Protocolo de Transfecção Reversa Otimizado para a Entrega de mRNA de Telomerase em Fibroblastos Humanos em Senescência Precoce

Sukanta Jash; John Sedivy

doi:10.3791/71538

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Artigo de método

Protocolo de Transfecção Reversa Otimizado para a Entrega de mRNA de Telomerase em Fibroblastos Humanos em Senescência Precoce

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DOI:

10.3791/71538

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18 de agosto de 2026

Sukanta Jash^*¹ , John Sedivy^*¹

¹Center on the Biology of Aging, and Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo de transfeção reversa otimizado para a entrega eficiente de mRNA modificado de nucleosídeo da telomerase reversa humana (hTERT) (mRNA de hTERT) em fibroblastos humanos senescentes. O pré-revestimento das superfícies de cultura com complexos de mRNA de hTERT e lipídeos aumenta a captação, permitindo a ativação da telomerase, o alongamento dos telômeros e uma rejuvenescência parcial. As culturas acabam por reentrar na senescência ou em crise sem imortalização.

Resumo

A senescência celular está associada a alterações profundas na fisiologia celular, incluindo redução da fluidez da membrana, tráfego endossomal prejudicado, capacidade endocítica diminuída e aumento da atividade de RNase extracelular, todos os quais dificultam a entrega eficiente de mRNA. Essas barreiras têm limitado a aplicação de abordagens baseadas em RNA em células senescentes, particularmente para a entrega de transcritos terapêuticos grandes. Este protocolo descreve um método de transfeção reversa otimizado para a entrega eficiente de RNA mensageiro (mRNA) modificado em fibroblastos humanos senescentes. Embora o mRNA da transcriptase reversa telomerase humana (hTERT) tenha sido usado como transcrito modelo, o fluxo de trabalho é amplamente aplicável a outros mRNAs. Em contraste com os métodos convencionais de transfeção, nos quais os complexos RNA-lipídio são adicionados ao meio de cultura após a adesão celular, a transfeção reversa deposita os complexos na superfície de cultura antes da semeadura das células, permitindo a interação direta entre as células em adesão e os complexos de transfeção. Para maximizar a eficiência de transfeção, o protocolo incorpora mRNA modificado com nucleosídeos contendo pseudouridina e 5-metilcitidina, caudas poli(A) alongadas, cronometragem otimizada da formação de complexos, inibição de RNase, elevação transitória do pH endossomal com cloroquina, aumento da densidade de semeadura celular e períodos de incubação prolongados. Com esta abordagem, eficiências de transfeção de aproximadamente 50%–80% foram alcançadas em fibroblastos senescentes após a entrega de um transcrito de mRNA hTERT de 5 kb. A atividade máxima da telomerase foi detectada 24–48 h após a transfeção. Um único ciclo de transfeção produziu alongamento mensurável dos telômeros, enquanto três transfeções sequenciais resultaram em extensão substancial, mas finita, dos telômeros. A reversão parcial dos fenótipos associados à senescência foi detectável dentro de 72–96 h, incluindo redução da atividade da β-galactosidase associada à senescência, diminuição da expressão de p16 e p21, restauração da morfologia celular e prolongamento da longevidade replicativa. O mRNA hTERT entregue foi degradado dentro de 72–96 h, e nenhuma imortalização foi observada. Este protocolo fornece uma abordagem prática para a entrega transitória de mRNA em células senescentes e pode ser adaptado a uma ampla variedade de tipos celulares e espécies.

Introdução

A abordagem da transfeção reversa representa uma adaptação metodológica essencial para células senescentes, superando as barreiras fundamentais que essas células impõem aos métodos padrão de transfeção. Diferentemente da transfeção direta, na qual as células são semeadas previamente e deixadas aderirem antes da adição dos complexos de transfeção, a transfeção reversa envolve a adição de células em suspensão diretamente sobre complexos pré-formados de mRNA de hTERT com lipídeos. Essa técnica aumenta drasticamente a eficiência de transfeção em células senescentes, maximizando a exposição aos complexos de transfeção durante a fase crítica de adesão, quando a remodelação da membrana é mais ativa.

A mudança conceitual central do protocolo é tratar as células senescentes como um problema distinto de entrega, e não apenas como versões difíceis de transfectar de células jovens. Na senescência, alterações globais na composição lipídica da membrana, incluindo fosfolipídios, esfingolipídios e colesterol, modificam a fluidez da membrana, a curvatura e as interações proteína-lipídio, ao mesmo tempo em que contribuem para o fenótipo secretório associado à senescência¹^,²^,³. As células senescentes também apresentam redução da endocitose mediada por clatrina e caveolas e alterações no tráfego endocítico, impulsionadas em parte pela subexpressão da anfifisina-1 e mudanças compensatórias na expressão da caveolina, o que atenua a captação e sinalização mediadas por receptores⁴^,⁵^,⁶. Paralelamente, o eixo do endossomo tardio-lisossomo regulado pela Rab7 e a rede mais ampla endossomal-autofágica-lisossomal (EAL) tornam-se disfuncionais, com a Rab7 atuando como reguladora principal da maturação endolisossomal e da fusão autofagossomo-lisossomo, processos perturbados no envelhecimento e na neurodegeneração⁷.

Células senescentes frequentemente regulam positivamente múltiplos componentes do sistema de processamento e adaptação lisossomal (LYPAS), incluindo a biogênese lisossomal mediada por TFEB/TFE3 e a autofagia mediada por chaperonas, aumentando assim a massa lisossomal. No entanto, lisossomos individuais frequentemente apresentam pH luminal elevado, danos na membrana e capacidade proteolítica alterada, contribuindo para a disfunção lisossomal apesar de sua abundância aumentada⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Em conjunto, essas alterações podem direcionar material internalizado de forma mais eficiente para compartimentos endolisossomais degradativos, aumentando a probabilidade de que o RNA ou proteína entregue seja degradado antes da liberação produtiva no citosol⁹^,¹⁰^,¹¹. A transfeção reversa direciona-se diretamente à janela mais precoce em que as membranas estão em remodelação, durante a adesão, forçando um contato sustentado e de alta afinidade entre as células e os complexos de mRNA-lipídio, contornando pelo menos parcialmente a endocitose em estado estacionário prejudicada em células senescentes totalmente aderidas⁴^,⁵^,⁶^,¹².

Do ponto de vista do design do RNA, o protocolo parte do princípio de que, em um contexto de envelhecimento, uma simples base com cap e cauda é insuficiente: a modificação completa dos nucleosídeos (por exemplo, pseudouridina ou N1‑metilpseudouridina mais 5‑metilcitosina) é considerada imprescindível para desacoplar a tradução da detecção pelos receptores tipo Toll endossomais e da indução do interferon tipo I. Estudos fundamentais demonstraram que a incorporação de nucleosídeos modificados no RNA suprime a ativação de TLR3, TLR7 e TLR8 e reduz acentuadamente a produção de citocinas pelas células dendríticas, fornecendo uma base mecanicista para a menor imunogenicidade inata das atuais plataformas de mRNA com nucleosídeos modificados¹³. Revisões mais recentes sobre vacinas mRNA–LNP e medicamentos baseados em mRNA enfatizam a engenharia coordenada do cap 5′, das UTRs, da sequência codificante e da cauda poli(A) para aumentar a estabilidade e a tradução in vivo, ao mesmo tempo que se minimiza a ativação da imunidade inata¹⁴. Em particular, o comprimento e a arquitetura da cauda poli(A) surgiram como determinantes-chave da estabilidade e do rendimento traducional do mRNA transcrito in vitro, o que tem motivado o uso de designs poli(A) alongados ou engenheirizados em mRNA terapêutico¹⁵.

Sobreposto a isso, o protocolo incorpora explicitamente proteção contra RNases extracelulares e endossomais durante a formação e captação dos complexos, juntamente com uma janela definida de escape endossomal utilizando um agente lisossomotrópico transitório, como a cloroquina¹⁶^,¹⁷. A cloroquina tem sido amplamente utilizada como sonda funcional para barreiras endossomais e pode aumentar significativamente o engajamento com o alvo e o silenciamento por siRNA ou oligonucleotídeos antissenso, promovendo a ruptura da membrana endossomal e a liberação da carga de ácidos nucleicos no citosol¹⁸. Ao mesmo tempo, imagens de células vivas e de super-resolução de mRNA entregue por LNPs demonstraram que a entrega produtiva é fortemente limitada por eventos raros de escape de endossomos iniciais/recicláveis, e não pela captação inicial em si, destacando a importância de projetar deliberadamente uma etapa de escape endossomal para terapêuticas baseadas em mRNA¹⁹.

Coletivamente, essas alterações associadas à senescência nas dinâmicas da membrana, no tráfego endocítico, no processamento lisossomal e na ativação da imunidade inata criam barreiras substanciais para a entrega eficiente de mRNA. A estratégia de transfeção reversa descrita aqui foi desenvolvida para superar essas limitações, combinando engenharia otimizada de mRNA, proteção contra RNases, escape endossomal aprimorado e exposição direta de células em adesão a complexos pré-formados de mRNA e lipídios. Embora o mRNA de hTERT seja utilizado como carga modelo, o fluxo de trabalho é amplamente aplicável à entrega de outros transcritos terapêuticos de mRNA de grande porte em populações celulares senescentes e difíceis de transfectar²⁰^,²¹^,²².

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Protocolo

1. Transcrição in vitro de mRNA de hTERT

Transcrição in vitro (IVT) com ARCA e ΨUTP
1. Prepare uma reação de IVT de 20 µL conforme a Tabela 1. Ajuste a reação linearmente se for necessário um rendimento maior.
2. Combine todos os componentes da reação, exceto a polimerase de RNA T7, em um tubo livre de RNase. Adicione a polimerase de RNA T7 por último, misture suavemente e centrifugue brevemente o tubo.
3. Incube a reação a 37 °C por 0,5–4 h.
  NOTA: Ajuste o tempo de incubação de acordo com o comprimento do molde. Incube reações contendo moldes menores (aproximadamente 500 pb) por cerca de 30 min e reações contendo moldes maiores (aproximadamente 4 kb) por 3–4 h.
Tratamento com DNase
1. Adicione 1 µL de DNase I livre de RNase diretamente à mistura da reação de IVT.
2. Incube a reação a 37 °C por 15 min.
  NOTA: O tratamento com DNase deve ser realizado diretamente na reação de IVT, sem purificação prévia do mRNA sintetizado.
Purificação do mRNA
1. Adicione 115 µL de H₂O livre de nucleases para diluir a mistura da reação.
2. Purifique o mRNA utilizando um kit de purificação de RNA conforme as instruções do fabricante.
3. Elua o mRNA purificado em 20–30 µL de H₂O livre de nucleases.
4. Meça a pureza do mRNA por espectrofotometria e verifique a integridade do RNA por eletroforese em gel de agarose desnaturante a 1,0–1,5% ou em gel de poliacrilamida de baixa porcentagem.
Adição da cauda poli(A)
1. Prepare uma reação de adição da cauda poli(A) de 50 µL conforme a Tabela 2. Misture suavemente os componentes da reação e incube a 37 °C por 30–60 min.
  NOTA: Ajuste o tempo de incubação de acordo com a quantidade de RNA utilizado.
2. Termine a reação adicionando 2 µL de EDTA 0,5 M (pH 8,0).
Purificação final e controle de qualidade
1. Purifique o mRNA com cauda poli(A) utilizando um kit de purificação de RNA conforme as instruções do fabricante.
2. Elua o mRNA purificado em 20–30 µL de H₂O livre de nucleases.
3. Avalie a qualidade do mRNA antes de prosseguir para a transfeção
  1. Meça a concentração do mRNA a 260 nm e determine a pureza utilizando as razões A260/A280 e A260/A230. Utilize preparações de mRNA com valores de A260/A280 em torno de 2,0 e valores de A260/A230 superiores a 2,0.
  2. Avalie a integridade do mRNA por eletroforese em gel ou por sistema de análise de RNA conforme as instruções do fabricante.
  3. Confirme o comprimento da cauda poli(A) por RT-PCR ou análise no Bioanalyzer. Verifique se o comprimento da cauda poli(A) está entre 120 e 200 nucleotídeos.
  4. Aliquote o mRNA purificado e armazene os alíquotas a −80 °C para minimizar ciclos de congelamento-descongelamento.

2. Transfecção reversa

Dia −1: Preparação pré-transfecção
1. Verificar o fenótipo senescente
  1. Realizar coloração por β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) em uma amostra representativa de células. Verificar que mais de 70% das células são positivas.
  2. Confirmar a expressão dos marcadores de senescência (p16 e p21) por qRT-PCR ou imunofluorescência.
  3. Determinar a viabilidade celular e verificar que a viabilidade excede 90%.
2. Preparar reagentes
  1. Pré-aquecer o meio de cultura completo a 37 °C.
  2. Pré-aquecer a solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 37 °C.
  3. Preparar meio Opti-MEM I fresco.
    NOTA: Não adicionar inibidor de RNase ao Opti-MEM I antes do uso.
Dia 0: Dia da transfeção
NOTA: Permitir aproximadamente 3 h entre a preparação dos reagentes e a incubação das células transfectadas.
1. Preparação do mRNA de hTERT
  1. Descongelar o mRNA de hTERT em gelo. Medir a concentração do mRNA e utilizar preparações com concentrações entre 0,5 e 1,0 µg/µL.
  2. Diluir a quantidade desejada de mRNA de hTERT em Opti-MEM I de acordo com o formato de cultura utilizado (Tabela 3). Adicionar inibidor de RNase até uma concentração final de 0,5–1,0 U/µL e misturar suavemente.
  3. Mantém o mRNA diluído em gelo até a formação do complexo.
    NOTA: Adicionar o inibidor de RNase imediatamente antes do uso. Não armazenar mRNA com inibidor de RNase, pois sua atividade diminui após o congelamento.
2. Preparação do reagente de transfeção
  1. Combinar 6,0 µL do reagente de transfeção com 100 µL de Opti-MEM I em um tubo estéril livre de RNase. Misturar suavemente por pipetagem.
  2. Incubar a mistura à temperatura ambiente por 5 min.
    NOTA: Para construtos grandes de mRNA de hTERT (~5 kb), otimizar as proporções de reagente para mRNA entre 0,4 e 0,6 µL de reagente por 100 ng de mRNA.
3. Formação do complexo mRNA-lipídico
  1. Adicionar a solução diluída de mRNA de hTERT (100 µL) à solução diluída do reagente de transfeção (106 µL). Misturar suavemente pipetando 5–6 vezes.
  2. Incubar a mistura à temperatura ambiente por 15–20 min.
  3. Não exceder 30 min de complexação.
  4. Verificar a formação bem-sucedida do complexo pela aparência de uma solução levemente turva.
    NOTA: Realizar a preparação das células durante o período de complexação.
4. Preparação das células para transfeção reversa
  1. Aspirar o meio de cultura das culturas celulares senescentes.
  2. Lavar as células uma vez com PBS pré-aquecido (2 mL por poço de uma placa de 6 poços).
  3. Adicionar 500 µL de tripsina-EDTA 0,05% por poço.
  4. Incubar as células a 37 °C por 3–5 min.
  5. Neutralizar a tripsina com 3 mL de meio completo contendo soro.
  6. Triturar suavemente as células para obter uma suspensão unicelular.
  7. Determinar o número de células utilizando um hemocitômetro ou contador celular automatizado.
  8. Preparar uma suspensão contendo 2,0–2,5 × 10⁵ células por poço em meio completo.
    NOTA: Evitar a tripsinização prolongada, pois as células senescentes são altamente suscetíveis ao estresse mecânico. Manter as células em suspensão; não pré-semear antes da transfeção reversa.
5. Transfeção reversa
  1. Preparação da placa de cultura
    1. Adicionar 500 µL de poli-L-lisina 0,01% a cada poço de uma placa de 6 poços e incubar por 30 min à temperatura ambiente.
    2. Aspirar a solução de revestimento imediatamente antes do uso.
    3. Adicionar 200 µL do complexo mRNA-lipídico de hTERT ao centro de cada poço.
    4. Incubar a placa a 37 °C e 5% CO₂ por 30 min.
      NOTA: Realizar o revestimento da placa em paralelo com a formação do complexo e a preparação das células.
  2. Preparação da suspensão celular
    1. Suspender 2,0–2,5 × 10⁵ células em 1800 µL de meio completo sem antibiótico.
    2. Resuspender suavemente as células para obter uma suspensão unicelular uniforme.
      NOTA: Utilizar meio sem antibiótico durante a transfeção.
  3. Semeação celular sobre os complexos
    1. Adicionar 1800 µL da suspensão celular diretamente sobre os complexos pré-formados de mRNA-lipídico de hTERT.
    2. Inclinar suavemente a placa 2–3 vezes em cada direção para distribuir as células uniformemente.
      NOTA: Não pipetar a suspensão após a adição das células, pois isso pode perturbar os complexos mRNA-lipídicos.
  4. Incubação celular
    1. Incubar as células a 37 °C em incubadora umidificada contendo 5% CO₂ por 6–8 h.
    2. Monitorar a adesão celular por microscopia de luz 2–3 h após a transfeção.
    3. Verificar que as células estão distribuídas uniformemente e começando a aderir à superfície de cultura.
      NOTA: Um número excessivo de células flutuantes ou detritos celulares pode indicar citotoxicidade associada à transfeção.

3. Mitigação da citotoxicidade

Reduza o período de exposição à transfeção para 48 h se a perda celular exceder 20%.
Suplemente os cultivos com inibidor de ROCK Y-27632 a 10 µM durante o período de transfeção para melhorar a sobrevivência celular.
Após 6–8 h de transfeção, aspire cuidadosamente o meio de transfeção, minimizando a perturbação de células parcialmente aderidas. Deixe aproximadamente 100 µL de meio residual em cada poço.
Adicione 1 mL de meio de crescimento completo fresco, pré-aquecido e suplementado com 15% de FBS, a cada poço.
Adicione cloroquina para uma concentração final de 10–20 µM imediatamente após a troca do meio.
Incube os cultivos por mais 2 h a 37 °C em incubadora umidificada contendo 5% de CO₂.
Substitua o meio contendo cloroquina por meio de crescimento completo fresco.
Retorne os cultivos à incubadora para crescimento contínuo.
NOTA: Monitore a morfologia e a viabilidade celular durante todo o período de recuperação. Desprendimento celular excessivo ou debris podem indicar citotoxicidade associada à transfeção.

4. Análise pós-transfeção

Avalie a expressão da proteína TERT 24–48 h após a transfeção.
Meça os níveis da proteína TERT por meio de western blot ou coloração por imunofluorescência, conforme procedimentos laboratoriais padrão.
Meça a atividade da telomerase durante o mesmo intervalo utilizando um ensaio apropriado de atividade da telomerase.
NOTA: A atividade da telomerase geralmente diminui após 48 h devido à degradação do mRNA de hTERT entregue de forma transitória.
Avalie o comprimento dos telômeros 48–72 h após a transfeção utilizando PCR quantitativa multiplex monocromática (MMqPCR) ou outro método equivalente de análise de comprimento de telômeros.
NOTA: Pode-se observar alongamento detectável dos telômeros após entrega bem-sucedida do mRNA de hTERT.
Avalie fenótipos associados ao envelhecimento e à rejuvenescência 7 dias após a transfeção
1. Meça a atividade da β-galactosidase associada ao envelhecimento (SA-β-gal).
2. Meça os níveis de expressão de p16 e p21.
3. Avalie a expressão de Ki67.
4. Examine a morfologia celular por microscopia de luz.
  NOTA: Compare culturas tratadas com controles senescentes não tratados ou submetidos à transfeção simulada para avaliar alterações em fenótipos associados ao envelhecimento e características proliferativas.

5. Protocolo de administração repetida de doses (Opcional)

Realize a transfeção inicial conforme descrito nas Seções 2–4.
Repita as transfeções de acordo com o seguinte cronograma: Dia 0: Primeira transfeção; Dia 5: Segunda transfeção; Dia 10–12: Terceira transfeção.
Mantenha as células como culturas aderentes e não as tripsinize antes das transfeções subsequentes.
Prepare complexos frescos de mRNA de hTERT com lipídeos conforme descrito nas Seções 2.2.1–2.2.3.
Aspire o meio de cultura de cada poço.
Adicione 200 µL de complexos de mRNA de hTERT com lipídeos diretamente a cada poço.
Adicione 800 µL de meio F-10 completo fresco imediatamente após a adição dos complexos.
Incube as células por 4–6 h a 37 °C em incubadora umidificada contendo 5% de CO₂.
Substitua o meio de transfeção por meio completo fresco.
NOTA: Limite o tratamento a um máximo de três ciclos de transfeção para minimizar a citotoxicidade cumulativa associada à transfeção.

6. Protocolo de transfeção direta (2 µg/mL, formato de placa de 6 poços)

Dia −1: Semeadura celular
1. Desanexar fibroblastos senescentes ou pré-senescentes utilizando tripsina-EDTA a 0,05%.
2. Neutralizar a tripsina com meio de cultura completo.
3. Determinar o número e a viabilidade celular.
4. Semeie as células em placas de 6 poços numa densidade de 2,0–2,5 × 10⁵ células por poço.
5. Incubar as células durante a noite a 37 °C em incubadora umidificada contendo 5% de CO₂ até atingirem cerca de 60–80% de confluência.
Dia 0: Preparação dos complexos de hTERT mRNA–reagente
1. Descongele uma alíquota de hTERT mRNA modificado com nucleosídeos em gelo.
2. Dilua o hTERT mRNA em Opti-MEM até uma concentração final de 2 µg/mL em um tubo estéril livre de RNase (Tubo A).
3. Adicione inibidor de RNase ao Tubo A até uma concentração final de 0,5–1,0 U/µL e misture suavemente.
4. Dilua o reagente de transfeção em Opti-MEM em um segundo tubo livre de RNase (Tubo B), utilizando 0,4–0,6 µL de reagente por 100 ng de mRNA.
5. Adicione o conteúdo do Tubo B gota a gota ao Tubo A, misturando suavemente.
6. Incube a mistura à temperatura ambiente por 15–20 min.
Dia 0: Transfeção direta
1. Confirme que as células estão com 60–80% de confluência e apresentam morfologia saudável.
2. Aspire o meio de cultura.
3. Lave as células uma vez com 1–2 mL de PBS pré-aquecido.
4. Adicione 0,5 mL de meio completo ou com redução de soro, pré-aquecido, a cada poço.
5. Opcionalmente, adicione cloroquina até uma concentração final de 10–20 µM.
6. Adicione 0,5 mL dos complexos de hTERT mRNA–reagente preparados na Etapa 6.2.6 a cada poço.
7. Balançe suavemente a placa para distribuir os complexos uniformemente.
8. Incube as células por 4–6 h a 37 °C em incubadora umidificada contendo 5% de CO₂.
  NOTA: Prolongue o período de incubação para 6–8 h para células senescentes, se necessário.
9. Aspire o meio de transfeção.
10. Adicione 2,0 mL de meio completo fresco a cada poço.
11. Realize as análises pós-transfeção conforme descrito na Seção 4.
  NOTA: Utilize o mesmo lote de hTERT mRNA, reagente de transfeção e dose nominal ao comparar condições de transfeção direta e reversa.

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Resultados

O modRNA d2EGFP-T2A-hTERT foi projetado como um quadro de leitura aberto híbrido no qual um repórter de EGFP instável (d2EGFP) foi ligado à TERT humana por meio de um peptídeo auto-clivável T2A. As sequências completas de nucleotídeos e proteínas de todas as construções estão fornecidas no Arquivo Suplementar 1. A sequência codificadora foi flanqueada por uma região não traduzida (UTR) 5′ sintética e pela UTR 3′ da β-globina humana para aumentar a eficiência traducional e a estabilidade do mRNA (

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Discussão

Este estudo reinterpreta a senescência celular como um problema distinto de entrega, e não como uma simples variação da fisiologia proliferativa, e desenvolve uma estratégia de transfeção de mRNA de telomerase adaptada às restrições biofísicas e imunológicas do estado senescente. Células senescentes exibem membranas rigidificadas e enriquecidas em colesterol, além de atividade endocítica reduzida, criando uma barreira significativa para a entrega eficiente de ácidos nucleicos. Ao adotar uma abordagem de transfeção revers...

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Divulgações

J.M.S. é cofundador e presidente do conselho consultivo científico da Transposon Therapeutics.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios dos National Institutes of Health (NIH) P01 AG051449, R01 AG016694 e R01 AG078925 concedidos a JS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio Nutriente Ham's F-10	Thermo Fisher	11550043	Meio de cultura celular.
Análogo da Estrutura do Cap 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G de RNA	New England Biolab	S1411L	Para a maioria dos RNAs, a estrutura do cap aumenta a estabilidade, diminui a suscetibilidade à degradação por exonuclease e promove a formação de complexos de iniciação do mRNA.
5-Metil-Citidina-5´-Trifosfato (5-Metil-CTP)	New England Biolab	N0432S	NTPs modificados são comumente usados para reduzir a imunogenicidade do RNA transcrito in vitro.
Placa de 6 Poços	Corning	351146	Para cultivar e tratar volumes médios a grandes de células aderentes ou em suspensão em condições experimentais independentes.
Anticorpo Anti-Ki67 (SP6)	abcam	ab16667	O Ki67 é principalmente expresso em células proliferantes.
Kit de Ensaio de Senescência Celular (Coloração SA-beta-gal)	cellbiolabs	CBA-230	Identificação de células senescentes com o ensaio de coloração SA-β-gal
Tubos DNA LoBind de 0,5 ml	Eppendorf	022431005	Para recuperar eficientemente DNA e RNA sem qualquer perda
Tubos DNA LoBind de 1,5 ml	Eppendorf	22431021	Para recuperar eficientemente DNA e RNA sem qualquer perda
DNase I, livre de RNase (1 U/μL)	Thermo Fisher	EN0521	A DNase I, livre de RNase, é uma endonuclease que digere DNA de fita simples e dupla.
Polimerase de Poli(A) de E. coli	New England Biolab	M0276S	Em Escherichia coli, a Poli(A) Polimerase I (PAP I) atua principalmente como catalisadora da adição independente de molde de resíduos de monofosfato de adenosina (AMP) à extremidade 3' de moléculas de RNA.
Soro Fetal Bovino	Thermo Fisher	A5256701	Suplemento para meio de cultura celular
Kit HiScribe T7 ARCA mRNA	New England Biolab	E2065S	O Kit HiScribe T7 ARCA mRNA (com alongamento) é projetado para produção rápida de mRNA com cap ARCA e cauda de poli(A) in vitro. Os mRNAs com cap são sintetizados pela incorporação co-transcricional do Análogo do Cap Reverso (ARCA) usando a Polimerase de RNA T7.
Kit HiScribe T7 mRNA com Reagente CleanCap AG	New England Biolab	E2080S	os Kits HiScribe T7 mRNA com Reagente CleanCap AG permitem a produção rápida e simplificada de um ou vários transcritos com rendimentos típicos de ≥90 μg por reação,
LongAmp Hot Start Taq DNA Polimerase	New England Biolab	M0534S	A LongAmp Hot Start Taq DNA Polimerase oferece desempenho excepcional com amplicons longos.
Transcriptase Reversa M-MuLV	New England Biolab	M0253L	A Transcriptase Reversa M-MuLV sintetiza uma fita complementar de DNA iniciando a partir de um primer, utilizando RNA (síntese de cDNA) ou DNA de fita simples como molde.
Kit Monarch Spin RNA Cleanup (50 μg)	New England Biolab	T2040L	A função principal do Kit Monarch® Spin RNA Cleanup (50 μg) é purificar e concentrar até 50 μg de RNA de alta qualidade proveniente de reações enzimáticas ou misturas de extração.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolab	E2621L	O NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix permite a montagem contínua de múltiplos fragmentos de DNA, independentemente do comprimento do fragmento ou compatibilidade das extremidades. É útil para a comunidade de biologia sintética, bem como para clonagem em uma única etapa de múltiplos fragmentos, devido à sua facilidade de uso, flexibilidade e formato simples de master mix.
Opti-MEM - Meio com Redução de Soro	Thermo Fisher	31985070	Para maximizar a eficiência de transfeção celular durante a formação do complexo lipídio-carga. Serve como um ambiente otimizado e quimicamente definido que mantém as células de mamíferos altamente viáveis, reduzindo a necessidade de suplementação padrão com soro
PBS, pH 7,4	Thermo Fisher	10010023	O uso funcional principal do Salina Tamponada com Fosfato (PBS) em pH 7,4 é manter um pH estável e equilíbrio osmótico para células de mamíferos e moléculas biológicas.
Tiras de PCR	Thermo Fisher	AB0776	O uso funcional principal das tiras de tubos de PCR (geralmente em formato de 8 ou 12 tiras) é conter reações líquidas de pequeno volume durante ciclagem térmica de alto rendimento.
Poli-L-Lisina Hidrobrometo	Millipore Sigma	P4707-50ML	O uso funcional principal do Poli-L-Lisina (PLL) Hidrobrometo para adesão celular é revestir superfícies sólidas negativamente carregadas (como vidro ou plástico) para criar um substrato altamente adesivo e positivamente carregado.
Pseudouridina-5´-Trifosfato (Pseudo-UTP- ΨUTP)	New England Biolab	N0433S	A Pseudouridina-5´-Trifosfato (Pseudo-UTP) é comumente usada para reduzir a imunogenicidade do RNA transcrito in vitro.
Conjunto de Soluções de Ribonucleotídeos	New England Biolab	N0450L	Quatro soluções separadas de ATP, GTP, CTP e UTP
Inibidor ROCK Y-27632 (Dihidrocloridrato)	Stem cell technologies	72302	O Y-27632 é um inibidor permeável às células, altamente potente e seletivo da quinase associada à Rho, contendo alça em espiral (ROCK). O Y-27632 inibe tanto a ROCK1 (Ki = 220 nM) quanto a ROCK2 (Ki = 300 nM) competindo com o ATP pela ligação ao sítio catalítico
Água Grau RT-PCR	Thermo Fisher	AM9935	O uso funcional principal da Água Grau RT-PCR (frequentemente rotulada como Água Livre de Nucleases) é servir como solvente ultra-puro para ensaios enzimáticos sensíveis, nos quais qualquer contaminação degradaria a amostra ou inibiria a amplificação.
SUPERase·In Inibidor de RNase	Thermo Fisher	AM2694	O SUPERase In Inibidor de RNase é um inibidor baseado em proteína de origem não humana que se liga não covalentemente e inibe as RNases mais comuns e problemáticas, incluindo RNase A, B, C, 1 e T1.
Corante SYBR Green I para Eletroforese de Ácidos Nucléicos	Thermo Fisher	S7563	O uso funcional principal do Corante SYBR™ Green I para géis de ácidos nucléicos é visualizar e quantificar DNA de dupla fita (dsDNA) em géis de agarose ou poliacrilamida.
Kit de Transfeção TransIT-mRNA	Mirusbio/ Millipore Sigma	MIR 2250	Um reagente de transfeção de alta eficiência e baixa toxicidade para RNA de grande porte
Kit de Detecção de Telomerase TRAPeze	Millipore Sigma	S7700	O ensaio TRAP (Protocolo de Amplificação de Repetições Teloméricas) é um método amplamente utilizado e sensível baseado em PCR para detectar e medir a atividade da telomerase em células e amostras de tecidos de mamíferos. Envolve três etapas principais: alongamento de repetições teloméricas pela telomerase, amplificação desses produtos por PCR e detecção subsequente.
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Thermo Fisher	25300054	Para destacar células aderentes de mamíferos dos frascos de cultura durante a passagem rotineira (subcultivo) e colheita.

Referências

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