Artigo de método

Microinjeção de Interleucina-6 na corrente sanguínea de larvas de peixe-zebra do TSC para estudar comportamentos semelhantes a transtornos neuropsiquiátricos

152 vistas

⸱

DOI:

10.3791/71524

⸱

26 de junho de 2026

 , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, International Institute of Molecular Mechanisms and Machines, IMol, Polish Academy of Sciences, 2Warsaw-4-PhD doctoral school, International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

Neste artigo

Resumo

Para modelar como os sinais inflamatórios influenciam o neurodesenvolvimento em organismos geneticamente suscetíveis, apresentamos um protocolo para microinjeção de IL-6 no ducto de Cuvier (veia cardinal comum) das larvas de peixe-zebra, possibilitando indução controlada da inflamação e avaliação de seu impacto no desenvolvimento no contexto do complexo de esclerose tuberosa (TSC).

Resumo

Pacientes com complexo de esclerose tuberosa (mutações TSC1/TSC2) apresentam expressividade variável do transtorno do espectro autista (TEA), e sabe-se que a ativação imunológica materna aumenta o risco de TEA. A interleucina-6 (IL-6) é uma citocina pleiotrópica com papéis bem estabelecidos na regulação imunológica, inflamação e processos neuroinflamatórios. É produzido por múltiplos tipos de células imunes em resposta a infecções ou lesões teciduais, e é comumente caracterizado como mediador pró-inflamatório. Notavelmente, a IL-6 pode atravessar a barreira hematoencefálica e tem sido implicada em condições neuropsiquiátricas associadas à neuroinflamação e à inflamação, incluindo transtorno do espectro autista (TEA) e deficiência intelectual (DI). Aqui, descrevemos um protocolo para induzir sinalização inflamatória sistêmica no peixe-zebra, ao liberar IL-6 na corrente sanguínea por meio da injeção no ducto de Cuvier. Essa abordagem permite respostas inflamatórias controladas e reprodutíveis para estudar mudanças causadas pela inflamação no desenvolvimento inicial. O protocolo detalha as etapas essenciais para preparação de IL-6, microinjeção e aplicações experimentais posteriores em modelos de doença e neuroinflamação do peixe-zebra, incluindo estudos projetados para investigar interações gene-ambiente. Ao permitir a indução controlada da sinalização inflamatória sistêmica, essa abordagem oferece uma plataforma versátil para examinar como suscetibilidade genética e exposições inflamatórias se cruzam para moldar os resultados do desenvolvimento.

Introdução

Compreender como os sinais inflamatórios moldam o neurodesenvolvimento precoce é essencial para dissecar os mecanismos subjacentes aos distúrbios neurodesenvolvimentais, especialmente em contextos geneticamente suscetíveis. O objetivo principal deste protocolo é fornecer uma abordagem precisa e reprodutível para induzir sinalização inflamatória sistêmica em larvas de peixe-zebra por meio da microinjeção direta de interleucina-6 (IL-6) no ducto de Cuvier (a veia cardinal comum).

O complexo de esclerose tuberosa (TSC) exemplifica tais interações gene-ambiente. TSC é um distúrbio genético raro causado por mutações em TSC1 ou TSC2, que codificam hamartin e tuberina, respectivamente, proteínas que formam um complexo que normalmente suprime a sinalização do mTORC1. A perda dessa inibição leva à hiperativação da via mTORC1, resultando em crescimento celular anormal e em uma ampla gama de manifestações clínicas, incluindo transtorno do espectro autista (TEA)1,2. Estima-se que o TEA afete ~1,5% dos indivíduos com idade média de diagnóstico de ~3 anos em paísesdesenvolvidos 3. O TEA é caracterizado por comportamentos repetitivos, interações sociais prejudicadas e redução da flexibilidadecognitiva 4, e os pacientes frequentemente apresentam desafios neurocomportamentais adicionais, como ansiedade, depressão ou deficiência intelectual3. Notavelmente, 40%-60% dos indivíduos com TSC apresentam características relacionadas aoTEA 2, mas a gravidade dos sintomas varia amplamente – mesmo entre pacientes com mutações semelhantes – sugerindo que fatores ambientais modulam o risco geneticamente determinado.

Um desses fatores é a inflamação. Embora a etiologia do TEA permaneça em grande parte desconhecida, a neuroinflamação em múltiplas regiões cerebrais há muito tempo éimplicada 5. Evidências pré-clínicas e clínicas crescentes indicam que a neuroinflamação fetal desencadeada pela ativação imune materna (MIA) e o consequente aumento da sinalização das citocinas podem contribuir significativamente para a patogênese doTEA 6. Assim, modelar a exposição a citocinas inflamatórias em sistemas geneticamente suscetíveis, como o TSC, fornece uma estrutura poderosa para investigar como sinais imunes se intersectam com a regulação disruptiva do mTORC1 para influenciar o desenvolvimento cerebral precoce.

A justificativa para o desenvolvimento desse protocolo decorre do crescente reconhecimento de que a inflamação mediada por citocinas, incluindo a sinalização da IL-6, pode interagir com vulnerabilidades genéticas para influenciar trajetórias neurodesenvolvimentais. Citocinas são glicoproteínas de baixo peso molecular que coordenam a comunicação dentro do sistema imunológico. No TEA, múltiplos estudos relataram consistentemente níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-6 no sangueperiférico 7,8,9,10, apoiando a hipótese de que a sinalização desregulada da IL-6 pode contribuir para as características neurodesenvolvementais e comportamentais características do transtorno. A IL-6 é um mediador-chave da ativação imune produzida por diversos tipos de células imunes em resposta a infecção ou dano tecidual. Como a IL-6 pode atravessar a barreira hematoencefálica e influenciar diretamente neurônios, astrócitos e micróglias, a elevação sustentada dessa citocina tem sido implicada na alteração das vias neurodesenvolvimentais, da plasticidade sináptica e da homeostase neuroimune – mecanismos cada vez mais explorados na fisiopatologia doTEA 11,12. Essas ligações são ainda mais fortalecidas por estudos de MIA, onde o aumento da IL-6 materna durante a gravidez interrompe o desenvolvimento cerebral fetal e aumenta o risco relacionado aoTEA 13. No entanto, os modelos existentes de vertebrados frequentemente dependem da estimulação imune sistêmica por meio de moléculas associadas a patógenos ou paradigmas de exposição materna, que podem introduzir variabilidade, ativar múltiplas vias imunes simultaneamente e limitar a capacidade de isolar a contribuição específica da IL-6. A microinjeção direta de IL-6 em peixes-zebra supera essas limitações ao permitir a manipulação direcionada de uma única citocina dentro de um organismo transparente e geneticamente manipulável.

O peixe-zebra oferece várias vantagens para estudar os efeitos do desenvolvimento impulsionados por citocinas. Sua transparência óptica permite visualização em tempo real das respostas imunes e neurais; seu rápido desenvolvimento permite experimentação de alto rendimento; e suas vias conservadas de sinalização de citocinas as tornam um modelo vertebrado poderoso para dissecar mecanismosinflamatórios 14,15,16,17,18. Em estudos experimentais, é necessário entregar materiais exógenos (bactérias, células cancerígenas, DNA, nanopartículas, etc.) nas larvas de peixe-zebra. Uma abordagem envolve expor as larvas a uma solução contendo o material de interesse, permitindo a absorção passiva pela pele, brânquias ou trato gastrointestinal. O segundo e mais direto método é a microinjeção, na qual materiais externos são entregues em compartimentos embrionários ou larvares específicos usando agulhas finas de vidro 19,20,21. Importante, a microinjeção no ducto de Cuvier oferece uma rota confiável para a entrega sistêmica, garantindo a rápida distribuição de IL-6 por toda a circulação sem os efeitos confusos da estimulação imune de organismos inteiros.

Neste protocolo, apresentamos um procedimento passo a passo desde a preparação das seringas de injeção até as injeções de IL-6 na corrente sanguínea pelo ducto de Cuvier das larvas de peixe-zebra aos 2 e 3 dias após a fertilização (dpf). Esse método é particularmente útil para pesquisadores que investigam como sinais inflamatórios específicos influenciam processos iniciais de desenvolvimento, interações gene-ambiente em modelos de distúrbios neurodesenvolvimentais ou relacionados ao sistema imunológico, as consequências celulares e moleculares da exposição a citocinas in vivo, ou a interação entre mutações genéticas e vias de sinalização inflamatória. Ao oferecer uma abordagem controlada, específica para citocinas e precisa no desenvolvimento, esse protocolo oferece uma plataforma versátil para investigar os mecanismos pelos quais a IL-6 e sinais imunes relacionados moldam os desfechos imunológicos, neurais e comportamentais precoces.

Protocolo

Para o procedimento descrito aqui, a linha tsc2 vu242/+ peixe-zebra foi usada22,23. Todos os experimentos realizados foram realizados de acordo com toda a legislação relevante, e não é necessária aprovação adicional de comitês de ética especificamente porque o estágio de desenvolvimento utilizado (<5 dpf) está fora do escopo da revisão ética obrigatória. A Figura 1 apresenta um esquema do protocolo.

1. Puxar micropipetas

  1. Prepare agulhas de microinjeção a partir de capilares de vidro borosilicato usando um puxador de micropipeta, seguindo os procedimentosestabelecidos 24.
  2. Use capilares de vidro borosilicato de 10 cm de comprimento (1,0 mm de diâmetro externo, paredes finas) e coloque-os em um puxador de micropipeta.
  3. Posicione cuidadosamente o capilar dentro do carro de puxação, garantindo alinhamento preciso dentro do sulco designado, e fixe-o firmemente usando as grampos de instrumentos para evitar movimentos durante a puxada.
  4. Ajuste o capilar para que fique centralizado dentro do filamento de aquecimento, garantindo um aquecimento uniforme ao longo da região a ser puxada para uma formação consistente da agulha.
  5. Inicie o programa de puxada usando parâmetros otimizados (por exemplo, para instrumentos Sutter use calor: 533, puxada: 50, velocidade: 60, atraso: 90 e pressão: 200) para gerar agulhas de microinjeção de ponta fina.
    ATENÇÃO: Microagulhas retiradas de capilares de vidro são frágeis e podem facilmente rachar, entupir ou desenvolver formas irregulares das pontas que alteram o volume da injeção. Inspecione cada agulha sob um estereoscópio antes do uso, evite tocar a ponta em superfícies duras e substitua imediatamente as agulhas se houver resistência, vazamento ou tamanho inconsistente da gotícula.
    NOTA: Após o processo de puxada, as pontas afiladas das agulhas são formadas em ambas as extremidades do capilar. Antes do uso, a ponta deve ser cuidadosamente aberta, quebrando-a suavemente com pinças finas sob um estereomicroscópio para alcançar o tamanho desejado da abertura para microinjeção.

2. Preparação de tampões e solução de estoque

  1. Prepare uma solução de 60× de meio embrionário E3 (veja a Tabela 1). Esterilize a solução por autoclav e armazene a 4 °C. Para uso, dilua a solução original em água ultrapura para obter 1× solução de trabalho E3.
    NOTA: 60× solução de estoque do meio embrionário E3 pode ser armazenada a 4 °C para armazenamento a longo prazo.
  2. Prepare uma solução de tricaína (MS-222) 20x conforme descrito na Tabela 1. Armazene a solução a 4 °C no escuro para evitar degradação. Antes do uso, dilua para 1× concentração de trabalho no meio E3.
    NOTA: Ajuste o pH da solução de tricaína para 7,5 usando 1 M de Tris pH 9,0. Essa solução pode ser aliquotada e mantida em -20 °C (congelada) para armazenamento prolongado ou armazenada a 4 °C. A tricaína se degrada na RT e sob luz até se tornar um composto tóxico.
    ATENÇÃO: Cuidado especial deve ser tomado ao usar tricaína (MS-222) para anestesia, pois tanto a subexposição quanto a superexposição podem afetar negativamente a fisiologia e o comportamento larvar. A exposição excessiva pode deprimir a função cardíaca e alterar comportamentos posteriores, enquanto anestesia insuficiente aumenta o risco de lesão durante a montagem. Use apenas a concentração e duração mínimas efetivas, e permita a recuperação completa em meio embrionário fresco antes dos ensaios comportamentais.
  3. Prepare uma solução de agarose a 1% (p/v) em meio E3 aquecendo até que esteja totalmente dissolvida.
    NOTA: Se preparada com antecedência, a solução pode ser armazenada a 4 °C e reaquecida antes do uso. No dia do experimento, mantenha a agarose em estado líquido entre 55–60 °C para evitar solidificação prematura.
  4. Prepare uma solução de NaCl a 0,9% (p/v) e armazene em temperatura ambiente por até 1 semana ou a 4 °C para armazenamento prolongado. Antes do uso, equilibre a solução à temperatura ambiente ou incube a 28,5 °C para corresponder às condições fisiológicas dos embriões.
  5. Prepare uma solução de 2 pg/nL de IL-6 com 0,9% de NaCl. Aliquota a solução para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento e armazenar a -20 °C. Antes do uso, descongele e leve a aliquota à temperatura ambiente.
  6. Prepare uma solução de trabalho de pronase a 0,5 mg/mL em meio E3 a partir de uma solução de estoque de 20 mg/mL preparada em água ultrapura.

3. Obtenção e criação de embriões até 2 dpf

  1. Prepare a desova em grupo colocando vários peixes-zebra adultos TSC2vu242/vu242 em um aquário de desova.
    NOTA: Machos e fêmeas podem ser separados durante a noite usando um divisor para evitar desova prematura, com o divisor removido na manhã seguinte para induzir o acasalamento sincronizado. Alternativamente, os peixes podem ser mantidos sem divisória em um ambiente controlado pela luz, onde a transição da escuridão (noite) para a luz (manhã) atua como um sinal de desova.
  2. No dia seguinte, remova o divisor (se usado) e permita que a desova prossiga por aproximadamente 1 hora.
  3. Colete embriões fertilizados rapidamente e transfira-os para placas de Petri de 100 mm contendo 40 mL de meio embrionário E3, mantendo uma densidade não superior a ~60 embriões por recipiente para garantir o desenvolvimento ideal.
  4. Incubar embriões a 28,5 °C sob um ciclo diurno controlado de 14 horas de luz e 10 horas de escuridão.
  5. Em 1 dpf e 2 dpf, examine embriões sob um estereomicroscópio e remova embriões mortos, óvulos não fertilizados e detritos para manter a qualidade da cultura.
  6. Substitua o meio E3 por uma solução fresca para minimizar o acúmulo de resíduos e apoiar o desenvolvimento embrionário normal.

4. Preparação de placas de agarose para microinjeções e decorionação

  1. Prepare uma solução de agarose de 1% (p/v) em meio E3 e aqueça-a até que a agarose esteja completamente dissolvida e a solução fique clara.
  2. Deixe a solução resfriar brevemente e depois despeje aproximadamente 30 mL em uma placa de Petri de 100 mm, garantindo uma camada uniforme sobre a superfície.
  3. Enquanto a agarose ainda está líquida, mas começando a solidificar, coloque delicadamente um molde de silicone sobre a superfície para criar sulcos uniformes.
    NOTA: Aqui, moldes de silicone com padrões piramidales (Figura 2) são usados para gerar poços capazes de reter o excesso de E3 durante a microinjeção. Esses poços são projetados para fornecer estabilidade transitoriamente durante o manuseio e a injeção, mantendo umidade suficiente para evitar a dessecação e garantir a viabilidade do embrião por vários minutos fora das condições padrão de incubação.
  4. Prepare placas de Petri revestidas com agarose para decorionação enzimática (50 mm de diâmetro) despejando aproximadamente 5 mL de solução de agarose derretida a 1% (p/v) e girando suavemente a placa para revestir uniformemente a superfície.
  5. Remova qualquer excesso de agarose.
  6. Deixe a agarose solidificar em temperatura ambiente por 10–15 minutos. Uma vez fixos, os pratos estão prontos para uso na descorionação enzimática dos embriões.

5. Decorionação enzimática de 2 peixes dpf

  1. Transfira aproximadamente 100 embriões em corions a 2 dpf para uma pequena placa de Petri revestida de agarose (50 mm).
  2. Remova o máximo possível de meio E3 para minimizar a diluição da solução enzimática e garantir uma decorionação eficiente.
  3. Adicione 4 mL de solução de pronase recém-preparada (concentração de estoque: 20 mg/mL [preparada em água ultrapura], concentração de trabalho: 0,5 mg/mL [diluída em E3]) ao recipiente, garantindo que os embriões estejam totalmente submersos.
    ATENÇÃO: O tratamento com pronase deve ser cuidadosamente controlado, pois a digestão excessiva pode danificar os tecidos larvais, aumentando a fragilidade durante o manuseio e potencialmente afetando a sobrevivência ou o comportamento. Use apenas o tempo mínimo de exposição efetiva e enxágue os embriões cuidadosamente depois para evitar a continuidade da atividade enzimática.
  4. Incube em temperatura ambiente por 3–5 minutos, monitorando a liberação dos corions sob um estereoscópio.
  5. Gire ou gire suavemente o recipiente intermitentemente para facilitar a remoção enzimática dos corions. Continue até que a maioria dos embriões seja liberada de seus corions.
    NOTA: Certifique-se de que os embriões nus estejam sempre submersos em solução; caso contrário, o saco vitelino pode romper, resultando na morte dos embriões.
  6. Uma vez alcançada a decorionação, lave os embriões cuidadosamente, transferindo-os por 5–6 mudanças de meio E3 fresco.
    NOTA: Certifique-se de que os embriões nus estejam sempre submersos em solução; caso contrário, o saco vitelino pode romper, resultando na morte dos embriões.
  7. Certifique-se de que todos os resíduos de corios e pronase sejam removidos para evitar danos às larvas e manter condições ideais de cultura.
  8. Transfira ~50 larvas decorionadas para uma placa de Petri de 100 mm contendo 40 mL de meio E3 usando uma pipeta Pasteur de vidro.
  9. Mantenha as larvas nessas condições até que sejam microinjetadas.

6. Injeção de embriões de peixe-zebra

  1. Sob um estereomicroscópio (ampliação ≥150×), use pinças finas para quebrar cuidadosamente a ponta do capilar de vidro puxado (seção 1), gerando uma micropipeta com abertura de aproximadamente 3 μm de diâmetro.
    NOTA: Uma micropipeta adequada pode ser reconhecida garantindo que a ponta esteja finamente aberta, sem achatamento visível ou uma grande superfície aberta na ponta. Se a ponta for quebrada demais, ela não penetrará eficazmente na pele do peixe e pode resultar em injeções ruins ou inconsistentes. Portanto, a abertura da ponta deve ser realizada cuidadosamente sob um estereoscópio em alta ampliação, garantindo uma pausa mínima e controlada na extremidade do capilar.
  2. Prepare soluções de injeção de 0,9% (p/v) NaCl (controle) ou IL-6 (2 pg/nL) em 0,9% de NaCl e adicione 1 μL de 0,1% de azul de tripano a cada 10 μL de solução para facilitar a visualização durante a injeção.
  3. Preencha a micropipeta preparada com ~3 μL da solução de injeção usando uma ponta de microcargador, garantindo que não haja bolhas de ar.
  4. Fixe a micropipeta carregada no suporte capilar (Figura 2) conectado ao sistema de microinjeção.
  5. Coloque uma pequena gota de óleo mineral em um lâmina de calibração.
  6. Calibre o volume de injeção expelindo gotículas no óleo mineral e medindo seu diâmetro usando uma lâmina de calibração (Figura 2) com escala de 0,01 mm. Ajuste a pressão de injeção (entre 300–500 hPa) para alcançar um volume de gotícula de ~1 nL.
  7. Adicione tricaína (MS-222) ao meio que contém larvas com E3 até uma concentração final de 1× para anestesia. Para minimizar o estresse e garantir uma sedação consistente, use larvas em pequenos lotes.
  8. Transfira 2 larvas individuais de dpf para uma placa de injeção de agarose solidificada. Várias larvas (por exemplo, até 10) podem ser posicionadas por recipiente, dependendo da capacidade de manuseio.
  9. Coloque o prato sob o estereomicroscópio. Usando uma pipeta de vidro, oriente delicadamente cada larva de modo que o ducto de Cuvier fique claramente visível e acessível.
    NOTA: Ao trabalhar com várias larvas, certifique-se de que a superfície da agarose permaneça hidratada, adicionando periodicamente gotas de meio E3 contendo tricaína (1×) para evitar a dessecação.
  10. Posicione a ponta da micropipeta no ponto de entrada do ducto de Cuvier (como mostrado na Figura 3), identificável ao acompanhar as células sanguíneas se movendo em direção ao coração sob o estereoscópio.
  11. Injete duas gotículas consecutivas (~1 nL cada) da solução preparada no duto de Cuvier, com um intervalo de aproximadamente 20 s entre as injeções para permitir a distribuição adequada.
  12. Após a injeção, transfira suavemente as larvas da placa de agarose para uma nova placa de Petri de 100 mm contendo 40 mL de meio E3. Minimize o estresse mecânico durante a transferência.
  13. Retorne as larvas à incubadora a 28,5 °C para recuperação.
  14. No dia seguinte (3 dpf), repita o procedimento de microinjeção conforme descrito nos passos 6.8–6.13.
    NOTA: Uma única injeção produz apenas sinalização de curta duração e nenhuma resposta comportamental consistente, enquanto a segunda injeção garante ativação sustentada das vias inflamatórias ao longo da janela inicial de desenvolvimento larval relevante para o neurodesenvolvimento e produz mudanças comportamentais conforme descrito na seção de resultados Representativos.
  15. A 5 dpf, use as larvas para aplicações posteriores, incluindo ensaios comportamentais, imagens cerebrais ou análise de imunofluorescência.

Resultados

Para avaliar os efeitos da microinjeção de IL-6 na fisiologia e comportamento larvar, comparamos larvas injetadas com IL-6 com controles injetados em NaCl durante a sobrevivência e dois indicadores comportamentais comumente usados para avaliar comportamentos semelhantes à ansiedade e repetitivos em peixes-zebra. A microinjeção de IL-6 não afetou a viabilidade larval em comparação com as injeções de NaCl (Figura 4A). As taxas de sobrevivência a 5 dpf foram indistinguíveis entre os grupos injetado com IL-6 e injetado em NaCl, indicando que o regime de dosagem é bem tolerado e não introduz toxicidade inespecífica. As microinjeções em si reduzem ligeiramente a viabilidade em comparação com irmãos não injetados, indicando um impacto modesto relacionado ao manuseio, independentemente da exposição à IL-6. Isso confirma que o protocolo é adequado para análises comportamentais posteriores.

Para validar que o paradigma da microinjeção IL-6 induz uma resposta inflamatória mensurável em 5 dpf, quantificamos a prostaglandina E2 (PGE2), um mediador a jusante da sinalização inflamatória25 impulsionada por citocinas. Os mutantes homozigóticos tsc2-/- apresentaram níveis elevados de PGE2 no início do basal mesmo sem injeção de IL-6, significativamente maiores do que seus irmãos do tipo selvagem (WT) tsc2+/+ (Figura 4B). Mutantes heterozigóticos TSC2+/- apresentaram um aumento modesto e não significativo na PGE2 basal em comparação com larvas WT, mas, importante, seus níveis de PGE2 aumentaram acentuadamente após a microinjeção de IL-6. Esse padrão é consistente com nosso objetivo de modelar interações entre genes × ambiente: as larvas de WT permanecem em grande parte inalteradas por exposição leve e transitória à IL-6, enquanto mutantes geneticamente suscetíveis TSC2+/- apresentam uma resposta inflamatória pronunciada.

Em consonância com essas diferenças no tônus inflamatório dependentes do genótipo, examinamos em seguida se a sinalização induzida por IL-6 se traduziu em mudanças comportamentais mensuráveis no ensaio de campo aberto. Teste em campo aberto a 5 dpf (conforme descritoanteriormente 22) revelou que larvas mutantes tsc2 apresentaram comportamento aumentado semelhante à ansiedade em comparação com os irmãos WT (Figura 4C); no entanto, microinjeções de IL6 não afetaram esse comportamento. Especificamente, as larvas tsc2+/- e tsc2-/- passaram significativamente mais tempo na zona externa da arena e apresentaram menor exploração do centro em comparação com tsc2+/+, consistente com fenótipos relacionados à ansiedade estabelecidos em larvas de peixe-zebra.

As injeções de IL-6 aumentaram padrões de natação repetitivos e estereotipados, especialmente em larvas mutantes tsc2+/- (Figura 4D–E), uma característica comportamental comumente usada como leitura relevante para TEA em modelos26 de peixe-zebra. A quantificação detalhada do looping repetitivo, definido como três ou mais nadas circulares consecutivas, revelou um aumento significativo na proporção de mutantes TSC2+/- injetados em IL-6 apresentando esse comportamento em comparação com controles injetados com NaCl. Esse aprimoramento seletivo da natação repetitiva em larvas geneticamente suscetíveis apoia ainda mais uma interação gene × ambiente, na qual uma estimulação inflamatória leve revela ou amplifica tendências comportamentais semelhantes ao TEA, especificamente no fundo mutante tsc2+/-.

figure-results-1
Figura 1: Esquema do protocolo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Configuração de estação de trabalho por microinjeção. Esquema da estação de trabalho de microinjeção usada para injeções larvais de peixe-zebra. (1) Micropipeta de vidro montada no suporte do injetor; (2) placa de Petri revestida de agarose com poços moldados para posicionamento larval; (3) óleo mineral para calibração; (4) solução de azul de tripano; (5) agulhas de vidro puxadas; (6) lâmina de calibração; (7) pontas de pipeta estendidas; (8) pipeta Pasteur; (9) Molde de silicone. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Injeção no duto de Cuvier. (A) Representação esquemática do canal do sítio de injeção de Cuvier (veia cardinal comum) em larvas de peixe-zebra e trilhos locomotores representativos em campo aberto a 5 dpf. (B) Imagens representativas do controle (não injetado) e injeções com NaCl e IL-6. Barra de escala: 250 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Resultados representativos da interação gene x ambiente usando a linhagem mutante tsc2. (A) Taxas de sobrevivência (%) das larvas tsc2 vu242 ao longo do experimento em grupos controle (não injetados), injetados com NaCl e injetados por IL-6. Os dados são apresentados como média ± SEM em 5 dpf (n = 4 réplicas experimentais independentes, cada genótipo × combinação de tratamento contendo 60–70 peixes). A análise estatística foi realizada usando ANOVA seguida pelo teste Tukey post hoc para comparação par a par. Diferenças significativas foram observadas entre grupos controle e injetados por IL-6 (p = 0,00150) e entre grupos controle e injetados por NaCl (p = 0,00243). (B) Boxplots representando os níveis de PGE2 nos mutantes e irmãos tsc2, medidos a 5 dpf usando um kit de ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) de acordo com o protocolo do fabricante (ANOVA bidirecional para genótipo: F = 7,4503; P = 0,01234). Cada amostra contém 20 cabeças (caudas foram usadas para genotipagem). Pontos nos boxplots representam réplicas biológicas. (C) Boxplots dos resultados do teste em campo aberto para peixes mutantes tsc2 mostrando o tempo relativo gasto próximo às paredes para cada genótipo após injeções com NaCl e IL-6 e para controles não injetados (ANOVA bidirecional para genótipo: F = 7,021; P = 0,00106). O teste em campo aberto foi realizado usando uma câmara de análise automatizada (Tabela de Materiais) de acordo com o protocolopreviamente reportado 22. (D) Figura exemplar mostrando comportamento exploratório aleatório após injeção de NaCl e looping repetitivo após injeções de IL-6. (E) Boxplots representando o número de animais apresentando comportamentos normais e repetitivos de looping para cada genótipo tsc2 após a injeção com NaCl ou IL-6 e para peixes controle não injetados (ANOVA bidirecional para genótipo: F = 5,7615; P = 0,005849). Três réplicas experimentais independentes, cada genótipo × combinação de tratamento contendo 60–70 peixes, foram usadas para isso. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Solução original 60 x E3
ReagenteConcentração finalValor
NaCl297 mM17,4 g
KCl10,7 mM0,8 g
CaCl219,6 mM2,18 g
MgCl 2,6H 2O24 mM4,89 g
UltrapureH 2ON/Aencher até 1 L
TotalN/A1 L
Solução de coronha tricaine
ReagenteConcentração finalValor
Tricaine15,3 mM1 g
1 M Tris-HCl pH 921 mM5,25 mL
UltrapureH 2ON/A244,75 mL
TotalN/A250 mL

Tabela 1: Composição das soluções de E3 e Tricaína.

Discussão

Como esperado, mutantes homozigóticos TSC2 apresentaram altos níveis basais de ansiedade, consistentes com fenótipos22,27 relatados anteriormente. Como essas larvas já apresentam graves anormalidades comportamentais, a injeção de IL-6 não agravou ainda mais seu fenótipo. Em contraste, os heterozigotos tsc2 apresentaram mudanças claras induzidas pela IL-6. Essa sensibilidade seletiva destaca a utilidade desse protocolo para sondar interações entre genes × ambiente, onde sinalização inflamatória leve, porém prolongada, interage com a vulnerabilidade genética subjacente para moldar os resultados neurocomportamentais.

A exposição ao LPS continua sendo o paradigma indutor de inflamação mais amplamente utilizado no peixe-zebra e produz de forma confiável uma resposta imune ampla e robusta, caracterizada por forte indução de citocinas pró-inflamatórias, recrutamento de células imunes inatas e mortalidade dependente dedose 28. Embora poderoso, o LPS ativa múltiplas vias receptoras semelhantes ao Tollsimultaneamente 28,29,30, tornando difícil isolar a contribuição de citocinas individuais para os efeitos neurodesenvolvimentos posteriores. Em contraste, o protocolo de microinjeção de IL-6 descrito aqui oferece uma abordagem direcionada e controlada ao elevar uma única citocina conhecida por ser central na ativação imune materna. Importante destacar que as injeções de IL-6 não aumentam a mortalidade em relação aos controles injetados com NaCl, permitindo que fenótipos comportamentais e moleculares sejam examinados sem causar toxicidade confusa. Além disso, a microinjeção de IL-6 produz sinalização inflamatória específica a jusante, como demonstrado pelos níveis elevados de PGE2, e induz mudanças comportamentais mensuráveis — particularmente aumento da natação repetitiva em larvas heterozigotas TSC2 — onde a suscetibilidade genética interage com a exposição a citocinas. Juntas, essas distinções ressaltam que, enquanto o LPS modela a ativação imune global, a microinjeção de IL-6 permite a dissecação precisa de mecanismos específicos de citocinas relevantes para o risco neurodesenvolvimental.

Os resultados representativos apresentados aqui ilustram os efeitos da IL-6 em um contexto mutante tsc2, mas o protocolo em si é amplamente aplicável. O método pode ser facilmente implementado em larvas do tipo selvagem ou outros modelos genéticos para investigar como sinais inflamatórios definidos se cruzam com diversos contextos genéticos durante o neurodesenvolvimento inicial. Para aplicações além do modelo TSC2, recomendamos determinar empiricamente a dose ideal de IL-6, já que a sensibilidade às citocinas e os limiares inflamatórios podem variar entre genótipos e objetivos experimentais.

Uma consideração técnica chave neste protocolo é a consistência do volume de injeção, já que os efeitos biológicos da IL-6 dependem da entrega precisa de aproximadamente 1 nL por injeção. A variabilidade no tamanho das gotículas frequentemente surge de diferenças na abertura da agulha ou na pressão de injeção. Se as gotículas forem muito pequenas, aumentar gradualmente a pressão ou alargar levemente a ponta da agulha sob alta ampliação normalmente restaura o fluxo adequado. Por outro lado, gotículas que excedem o volume pretendido geralmente indicam que a abertura da agulha está muito larga, nesse caso é necessário reduzir a pressão ou preparar uma nova agulha com uma ponta mais estreita. Manter volumes precisos de injeção é essencial, pois desvios podem alterar a carga inflamatória e comprometer a reprodutibilidade. Ocasionalmente, os usuários podem encontrar situações em que nenhuma solução é eliminada da agulha. Isso acontece mais frequentemente devido a bolhas de ar, detritos ou obstruções na ponta da agulha. Inspecionar a agulha sob um estereoscópio e verificar o sistema injetor em busca de vazamentos ou conexões soltas geralmente resolve o problema. Garantir uma ponta limpa e sem obstruções é essencial para a entrega consistente e para evitar o acúmulo de pressão que possa danificar as larvas.

Outro fator importante é a tolerância fisiológica ao volume injetado. As larvas geralmente toleram ~1 nL bem, mas volumes maiores podem aumentar a mortalidade, especialmente quando múltiplas injeções são realizadas em dias consecutivos. Para experimentos que exigem dosagem repetida, é crucial minimizar o estresse mecânico, permitir tempo suficiente de recuperação entre as injeções e ajustar a concentração de IL-6 em vez do volume para alcançar a dose desejada. Essas considerações ajudam a garantir que os fenótipos observados reflitam a exposição às citocinas, e não lesões relacionadas à injeção.

Por fim, a mortalidade relacionada à injeção pode variar amplamente dependendo da experiência do usuário. Enquanto usuários qualificados normalmente alcançam taxas de mortalidade próximas a 5%, usuários inexperientes podem observar taxas de até 50%. A maioria das perdas decorre de danos mecânicos durante a montagem, colocação incorreta da agulha ou perfuração acidental do saco vitelino ou dos tecidos ao redor. Praticar o procedimento em larvas do tipo selvagem antes de iniciar as injeções experimentais melhora muito a consistência e reduz a mortalidade. O posicionamento adequado das larvas para visualizar claramente o ducto de Cuvier, combinado com manuseio suave durante a montagem e recuperação, minimiza ainda mais o dano procedimental.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a Kevin Ess e Lilianna Solnica-Krezel (Universidade Vanderbilt) pelo tsc2vu242/+ peixes e ao IIMCB ZCF pela ajuda com os peixes adultos. Esse trabalho foi apoiado pela bolsa SONATA BIS nº 2023/50/E/NZ3/00252, uma bolsa para JZ do Centro Nacional de Ciência, Polônia.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Borosilicate Glass capillaries (Outer diameter 1.0 mm/ inner diameter 0.75 mm)Sutter InstrumentBF150-75-10
CaCl2 (calcium chloride)Chempur118748703
Callibration Slide (1/100 mm)Bresser5916710
Capillary holder (Grip head set 4 size 0)Fertilart Sp. z o.o5196082001
Flaming/Brown micropipette pullerSutter InstrumentP-1000
HClChempur115752837
Human IL6Thermo Fischer Scientific200-06-20UGConcentração de estoque: 10 µg/mL, Concentração de trabalho: 2 pg/nL (diluído em 0,9% NaCl)
Injector pump FemtoJet 4iEppendorfE5252000021
KCl (potassium chloride)Chempur117397402
MgCl2·6H2O (magnesium chloride hexahydrate)Chempur116120500
Femtotips Microloader Tips for Femtojet MicroinjectorEppendorfEPE 5242956003
Microscope Leica M165 FC 1983 magnificationLeica Microsysytemshttps://www.leica-microsystems.com/products/
light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/
Mineral oilSigma-AldrichM5904
NaCl (sodium chloride)Chempur117941206
PronaseSigma-AldrichP5147-1GConcentração de estoque: 20 mg/mL (preparado em água ultrapura), Concentração de trabalho: 0,5 mg/mL (diluído em E3)
TricaineSigma-Aldrich/MerckA-5040
Tris baseCarl Roth4855.3
Trypan BlueThermo Fischer Scientific15250061
UltraPure Low Melting Point AgaroseThermo Fischer Scientific16520050
ZebraBox extension - Photo Motor Response EZBPMRAnimalabhttps://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system
ZebraboxViewPointhttps://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebraboxCâmara de análise automatizada

Referências

  1. Winden, K., et al. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 12, 11(2026).
  2. Ramani, R., et al. The clinical interface of tuberous sclerosis complex and autism spectrum disorder: insights and future directions. Neurol Sci. 46 (6), 2571-2580 (2025).
  3. Lyall, K., et al. The changing epidemiology of autism spectrum disorders. Annu Rev Public Health. 38, 81-102 (2017).
  4. Nazeer, A., Ghaziuddin, M. Autism spectrum disorders: clinical features and diagnosis. Pediatr Clin North Am. 59, 19-25 (2012).
  5. Kern, J. K., Geier, D. A., Sykes, L. K., Geier, M. R. Relevance of neuroinflammation and encephalitis in autism. Front Cell Neurosci. 9, 519(2016).
  6. Careaga, M., Murai, T., Bauman, M. D. Maternal immune activation and autism spectrum disorder: from rodents to nonhuman and human primates. Biol Psychiatry. 81 (5), 391-401 (2017).
  7. Croonenberghs, J., Bosmans, E., Deboutte, D., Kenis, G., Maes, M. Activation of the inflammatory response system in autism. Neuropsychobiology. 45, 1-6 (2002).
  8. Girgis, R. R., Kumar, S. S., Brown, A. S. The cytokine model of schizophrenia: emerging therapeutic strategies. Biol Psychiatry. 75 (4), 292-299 (2014).
  9. Heuer, L. S., et al. An exploratory examination of neonatal cytokines and chemokines as predictors of autism risk: the early markers for autism study. Biol Psychiatry. 86 (4), 255-264 (2019).
  10. Sasayama, D., et al. Negative correlation between serum cytokine levels and cognitive abilities in children with autism spectrum disorder. J Intell. 5 (2), 19(2017).
  11. Banks, W. A., Kastin, A. J., Gutierrez, E. G. Penetration of interleukin-6 across the murine blood-brain barrier. Neurosci Lett. 179 (1-2), 53-56 (1994).
  12. Otkıran, G., Erdoğan, M. A., Uyanıkgil, Y., Erbaş, O. Prenatal interferon-alpha exposure induces autism-like neurobehavioral and neurochemical alterations in male offspring. J Neuroimmune Pharmacol. 21, 4(2026).
  13. Smith, S. E. P., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  14. Bedell, V. M., Meng, Q. C., Pack, M. A., Eckenhoff, R. G. A vertebrate model to reveal neural substrates underlying the transitions between conscious and unconscious states. Sci Rep. 10, 15789(2020).
  15. Belo, M. A. A., et al. Zebrafish as a model to study inflammation: a tool for drug discovery. Biomed Pharmacother. 144, 112310(2021).
  16. Ka, J., Pak, B., Han, O., Lee, S., Jin, S. -W. Comparison of transcriptomic changes between zebrafish and mice upon high fat diet reveals evolutionary convergence in lipid metabolism. Biochem Biophys Res Commun. 530 (4), 638-643 (2020).
  17. Li, Y., Hu, B. Establishment of multi-site infection model in zebrafish larvae for studying Staphylococcus aureus infectious disease. J Genet Genomics. 39 (9), 521-534 (2012).
  18. Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Res. 67 (7), 2927-2931 (2007).
  19. Cao, Z., et al. Carboxyl graphene oxide nanoparticles induce neurodevelopmental defects and locomotor disorders in zebrafish larvae. Chemosphere. 270, 128611(2021).
  20. Martini, D., Pucci, C., Gabellini, C., Pellegrino, M., Andreazzoli, M. Exposure to the natural alkaloid berberine affects cardiovascular system morphogenesis and functionality during zebrafish development. Sci Rep. 10, 17358(2020).
  21. Sun, M., et al. Robotic cardinal vein microinjection of zebrafish larvae based on 3D positioning. 2021 IEEE International Conference on Robotics and Automation (ICRA), Xi'an, China, , (2021).
  22. Kedra, M., et al. TrkB hyperactivity contributes to brain dysconnectivity, epileptogenesis, and anxiety in zebrafish model of tuberous sclerosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2170-2179 (2020).
  23. Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Dis Model Mech. 4 (2), 255-267 (2011).
  24. Konadu, B., Cox, C. K., Gibert, Y. Protocol for the microinjection of free fatty acids and triacylglycerol in zebrafish embryos. STAR Protoc. 5 (2), 103086(2024).
  25. Evans, S. S., Repasky, E. A., Fisher, D. T. Fever and the thermal regulation of immunity: the immune system feels the heat. Nat Rev Immunol. 15 (6), 335-349 (2015).
  26. Zabegalov, K. N., et al. Abnormal repetitive behaviors in zebrafish and their relevance to human brain disorders. Behav Brain Res. 367, 101-110 (2019).
  27. Scheldeman, C., et al. mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebrafish: phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108, 225-237 (2017).
  28. Ilyin, N. P., et al. Effects of intracerebroventricular lipopolysaccharide administration on behavioral, neurochemical, and neurogenomic responses in adult zebrafish. Behav Brain Res. 493, 115676(2025).
  29. Luo, R., Yao, Y., Chen, Z., Sun, X. An examination of the LPS-TLR4 immune response through the analysis of molecular structures and protein-protein interactions. Cell Commun Signal. 23, 142(2025).
  30. Grebennikova, D. V., Shandilya, U. K., Karrow, N. A. Beyond TLR4 and its alternative lipopolysaccharide (LPS) sensing pathways in zebrafish. Genes. 16 (9), 1014(2025).

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Neuroci nciaEdi o 232Edi o 232TodosEdi oTodosEdi oEste M s no JoVEEdi oComplexo de esclerose tuberosa TSCDist rbios neuropsiqui tricos associados ao TSC TANDsInterleucina 6 IL 6Transtorno do espectro autista TEAneuroinflama oDucto de CuvierAtiva o imune materna MIA
Microinjeção de Interleucina-6 na corrente sanguínea de larvas de peixe-zebra do TSC para estudar comportamentos semelhantes a transtornos neuropsiquiátricos
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.