA, um total de 14 amostras de pacientes normozoospermicos foram analisadas em quatro pontos de tempo a partir da coleta. As amostras analisadas foram consideradas "normais" nos parâmetros de análise de sêmen de acordo com a^5ª edição¹⁴ da OMS. Todas as amostras foram coletadas no local do nosso Centro de Fertilidade para otimizar a precisão dos parâmetros de análise em cada momento. A idade média dos pacientes era de 35,4 anos (24–45 anos). Os resultados iniciais do parâmetro de sêmen do grupo indicaram volume médio de sêmen de 3,7 mL, concentração média de 42,2 milhões/mL, motilidade média de 46,9%, morfologia normal média de 4% e glóbulos brancos negativos para todas as amostras no teste qualitativo (Tabela 1).

Uma diminuição progressiva na motilidade espermática foi observada ao longo do tempo. Comparado ao valor inicial (0 h), a motilidade média dos espermatozoides diminuiu 7,4% (intervalo 3–16%) a 1 hora, 14,5% (intervalo 4–31%) a 2 horas e 18,7% (intervalo 8–37%) às 4 horas. A motilidade dos espermatozoides diminuiu progressivamente ao longo do tempo, de 58,6% no início para 42,5% após 4 horas de exposição (Figura 1). No geral, a redução da motilidade entre os pontos de tempo foi estatisticamente significativa (p = 0,0001585). Simultaneamente, a SDF aumentou significativamente com a incubação prolongada no plasma seminal. A média de SDF aumentou de 15,6% no início para 21,1% em 1 hora, 27,1% em 2 horas e 31,7% em 4 horas. Em relação à linha de base, a SDF aumentou 5,5 pontos percentuais (intervalo 4–8 pontos percentuais) a 1 hora, 11,5 pontos percentuais (intervalo 8–16 pontos percentuais) a 2 horas e 16,1 pontos percentuais (intervalo 13–22 pontos percentuais) a 4 horas. Aumentos estatisticamente significativos na SDF foram detectados em todos os pontos de tempo subsequentes em comparação com a linha inicial, incluindo 1 h (p = 0,021129), 2 h (p < 0,00001) e 4 h (p = 0,000018) (Tabela 2).

DISPONIBILIDADE DE DADOS
Os dados de motilidade em nível de paciente e SDF usados para a análise são fornecidos na Tabela Suplementar S1.

Figura 1. Mudança na motilidade dos espermatozoides ao longo do tempo após a ejaculação. A motilidade dos espermatozoides foi avaliada no início da linha e após 1, 2 h e 4 h de exposição ao sêmen. A motilidade diminuiu progressivamente com o aumento do tempo de exposição. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Parâmetro	Média	Desvio padrão
Idade do paciente	35,4 (faixa de idade, 24–45 anos)	6.22
Volume de sêmen	3,7 mL	2.18
Concentração	42,2 milhões/mL	33.45
Motilidade	46.9%	18.77
Glóbulos brancos	Negativo (todos)	—
Morfologia	4.0%	0.77

Tabela 1: Características basais do sêmen das amostras do estudo. Os parâmetros do sêmen foram registrados após a liquefação e antes da avaliação dependente do tempo da fragmentação e motilidade do DNA do esperma.

Tempo	0 h	1 h	2 h	4 h
Redução média da motilidade dos espermatozoides de 0 h*	—	-7.4%	-14.5%	-18.7%
SDF média	15.6%	21.1%	27.1%	31.7%
Desvio padrão	5.28%	5.27%	5.31%	4.80%
P-valor vs. 0 h	—	p = 0,021129	p < 0,00001	p = 0,000018
*ANOVA de medidas repetidas com comparações post hoc do Tukey HSD.

Tabela 2: Mudanças dependentes do tempo na fragmentação e motilidade do DNA do esperma. Fragmentação e motilidade do DNA do esperma foram avaliadas no início e após 1, 2 h e 4 h de exposição ao sêmen. Os valores são apresentados conforme relatado pelos autores, com comparações estatísticas realizadas em relação à linha de base.

Tabela Suplementar S1. Diferença de motilidade espermática em nível de paciente e índices de fragmentação do DNA espermatozoides. Os valores são expressos como proporções; Multiplique por 100 para converter em porcentagens. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Nas amostras incluídas neste experimento, a SDF aumentou ao longo do tempo, enquanto a motilidade diminuiu no mesmo período. Isso sugere que a integridade do DNA do esperma pode diminuir quando o fluido seminal permanece estagnado por períodos mais longos entre a ejaculação e a análise ou processamento. Aumentar o tempo em que as amostras permaneceram estagnadas antes da análise pode ter aumentado a exposição a condições associadas ao estresse oxidativo. Como já discutido, o estresse oxidativo pode ser prejudicial à qualidade do DNA do espermatozoide, levando a altos níveis de fragmentação^{do DNA 6,8,13}. Os resultados deste estudo podem informar o manuseio do sêmen nos ciclos de ART.

Primeiro, pode valer a pena que as clínicas adicionem esse teste aos parâmetros tradicionais de análise de sêmen para garantir a qualidade do DNA espermatozoide antes de utilizar o esperma nos ciclos de ART. Otimizar a qualidade do esperma pode estar associado a melhores desfechos, como maior número de embriões congelados, aumento das taxas de euploidia e maiores taxas de gestações positivas e nascimentos vivos, conforme relatado em estudos^{anteriores 16}.

Segundo, esses resultados fornecem insights sobre os efeitos da coleta de sêmen em casa nos resultados da ART. Durante a pandemia de COVID-19, muitas clínicas começaram a utilizar a coleta de sêmen em casa como uma opção mais segura para pacientes^15,17. À medida que as clínicas começaram a fazer essa mudança, os pacientes tiveram a oportunidade não apenas de reduzir a exposição à COVID, mas também de realizar a coleta na privacidade de suas casas. No entanto, nossos achados sugerem que essas mudanças na prática podem envolver compensações relacionadas à qualidade do esperma e, potencialmente, aos resultados da TAR.

Estudos anteriores com kits de coleta caseira mostraram grandes flutuações nos resultados da análise de sêmen para homens com diferentes diagnósticos de fatores masculinos e homens que normalmente produzem amostras de sêmen "normais^{" 18}. Essa flutuação pode ser causada pela estagnação do esperma durante o transporte de casa para a clínica, especialmente ao enviar amostras de sêmen durante a noite em alguns casos. Outros estudos apoiam nosso resultado de que a SDF aumenta rapidamente nas primeiras 3–4 horas da incubação em 5% de CO2 a 37 °C após a preparação do espermatozoide, seja em^{espermatozoides congelados/descongelados 19} ou^{espermatozoides frescos 20}, sugerindo que o espermatozoide deve ser usado o mais rápido possível após a preparação para ART.

Kerdtawee et al. realizaram uma meta-análise do efeito da localização da coleta de esperma nos parâmetros do sêmen e nos desfechos de fertilidade. Embora não tenham mostrado diferenças significativas entre amostras coletadas em casa e em clínicas, notaram uma heterogeneidade significativa entre os estudos analisados, a maioria dos quais foram estudos^{observacionais 16}. Importante destacar que esses estudos também não tinham um cronograma controlado de quando as amostras coletadas em casa deveriam ser devolvidas às clínicas e analisadas. Os dados analisados neste estudo, no entanto, permitiram uma análise controlada da fragmentação do DNA em vários pontos temporais, proporcionando maior precisão e consistência nos resultados experimentais.

Embora a coleta domiciliar possa ser uma opção para alguns pacientes, entender a taxa de SDF pode ajudar a desenvolver diretrizes para identificar pacientes para quem a coleta domiciliar pode ser prejudicial aos desfechos da TAR. Uma revisão sistemática e meta-análise de Christoforaki et al. descobriu que o potencial de redução oxidativa no fluido seminal afeta negativamente a infertilidade^{masculina 21}. Os parâmetros analisados incluem concentração de espermatozoides, contagem, motilidade e morfologia, todos eles desfavoravelmente afetados pelo maior potencial de redução oxidativa, demonstrando que a qualidade dos espermatozoides pode ser influenciada pelo estresse oxidativo.

Os pontos fortes deste estudo incluem sua novidade, já que poucos estudos avaliaram mudanças dependentes do tempo das SDF durante exposição prolongada a fluidos seminais. Este estudo também foi realizado em ambiente controlado com um grupo relativamente homogêneo de homens, sem patologia seminal subjacente. No entanto, este estudo foi limitado a uma pequena amostra de 14 pacientes. Novos experimentos devem ser realizados para maximizar a confiança nos pontos de dados coletados e nas observações conclusivas.

Pesquisas adicionais também devem investigar variáveis que podem afetar as taxas de SDF, especificamente para entender melhor os fatores que contribuem para a manutenção da qualidade do esperma. Alguns fatores a considerar incluem, mas não se limitam a, manuseio de meios utilizados durante a preparação do esperma, temperatura das condições de transporte de casa para clínica, métodos de criopreservação e condições subjacentes de pacientes do sexo masculino. Obter uma compreensão abrangente dos fatores que contribuem para a SDF permitirá, em última análise, que as clínicas otimizem suas diretrizes e orientem melhor suas decisões ao estabelecer protocolos para tratar pacientes que recebem TAR.

A deterioração observada na qualidade do esperma demonstrou um padrão claro dependente do tempo, caracterizado pela diminuição da motilidade e aumento da fragmentação do DNA durante exposição prolongada ao fluido seminal. Notavelmente, a deterioração mais pronunciada ocorreu após 2–4 horas de armazenamento, quando a SDF ultrapassou 30%, e a motilidade diminuiu quase um quinto em relação ao valor inicial. Esses achados indicam que atrasos entre a ejaculação e o processamento do sêmen podem afetar negativamente a integridade funcional dos espermatozoides e reforçam a importância de minimizar os tempos de transporte e manuseio das amostras coletadas fora do local para procedimentos de tecnologia reprodutiva assistida. Laboratórios de Andrologia podem considerar estabelecer e comunicar um prazo aceitável para os pacientes receberem sêmen de coleta fora do local, especialmente no contexto da preparação para IUI ou FIV. O tempo desde a ejaculação até a análise e/ou preparação do sêmen deve ser considerado em relação à SDF, especialmente quando a coleta ocorre fora do laboratório de andrologia para ART.

Devido às limitações do pequeno tamanho da amostra deste estudo, estudos futuros devem avaliar o efeito da exposição prolongada ao sêmen na SDF em uma gama mais ampla de categorias de qualidade do sêmen, incluindo amostras de homens com parâmetros anormais. Além disso, são necessários ensaios clínicos randomizados prospectivos para determinar se aumentos dependentes do tempo na SDF se traduzem em diferenças clinicamente significativas nos desfechos da TAR, incluindo fertilização, desenvolvimento embrionário, implantação, gravidez, aborto espontâneo e taxas de nascimento vivo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Calculadora ANOVA	Reino Estatístico		Análise estatística https://www.statskingdom.com/anova_manova.html
Halosperm G2	Halotech	HT-HSG2	Kit de diagnóstico in vitro para medir a fragmentação do DNA dos espermatozoides https://halotechdna.com/pt/producto/halosperm-g2/
Microcell	Vitrolife	15423	Câmara de contagem descartável para análise de sêmen https://www.vitrolife.com/products/sperm-processing/microcell--accessories/
Controle de Qualidade para Tiras de Teste de WBC/pH	Sistemas Eletrônicos Médicos	A-CA-01752-00	Controle positivo e negativo para tiras de teste QwikCheck WBC https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/qwikcheck-wbc-ph-test-strips-quality-control/
Tiras Reagentes de Teste QwikCheck WBC/pH	Sistemas Eletrônicos Médicos	0700	Determine leucócitos (GLCs) no sêmen https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/