É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de investigação

Assinatura imune relacionada ao estresse do retículo endoplasmático na fibrilação auricular: aprendizado de máquina e transcriptômica de célula única

145 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/71532

⸱

7 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Basic Medical Sciences, Harbin Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para identificar assinaturas imunes relacionadas ao estresse do retículo endoplasmático na fibrilação auricular, integrando transcriptômica pública em massa, aprendizado de máquina, análise de infiltração imune e transcriptômica de célula única para priorização de biomarcadores reprodutíveis e localização por tipo celular.

Resumo

Este estudo descreve um fluxo de trabalho computacional reprodutível para identificar assinaturas gênicas relacionadas ao estresse do retículo endoplasmático (ERS) na fibrilação auricular (FA) por meio da integração de transcriptômica em massa, aprendizado de máquina, análise de infiltração imune e transcriptômica de célula única. Conjuntos de dados transcribômicos públicos em massa foram retirados do Gene Expression Omnibus (GEO), seguidos por harmonização de fenótipos, normalização, correção de efeito lote e análise de expressão diferencial. A análise ponderada da rede de coexpressão gênica (WGCNA) foi combinada com conjuntos gênicos relacionados ao ERS para identificar genes candidatos associados ao ERS. Uma estrutura de aprendizado de máquina multi-algoritmo foi então usada para comparar estratégias de seleção de características e ajuste de modelos. O modelo selecionado foi avaliado em uma coorte de validação externa independente (GSE115574) e posteriormente avaliado em uma coorte adicional (GSE14975), com desempenho discriminatório quantificado pela análise de características operacionais do receptor (ROC) e a área sob a curva (AUC). Usando esse fluxo de trabalho, 22 genes centrais relacionados ao ERS foram identificados, e um modelo Elastic Net (Enet) com 18 genes apresentou o maior desempenho discriminatório geral entre as coortes de treinamento e validação. A análise SHapley Aditiva de ExPlanações (SHAP) destacou a principal contribuição de genes como RPS11, NCF2 e S100A4 para a previsão do modelo. A deconvolução imune e a análise transcriptômica de célula única mapearam ainda mais a assinatura relacionada ao ERS predominantemente para a linhagem monócito-macrófago, sugerindo seu possível envolvimento na remodelação imune associada à FA. Esse fluxo de trabalho fornece uma estratégia reprodutível para ligar assinaturas transcriptômicas associadas à doença a populações específicas de células imunes e pode ser adaptado a outros contextos de doenças com conjuntos de dados adequados em massa e unicelulares.

Introdução

A fibrilação auricular (FA) é a arritmia sustentada mais comum na prática clínica, caracterizada por atividade elétrica desordenada nos átrios e perda da função mecânica. Aumenta significativamente os riscos de AVC, insuficiência cardíaca e mortalidade por qualquer causa, tornando-se um grande fardo global de saúdepública 1. O manejo clínico atual da FA enfrenta desafios significativos: os medicamentos antiarrítmicos tradicionais têm eficácia limitada a longo prazo na manutenção do ritmo sinusal, e seus efeitos adversos, como arritmias e cardiotoxicidade, limitam seu usocontínuo 2,3. A ablação por cateter também continua sendo desafiadora para manter o ritmo sinusal a longo prazo para aFA4 persistente. Estratégias de tratamento inovadoras são atualmente limitadas pela falta de um entendimento sistemático do cenário molecular dos mecanismos upstream da FA, o que dificulta a identificação e tradução de alvos precisos. Pesquisas mostraram que a progressão patológica da FA envolve interações complexas em múltiplas dimensões, incluindo remodelação elétrica, estrutural e do sistema nervoso autônomo. Entre eles, a remodelação estrutural atrial, centrada na fibrose miocárdica, é um mecanismo chave para a manutenção daFA 5,6,7.

Portanto, elucidar as vias de estresse a montante que impulsionam a fibrose é uma das chaves para superar o gargalo terapêutico na FA persistente. Estudos recentes sugerem que o estresse do retículo endoplasmático (ERS), um centro regulador fundamental que permite às células lidar com perturbações intra e extracelulares, é uma resposta adaptativa altamente conservada, desencadeada quando a homeostase do RE é interrompida, levando ao acúmulo excessivo de proteínas não dobradas ou mal dobradas dentro do lúmen do RE. O RES pode participar da remodelação atrial regulando proteostase, ciclo do cálcio, respostas inflamatórias e apoptose 8,9. No entanto, os gatilhos a montante, moléculas-chave efetorais e vias descendentes do ERS na FA ainda não foram caracterizados sistematicamente, dificultando a definição de seus nós críticos e pontos de intervenção acionáveis na remodelação auricular.

Em comparação com estudos transcriptômicos tradicionais em massa, a integração multi-ômica pode gerar sinais associados à doença em nível populacional mais robustos. Além disso, incorporar transcriptômica de célula única possibilita a dissecação da heterogeneidade celular e a identificação das fontes celulares desses sinais, mapeando assim os resultados da associação para tipos celulares específicos e suas potenciais vias de interação. Isso fornece uma base para investigações mecanicistas subsequentes e priorização de alvos. No presente estudo, conjuntos de dados transcriptômicos em massa e transcriptômicos de célula única relacionados à FA foram recuperados do banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO). Módulos centrais relacionados ao ERS foram identificados por meio de análise diferencial de expressão e análise ponderada de redes de coexpressão gênica (WGCNA). Ao integrar análises de célula única, moléculas-chave foram ainda mais localizadas para tipos celulares específicos e suas redes de interação. Coletivamente, este estudo visa delinear redes-chave relacionadas ao ERS na FA e suas associações com remodelação estrutural, fornecendo assim uma justificativa para a descoberta de alvos e estratégias terapêuticas estratificadas e orientadas por mecanismos.

Comparado à análise diferencial de expressão por conjunto único ou triagem de biomarcadores por algoritmo único, esse fluxo de trabalho melhora a robustez e a interpretabilidade ao integrar validação entre coortes, seleção de características biologicamente restritas, comparação de modelos multi-algoritmo, deconvolução imune e transcriptômica de célula única. Essas etapas ajudam a priorizar assinaturas reprodutíveis relacionadas ao ERS e localizam sinais derivados de grandes volumes para populações celulares imunes específicas e redes de interação. Esse fluxo de trabalho é adequado para estudos que utilizam conjuntos de dados transcriptômicos públicos ou internos com grupos bem definidos de doenças e controle, fontes de tecido comparáveis, tamanho adequado da amostra e anotações de fenótipos disponíveis. É particularmente útil para geração de hipóteses, priorização de biomarcadores e localização por tipo celular de programas moleculares associados a doenças. No entanto, seu desempenho depende da qualidade do conjunto de dados, consistência do fenótipo e correção eficaz do efeito em lote; portanto, assinaturas candidatas identificadas por esse fluxo de trabalho requerem validação em coortes independentes e modelos experimentais antes da tradução clínica. O fluxo de trabalho geral do estudo é mostrado na Figura 1.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

De acordo com as Medidas para Revisão Ética das Ciências da Vida e Pesquisa Médica Envolvendo Sujeitos Humanos, promulgadas na China em 18 de fevereiro de 2023, pesquisas que utilizam dados públicos podem atender aos critérios para isenção da revisão ética. Este estudo utilizou apenas dados secundários transcriptômicos públicos e desidentificados, e não envolveu recrutamento de novos participantes humanos, coleta de amostras humanas ou experimentos com animais. Portanto, não era necessária aprovação ética institucional adicional. Nenhum experimento com animais foi realizado neste estudo. Portanto, a aprovação do comitê institucional de cuidado e uso animal não era aplicável.

Fontes de dados para genes relacionados ao estresse do retículo endoplasmático na fibrilação auricular
Neste estudo, conjuntos de dados transcriptômicos relacionados à FA, disponíveis publicamente, foram retirados do banco de dados GEO, incluindo GSE41177, GSE79768, GSE115574, GSE14975 e GSE165838. Informações detalhadas sobre os conjuntos de dados GSE são fornecidas no Arquivo Suplementar 1—Tabela Suplementar S1. GSE41177 e GSE79768 foram usados para construir a coorte integrada de treinamento transcriptômico em massa, enquanto GSE115574 e GSE14975 foram usados como duas coortes externas independentes de validação. GSE165838 era usado para análise transcriptômica de célula única. Como esses conjuntos de dados foram gerados em diferentes plataformas e podem diferir na origem do tecido, histórico clínico e composição da amostra, cada conjunto de dados foi pré-processado separadamente de acordo com as características da plataforma antes da integração ou validação. A correção por efeito de lote foi então realizada usando o pacote sva R para a coorte de treinamento unificada. O conjunto genético relacionado ao estresse do retículo endoplasmático foi recuperado do banco de dados GeneCards com escore de relevância ≥ 3 e, após a deduplicação, formou a lista de genes-alvo usada neste estudo.

Análise de genes diferencialmente expressos
Após a padronização e normalização dos dados, o limma do pacote R foi usado para identificar genes diferencialmente expressos (DEGs) no conjunto de treinamento integrado. Os DEGs foram definidos usando os seguintes critérios de significância: valor P ajustado pela taxa de descoberta falsa (adj. P.Val) < 0,05 e |log2FC| > 0,58510. Para visualizar os padrões de expressão dos DEGs, gráficos vulcânicos e mapas de calor foram gerados usando os pacotes ggplot2 e pheatmap, respectivamente.

Análise WGCNA
Para elucidar os potenciais mecanismos de regulação gênica coordenada, definir os padrões de associação entre módulos de co-expressão e variáveis clínicas de traços, e identificar biomarcadores centrais ou alvos terapêuticos com potencial translacional, foi aplicado WGCNA11.

Uma rede ponderada de coexpressões foi construída usando o pacote WGCNA em R. O poder de limiar suave (β) foi selecionado de acordo com o critério de topologia livre de escala; o valor correspondente de β foi escolhido para análises subsequentes quando o índice de ajuste da topologia livre de escala (R2) atingiu e permaneceu acima de 0,8512. Durante a identificação do módulo, parâmetros relacionados ao corte dinâmico de árvores e à sensibilidade à detecção de módulos foram otimizados para melhorar a resolução e estabilidade dos limites do módulo. Por fim, módulos significativamente associados à característica alvo foram extraídos, e genes hubs intramodulares foram identificados como conjuntos de genes candidatos para análises posteriores.

Análise de enriquecimento de DEGs relacionadas à FA
Para identificar com precisão os genes hub, os DEGs foram primeiro intersectados com genes dos módulos-chave do WGCNA para definir um conjunto de genes implicados na patogênese da FA. Em seguida, esse conjunto de genes AF foi ainda mais intersectado com genes relacionados ao ERS, e os genes sobrepostos resultantes foram mantidos para análises subsequentes.

O enriquecimento funcional dos genes triados foi avaliado usando análises Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Os termos GO foram analisados com o pacote R clusterProfiler para resumir o enriquecimento em processos biológicos (BP), componentes celulares (CC) e funções moleculares(MF) 13. A análise KEGG foi então usada para identificar vias enriquecidas associadas aosgenes-alvo 14. Resultados de enriquecimento com valor P ajustado < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Os termos principais do GO e as vias KEGG foram exibidos como gráficos de barras e gráficos de bolhas usando ggplot2.

Análise de interação proteína-proteína (IBP)
A análise de IBP foi realizada enviando o conjunto de genes intersectados para o banco de dados STRING, com o organismo restrito a Homo sapiens. Nós desconectados foram removidos e as interações foram recuperadas usando um limiar de pontuação de confiança média (pontuação combinada ≥ 0,4). A rede PPI resultante foi então importada para uma ferramenta de visualização e análise de rede para análise topológica e identificar nós-chave.

Construção de um modelo candidato de classificação AF-ERS baseado em 12 algoritmos de aprendizado de máquina
Neste estudo, foi desenvolvido um framework de classificação em conjunto baseado em doze algoritmos convencionais de aprendizado de máquina para triar genes de assinatura de candidatos relacionados ao ERS associados à AF e otimizar o desempenho da classificação. Para particionamento de dados, após padronização e normalização, GSE41177 e GSE79768 foram fundidos para gerar a matriz de expressão da coorte de treinamento. GSE115574 foi usado como uma coorte independente de validação externa para avaliar a generalizabilidade do modelo. Especificamente, os DEGs foram identificados pela primeira vez na coorte de treinamento (|log2FC| >0,585, ajustado p < 0,05). Esses DEGs foram então intersectados com genes dos módulos-chave do WGCNA e genes relacionados ao ERS, e o conjunto de genes resultante foi usado como características de entrada para a construção do modelo.

Para ligar genes relacionados ao ERS com o fenótipo AF, foi desenvolvido um modelo de classificação candidato usando 12 abordagens de aprendizado de máquina: Lasso, Ridge, modelo linear generalizado passo a passo (Stepglm), aumento de gradiente extremo (XGBoost), floresta aleatória (RF), rede elástica (Enet), regressão de mínimos quadrados parciais para modelos lineares generalizados (plsRglm), modelagem de regressão generalizada impulsionada (GBM), Bayes naïve, análise discriminante linear (LDA), glmBoost, e máquina vetorial de suporte (SVM). Uma estratégia sistemática de modelagem combinatória foi adotada ao adicionar um segundo algoritmo ao primeiro e integrá-los via o parâmetro de ajuste α, resultando em 113 combinações de seleção de características e ajuste de modelos que foram avaliadas de forma abrangente. A discriminação do modelo foi avaliada calculando a área sob a curva característica operacional do receptor (AUC). De acordo com critérios de seleção de modelos previamente relatados, o modelo final do candidato foi definido como o modelo com melhor desempenho geral, conforme avaliado pela média de AUC entre as coortes de treinamento e validação.

Essa estratégia de modelagem combinatória foi informada por estudos anteriores em aprendizado de máquinabiomédico 15,16,17. Coletivamente, esses estudos indicam que nenhum algoritmo individual supera consistentemente outros em conjuntos de dados e tarefas analíticas. Com base nessa premissa, adotar uma estrutura de aprendizado em conjunto e modelagem combinatória pode aumentar a probabilidade de obter um modelo candidato de alto desempenho com generalizabilidade mais estável e melhorar a robustez da seleção do modelo.

Subsequentemente, os valores SHAPapley Aditivas (SHAP) foram aplicados para interpretar o modelo de aprendizado de máquina visualizando as principais características que impulsionam a classificação AF, quantificando assim a contribuição de cada característica para o resultado previsto e ilustrando como genes individuais de assinatura influenciam a saída final domodelo 18.

Avaliação do desempenho do modelo e validação externa do modelo ideal
O desempenho do modelo ótimo foi avaliado na coorte de treinamento e na coorte independente de validação externa (GSE115574). No nível do modelo, uma matriz de confusão foi construída com base nos rótulos de classe previstos, e as métricas de classificação correspondentes foram reportadas. Curvas de característica operacional do receptor (ROC) foram geradas usando o pacote R pROC, e o AUC foi calculado para quantificar o desempenho discriminativo.

No nível do biomarcador, curvas ROC de gene único foram plotadas para cada gene-chave no modelo ótimo, e os AUCs correspondentes foram calculados para avaliar sua capacidade discriminatória individual. Além disso, a expressão diferencial dos genes-chave foi resumida usando um gráfico vulcânico, e boxplots foram usados para representar suas distribuições de expressão em amostras de doenças versus saudáveis. Para avaliar ainda mais a generalização da assinatura gênica ótima previamente definida do modelo, uma validação externa independente adicional foi realizada usando GSE14975. GSE14975 contém dados transcriptômicos de amostras do apêndice auricular esquerdo, incluindo cinco amostras de fibrilação auricular e cinco amostras de ritmo/controle sinusal. Todos os genes incluídos na assinatura bloqueada estavam disponíveis neste conjunto de dados. Para manter a consistência com o fluxo de trabalho analítico original entre coortes, a coorte de desenvolvimento e GSE14975 foram harmonizadas usando ComBat com a fonte do conjunto de dados como variável em lote. Essa harmonização era realizada de forma não supervisionada. Importante ressaltar que rótulos de doença/controle de GSE14975 não foram usados para seleção de características, estimativa de coeficientes, determinação de limiar ou ajuste de hiperparâmetros.

O modelo ótimo de pontuação derivado do modelo foi ajustado usando apenas a coorte de desenvolvimento e depois aplicado a GSE14975 para validação externa. O desempenho do modelo em GSE14975 foi avaliado usando análise da curva característica operacional do receptor, área sob a curva, intervalo de confiança (IC) de 95%, sensibilidade, especificidade, precisão, valores preditivos positivos e negativos, e pontuação Brier. Além disso, curvas ROC de gene único foram geradas para todos os genes ideais derivados do modelo em GSE14975 para ilustrar sua habilidade discriminatória individual. Para avaliar ainda mais o potencial sobreajuste na coorte de desenvolvimento, foram realizadas repetidas validações cruzadas 10 vezes e correção de otimismo bootstrap usando a assinatura gênica derivada do modelo ótimo bloqueado. Para validação cruzada repetida, a coorte de desenvolvimento foi repetidamente dividida em 10 vezes, e a discriminação do modelo foi resumida em todas as iterações. Para validação bootstrap, foram geradas 1.000 reamostras bootstrap para estimar o otimismo do desempenho aparente do conjunto de desenvolvimento e calcular o AUC corrigido pelo otimismo. Como a assinatura final foi derivada do modelo ótimo, a contribuição de cada gene foi interpretada principalmente de acordo com a magnitude absoluta e a direção dos coeficientes do modelo. Além disso, análises ROC de gene único foram realizadas em GSE14975 para ilustrar a capacidade discriminatória individual de cada gene componente. Para fins de visualização, curvas ROC de um único gene foram orientadas para refletir a capacidade discriminatória, independentemente de expressão maior ou menor estar associada à FA.

Análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA)
Para explorar as implicações funcionais dos genes-chave, o GSEA foi realizado utilizando amostras do grupo de doenças19. Para cada gene chave, as amostras foram estratificadas em subgrupos de alta e baixa expressão, usando o valor mediano de expressão no grupo da doença como limite. A diferença média de expressão entre os dois subgrupos para cada gene foi calculada, e uma lista ordenada de genes foi gerada em ordem decrescente como entrada para análise de enriquecimento. O GSEA foi conduzido usando o cluster Profile do pacote R, com conjuntos de genes obtidos da coleção MSigDB c2.cp.kegg.Hs.symbols.gmt. A significância estatística foi definida como p < 0,05. A direção do enriquecimento foi determinada pelo sinal da pontuação de enriquecimento normalizado (NES), e gráficos de enriquecimento foram gerados para caminhos representativos.

Avaliação da abundância de subtipos de células imunes e expressão diferencial
O algoritmo de deconvolução CIBERSORT foi aplicado para estimar a abundância relativa de subconjuntos de células imunes infiltrantes e suas inter-relações entre amostras. Com base na matriz de assinatura leucocitária LM22, a composição das células imunes foi inferida quantitativamente a partir dos perfis de expressão gênica usando o pacote RCIBERSORT 20. Um limiar de p < 0,05 foi usado para filtrar resultados, e apenas amostras que atenderam a esse critério foram mantidas para análises subsequentes. Diagramas de caixa foram gerados para comparar as frações relativas estimadas de subconjuntos de células imunológicas entre os grupos FA e controle. Além disso, a análise de correlação de Spearman foi realizada para avaliar as associações entre os níveis de infiltração das células imunes e a expressão gênica central.

Análise de célula única
A análise transcriptômica de célula única foi realizada usando o conjunto de dados GEO GSE165838. Matrizes brutas de contagem de células genéticas foram importadas para R e processadas usando Seurat v4.4.0. Para cada amostra, um objeto Seurat foi gerado usando CreateSeuratObject com min.cells = 5 e min.features = 300. Métricas de controle de qualidade, incluindo o número de genes detectados, contagens totais de identificadores moleculares únicos (UMI), porcentagem de genes mitocondriais, percentual de genes ribossomiais e porcentagem de genes de hemoglobina, foram calculadas para cada célula. As células foram mantidas se tivessem mais de 500 genes detectados, menos de 5.000 contagens de UMI, porcentagem de genes mitocondrials < 25%, porcentagem de genes ribassomômicos > 3% e percentual de genes de hemoglobina < 1%. Genes detectados em menos de três células foram removidos. Genes MALAT1 e mitocondriais também foram excluídos antes da análise a jusante. O DoubletFinder era usado para detectar e excluir potenciais doublets. Resumidamente, as células foram divididas pela identidade da amostra, e a detecção de duplos foi realizada separadamente para cada amostra usando componentes principais de 1 a 30.

O parâmetro pN foi definido para 0,25, e o valor ótimo de pK foi selecionado de acordo com a métrica máxima de BC obtida a partir do varrimento de parâmetros. A taxa esperada de duplicação foi estimada de acordo com o número de células recuperadas em cada amostra, com taxas de 2,5%, 5% e 6,5% usadas para amostras com números celulares relativamente baixos, intermediários e altos, respectivamente. Apenas células classificadas como singlets foram mantidas. A contaminação por RNA ambiente foi ainda mais estimada usando DecontX, e células com pontuação de contaminação ≥ 0,2 foram excluídas. Após controle de qualidade, remoção de doublet e filtragem de RNA ambiente, 40.886 células e 23.947 genes foram retidos para análise posterior. O conjunto de dados filtrado de célula única foi normalizado com o método LogNormalize usando um fator de escala de 10.000, seguido pela identificação de genes altamente variáveis. Os dados foram então escalonados antes da análise de componentes principais.

Para reduzir efeitos de lote específicos de amostra, o Harmony foi aplicado usando orig.ident como variável de lote. A visualização da Aproximação e Projeção de Variedades Uniformes (UMAP) e a construção do grafo do vizinho mais próximo foram realizadas usando as primeiras 15 dimensões corrigidaspor Harmony 21. O agrupamento foi realizado usando o algoritmo de Louvain, e múltiplas resoluções de agrupamento foram avaliadas. A última grande anotação de tipo de célula foi baseada no resultado de agrupamento com resolução 0,05. Os agrupamentos celulares foram anotados manualmente de acordo com a expressão canônica do marcador gênico. Essa estratégia de anotação baseada em marcadores é consistente com estudos anteriores de perfilamento imunológico de célulasúnicas 22. Células T foram identificadas por CD3D, CD3E e TRAC; células natural killer (NK) por NKG7, GNLY, NCAM1 e KLRG1; células monócito-macrófago por LYZ, CD14, FCGR3A, CD68, CD163, FCN1, TYROBP, S100A8 e S100A9; células B por MS4A1 e CD79A; células plasmáticas por MZB1 e XBP1; células endoteliais por PECAM1, VWF e CDH5; células musculares lisas vasculares por ACTA2, TAGLN, MYH11 e MYL9; fibroblastos por DCN, LUM, COL1A1, COL1A2 e PDGFRA; células semelhantes a neutrófilos por FCGR3B, CXCR2, S100A8 e MPO; mastócitos por TPSB2; e células dendríticas por LILRA4, CD1C e XCR1. A expressão dos gene marcador entre clusters foi visualizada usando gráficos de pontos, e a distribuição de expressão dos genes finais relacionados ao ERS hub foi visualizada nos embeddings do UMAP.

Para quantificar a atividade transcricional relacionada ao ERS no nível de célula única, o conjunto final de genes hub foi usado para calcular escores de assinatura célula a célula usando AUCell, análise de enriquecimento de conjuntos gênicos de amostra única e Seurat AddModuleScore. Para o AUCell, as classificações celulares foram construídas a partir da matriz de expressão de RNA normalizada, e as pontuações do AUC foram calculadas usando o conjunto de genes hub, tendo os 10% melhores dos genes ranqueados como limiar máximo de classificação. Para o ssGSEA, as pontuações de enriquecimento foram calculadas usando o pacote GSVA. As três saídas de pontuação foram centralizadas e escaladas, depois normalizadas ao máximo e, finalmente, somadas para gerar uma pontuação composta integrada relacionada ao ERS para cada célula. A distribuição da pontuação composta foi comparada entre populações celulares anotadas para avaliar a heterogeneidade dos tipos celulares do programa relacionado ao ERS. Como a linhagem monócito-macrófago apresentou enriquecimento proeminente relacionado à assinatura de ERS e estava intimamente associada à remodelação imuno-inflamatória, foi selecionada para análises subsequentes dentro da linhagem. As células monocyto-macrófago foram divididas em grupos de alta e baixa pontuação de acordo com a mediana da pontuação composta relacionada ao ERS. A análise da trajetória pseudotemporal foi então realizada em células monocito-macrófago usando monóculo.

Para análise de pseudotempo, um objeto CellDataSet foi criado a partir da matriz bruta de contagem usando um modelo de expressão binomial negativa. Fatores de tamanho e dispersões foram então estimados. Os genes de ordenação foram selecionados usando um limiar médio de expressão de ≥ 0,1 e dispersão empírica maior que a dispersão ajustada. A dimensionalidade foi reduzida com o algoritmo DDRTree, e as células foram ordenadas ao longo da trajetória inferida. Os padrões dinâmicos de expressão dos genes hub relacionados ao ERS ao longo do pseudotempo foram visualizados. A análise de comunicação célula-célula foi realizada usando o CellChat para explorar possíveis interações ligante-receptor envolvendo células monocito-macrófago com diferentes escores relacionados ao ERS. Para esta análise, as células monocito-macrófago foram rotuladas como de alta ou baixa pontuação de acordo com a mediana pontuação composta, enquanto outras células mantiveram seus tipos celulares originais. A matriz de expressão de RNA normalizada e as anotações correspondentes de grupos celulares foram usadas para criar o objeto CellChat. Para a análise de comunicação célula-célula, o banco de dados humano CellChatDB foi selecionado, e apenas interações de sinalização secretadas foram avaliadas. Genes superexpressos e pares ligante-receptor foram detectados antes do cálculo das probabilidades de comunicação. Grupos celulares contendo menos de 10 células foram excluídos da análise de interação. As probabilidades de comunicação em nível de via foram posteriormente estimadas e agregadas para comparar o número e a intensidade das interações entre populações celulares. Para facilitar a reprodutibilidade, uma tabela de checkpoints é fornecida abaixo vinculando cada etapa do protocolo à sua correspondente figura ou tabela de saída esperada (Arquivo Suplementar 1—Tabela Suplementar S2).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Identificação de genes diferencialmente expressos em FA
Para melhorar a comparabilidade entre coortes, dois conjuntos de dados transcriptômicos relacionados à AF (GSE41177 e GSE79768) foram integrados, e os efeitos em lote foram corrigidos na matriz de expressão mesclada. A Figura 2A,B mostra boxplots das distribuições globais de expressão antes e depois da correção por efeito de lote, que foram usados para avaliar se as ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este estudo integrou transcriptomas de célula única e a granel para investigar o papel do ERS na FA. Foi derivada uma assinatura gênica relacionada ao ERS, com discriminação favorável entre coortes, e esses sinais foram mapeados predominantemente para a linhagem monocito-macrófago e associados a extensa comunicação intercelular. Coletivamente, os achados sugerem que programas associados ao ERS estão acoplados à remodelação centrada em células imunológicas na FA. Comparado à triagem de bi...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não relatam conflitos de interesse nesta obra. Durante a revisão deste manuscrito, o ChatGPT da OpenAI foi usado apenas para auxiliar no polimento do inglês. Os autores revisaram, verificaram e editaram todo o texto assistido por IA e assumem total responsabilidade pela precisão e integridade do manuscrito final. Nenhuma ferramenta assistida por IA foi usada para gerar ideias de pesquisa, realizar análise de dados, interpretar resultados, criar figuras ou tabelas, ou tirar conclusões científicas. O trabalho relatado no artigo foi realizado pelos autores. F.T., PR. W: Redação - rascunho original, software, metodologia, visualização, validação e curadoria de dados. SY. T: Investigação e Metodologia. FF. B: Supervisão. QR. L: Supervisão, Metodologia, Curadoria de dados. XY. J, YX. X: Recuperação de literatura e interpretação de dados.

Materiais

```html
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AddModuleScoreFunção Seuratversão 4.4.0NA
AUCellBioconductorversão 1.32.0RRID:SCR_021327
caretCRANversão 7.0.1RRID:SCR_022524
celda / decontXBioconductorversão 1.24.0NA
CellChatGitHub / CellChatversão 2.2.0RRID:SCR_021946
CIBERSORT / LM22 signature matrixCIBERSORTLM22NA
clusterProfilerBioconductorversão 4.12.6RRID:SCR_016884
CytoscapeCytoscape Consortiumversão 3.10RRID:SCR_003032
DoubletFinderGitHub / McGinnis Labversão 2.0.4NA
e1071CRANversão 1.7.16NA
gbmCRANversão 2.2.2NA
Gene Expression Omnibus (GEO) databaseNational Center for Biotechnology Information (NCBI)GSE41177NA
Gene Expression Omnibus (GEO) databaseNCBIGSE79768NA
Gene Expression Omnibus (GEO) databaseNCBIGSE115574NA
Gene Expression Omnibus (GEO) databaseNCBIGSE14975NA
Gene Expression Omnibus (GEO) databaseNCBIGSE165838NA
glmnetCRANversão 4.1.8NA
HarmonyCRANversão 1.2.4NA
limmaBioconductorversão 3.60.6RRID:SCR_010943
MASSCRANversão 7.3.61NA
mboostCRANversão 2.9.11NA
MonocleBioconductorversão 2.38.0RRID:SCR_016339
org.Hs.eg.dbBioconductorversão 3.19.1NA
plsRglmCRANversão 1.5.1NA
pROCCRANversão 1.18.5RRID:SCR_024286
R statistical softwareR Foundation for Statistical Computingversão 4.4.2RRID:SCR_001905
randomForestCRANversão 4.7.1.2RRID:SCR_015718
RStudioPosit Software, PBCversão 2024.4.1.748RRID:SCR_000432
SeuratCRAN / Satija Labversão 4.4.0RRID:SCR_016341
shapvizCRANversão 0.10.2NA
svaBioconductorversão 3.52.0NA
WGCNACRANversão 1.73RRID:SCR_003302
xgboostCRANversão 1.7.8.1NA
```

Referências

  1. Saleh K, Haldar S. Atrial fibrillation: a contemporary update. Clin Med (Lond). 2023;23(5):437-41.
  2. Lemme M, et al. Atrial-like engineered heart tissue: an in vitro model of the human atrium. Stem Cell Reports. 2018;11(6):1378-90.
  3. van Gorp PRR, Trines SA, Pijnappels DA, de Vries AAF. Multicellular in vitro models of cardiac arrhythmias: focus on atrial fibrillation. Front Cardiovasc Med. 2020;7:43.
  4. Scherr D, et al. Five-year outcome of catheter ablation of persistent atrial fibrillation using termination of atrial fibrillation as a procedural endpoint. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2015;8(1):18-24.
  5. Staerk L, et al. Atrial fibrillation: epidemiology, pathophysiology, and clinical outcomes. Circ Res. 2017;120(9):1501-17.
  6. Schotten U, Verheule S, Kirchhof P, Goette A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiol Rev. 2011;91(1):265-325.
  7. Van Wagoner DR, Chung MK. Inflammation, inflammasome activation, and atrial fibrillation. Circulation. 2018;138(20):2243-6.
  8. Yuan M, et al. IP3R1/GRP75/VDAC1 complex mediates endoplasmic reticulum stress-mitochondrial oxidative stress in diabetic atrial remodeling. Redox Biol. 2022;52:102289.
  9. Wang M, Kaufman RJ. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 2016;529(7586):326-35.
  10. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47.
  11. Langfelder P, Horvath S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 2008;9:559.
  12. Hu H, et al. Dissection of metabolome and transcriptome: insights into capsaicin and flavonoid accumulation in two typical Yunnan Xiaomila fruits. Int J Mol Sci. 2024;25(14):7761.
  13. Chen GY, et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong Recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022;2022:7858925.
  14. Chen GY, et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:5233462.
  15. Díaz-Uriarte R, Alvarez de Andrés S. Gene selection and classification of microarray data using random forest. BMC Bioinformatics. 2006;7:3.
  16. Saeys Y, Inza I, Larrañaga P. A review of feature selection techniques in bioinformatics. Bioinformatics. 2007;23(19):2507-17.
  17. Statnikov A, Wang L, Aliferis CF. A comprehensive comparison of random forests and support vector machines for microarray-based cancer classification. BMC Bioinformatics. 2008;9:319.
  18. Liu H, et al. Unraveling diethyl phthalate-induced prostate carcinogenesis: core targets revealed by integrated network toxicology, machine learning, and structural validation. Hum Genomics. 2025;19(1):149.
  19. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545-50.
  20. Newman AM, et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nat Methods. 2015;12(5):453-7.
  21. Xu H, et al. Single-cell transcriptomics reveals CCL3+ classical monocyte subset linked to autoimmune pathogenesis. J Inflamm Res. 2025;18:16273-91.
  22. Wang Y, et al. Immunological profiling of rheumatoid factor-positive primary Sjögren’s syndrome by single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 2026;17:1822615.
  23. Wiersma M, et al. Endoplasmic reticulum stress is associated with autophagy and cardiomyocyte remodeling in experimental and human atrial fibrillation. J Am Heart Assoc. 2017;6(10):e006458.
  24. Hu HJ, et al. Hydrogen sulfide ameliorates angiotensin II-induced atrial fibrosis progression to atrial fibrillation through inhibition of the Warburg effect and endoplasmic reticulum stress. Front Pharmacol. 2021;12:690371.
  25. Liu Y, et al. Integrative transcriptomic, proteomic, and machine learning approach to identifying feature genes of atrial fibrillation using atrial samples from patients with valvular heart disease. BMC Cardiovasc Disord. 2021;21(1):52.
  26. Fu S, et al. Using integrative bioinformatics approaches and machine-learning strategies to identify potential signatures for atrial fibrillation. Int J Cardiol Heart Vasc. 2025;56:101592.
  27. Wu S, et al. Multiplex proteomics identifies inflammation-related plasma biomarkers for aging and cardio-metabolic disorders. Clin Proteomics. 2024;21(1):30.
  28. Xie Z, et al. Identification and verification of biomarkers and immune infiltration in obesity-related atrial fibrillation. Biology (Basel). 2023;12(1):121.
  29. Huo TM, Wang ZW. Comprehensive analysis to identify key genes involved in advanced atherosclerosis. Dis Markers. 2021;2021:4026604.
  30. Chen M, et al. Weighted gene co-expression network analysis identifies crucial genes mediating progression of carotid plaque. Front Physiol. 2021;12:601952.
  31. Wang S, et al. S100A8/A9 in inflammation. Front Immunol. 2018;9:1298.
  32. Wang Q, et al. Myeloid-specific S100A8/A9 deficiency attenuates atrial fibrillation through prevention of TLR4/NF-κB-mediated immune cell recruitment and inflammation. Front Immunol. 2025;16:1623486.
  33. Wu CL, Yin R, Wang SN, Ying R. A review of CXCL1 in cardiac fibrosis. Front Cardiovasc Med. 2021;8:674498.
  34. Zhang YF, et al. CXCR4 and TYROBP mediate the development of atrial fibrillation via inflammation. J Cell Mol Med. 2022;26(12):3557-67.
  35. Hulsmans M, et al. Recruited macrophages elicit atrial fibrillation. Science. 2023;381(6654):231-9.
  36. van der Net JB, et al. Arachidonate 5-lipoxygenase-activating protein gene and coronary heart disease risk in familial hypercholesterolemia. Atherosclerosis. 2009;203(2):472-8.
  37. Ye X, et al. ALOX5AP predicts poor prognosis by enhancing M2 macrophage polarization and immunosuppression in serous ovarian cancer microenvironment. Front Oncol. 2021;11:675104.
  38. Song P, Deng H, Liu Y, Zhang M. Integrated bioinformatics analysis and experimental validation reveal the relationship between ALOX5AP and the prognosis and immune microenvironment in glioma. BMC Med Genomics. 2024;17(1):218.
  39. Chen S, Tang L, Guillot A, Liu H. Bariatric surgery associates with nonalcoholic steatohepatitis/hepatocellular carcinoma amelioration via SPP1 suppression. Metabolites. 2023;13(1):11.
  40. Ji H, et al. Integrated genomic, transcriptomic, and epigenetic analyses identify a leukotriene synthesis-related M2 macrophage gene signature that predicts prognosis and treatment vulnerability in gliomas. Front Immunol. 2022;13:970702.
  41. Sirish P, et al. The critical roles of proteostasis and endoplasmic reticulum stress in atrial fibrillation. Front Physiol. 2021;12:793171.
  42. Sun Z, et al. Cross-talk between macrophages and atrial myocytes in atrial fibrillation. Basic Res Cardiol. 2016;111(6):63.
  43. Schall TJ, Proudfoot AEI. Overcoming hurdles in developing successful drugs targeting chemokine receptors. Nat Rev Immunol. 2011;11(5):355-63.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

MedicinaEdição 234Edição 234Valor VazioEdiçãoAnálise de Célula Únicaanálise SHAP
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.