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Artigo de investigação
A fragmentação do DNA do esperma aumentou e a motilidade diminuiu significativamente com a exposição prolongada ao sêmen após a ejaculação. Em 14 amostras normais, a fragmentação do DNA aumentou 5,5%, 11,5% e 16,1% em 1h, 2h e 4h, respectivamente, enquanto a motilidade diminuiu. Esses achados apoiam a minimização dos atrasos na coleta e processamento do sêmen fora do local.
A fragmentação do DNA espermatozoide é conhecida por ser prejudicial à qualidade do esperma, o que pode impactar negativamente os ciclos da tecnologia de reprodução assistida (TAR). Examinar a fragmentação do DNA do esperma (SDF) no fluido seminal ao longo do tempo pode fornecer insights sobre os efeitos da exposição prolongada ao sêmen na integridade do DNA do espermatozoide. Neste estudo preliminar, um ensaio SDF foi realizado em vários momentos para simular condições de coleta de sêmen fora do local, usando o ensaio de dispersão de cromatina espermática em 14 amostras normais de sêmen. A análise estatística dos percentuais de fragmentação do DNA ao longo da duração do ensaio mostrou que a estagnação prolongada do fluido seminal, desde a ejaculação até a análise de sêmen, aumentou significativamente a fragmentação do DNA. A motilidade média dos espermatozoides foi significativamente reduzida em 7,4% em 1 hora, 14,5% em 2 horas e 18,7% em 4 horas, e a FDS média aumentou significativamente 5,5% em 1 hora, 11,5% em 2 horas e 16,1% em 4 horas após a coleta de sêmen. Essa diminuição na qualidade do esperma ao longo do tempo pode informar os protocolos das clínicas de fertilidade ao considerar a preparação do esperma para ciclos de ART, especialmente quando a coleta ocorre fora do laboratório de andrologia. Os laboratórios podem considerar estabelecer um prazo aceitável para receber sêmen proveniente de coleta fora do local.
A Organização Mundial da Saúde (OMS) identifica uma em cada seis pessoas, ou 17,5% da população mundial, como tendo sofrido de infertilidade em algum momento de suavida 1. Aproximadamente 20% dos casos de infertilidade têm um diagnóstico exclusivo de infertilidade por fator masculino, com outros 30–40% dos casos tendo fator masculino como diagnósticosecundário 2. Mesmo em homens saudáveis, os parâmetros seminais podem variar muito de pessoa para pessoa, incluindo flutuações na concentração, motilidade, morfologia evitalidade 3. Portanto, é importante entender os fatores específicos que comprometem a fertilidade masculina para fornecer o tratamento adequado em um ambiente clínico.
Uma área de pesquisa em desenvolvimento é o efeito da integridade do DNA do esperma nos ciclos 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. O manual laboratorial da OMS para exame e processamento de sêmen humano, 5ª edição, afirma que a fragmentação do DNA espermatozoide (SDF) (seja por quebra de fita simples ou dupla) pode afetar o desenvolvimento embrionário, a implantação e os desfechos dagravidez 14. Muriel et al. realizaram uma análise da SDF e descobriram que o aumento da SDF resultou em taxas de fertilização, qualidade embrionária e taxas de implantação prejudicadas nos ciclos deART 10. No entanto, é necessário entender melhor o que causa a fragmentação do DNA.
Estudos anteriores relatam que o estresse oxidativo pode levar à diminuição da motilidade dos espermatozoides, deterioração da produção e função enzimática e, mais significativamente, danos aoDNA 8. Esse dano ao DNA pode incluir, mas não se limita a, deleções gênicas, traduções incorretas e SDF. Atualmente, ensaios SDF são usados para avaliar a integridade do DNA do esperma. Embora estudos tenham correlacionado criopreservação, manuseio de meios e estresse oxidativo com SDF, pouco se sabe sobre SDF no período desde a ejaculação atéa análise 4,5. Este é um momento crítico na vida útil dos espermatozoides, dado o aumento da prevalência de coletas domésticas de espermatozoides para preparação de espermatozoides nos ciclosART 15. As cobranças domiciliares se tornaram cada vez mais populares durante a pandemia de COVID-19, pois limitam o contato direto com o paciente e aumentam o conforto e a conveniência. No entanto, não existem diretrizes específicas que sugiram um momento ideal desde a ejaculação até a análise para as coleções domiciliares. Assim, o objetivo principal do nosso estudo foi entender se a SDF muda ao longo do tempo em fluidos seminais estagnados e se tais mudanças podem ser relevantes para o manuseio de amostras de ART.
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O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional dos Hospitais Universitários (STUDY20201371). O consentimento informado foi obtido de todos os participantes envolvidos no estudo. Quatorze amostras de sêmen foram selecionadas de pacientes em um único centro acadêmico de fertilidade no nordeste de Ohio. Todas as amostras analisadas neste experimento foram coletadas no local, em nossa instalação. Testes de dispersão de cromatina espermática foram realizados em amostras de sêmen por um andrologista totalmente treinado, de acordo com as instruções do fabricante, para minimizar a variação interpessoal. Com este kit, espermatozoides frescos intactos, não fixados foram imersos em um microgel inerte de agarose em uma lâmina pré-tratada e depois resfriados a 4 °C por 5 minutos para solidificar o microgel. Um tratamento inicial com ácido foi usado para desnaturalizar o DNA de espermatozoides com DNA fragmentado, e uma solução tampão de lise foi aplicada para remover proteínas nucleares. Após lavagem com água destilada, os slides eram desidratados em soluções de etanol graduados e secados ao ar. Quando visualizados sob microscopia óptica após a coloração com as soluções de coloração fornecidas pelo kit, espermatozoides sem fragmentação demonstraram nucleoides com um grande halo de dispersão (maior que 1/3 do diâmetro do núcleo), enquanto espermatozoides com fragmentação apresentaram um halo pequeno (menos de 1/3 do diâmetro do núcleo) ou ausência de halo. A porcentagem de espermatozoides com fragmentação do DNA foi calculada como o número de espermatozoides fragmentados e degradados e expressa como porcentagem. Um total de 300 espermatozoides foram contados em uma lâmina e foram categorizados como tendo um halo de dispersão grande ou médio ou como ausência de halo de dispersão. Essa contagem foi replicada duas vezes para avaliar a variabilidade técnica, e as duas contagens foram calculadas em média. A sensibilidade e especificidade diagnóstica do kit são de 93%, e controles positivos e negativos foram incluídos em cada experimento. As amostras de sêmen foram avaliadas em 0, 1, 2 e 4 horas (0 h foi definido como 15 minutos após o período de liquefação a 37 °C) e mantidas em temperatura ambiente (22–25 °C).
Uma análise adicional de motilidade foi realizada em cada amostra em 0, 1, 2 e 4 horas. A avaliação de motilidade foi realizada por um andrologista experiente via protocolo de contagem usando uma câmara descartável. Trezentos espermatozoides móveis foram contados por grade, e a contagem foi replicada duas vezes. Uma concentração média de espermatozoides móveis foi calculada com base nas duas contagens replicadas.
Análises estatísticas foram realizadas usando ANOVA de medidas repetidas para comparar cada grupo temporal. Quando um efeito geral significativo foi detectado, o teste de diferença honestamente significativa (HSD) de Tukey foi aplicado para comparações post hoc par a par. Um valor-p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Informações detalhadas sobre materiais são resumidas na Tabela de Materiais.
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Para avaliar o impacto da exposição prolongada ao sêmen na motilidade espermática e fragmentação do DNA, um total de 14 amostras de pacientes normozoospermicos foram analisadas em quatro pontos de tempo a partir da coleta. As amostras analisadas foram consideradas "normais" nos parâmetros de análise de sêmen de acordo com a5ª edição14 da OMS. Todas as amostras foram coletadas no local do nosso Centro de Fertilidade para otimizar a precisão dos parâmetro...
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Nas amostras incluídas neste experimento, a SDF aumentou ao longo do tempo, enquanto a motilidade diminuiu no mesmo período. Isso sugere que a integridade do DNA do esperma pode diminuir quando o fluido seminal permanece estagnado por períodos mais longos entre a ejaculação e a análise ou processamento. Aumentar o tempo em que as amostras permaneceram estagnadas antes da análise pode ter aumentado a exposição a condições associadas ao estresse oxidativo. Como já discutido, o estresse oxi...
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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Calculadora ANOVA | Reino Estatístico | Análise estatística https://www.statskingdom.com/anova_manova.html | |
| Halosperm G2 | Halotech | HT-HSG2 | Kit de diagnóstico in vitro para medir a fragmentação do DNA dos espermatozoides https://halotechdna.com/pt/producto/halosperm-g2/ |
| Microcell | Vitrolife | 15423 | Câmara de contagem descartável para análise de sêmen https://www.vitrolife.com/products/sperm-processing/microcell--accessories/ |
| Controle de Qualidade para Tiras de Teste de WBC/pH | Sistemas Eletrônicos Médicos | A-CA-01752-00 | Controle positivo e negativo para tiras de teste QwikCheck WBC https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/qwikcheck-wbc-ph-test-strips-quality-control/ |
| Tiras Reagentes de Teste QwikCheck WBC/pH | Sistemas Eletrônicos Médicos | 0700 | Determine leucócitos (GLCs) no sêmen https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/ |
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