Este protocolo descreve um método LAMP baseado em um chip microfluídico totalmente integrado, que permite a detecção na assistência médica de 15 patógenos causadores de infecções do trato respiratório inferior em pacientes de terapia intensiva dentro de uma hora.
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Artigo de método
Detecção Rápida no Ponto de Atendimento de Patógenos para Infecções do Trato Respiratório Inferior em Pacientes de UTI
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As infecções do trato respiratório inferior (ITRI) estão entre as principais causas de deterioração clínica e morte em pacientes gravemente enfermos. Na unidade de terapia intensiva (UTI), a identificação rápida do patógeno causador é essencial para uma terapia antimicrobiana adequada; no entanto, os métodos convencionais de cultura levam de 3 a 5 dias e apresentam taxas de positividade subótimas, particularmente para fungos. Abordagens moleculares, como a PCR, reduzem o tempo de análise, mas ainda dependem da extração manual de ácidos nucleicos e do termociclamento, limitando sua adequação para uso à beira do leito. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho para diagnóstico pontual baseado em um chip microfluídico totalmente integrado, com formato de disco (chip em CD), que combina a purificação de ácidos nucleicos com esferas magnéticas à amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP). Após uma etapa simplificada de liquefação e lise manual, a amostra processada é carregada no chip junto com dois frascos de reagentes pré-embalados. O instrumento então realiza autonomamente a extração, a amplificação a 65 °C e a leitura em tempo real da fluorescência, fornecendo resultados qualitativos para 15 alvos, nomeadamente 11 bactérias, 3 fungos e 1 patógeno atípico, em 45 minutos de tempo de execução do instrumento (aproximadamente 1 hora para o fluxo completo de trabalho de amostra à resposta, incluindo a etapa manual de pré-processamento). Apresentamos dados de detecção de 10 amostras da UTI, incluindo escarro, aspirados brônquicos e lavado broncoalveolar, abrangendo tanto infecções por um único patógeno quanto coinfecções polimicrobianas envolvendo até 7 organismos em um único chip. O design fechado da cartela minimiza o risco de contaminação por aerossóis, e a única etapa de carregamento não exige treinamento especializado, posicionando este sistema como uma ferramenta diagnóstica prática para uso à beira do leito pelas equipes da UTI.
Introdução
Entre pacientes gravemente doentes na UTI, as infecções do trato respiratório inferior, sendo a pneumonia associada à ventilação (PAV) a principal delas, continuam sendo um fator persistente de morbidade, ventilação mecânica prolongada e mortalidade excessiva1,4. O panorama microbiológico das infecções adquiridas na UTI no trato respiratório inferior (IRTI) difere acentuadamente do observado nas doenças adquiridas na comunidade. Predominam bactérias Gram-negativas multirresistentes (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii), muitas vezes em constelações polimicrobianas que dificultam os esquemas empíricos3,4. Os fungos oportunistas acrescentam uma camada adicional de complexidade. A aspergilose pulmonar invasiva, antes considerada uma característica típica de imunossupressão profunda, agora é reconhecida com frequência crescente em pacientes da UTI sem neutropenia, especialmente após gripe grave e COVID-195. Os algoritmos diagnósticos atuais para aspergilose combinam culturas de baixo rendimento com o teste de antígeno galactomanana (GM), mas o ensaio GM apresenta limitações conhecidas relacionadas às janelas diagnósticas e à sensibilidade variável em hospedeiros sem neutropenia6. Cada hora de atraso no início de uma terapia antimicrobiana adequada para sepse está associada a um aumento mensurável na mortalidade7. Em conjunto, a rapidez e a complexidade das infecções na UTI exigem ferramentas diagnósticas capazes de acompanhar a urgência clínica.
O cultivo microbiológico convencional, embora indispensável para testes de suscetibilidade, é fundamentalmente limitado em velocidade: o tempo de resposta varia de 3 a 5 dias, organismos fastidiosos são frequentemente não detectados e a positividade do cultivo fúngico permanece baixa8. O sequenciamento metagenômico de nova geração (mNGS) oferece uma alternativa imparcial, mas sua adoção clínica é limitada pelo custo, tempos de processamento de 24 a 48 horas, dependência de pipelines de bioinformática e viabilidade reduzida no ponto de atendimento9. Painéis baseados em PCR reduziram a lacuna de tempo, mas ainda exigem extração multi-etapa de ácidos nucleicos, equipamentos com ciclagem térmica e, nos formatos convencionais, eletroforese pós-amplificação10. Nenhuma dessas plataformas atende plenamente às demandas convergentes da UTI: velocidade inferior a uma hora, tempo mínimo de manipulação manual, cobertura multiplex de patógenos incluindo fungos e simplicidade operacional suficiente para pessoal não especializado em laboratório.
A amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) aborda várias dessas limitações. Primeiramente descrita por Notomi et al., o método amplifica o DNA alvo a uma temperatura constante de 65 °C utilizando um conjunto de quatro a seis iniciadores que reconhecem seis regiões distintas, impulsionado por uma polimerase deslocadora de fita11. A reação gera estruturas características de amplicons em formato de alça e semelhantes a couve-flor, detectáveis por fluorescência em tempo real, produzindo curvas em forma de S logo após a ultrapassagem do limiar. A sensibilidade em baixas concentrações de molde é alta, e o desenho com múltiplos iniciadores confere seletividade que limita resultados falsos positivos12,13. Quando combinada com plataformas de chips microfluídicos, a LAMP pode ser paralelizada para múltiplos alvos a partir de uma única carga de espécime14. Trabalhos anteriores demonstraram que sistemas de chip LAMP detectam patógenos respiratórios com tempo de resposta bem inferior a três horas15. Uma limitação importante desses sistemas, no entanto, é a dependência de extração manual separada de DNA, o que aumenta o tempo, a complexidade operacional e o risco de contaminação.
O sistema descrito aqui elimina esse gargalo. Baseado em um chip microfluídico descartável com formato de disco (86 mm de diâmetro), ele integra o carregamento da amostra, purificação de ácidos nucleicos com base em microesferas magnéticas e amplificação LAMP em 16 plex em um único cartucho selado (Figura 1). O operador realiza apenas uma breve etapa manual de liquefação-lise utilizando um tubo de processamento projetado especificamente para isso, e então carrega o lisado e dois frascos de reagentes no chip (Figura 2). A partir desse momento, o instrumento realiza de forma autônoma a extração, a amplificação isotérmica a 65 °C e a aquisição de fluorescência, fornecendo resultados qualitativos para 15 alvos clinicamente relevantes, a saber: 11 bactérias, 3 fungos (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) e 1 patógeno atípico (Mycoplasma pneumoniae), em 45 minutos. Um gene da família do ponto de quebra de neuroblastoma (NBPF), utilizado como controle interno, valida a adequação da amostra e a integridade da reação em cada ensaio. Este protocolo fornece instruções passo a passo para todo o fluxo de trabalho, desde a coleta da amostra na UTI até o pré-processamento, carregamento do chip, detecção automatizada e interpretação dos resultados, destinado tanto a profissionais de laboratório clínico quanto às equipes de atendimento à beira do leito na UTI.
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Protocolo
Todas as amostras foram coletadas sob um protocolo aprovado pelo Comitê de Revisão de Ética do Hospital Peking Union Medical College, Academia Chinesa de Ciências Médicas (Número de Aprovação I-24PJ1778). O consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante ou de seu representante legalmente autorizado antes da coleta das amostras. O painel de patógenos-alvo e as atribuições dos poços de reação estão listados na Tabela 1, e os consumíveis utilizados durante o pré-processamento das amostras estão listados na Tabela 2.
1. Coleta de amostras clínicas do trato respiratório inferior na UTI
- Coleta de escarro
- Enxaguar a cavidade oral com água limpa ou soro fisiológico estéril três vezes para remover resíduos alimentares e a flora oral comensal.
- Instruir o paciente a realizar duas a três respirações profundas, depois tossir com força para expelir escarro respiratório profundo diretamente em um copo estéril de coleta.
NOTA: Um espécime aceitável consiste em material viscoso, purulento ou com estrias de sangue proveniente abaixo da traqueia; saliva clara ou drenagem pós-nasal é inadequada e pode comprometer a detecção subsequente.
- Coleta de aspirado brônquico (BAS)
- Para pacientes não entubados, inserir um cateter de aspiração estéril (um cateter de 10–12 Fr, com a fonte de aspiração ajustada a uma pressão de −0.0267 MPa, equivalente a −200 mmHg) pela via nasal ou oral até uma profundidade de aproximadamente 30 cm.
- Aplicar aspiração enquanto gira o cateter e retirar o cateter lentamente. Coletar as secreções aspiradas em uma armadilha estéril para espécimes.
NOTA: Se as secreções forem escassas, instilar aproximadamente 5 mL de soro fisiológico estéril através do cateter antes da aspiração. - Para pacientes em ventilação mecânica, selecionar o cateter de aspiração de acordo com o tamanho do tubo endotraqueal: usar um cateter de 10 Fr para um tubo de 7,0–7,5 mm e um cateter de 12 Fr para um tubo de 8,0 mm.
- Pré-oxigenar o paciente com oxigênio a 100% por 30–60 s antes da aspiração. Desconectar o circuito do ventilador e inserir o cateter selecionado pela via aérea artificial até encontrar resistência.
- Aplicar uma pressão negativa de −0.0267 MPa (equivalente a −200 mmHg), limitando cada passagem de aspiração, e consequentemente o tempo de desconexão do ventilador, a não mais que 15 s para minimizar a derecrutação e hipoxemia, e reoxigenar o paciente com oxigênio a 100% por 30–60 s após a aspiração.
- Instilar 1–2 mL de soro fisiológico estéril através do cateter e aguardar 3 s.
- Aplicar aspiração e retirar o cateter. Coletar as secreções aspiradas em uma armadilha estéril para espécimes. Reconectar imediatamente o circuito do ventilador após a coleta do espécime.
NOTA: É essencial manter técnica asséptica rigorosa durante todo o procedimento para evitar contaminação nosocomial do espécime.
- Coleta de lavado broncoalveolar (BALF)
- Identificar o segmento-alvo na imagem de tórax. Avançar o broncoscópio e posicioná-lo firmemente no brônquio segmentar ou subsegmentar apropriado.
- Instilar alíquotas de 20–50 mL de soro fisiológico estéril rapidamente, por 3–5 alíquotas (total de 60–120 mL). Aplicar sucção suave após cada alíquota e, em seguida, coletar o fluido recuperado em um recipiente estéril e vedado.
ATENÇÃO: Monitoramento hemodinâmico e ventilatório contínuo é obrigatório durante o BAL em pacientes na UTI. Ajustar os parâmetros do ventilador conforme necessário para pacientes em ventilação mecânica.
NOTA: A recuperação típica é de 40–60% do volume instilado. Uma baixa recuperação pode exigir reposicionamento da ponta do broncoscópio.
2. Liquefação e lise de patógenos
- Usando a pipeta descartável #2, aspire a amostra até a linha marcada (aproximadamente 1 mL) e transfira-a para o tubo de liquefação. Aperte repetidamente a bolsa da pipeta para transferir todo o material viscoso e, em seguida, tampe o tubo.
NOTA: Para LBA ou escarro aquoso, carregue dois volumes da pipeta para garantir entrada suficiente de patógenos. - Agite vigorosamente o tubo de liquefação manualmente por 1 min. Inspecione visualmente a amostra e continue agitando até que não haja mais grumos visíveis de muco e a amostra escoe livremente pela pipeta descartável #1 sem resistência (consistência uniforme, semelhante à da água). Agite por pelo menos 1 min, prolongando o tempo conforme necessário para amostras altamente viscosas até que esses critérios sejam atendidos.
- Abra a tampa de vedação do tubo de lise.
- Aspire aproximadamente 0,5 mL da amostra homogeneizada usando a pipeta descartável #1 e transfira a amostra para o tubo de lise.
- Feche a tampa de vedação e verifique se a tampa da ponta está firmemente apertada.
- Encaixe o tubo de lise no dispositivo de pré-processamento de amostra (dispositivo SP), pressionando para baixo até que fique firme. Pressione Iniciar.
- Permita que o dispositivo SP conclua o ciclo automatizado de liquefação-lise (parâmetros na Tabela 3), com duração aproximada de 15 min.
NOTA: Não abra nem remova o tubo durante o processamento.
3. Carregamento do chip e detecção automatizada
- Carregamento de reagentes e amostras
- Retire o chip de CD do armazenamento a 4 °C e equilibre-o à temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) por 10 min.
NOTA: Os frascos de reagentes O e B e o lisado pré-processado são utilizados à temperatura ambiente; a amplificação LAMP em chip é realizada a 65 °C (ver etapa 3.2.3 e Tabela 3). - Abra a embalagem de folha e coloque o chip sobre uma superfície plana.
- Gire a tampa no sentido anti-horário para abrir o chip.
- Agite levemente o frasco O para recolher o líquido na parte inferior do frasco.
- Destampe o frasco O, insira o bico no orifício O e dispense todo o conteúdo no orifício.
- Descarte o frasco O. Repita o procedimento utilizando o frasco B e o orifício B.
- Remova o tubo de lise processado do dispositivo SP e retire a tampa da ponta.
- Alinhe a ponta do tubo com o orifício S e dispense todo o volume de lisado no chip.
- Descarte o tubo de lise usado.
- Rotacione a tampa do chip no sentido horário até que dois estalos audíveis confirmem o fechamento completo.
NOTA: O carregamento incompleto de qualquer orifício pode causar falhas em canais individuais. Confirme a dispensação completa antes de fechar. Para evitar vedação incompleta e riscos de contaminação, não use luvas de PE ao fechar a tampa; recomenda-se o uso de luvas de látex ou nitrílica.
- Retire o chip de CD do armazenamento a 4 °C e equilibre-o à temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) por 10 min.
- Operação do equipamento
- Ligue o analisador automático de ácidos nucleicos. Toque em Detectar, escaneie o código de barras na embalagem de folha do chip e insira as informações demográficas do paciente e o ID da amostra.
- Posicione o chip no eixo rotativo e pressione para baixo até que um estalo confirme o engate.
- Toque em Iniciar. O equipamento realiza autonomamente a distribuição centrífuga dos reagentes, extração com microesferas magnéticas, amplificação LAMP a 65 °C e aquisição de fluorescência. O tempo de execução é de aproximadamente 45 min (o carregamento de reagentes/amostras e o fluxo de trabalho do equipamento são resumidos na Figura 3).
NOTA: Não abra a tampa durante a execução.
- Interpretação dos resultados
- O software identifica o ponto de inflexão de cada curva de amplificação em forma de S por meio da análise do máximo da segunda derivada e relata o valor TP correspondente (tempo até a positividade).
- Compare cada valor TP com o limiar correspondente listado na Tabela 4. Classifique os canais com valores TP iguais ou inferiores ao limiar como positivos e os canais com valores TP superiores ao limiar como negativos.
- Verifique se o canal do controle interno (poço 16) exibe uma curva de amplificação em forma de S com valor TP inferior a 12 min.
- Rejeite a execução se o controle interno falhar. Repita o teste utilizando um chip novo ou colete novamente a amostra.
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Resultados
Após a conclusão de uma execução válida, o instrumento exibiu traçados de fluorescência em tempo real para todos os 16 canais. Os canais positivos exibiram a cinética de amplificação em forma de S esperada, com valores de TP anotados automaticamente, enquanto os canais negativos permaneceram na linha de base. O canal IC (poço 16) gerou uma curva em forma de S com TP < 12 min em todas as execuções válidas.
Como demonstração piloto e de prova de conceito do protocolo, foram selecionados 10 e...
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Discussão
A identificação rápida de patógenos é fundamental no manejo de infecções em UTI. O sistema descrito aqui reduz o tempo para identificação do patógeno, que normalmente leva de 3 a 5 dias com o cultivo, para menos de 1 hora, um período em que as decisões sobre antimicrobianos de primeira linha frequentemente são tomadas7. Ao integrar a extração e purificação de ácidos nucleicos e a amplificação LAMP em 16 plexos em um único chip selado, este fluxo de trabalho elimina a etapa manual de extração de DN...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesses.
Agradecimentos
Doenças Crônicas Não Transmissíveis - Projeto Nacional de Ciência e Tecnologia (nº 2023ZD0516500), Financiamento para Pesquisa Clínica de Hospitais de Alto Nível (2026-PUMCH-A-103) e Programa de Concurso Aberto da CMB (24-561) e Programa de Formação de Talentos do Hospital da Escola de Medicina da Universidade de Pequim (nº UGG11571).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Analisador Automatizado de Ácidos Nucléicos | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-T80-01 | TurboFlow T; realiza distribuição centrífuga de reagentes, extração com microesferas magnéticas, LAMP a 65 °C e detecção em tempo real de fluorescência (~45 min de execução) |
| Pipeta Pasteur descartável #1 | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Material descartável; 0,5 mL; transfere espécime homogeneizado para tubo de lise |
| Pipeta Pasteur descartável #2 | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Material descartável; 2 mL; aspira espécime até a linha marcada no tubo de liquefação |
| Chip de CD | Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd | Custom-made | Material descartável; disco de 86 mm com zona central de carregamento (portas O, B, S), zona de purificação com microesferas magnéticas e anel externo com 16 poços de reação (15 alvos patogênicos + controle interno NBPF) |
| Reagentes para reação LAMP | Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | 16730ES80 | Reagentes para reação LAMP pré-armazenados no chip de CD na forma de microesferas liofilizadas |
| Tubo de liquefação | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Material descartável; 2 mL/tubo; recebe espécime para homogeneização manual |
| Tubo de lise | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Material descartável; 0,5 mL/tubo; corpo compressível de silicone com membrana de filtro de 200 µm; reagentes de lise pré-carregados |
| Primeres | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | Custom-made | Mistura de primeres embutida na câmara de reação do chip de CD |
| Dispositivo de Pré-processamento de Amostras | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-R10-02 | TS-2000; ciclo automatizado de liquefação–lise (~15 min) |
| Frasco de dose única “B” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Material descartável; reagente pré-embalado no chip; um por teste; armazenado a 4 °C e equilibrado à temperatura ambiente (~25 °C) antes do carregamento |
| Frasco de dose única “O” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Material descartável; reagente pré-embalado no chip; um por teste; armazenado a 4 °C e equilibrado à temperatura ambiente (~25 °C) antes do carregamento |
Referências
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Reimpressões e permissões
