Este protocolo descreve um método LAMP baseado em um chip microfluídico totalmente integrado, que permite a detecção na assistência médica de 15 patógenos causadores de infecções do trato respiratório inferior em pacientes de terapia intensiva dentro de uma hora.
Artigo de método
Detecção Rápida no Ponto de Atendimento de Patógenos para Infecções do Trato Respiratório Inferior em Pacientes de UTI
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As infecções do trato respiratório inferior (ITRI) estão entre as principais causas de deterioração clínica e morte em pacientes gravemente enfermos. Na unidade de terapia intensiva (UTI), a identificação rápida do patógeno causador é essencial para uma terapia antimicrobiana adequada; no entanto, os métodos convencionais de cultura levam de 3 a 5 dias e apresentam taxas de positividade subótimas, particularmente para fungos. Abordagens moleculares, como a PCR, reduzem o tempo de análise, mas ainda dependem da extração manual de ácidos nucleicos e do termociclamento, limitando sua adequação para uso à beira do leito. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho para diagnóstico pontual baseado em um chip microfluídico totalmente integrado, com formato de disco (chip em CD), que combina a purificação de ácidos nucleicos com esferas magnéticas à amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP). Após uma etapa simplificada de liquefação e lise manual, a amostra processada é carregada no chip junto com dois frascos de reagentes pré-embalados. O instrumento então realiza autonomamente a extração, a amplificação a 65 °C e a leitura em tempo real da fluorescência, fornecendo resultados qualitativos para 15 alvos, nomeadamente 11 bactérias, 3 fungos e 1 patógeno atípico, em 45 minutos de tempo de execução do instrumento (aproximadamente 1 hora para o fluxo completo de trabalho de amostra à resposta, incluindo a etapa manual de pré-processamento). Apresentamos dados de detecção de 10 amostras da UTI, incluindo escarro, aspirados brônquicos e lavado broncoalveolar, abrangendo tanto infecções por um único patógeno quanto coinfecções polimicrobianas envolvendo até 7 organismos em um único chip. O design fechado da cartela minimiza o risco de contaminação por aerossóis, e a única etapa de carregamento não exige treinamento especializado, posicionando este sistema como uma ferramenta diagnóstica prática para uso à beira do leito pelas equipes da UTI.
Introdução
Entre pacientes gravemente doentes na UTI, as infecções do trato respiratório inferior, sendo a pneumonia associada à ventilação (PAV) a principal delas, continuam sendo um fator persistente de morbidade, ventilação mecânica prolongada e mortalidade excessiva1,4. O panorama microbiológico das infecções adquiridas na UTI no trato respiratório inferior (IRTI) difere acentuadamente do observado nas doenças adquiridas na comunidade. Predominam bactérias Gram-negativas multirresistentes (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii), muitas vezes em constelações polimicrobianas que dificultam os esquemas empíricos3,4. Os fungos oportunistas acrescentam uma camada adicional de complexidade. A aspergilose pulmonar invasiva, antes considerada uma característica típica de imunossupressão profunda, agora é reconhecida com frequência crescente em pacientes da UTI sem neutropenia, especialmente após gripe grave e COVID-195. Os algoritmos diagnósticos atuais para aspergilose combinam culturas de baixo rendimento com o teste de antígeno galactomanana (GM), mas o ensaio GM apresenta limitações conhecidas relacionadas às janelas diagnósticas e à sensibilidade variável em hospedeiros sem neutropenia6. Cada hora de atraso no início de uma terapia antimicrobiana adequada para sepse está associada a um aumento mensurável na mortalidade7. Em conjunto, a rapidez e a complexidade das infecções na UTI exigem ferramentas diagnósticas capazes de acompanhar a urgência clínica.
O cultivo microbiológico convencional, embora indispensável para testes de suscetibilidade, é fundamentalmente limitado em velocidade: o tempo de resposta varia de 3 a 5 dias, organismos fastidiosos são frequentemente não detectados e a positividade do cultivo fúngico permanece baixa8. O sequenciamento metagenômico de nova geração (mNGS) oferece uma alternativa imparcial, mas sua adoção clínica é limitada pelo custo, tempos de processamento de 24 a 48 horas, dependência de pipelines de bioinformática e viabilidade reduzida no ponto de atendimento9. Painéis baseados em PCR reduziram a lacuna de tempo, mas ainda exigem extração multi-etapa de ácidos nucleicos, equipamentos com ciclagem térmica e, nos formatos convencionais, eletroforese pós-amplificação10. Nenhuma dessas plataformas atende plenamente às demandas convergentes da UTI: velocidade inferior a uma hora, tempo mínimo de manipulação manual, cobertura multiplex de patógenos incluindo fungos e simplicidade operacional suficiente para pessoal não especializado em laboratório.
A amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) aborda várias dessas limitações. Primeiramente descrita por Notomi et al., o método amplifica o DNA alvo a uma temperatura constante de 65 °C utilizando um conjunto de quatro a seis iniciadores que reconhecem seis regiões distintas, impulsionado por uma polimerase deslocadora de fita11. A reação gera estruturas características de amplicons em formato de alça e semelhantes a couve-flor, detectáveis por fluorescência em tempo real, produzindo curvas em forma de S logo após a ultrapassagem do limiar. A sensibilidade em baixas concentrações de molde é alta, e o desenho com múltiplos iniciadores confere seletividade que limita resultados falsos positivos12,13. Quando combinada com plataformas de chips microfluídicos, a LAMP pode ser paralelizada para múltiplos alvos a partir de uma única carga de espécime14. Trabalhos anteriores demonstraram que sistemas de chip LAMP detectam patógenos respiratórios com tempo de resposta bem inferior a três horas15. Uma limitação importante desses sistemas, no entanto, é a dependência de extração manual separada de DNA, o que aumenta o tempo, a complexidade operacional e o risco de contaminação.
O sistema descrito aqui elimina esse gargalo. Baseado em um chip microfluídico descartável com formato de disco (86 mm de diâmetro), ele integra o carregamento da amostra, purificação de ácidos nucleicos com base em microesferas magnéticas e amplificação LAMP em 16 plex em um único cartucho selado (Figura 1). O operador realiza apenas uma breve etapa manual de liquefação-lise utilizando um tubo de processamento projetado especificamente para isso, e então carrega o lisado e dois frascos de reagentes no chip (Figura 2). A partir desse momento, o instrumento realiza de forma autônoma a extração, a amplificação isotérmica a 65 °C e a aquisição de fluorescência, fornecendo resultados qualitativos para 15 alvos clinicamente relevantes, a saber: 11 bactérias, 3 fungos (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) e 1 patógeno atípico (Mycoplasma pneumoniae), em 45 minutos. Um gene da família do ponto de quebra de neuroblastoma (NBPF), utilizado como controle interno, valida a adequação da amostra e a integridade da reação em cada ensaio. Este protocolo fornece instruções passo a passo para todo o fluxo de trabalho, desde a coleta da amostra na UTI até o pré-processamento, carregamento do chip, detecção automatizada e interpretação dos resultados, destinado tanto a profissionais de laboratório clínico quanto às equipes de atendimento à beira do leito na UTI.
Protocolo
Todas as amostras foram coletadas sob um protocolo aprovado pelo Comitê de Revisão de Ética do Hospital Peking Union Medical College, Academia Chinesa de Ciências Médicas (Número de Aprovação I-24PJ1778). O consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante ou de seu representante legalmente autorizado antes da coleta das amostras. O painel de patógenos-alvo e as atribuições dos poços de reação estão listados na Tabela 1, e os consumíveis utilizados durante o pré-processamento das amostras estão listados na Tabela 2.
1. Coleta de amostras clínicas do trato respiratório inferior na UTI
- Coleta de escarro
- Enxaguar a cavidade oral com água limpa ou soro fisiológico estéril três vezes para remover resíduos alimentares e a flora oral comensal.
- Instruir o paciente a realizar duas a três respirações profundas, depois tossir com força para expelir escarro respiratório profundo diretamente em um copo estéril de coleta.
NOTA: Um espécime aceitável consiste em material viscoso, purulento ou com estrias de sangue proveniente abaixo da traqueia; saliva clara ou drenagem pós-nasal é inadequada e pode comprometer a detecção subsequente.
- Coleta de aspirado brônquico (BAS)
- Para pacientes não entubados, inserir um cateter de aspiração estéril (um cateter de 10–12 Fr, com a fonte de aspiração ajustada a uma pressão de −0.0267 MPa, equivalente a −200 mmHg) pela via nasal ou oral até uma profundidade de aproximadamente 30 cm.
- Aplicar aspiração enquanto gira o cateter e retirar o cateter lentamente. Coletar as secreções aspiradas em uma armadilha estéril para espécimes.
NOTA: Se as secreções forem escassas, instilar aproximadamente 5 mL de soro fisiológico estéril através do cateter antes da aspiração. - Para pacientes em ventilação mecânica, selecionar o cateter de aspiração de acordo com o tamanho do tubo endotraqueal: usar um cateter de 10 Fr para um tubo de 7,0–7,5 mm e um cateter de 12 Fr para um tubo de 8,0 mm.
- Pré-oxigenar o paciente com oxigênio a 100% por 30–60 s antes da aspiração. Desconectar o circuito do ventilador e inserir o cateter selecionado pela via aérea artificial até encontrar resistência.
- Aplicar uma pressão negativa de −0.0267 MPa (equivalente a −200 mmHg), limitando cada passagem de aspiração, e consequentemente o tempo de desconexão do ventilador, a não mais que 15 s para minimizar a derecrutação e hipoxemia, e reoxigenar o paciente com oxigênio a 100% por 30–60 s após a aspiração.
- Instilar 1–2 mL de soro fisiológico estéril através do cateter e aguardar 3 s.
- Aplicar aspiração e retirar o cateter. Coletar as secreções aspiradas em uma armadilha estéril para espécimes. Reconectar imediatamente o circuito do ventilador após a coleta do espécime.
NOTA: É essencial manter técnica asséptica rigorosa durante todo o procedimento para evitar contaminação nosocomial do espécime.
- Coleta de lavado broncoalveolar (BALF)
- Identificar o segmento-alvo na imagem de tórax. Avançar o broncoscópio e posicioná-lo firmemente no brônquio segmentar ou subsegmentar apropriado.
- Instilar alíquotas de 20–50 mL de soro fisiológico estéril rapidamente, por 3–5 alíquotas (total de 60–120 mL). Aplicar sucção suave após cada alíquota e, em seguida, coletar o fluido recuperado em um recipiente estéril e vedado.
ATENÇÃO: Monitoramento hemodinâmico e ventilatório contínuo é obrigatório durante o BAL em pacientes na UTI. Ajustar os parâmetros do ventilador conforme necessário para pacientes em ventilação mecânica.
NOTA: A recuperação típica é de 40–60% do volume instilado. Uma baixa recuperação pode exigir reposicionamento da ponta do broncoscópio.
2. Liquefação e lise de patógenos
- Usando a pipeta descartável #2, aspire a amostra até a linha marcada (aproximadamente 1 mL) e transfira-a para o tubo de liquefação. Aperte repetidamente a bolsa da pipeta para transferir todo o material viscoso e, em seguida, tampe o tubo.
NOTA: Para LBA ou escarro aquoso, carregue dois volumes da pipeta para garantir entrada suficiente de patógenos. - Agite vigorosamente o tubo de liquefação manualmente por 1 min. Inspecione visualmente a amostra e continue agitando até que não haja mais grumos visíveis de muco e a amostra escoe livremente pela pipeta descartável #1 sem resistência (consistência uniforme, semelhante à da água). Agite por pelo menos 1 min, prolongando o tempo conforme necessário para amostras altamente viscosas até que esses critérios sejam atendidos.
- Abra a tampa de vedação do tubo de lise.
- Aspire aproximadamente 0,5 mL da amostra homogeneizada usando a pipeta descartável #1 e transfira a amostra para o tubo de lise.
- Feche a tampa de vedação e verifique se a tampa da ponta está firmemente apertada.
- Encaixe o tubo de lise no dispositivo de pré-processamento de amostra (dispositivo SP), pressionando para baixo até que fique firme. Pressione Iniciar.
- Permita que o dispositivo SP conclua o ciclo automatizado de liquefação-lise (parâmetros na Tabela 3), com duração aproximada de 15 min.
NOTA: Não abra nem remova o tubo durante o processamento.
3. Carregamento do chip e detecção automatizada
- Carregamento de reagentes e amostras
- Retire o chip de CD do armazenamento a 4 °C e equilibre-o à temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) por 10 min.
NOTA: Os frascos de reagentes O e B e o lisado pré-processado são utilizados à temperatura ambiente; a amplificação LAMP em chip é realizada a 65 °C (ver etapa 3.2.3 e Tabela 3). - Abra a embalagem de folha e coloque o chip sobre uma superfície plana.
- Gire a tampa no sentido anti-horário para abrir o chip.
- Agite levemente o frasco O para recolher o líquido na parte inferior do frasco.
- Destampe o frasco O, insira o bico no orifício O e dispense todo o conteúdo no orifício.
- Descarte o frasco O. Repita o procedimento utilizando o frasco B e o orifício B.
- Remova o tubo de lise processado do dispositivo SP e retire a tampa da ponta.
- Alinhe a ponta do tubo com o orifício S e dispense todo o volume de lisado no chip.
- Descarte o tubo de lise usado.
- Rotacione a tampa do chip no sentido horário até que dois estalos audíveis confirmem o fechamento completo.
NOTA: O carregamento incompleto de qualquer orifício pode causar falhas em canais individuais. Confirme a dispensação completa antes de fechar. Para evitar vedação incompleta e riscos de contaminação, não use luvas de PE ao fechar a tampa; recomenda-se o uso de luvas de látex ou nitrílica.
- Retire o chip de CD do armazenamento a 4 °C e equilibre-o à temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) por 10 min.
- Operação do equipamento
- Ligue o analisador automático de ácidos nucleicos. Toque em Detectar, escaneie o código de barras na embalagem de folha do chip e insira as informações demográficas do paciente e o ID da amostra.
- Posicione o chip no eixo rotativo e pressione para baixo até que um estalo confirme o engate.
- Toque em Iniciar. O equipamento realiza autonomamente a distribuição centrífuga dos reagentes, extração com microesferas magnéticas, amplificação LAMP a 65 °C e aquisição de fluorescência. O tempo de execução é de aproximadamente 45 min (o carregamento de reagentes/amostras e o fluxo de trabalho do equipamento são resumidos na Figura 3).
NOTA: Não abra a tampa durante a execução.
- Interpretação dos resultados
- O software identifica o ponto de inflexão de cada curva de amplificação em forma de S por meio da análise do máximo da segunda derivada e relata o valor TP correspondente (tempo até a positividade).
- Compare cada valor TP com o limiar correspondente listado na Tabela 4. Classifique os canais com valores TP iguais ou inferiores ao limiar como positivos e os canais com valores TP superiores ao limiar como negativos.
- Verifique se o canal do controle interno (poço 16) exibe uma curva de amplificação em forma de S com valor TP inferior a 12 min.
- Rejeite a execução se o controle interno falhar. Repita o teste utilizando um chip novo ou colete novamente a amostra.
Resultados
Após a conclusão de uma execução válida, o instrumento exibiu traçados de fluorescência em tempo real para todos os 16 canais. Os canais positivos exibiram a cinética de amplificação em forma de S esperada, com valores de TP anotados automaticamente, enquanto os canais negativos permaneceram na linha de base. O canal IC (poço 16) gerou uma curva em forma de S com TP < 12 min em todas as execuções válidas.
Como demonstração piloto e de prova de conceito do protocolo, foram selecionados 10 espécimes representativos para ilustrar a variedade de cenários clínicos encontrados na prática em UTI, incluindo 6 aspirados brônquicos (BAS), 2 amostras de lavado broncoalveolar (BALF) e 2 amostras de escarro profundo (Spt). Esses espécimes foram deliberadamente escolhidos para abranger casos monomicrobianos e polimicrobianos complexos, em vez de estimar a prevalência de patógenos; 8 dos 10 eram polimicrobianos (com 2 a 7 alvos cada) e 2 eram monomicrobianos. Os dados completos de TP são apresentados na Tabela 5, e curvas de amplificação representativas são mostradas na Figura 4.
Em um extremo do espectro de complexidade, a amostra S1 (BAS) produziu um único sinal positivo para Aspergillus spp. (TP = 8 min), enquanto todos os canais bacterianos permaneceram negativos. Esse padrão foi compatível com aspergilose invasiva isolada, um diagnóstico que a cultura convencional frequentemente não consegue detectar prontamente. A amostra S10 (Spt) igualmente apresentou um único resultado positivo para Streptococcus pneumoniae (TP = 5,5 min). Esses achados demonstraram a capacidade do ensaio em identificar infecções monomicrobianas em um contexto de 15 alvos patogênicos.
Infecções polimicrobianas foram observadas nas amostras restantes, compatíveis com a epidemiologia das infecções respiratórias em pacientes de UTI. As amostras S2–S5 continham cada uma Aspergillus spp. juntamente com um ou mais patógenos bacterianos e, em duas amostras, Candida albicans. A amostra mais complexa, S5 (LBA), gerou sete sinais positivos simultâneos, incluindo Aspergillus spp., Burkholderia cepacia, Corynebacterium striatum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Stenotrophomonas maltophilia. Esses resultados demonstraram a capacidade de detecção multiplex do chip microfluídico de 16 poços em condições de testes clínicos.
As amostras S6–S9, que continham coinfecções bacterianas sem envolvimento fúngico, variaram desde a detecção de dois patógenos (S6: B. cepacia e E. coli) até a detecção de quatro patógenos (S8: Acinetobacter baumannii, B. cepacia, Klebsiella pneumoniae e S. maltophilia). Em todas as 10 amostras, os valores de TP para os canais positivos variaram de 3,5 a 9 min, e todos os canais de controle interno atenderam ao critério pré-definido de validade de TP < 12 min.
Para este conjunto piloto, os resultados do chip foram comparados com dois métodos de referência realizados em paralelo nas mesmas 10 amostras: sequenciamento metagenômico direcionado de nova geração (tNGS) e cultura convencional de escarro. A concordância por alvo para os 15 canais de patógenos está resumida na Tabela 6. Em relação ao tNGS, o ensaio apresentou 100% de concordância percentual positiva (PPA) e 100% de concordância percentual negativa (NPA) em todos os alvos nestas amostras. Em relação à cultura de escarro, a PPA foi de 100% para cada alvo positivo na cultura, enquanto a NPA variou de 44,4% a 100%; os valores mais baixos de NPA refletiram alvos detectados pelo chip (e pelo tNGS), mas não recuperados na cultura, o que é consistente com a maior sensibilidade analítica da amplificação de ácidos nucleicos em relação à cultura, e não com positividade falsa. Considerando o tamanho reduzido e deliberadamente selecionado da amostra, esses valores representam estimativas descritivas de concordância para a coorte piloto e não devem ser interpretados como medidas formais de precisão diagnóstica. Como o tNGS é, por si só, um método baseado em ácidos nucleicos, a concordância com o tNGS confirma a concordância ao nível do ácido nucleico, mas não estabelece o status clínico de cada organismo; nenhum dos métodos, isoladamente, distingue infecção verdadeira de colonização.
Figura 1: Arquitetura do chip microfluídico e consumíveis associados. (A) Visão geral do chip em formato de disco de 86 mm, mostrando três zonas concêntricas: uma região de carregamento, uma região intermediária de purificação com esferas magnéticas e uma região externa de amplificação e detecção. (B) Anel externo de amplificação contendo os 16 poços de reação (posições 1, 4, 8, 12 e 16 indicadas). (C) Componentes do tubo de lise (tampa da ponteira, tampa de vedação e corpo do tubo). (D) Frascos de reagentes de dose única "O" e "B". (E) Região de carregamento mostrando o poço de amostra "S" e os poços de reagentes "O" e "B". Abreviações: O = reagente O; B = reagente B; S = amostra. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Kit de pré-processamento e fluxo de trabalho de pré-processamento da amostra. (A) O espécime é transferido para o tubo de liquefação e homogeneizado por agitação manual. (B) O espécime homogeneizado é transferido do tubo de liquefação para o tubo de lise. (C) O tubo de lise é colocado no dispositivo de pré-processamento da amostra (SP) para o ciclo automatizado de liquefação-lise. (D) Materiais descartáveis para pré-processamento: as pipetas descartáveis nº 1 e nº 2 (as setas vermelhas indicam as marcas de carregamento da amostra), o tubo de lise e o tubo de liquefação. Abreviação: SP = Pré-processamento da amostra. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fluxo de trabalho para carregamento do chip e detecção automatizada. (A) O frasco do reagente O, o frasco do reagente B e a amostra processada são carregados nos respectivos orifícios do chip (O, B e S). (B) O chip é montado e selado. (C) O chip é fixado no analisador automatizado de ácidos nucleicos e o código de barras é escaneado. (D) O ensaio é iniciado pela tela sensível ao toque, após o que a extração, amplificação e detecção de fluorescência de ácidos nucleicos prosseguem automaticamente. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Curvas de amplificação representativas obtidas a partir de 10 espécimes do trato respiratório inferior coletados de pacientes em UTI. Cada painel representa um único espécime (S1–S10). Curvas de amplificação em forma de S indicam alvos positivos com valores de TP anotados, enquanto traçados planos indicam alvos negativos. O espécime S1 continha apenas Aspergillus spp.; os espécimes S2–S5 continham Aspergillus spp. juntamente com patógenos bacterianos e/ou Candida albicans; os espécimes S6–S9 continham infecções bacterianas polimicrobianas; e o espécime S10 continha apenas Streptococcus pneumoniae. Os valores correspondentes de TP são fornecidos na Tabela 5. Abreviações: Aba = Acinetobacter baumannii; Asp = Aspergillus spp.; Bcc = Burkholderia cepacia; Cal = Candida albicans; Cst = Corynebacterium striatum; Eco = Escherichia coli; Hin = Haemophilus influenzae; IC = controle interno; Kpn = Klebsiella pneumoniae; Lpn = Legionella pneumophila; Mpn = Mycoplasma pneumoniae; Pae = Pseudomonas aeruginosa; Pji = Pneumocystis jirovecii; Sau = Staphylococcus aureus; Sma = Stenotrophomonas maltophilia; Spn = Streptococcus pneumoniae. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Poço | Alvo | Abreviação | Categoria | Tipo |
| 1 | Acinetobacter baumannii | Aba | Bactéria | Bactéria |
| 2 | Aspergillus spp. | Asp | Fungos | Fungo |
| 3 | Burkholderia cepacia | Bcc | Bactéria | Bactéria |
| 4 | Candida albicans | Cal | Fungos | Fungo |
| 5 | Corynebacterium striatum | Cst | Bactéria | Bactéria |
| 6 | Escherichia coli | Eco | Bactéria | Bactéria |
| 7 | Haemophilus influenzae | Hin | Bactéria | Bactéria |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Kpn | Bactéria | Bactéria |
| 9 | Legionella pneumophila | Lpn | Bactéria | Bactéria |
| 10 | Mycoplasma pneumoniae | Mpn | Atípico | Bactéria atípica |
| 11 | Pseudomonas aeruginosa | Pae | Bactéria | Bactéria |
| 12 | Pneumocystis jirovecii | Pji | Fungos | Fungo |
| 13 | Staphylococcus aureus | Sau | Bactéria | Bactéria |
| 14 | Stenotrophomonas maltophilia | Sma | Bactéria | Bactéria |
| 15 | Streptococcus pneumoniae | Spn | Bactéria | Bactéria |
| 16 | NBPF (controle interno) | IC | controle interno | Controle interno |
Tabela 1: Painel de patógenos-alvo e atribuições das poças de reação.
| Material descartável | Especificação/volume | Função |
| Tubo de liquefação | 2 mL/tubo | Recebe o espécime; homogeneização manual |
| Tubo de lise | 0,5 mL/tubo | Corpo de silicone compressível com membrana de filtro de 200 µm; reagentes de lise pré-carregados |
| Pipeta descartável #1 | 0,5 mL | Transfere o espécime homogeneizado para o tubo de lise |
| Pipeta descartável #2 | 2 mL | Aspira o espécime até a linha marcada para dentro do tubo de liquefação |
Tabela 2: Especificações dos materiais descartáveis utilizados durante a pré-processamento das amostras.
| Etapa | Temperatura | Duração |
| Liquefação | 50 °C | 10 min |
| Lise de patógenos | 95 °C | 5 min |
| Ciclo total | — | ~15 min |
Tabela 3: Parâmetros operacionais do ciclo do dispositivo de pré-processamento de amostra (SP).
| Alvo | Limite do TP (min) | Regra de classificação |
| Acinetobacter baumannii | 13 | TP ≤ limite = positivo |
| Aspergillus spp. | 15,5 | TP ≤ limite = positivo |
| Burkholderia cepacia | 12,5 | TP ≤ limite = positivo |
| Candida albicans | 13,5 | TP ≤ limite = positivo |
| Corynebacterium striatum | 13 | TP ≤ limite = positivo |
| Escherichia coli | 12 | TP ≤ limite = positivo |
| Haemophilus influenzae | 13,5 | TP ≤ limite = positivo |
| Klebsiella pneumoniae | 15,5 | TP ≤ limite = positivo |
| Legionella pneumophila | 14,5 | TP ≤ limite = positivo |
| Mycoplasma pneumoniae | 14 | TP ≤ limite = positivo |
| Pseudomonas aeruginosa | 12 | TP ≤ limite = positivo |
| Pneumocystis jirovecii | 14,5 | TP ≤ limite = positivo |
| Staphylococcus aureus | 15,5 | TP ≤ limite = positivo |
| Stenotrophomonas maltophilia | 12 | TP ≤ limite = positivo |
| Streptococcus pneumoniae | 14,5 | TP ≤ limite = positivo |
| NBPF (controle interno) | 12 | Execução válida se TP < 12 min |
Tabela 4: Valores limiares de TP utilizados para classificação do alvo.
| Espécime | Tipo | Alvo detectado | TP (min) | Cultura / tNGS (leituras) |
| S1 | BAS | Aspergillus spp. | 8 | + / 1,253 |
| S2 | BAS | Aspergillus spp. | 7,5 | – / 3,877 |
| Pseudomonas aeruginosa | 4 | + / 55,039 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6,5 | – / 3,087 | ||
| S3 | BAS | Aspergillus spp. | 5,5 | + / 6,145 |
| Burkholderia cepacia | 6 | – / 3,221 | ||
| Candida albicans | 7,5 | – / 3,280 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | + / 13,189 | ||
| S4 | BALF | Acinetobacter baumannii | 6,5 | + / 10,485 |
| Aspergillus spp. | 7,5 | – / 4,432 | ||
| Burkholderia cepacia | 5,5 | – / 1,676 | ||
| Candida albicans | 8,5 | – / 576 | ||
| S5 | BALF | Aspergillus spp. | 7,5 | + / 2,869 |
| Burkholderia cepacia | 4 | – / 6,532 | ||
| Corynebacterium striatum | 5,5 | – / 71,839 | ||
| Escherichia coli | 7 | – / 1,891 | ||
| Pseudomonas aeruginosa | 4 | + / 31,386 | ||
| Staphylococcus aureus | 6,5 | – / 26,683 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 4 | + / 21,467 | ||
| S6 | BAS | Burkholderia cepacia | 5,5 | – / 1,984 |
| Escherichia coli | 5,5 | + / 8,005 | ||
| S7 | BAS | Acinetobacter baumannii | 5,5 | + / 28,007 |
| Burkholderia cepacia | 4 | + / 3,585 | ||
| Haemophilus influenzae | 6,5 | – / 8,912 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | – / 8,865 | ||
| S8 | BAS | Acinetobacter baumannii | 5,5 | – / 43,721 |
| Burkholderia cepacia | 4 | – / 53,796 | ||
| Klebsiella pneumoniae | 3,5 | + / 23,757 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 4 | – / 26,898 | ||
| S9 | Spt | Haemophilus influenzae | 9 | – / 3,636 |
| Staphylococcus aureus | 8,5 | + / 1,918 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 8,5 | – / 872 | ||
| S10 | Spt | Streptococcus pneumoniae | 5,5 | – / 29,893 |
Tabela 5: Resultados da detecção e valores de TP para 10 espécimes representativos do trato respiratório inferior coletados de pacientes em UTI.
| Alvo | tNGS + | POCT + | tNGS − | POCT − | PPA | NPA | (SC) PPA/NPA |
| Acinetobacter baumannii | 3 | 3 | 7 | 7 | 100% | 100% | 100% / 87,5% |
| Aspergillus spp. | 5 | 5 | 5 | 5 | 100% | 100% | 100% / 71,4% |
| Burkholderia cepacia | 6 | 6 | 4 | 4 | 100% | 100% | 100% / 44,4% |
| Candida albicans | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | – / 80,0% |
| Corynebacterium striatum | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Escherichia coli | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 88,9% |
| Haemophilus influenzae | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | – / 80,0% |
| Klebsiella pneumoniae | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Legionella pneumophila | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Mycoplasma pneumoniae | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Pseudomonas aeruginosa | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Pneumocystis jirovecii | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Staphylococcus aureus | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 88,9% |
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | 6 | 4 | 4 | 100% | 100% | 100% / 50,0% |
| Streptococcus pneumoniae | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | – / 90,0% |
Tabela 6: Concordância por alvo do ensaio com o sequenciamento metagenômico direcionado de nova geração (tNGS) e o cultivo convencional de escarro para as 10 amostras representativas. Para cada um dos 15 alvos patogênicos, são apresentados os números de resultados positivos e negativos obtidos por cada método, bem como a concordância percentual positiva (PPA) e a concordância percentual negativa (NPA) resultantes. Abreviaturas: PPA = concordância percentual positiva; NPA = concordância percentual negativa; tNGS = sequenciamento metagenômico direcionado de nova geração; PPA/NPA indicadas como "/" quando não havia resultados de referência positivos (ou negativos) disponíveis.
| Nº | Agente patogênico | LD (cópias/mL) |
| 1 | Acinetobacter baumannii | 1,000 |
| 2 | Aspergillus spp. | 2,000 |
| 3 | Burkholderia cepacia | 2,000 |
| 4 | Candida albicans | 1,000 |
| 5 | Corynebacterium striatum | 1,000 |
| 6 | Escherichia coli | 4,000 |
| 7 | Haemophilus influenzae | 2,000 |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 4,000 |
| 9 | Legionella pneumophila | 2,000 |
| 10 | Mycoplasma pneumoniae | 1,000 |
| 11 | Pseudomonas aeruginosa | 2,000 |
| 12 | Pneumocystis jirovecii | 1,000 |
| 13 | Staphylococcus aureus | 2,000 |
| 14 | Stenotrophomonas maltophilia | 2,000 |
| 15 | Streptococcus pneumoniae | 4,000 |
| 16 | Controle interno (NBPF) | Não aplicável (controle interno) |
Tabela 7: Limite analítico de detecção (LoD) para cada alvo do painel. O LoD foi determinado utilizando ácido nucleico genômico quantificado por PCR digital, adicionado a uma matriz negativa de fluido de lavagem broncoalveolar, diluído em série e testado em triplicata, sendo definido como a menor concentração detectada em pelo menos 95% das réplicas. Os valores são expressos em cópias/mL. Abreviação: LoD = limite de detecção.
| Dimensão | POCT (este ensaio) | Cultura de escarro | PCR convencional | mNGS |
| Tempo de resposta | ~1 h | 2–5 dias | 4–8 h | > 24 h |
| Habilidade exigida do operador | Baixa | Alta | Alta | Alta |
| Requisito de laboratório | Baixo; à beira do leito | Alto; laboratório de bacteriologia | Alto; laboratório de PCR | Alto; instalação especializada |
| Investimento em equipamento | Baixo–moderado | Baixo | Moderado | Alto |
| Custo por teste | Moderado | Baixo | Moderado | Alto |
| Sensibilidade analítica | Alta | Baixa | Alta | Alta |
| Vantagem principal | Totalmente integrado, entrada de amostra/saída de resultado, sem operação especializada | Padrão de referência; fornece suscetibilidade | Alta sensibilidade; quantitativo | Sem viés; detecta patógenos raros/inesperados; resolve casos difíceis |
Tabela 8: Comparação qualitativa do presente ensaio de diagnóstico rápido com cultura de escarro, PCR convencional e sequenciamento metagenômico. Os métodos são comparados quanto ao tempo de resposta, exigência de habilidade do operador, exigência de infraestrutura laboratorial, investimento em equipamentos, custo por teste, sensibilidade analítica e principais vantagens. Abreviações: POCT = teste diagnóstico na assistência primária; PCR = reação em cadeia da polimerase; mNGS = sequenciamento metagenômico de nova geração.
Discussão
A identificação rápida de patógenos é fundamental no manejo de infecções em UTI. O sistema descrito aqui reduz o tempo para identificação do patógeno, que normalmente leva de 3 a 5 dias com o cultivo, para menos de 1 hora, um período em que as decisões sobre antimicrobianos de primeira linha frequentemente são tomadas7. Ao integrar a extração e purificação de ácidos nucleicos e a amplificação LAMP em 16 plexos em um único chip selado, este fluxo de trabalho elimina a etapa manual de extração de DNA, que tem sido o principal gargalo operacional das plataformas anteriores de chip LAMP15. O resultado é um único procedimento de carregamento que pode ser realizado por pessoal sem treinamento especializado em biologia molecular.
Vários aspectos do procedimento merecem atenção especial. A qualidade da amostra é essencial. Amostras respiratórias profundas, como aspirado brônquico ou lavado broncoalveolar, são preferíveis em relação ao escarro expetorado em pacientes ventilados, nos quais a contaminação orofaríngea pode obscurecer o sinal do patógeno verdadeiro. A liquefação incompleta é a causa mais comum de lise subótima, e a agitação manual deve, portanto, continuar até que a amostra tenha claramente atingido uma consistência aquosa. Durante o carregamento do chip, o esvaziamento incompleto do frasco do reagente ou do tubo de lise pode privar os poços subsequentes do material necessário, resultando em falhas específicas de canal que podem ser interpretadas erroneamente como resultados negativos. Além disso, o fechamento em dois cliques da tampa do chip não é apenas uma característica mecânica; é necessário para manter o espaço fechado selado exigido para a amplificação isotérmica e para prevenir perda por evaporação.
A solução de problemas é relativamente simples. O escarro viscoso de UTI pode exigir agitação manual por um tempo superior ao recomendado de 1 min. Espécimes diluídos, particularmente o lavado broncoalveolar, podem necessitar de volume de pipetagem duas vezes maior que o padrão para compensar a menor densidade de patógenos. A falha do controle interno, definida pela ausência de uma curva de amplificação em forma de S ou por um valor de TP superior a 12 min, indica celularidade insuficiente da amostra ou falha no sistema de fluidos do chip. Nesses casos, a conduta apropriada é coletar uma nova amostra ou repetir o teste utilizando um chip novo, em vez de reinterpretar canais individuais.
Este método também possui limitações importantes. O painel está restrito a 15 alvos pré-definidos, e organismos fora dessa lista, incluindo muitos determinantes de resistência a antimicrobianos, não podem ser detectados. Cada conjunto de primers tem como alvo uma região conservada e específica da espécie do organismo pretendido, exceto o ensaio em nível de gênero para Aspergillus; portanto, espécies ou cepas não representadas no painel não são detectadas, e o painel não capta a variação intraespécie em nível de cepa. Como cada um dos 16 poços contém um conjunto de primers liofilizado dedicado, o painel é modular e pode ser reconfigurado em versões futuras para incluir novos alvos.
O resultado do ensaio é qualitativo. Embora os valores de TP possam apresentar uma relação aproximada com a carga do patógeno, eles não podem substituir os resultados quantitativos de cultura ou estimativas baseadas em valores de limiar de ciclo obtidos por PCR. Como ocorre com qualquer teste de amplificação de ácido nucleico realizado em espécimes respiratórios, o ensaio por si só não pode distinguir colonização de infecção verdadeira. A interpretação clínica deve, portanto, integrar os resultados do chip com marcadores inflamatórios, como proteína C-reativa e procalcitonina, achados de imagem, biomarcadores fúngicos incluindo galactomanana e (1,3)-β-D-glicano, e o quadro clínico geral. Além disso, o sistema não fornece dados de suscetibilidade antimicrobiana, e a cultura convencional continua sendo indispensável para essa finalidade.
Por fim, todos os espécimes incluídos neste estudo foram obtidos de uma única UTI terciária, e a prevalência de patógenos e os padrões de coinfecção podem variar entre instituições e populações de pacientes. Este trabalho deve, portanto, ser considerado uma demonstração piloto e de prova de conceito do protocolo em um conjunto pequeno e deliberadamente selecionado de espécimes representativos; não foi concebido para estimar a precisão diagnóstica. A sensibilidade e especificidade clínicas por alvo, bem como a concordância sistemática com o cultivo convencional e o sequenciamento metagenômico de nova geração (mNGS), serão estabelecidas em um estudo prospectivo planejado, com inclusão consecutiva de participantes e abrangendo múltiplos centros.
Como medida inicial de desempenho analítico, o limite de detecção (LoD) para cada alvo foi estimado utilizando ácido nucleico genômico quantificado por PCR digital, adicionado a uma matriz negativa de fluido de lavagem broncoalveolar. As amostras foram diluídas em série e testadas em triplicata. O LoD foi definido como a menor concentração detectada em pelo menos 95% das réplicas. Os valores de LoD obtidos variaram de 1.000 a 4.000 cópias/mL ao longo do painel (Tabela 7). Como a quantificação baseada em contagem de colônias para cada organismo não estava disponível neste estudo piloto, essas estimativas de LoD serão refinadas em trabalhos futuros mediante o uso de cepas de referência formalmente enumeradas.
A comparação com abordagens diagnósticas existentes esclarece ainda mais a posição desta plataforma. A cultura convencional, embora lenta, continua sendo o padrão de referência e fornece informações sobre suscetibilidade. O sequenciamento metagenômico de nova geração oferece cobertura muito mais ampla de organismos, mas com custo substancialmente maior, tempos de resposta mais longos (normalmente 24–48 h) e requisitos de bioinformática que muitas UTIs não conseguem apoiar in loco9. Os painéis-padrão de PCR multiplex reduzem o tempo até o resultado, mas ainda exigem, em geral, extração separada de ácidos nucleicos e, dependendo da plataforma, processamento em lotes que pode introduzir atrasos adicionais10.
Do ponto de vista de custo, embora uma análise formal de custo-efetividade estivesse além do escopo deste estudo piloto, a plataforma aborda os principais fatores de custo no mundo real na UTI, incluindo cultura e PCR convencional ou multiplex (uma comparação qualitativa entre os métodos é fornecida na Tabela 8). Ela fornece resultados em aproximadamente 1 h, em comparação com 2–5 dias para cultura de escarro, 4–8 h para PCR convencional (que normalmente exige processamento em lote) e >24 h para sequenciamento metagenômico. Como o fluxo de trabalho é totalmente integrado (entrada da amostra, saída do resultado), requer apenas uma única etapa manual de carregamento, sem necessidade de extração separada de ácidos nucleicos, pode ser realizado à beira do leito sem laboratório dedicado de bacteriologia ou biologia molecular ou pessoal especializado em biologia molecular, e utiliza um cartucho fechado e descartável que reduz testes repetidos relacionados à contaminação. Os custos com equipamentos também são modestos, eliminando a necessidade de um instrumento de PCR quantitativo em tempo real ou de uma plataforma de sequenciamento. Para pacientes gravemente doentes na UTI, esse tempo reduzido de resposta pode encurtar a duração da terapia empírica inadequada e reduzir o tempo de internação, proporcionando um benefício indireto, mas potencialmente substancial, em termos de custo.
O sistema atual ocupa um nicho distinto definido por tempo rápido de resposta, simplicidade operacional e biossegurança em cartucho fechado, características que conjuntamente tornam viável a implementação à beira do leito. A inclusão de três alvos fúngicos é uma característica particularmente importante. Aspergillus spp. foi detectado em 5 das 10 amostras (intervalo de TP: 5,5–8 min). Considerando as limitações conhecidas do cultivo e a janela diagnóstica restrita do teste de galactomanana para Aspergillus5,6, um sinal molecular disponível em menos de 45 minutos pode permitir uma consideração mais precoce de terapia antifúngica direcionada, embora o valor clínico desse sinal mais precoce precise ser estabelecido em estudos prospectivos.
Várias direções futuras são evidentes. A expansão do painel para incluir, no mínimo, os principais determinantes de resistência, como os genes de carba-penemase e o mecA, ajudaria a preencher a lacuna entre a identificação do patógeno e a seleção empírica de antimicrobianos. Além disso, à medida que os conjuntos de dados de TP crescerem, modelos de aprendizado de máquina treinados em perfis de amplificação pareados com metadados clínicos poderão eventualmente ajudar a distinguir colonização de infecção verdadeira, embora tais aplicações exijam uma cuidadosa validação prospectiva. De forma mais ampla, será necessário realizar uma avaliação multicêntrica em populações diversas de UTI para que o desempenho diagnóstico desta plataforma possa ser considerado generalizável.
Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesses.
Agradecimentos
Doenças Crônicas Não Transmissíveis - Projeto Nacional de Ciência e Tecnologia (nº 2023ZD0516500), Financiamento para Pesquisa Clínica de Hospitais de Alto Nível (2026-PUMCH-A-103) e Programa de Concurso Aberto da CMB (24-561) e Programa de Formação de Talentos do Hospital da Escola de Medicina da Universidade de Pequim (nº UGG11571).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Analisador Automatizado de Ácidos Nucléicos | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-T80-01 | TurboFlow T; realiza distribuição centrífuga de reagentes, extração com microesferas magnéticas, LAMP a 65 °C e detecção em tempo real de fluorescência (~45 min de execução) |
| Pipeta Pasteur descartável #1 | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Material descartável; 0,5 mL; transfere espécime homogeneizado para tubo de lise |
| Pipeta Pasteur descartável #2 | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Material descartável; 2 mL; aspira espécime até a linha marcada no tubo de liquefação |
| Chip de CD | Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd | Custom-made | Material descartável; disco de 86 mm com zona central de carregamento (portas O, B, S), zona de purificação com microesferas magnéticas e anel externo com 16 poços de reação (15 alvos patogênicos + controle interno NBPF) |
| Reagentes para reação LAMP | Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | 16730ES80 | Reagentes para reação LAMP pré-armazenados no chip de CD na forma de microesferas liofilizadas |
| Tubo de liquefação | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Material descartável; 2 mL/tubo; recebe espécime para homogeneização manual |
| Tubo de lise | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Material descartável; 0,5 mL/tubo; corpo compressível de silicone com membrana de filtro de 200 µm; reagentes de lise pré-carregados |
| Primeres | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | Custom-made | Mistura de primeres embutida na câmara de reação do chip de CD |
| Dispositivo de Pré-processamento de Amostras | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-R10-02 | TS-2000; ciclo automatizado de liquefação–lise (~15 min) |
| Frasco de dose única “B” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Material descartável; reagente pré-embalado no chip; um por teste; armazenado a 4 °C e equilibrado à temperatura ambiente (~25 °C) antes do carregamento |
| Frasco de dose única “O” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Material descartável; reagente pré-embalado no chip; um por teste; armazenado a 4 °C e equilibrado à temperatura ambiente (~25 °C) antes do carregamento |
Referências
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