Explorando alvos para insuficiência cardíaca usando randomização mendeliana, colocalização, randomização mendeliana baseada em dados resumidos e previsão de medicamentos

Resumo

Este estudo identificou oito potenciais alvos de medicamentos para insuficiência cardíaca por meio de análise genética e explorou compostos terapêuticos candidatos associados a esses alvos identificados.

Resumo

A insuficiência cardíaca (IC) é uma doença cardiovascular prevalente que prejudica significativamente a qualidade de vida em seus estágios avançados. Apesar da variedade de estratégias de tratamento atuais, a carga da doença causada pela IC permanece significativa. Portanto, é urgente explorar novos alvos terapêuticos. Este estudo utilizou randomização mendeliana (RM) para avaliar as relações causais entre genes medicamentosos e HF. Análise de colocalização e randomização mendeliana baseada em dados resumidos (SMR) foram conduzidas para validar ainda mais a relação entre eles. Por fim, foram identificados 8 alvos terapêuticos potenciais para HF, incluindo 4 fatores de risco (CYP11A1, GALT, KCNH2 e METRN) e 4 fatores de proteção (APOM, CHD4, IL11RA e LPAR5). A análise de enriquecimento GO, enriquecimento KEGG e interação proteína-proteína (PPI) indicou que esses genes estavam envolvidos principalmente na regulação metabólica e nos processos eletrofisiológicos cardíacos. Além disso, potenciais medicamentos que visam esses alvos foram identificados por meio de predição de fármacos e acoplamento molecular, incluindo mitotano, Adehl, benzofránicos, 1,3-Di-o-tolilguanidina, 96-69-5 e bromoenol lactona. Além disso, os resultados da PCR também demonstraram que o mitotano pode estar associado à CYP11A1 e ao KCNH2. Medicamentos desenvolvidos com base nesses potenciais alvos terapêuticos podem oferecer taxas de sucesso mais altas e melhorar os resultados clínicos.

Introdução

Insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome cardiovascular prevalente definida por obturação ventricular comprometida ou contratilidade miocárdica, resultando em débito cardíaco inadequado para atender às demandas^{metabólicas 1,2,3}. Clinicamente, a IC é caracterizada por congestão pulmonar e sistêmica, hipoperfusão tecidular e sintomas como dispneia, fadiga e edema^{periférico 1,4,5}. Apesar dos avanços terapêuticos, a IC continua sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, afetando mais de 64 milhões de indivíduos, segundo o estudo Global Burden of Disease (GBD^{) 6,7,8}. A carga substancial da doença ressalta a necessidade urgente de novas estratégias terapêuticas.

Intervenções farmacológicas e baseadas em dispositivos atuais para IC são limitadas por eficácia subótima e efeitos adversos, contribuindo para taxas persistentemente altas de rehospitalização e qualidade de vida^comprometida 9,10,11,12. Identificar novos alvos moleculares com ligações causais com a patogênese da IC é, portanto, fundamental para melhorar os resultados clínicos. Integrar a genômica à descoberta de medicamentos representa uma estratégia altamente eficaz para melhorar a eficiência, já que terapias geneticamente validadas demonstram uma taxa de sucesso significativamente maior em ensaios^{clínicos 13, 14, 15}. Além disso, proteínas codificadas por esses genes acionáveis servem como alvos terapêuticos principais tanto para pequenas moléculas quanto para anticorpos^{monoclonais 16,17}.

Avanços recentes na genética humana facilitaram a priorização de alvos de fármacos por meio da análise integrativa de estudos de associação genômica ampla (GWAS) e dados de loci quantitativos de traços de expressão (eQTL). Randomização mendeliana (RM) utiliza variantes genéticas como variáveis instrumentais para estimar efeitos causais, minimizando a confusão e a causalidade reversa inerentes aos estudos^{observacionais 13,14}. Quando combinada com colocalização e RM baseada em resumo (SMR), essa abordagem permite a priorização robusta de genes cuja modulação pode influenciar o risco de doença, oferecendo uma estratégia geneticamente ancorada para a descoberta de^alvos 18,19,20. Comparado aos estudos convencionais de associação, integrar RM, SMR e colocalização supera a causalidade de confusão e reversa para estabelecer inferências causais robustas. Além disso, essa estrutura filtra sinais falsos positivos do desequilíbrio de ligação, garantindo que a expressão gênica e o risco de insuficiência cardíaca compartilhem a mesma variante causal subjacente, otimizando a priorização dos alvos. Vale ressaltar que, embora os tecidos cardiovasculares exibam alta especificidade, este estudo utiliza principalmente dados cis-eQTL sanguíneos em grande escala para maximizar o poder estatístico. Embora essa abordagem possa não capturar totalmente mecanismos específicos de tecido inerentes à IC, variantes derivadas do sangue servem como biomarcadores acessíveis e fornecem insights robustos sobre fatores genéticos sistêmicos da doença.

Neste estudo, conjuntos de dados GWAS e eQTL em grande escala foram usados para avaliar os efeitos causais dos genes medicamentosos sobre o risco de HF. Associações significativas foram ainda validadas por meio de análises de colocalização e SMR. Para elucidar as funções biológicas dos alvos priorizados, foram realizadas análises de enriquecimento da Gene Ontology (GO) e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), juntamente com análise de redes de interação proteína-proteína (PPI). O potencial terapêutico foi posteriormente avaliado por meio da predição de fármacos e acoplamento molecular. Por fim, as associações entre genes selecionados que podem ser usados medicamentosamente e fármacos candidatos foram validadas por meio de experimentos in vitro .

Em conclusão, este estudo oferece insights importantes para a descoberta de novos alvos terapêuticos para a IC. Ao empregar RM, SMR, análise de colocalização, análise de enriquecimento gênico, construção de redes de PPI, predição de fármacos, acoplamento molecular e experimentos in vitro , esses achados podem contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes para a IC.

Protocolo

Todos os conjuntos de dados utilizados neste estudo foram obtidos a partir de estudos previamente publicados com aprovação ética. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Desenho do estudo

O fluxo de trabalho deste estudo é ilustrado na Figura 1. Primeiro, os dados de exposição foram obtidos a partir dos cis-eQTLs de genes medicamentosos. Em segundo lugar, a análise por RM foi realizada para investigar a relação causal entre genes medicamentosos e IC. Alvos terapêuticos candidatos para HF foram posteriormente identificados por meio de análises de colocalização e SMR. Foram então realizadas análises de enriquecimento gênico e construção de redes PPI. Por fim, foram realizadas previsões de fármacos e acoplamento molecular para explorar a afinidade dos medicamentos pelos genes.

2. Fonte de dados

Um total de 6.888 genes medicamentosos foram identificados de duas fontes. Um conjunto de dados incluiu 4.463 genes de um estudo previamente publicado que integrou múltiplas fontes de^{dados 17}. O outro conjunto de dados continha 5.012 genes do Banco de Dados de Interação Medicamentosa-Gênica (DGIdb)²¹. Informações detalhadas foram ilustradas no site (https://www.dgidb.org/). Após a fusão e remoção de duplicados, 6.888 genes farmacológicos únicos foram retidos para análise.

Dados Cis-eQTL foram obtidos do Consórcio eQTLGen (https://eqtlgen.org/cis-eqtls.html), que inclui perfis de expressão de 31.684 amostras de sangue e cobre 16.987 genes²².

As estatísticas resumidas de HF foram obtidas a partir da versão R12 do banco de dados^{FinnGen 23}, que incluiu 37.653 casos e 462.695 controles. O diagnóstico da IC foi baseado na Classificação Internacional de Doenças (CID), incluindo CID-10—I11.0, I13.0, I13.2, I50, CID-9—4029B|428 e CID-8—42700|42710|428|7824. Todos os participantes eram de ascendência europeia. Informações detalhadas estão disponíveis no site da FinnGen e no artigo original (https://www.finngen.fi/en/access_results).

3. Análise de randomização mendeliana

Variáveis instrumentais (IVs) foram selecionadas com base em três suposições centrais da RM^{: 24}. Primeiramente, as IVs estão diretamente associadas aos fatores de exposição. Em segundo lugar, as IVs não estão associadas a fatores de confusão. Por fim, os soros intravenosos afetam o resultado apenas por exposição. Considerando que os eQTLs proximais exercem um controle regulatório mais imediato e robusto sobre os genes-alvo, a RM utilizou exclusivamente SNPs localizados dentro de 100 kb de regiões dos genes para maximizar a proximidade biológica. Critérios rigorosos foram empregados para a seleção do SNP. Todos os SNPs selecionados estavam localizados a menos de 100 kb a montante do local de início da transcrição e a 100 kb a jusante do sítio final da transcrição de cada gene medicamentoso. Apenas SNPs com significância genômica (p < 5×^10-8) foram^{incluídos 25}. Para minimizar o desequilíbrio de ligação (LD), o agrupamento de LD foi realizado usando um limiar de^r2 de 0,001 e uma distância de aglomeração de 10.000 kb²⁶. SNPs com estatística F >10 foram mantidos, calculados usando a fórmula: F = [R²(N−k−1)]/[k(1−R²)]²⁷. Informações sobre SNPs são fornecidas na Tabela Suplementar 1.

Os principais métodos analíticos foram ponderados inversamente pela variância (IVW) e razão de Wald. Um valor p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente^{significativo 28,29}. A taxa de falsas descobertas (FDR) foi aplicada para ajustar o valor p e minimizar resultados falsos^{positivos 30}. Quando apenas um SNP estava disponível, o método da razão de Wald era utilizado; caso contrário, a IVW era aplicada. As análises incluíram MR-Egger, mediana ponderada, modo ponderado e modo simples quando SNPs suficientes estavam presentes.

O teste Q de Cochran e a análise de interceptação MR-Egger foram empregados para testar heterogeneidade e pleiotropia. Um valor Q-p maior que 0,05 indicou a ausência de heterogeneidade³¹. Um valor p para a interceptação MR-Egger inferior a 0,05 indicou a presença de pleiotropia^{direcional 18}. Por fim, foi realizado o teste de deixar um-um fora para verificar se os resultados poderiam ser influenciados por um único SNP. Análises de RM foram realizadas usando o pacote TwoSampleMR (versão 0.6.11) em R (versão 4.4.2).

4. Análise de colocalização

A análise de colocalização foi realizada usando o pacote coloc R (versão 6.0.1) para identificar se variantes genéticas compartilhadas influenciavam tanto a expressão gênica quanto o risco^{de HF 32}. As probabilidades prévias de um SNP estar associado a qualquer um dos traços e ambos os traços foram definidas para 1 × ^10-4 e 1 × ^10-5, respectivamente. As probabilidades posteriores das cinco hipóteses podem ser calculadas: (1) PPH0: SNPs não estão ligados a duas características. (2) PPH1/PPH2: SNPs estão associados à expressão gênica ou HF. (3) PPH3: SNPs estão ligados à HF e à expressão gênica, mas são impulsionados por SNPs diferentes. (4) PPH4: SNPs estão ligados à HF e à expressão gênica, e são impulsionados pelos SNPs comuns. Um PPH4 > 0,8 foi considerado evidência para colocalização.

5. Análise SMR

A análise SMR foi realizada para explorar a relação entre o gene e HF usando o software SMR (versão 1.3.1)³³. O teste de heterogeneidade em instrumentos dependentes (HEIDI) foi realizado para determinar se associações observadas eram devido à ligação. Um valor-p significativo de SMR (< 0,05) combinado com um valor-p HEIDI > 0,05 foi interpretado como evidência que apoia uma relação causal verdadeira, e não como uma associação causada pelo cenário de ligação. Os protocolos operacionais detalhados e as configurações computacionais podem ser acessados no site oficial.

6. Análise de enriquecimento

A análise de enriquecimento GO e KEGG foi empregada para caracterizar as funções biológicas e vias dos genes-alvo terapêuticos potenciais^{triados 34}. O enriquecimento de GO incluiu processos biológicos (BP), funções moleculares (MF) e componentes celulares (CC). O clusterProfiler do pacote R (versão 4.14.6) e o Pathview (versão 1.46.0) foram utilizados para conduzir a análise de^{enriquecimento 35,36}.

7. Previsão de medicamentos candidatos

Para identificar potenciais compostos terapêuticos, a análise de predição de medicamentos foi realizada utilizando o Banco de Dados de Assinaturas de Medicamentos (DSigDB) (http://dsigdb.tanlab.org/DSigD Bv1.0/)³⁷. 22.527 conjuntos de genes estão incluídos no DSigDB, incluindo 17.389 compostos únicos que abrangem 19.531 genes. Associações entre genes e compostos candidatos foram analisadas, seguidas por uma análise de enriquecimento para identificar medicamentos potencialmente relevantes direcionados a genes associados à HF.

8. Construção de redes de interação proteica

Redes de interação proteína-proteína (IBP) foram construídas usando o GeneMANIA (https://genem ania.org/)³⁸. O GeneMANIA pode ajudar a gerar hipóteses de função gênica, analisar listas de genes e priorizar genes para testes funcionais.

9. Acoplamento molecular

Foi realizada a conexão molecular para validar a capacidade de medicamento dos genes e sua relação com os candidatos a medicamento. Simulações de acoplamento ajudam a avaliar a afinidade de ligação e os padrões de interação entre compostos e proteínas-alvo, informando assim a priorização e otimização dos candidatos. Estruturas proteicas foram recuperadas do Banco de Dados de Proteínas (PDB) (http://www.rcsb.org/), e estruturas compostas foram obtidas do PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)³⁹. O acoplamento foi realizado usando o CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php), que utiliza detecção de cavidades para guiar o acoplamento^{cego 40,41}. Procedimentos operacionais detalhados e informações sobre configurações de cálculo podem ser obtidas no site oficial.

10. Cultura celular

Células cardiomiócitas imortalizadas em humanos (AC16) foram cultivadas em meio de cultivo específico para células AC16 sob condições estéreis. As células foram mantidas a 37 °C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2. O meio de cultivo era substituído a cada 2–3 dias, e as células eram distribuídas em aproximadamente 70%–80% de confluência para manter condições ideais de crescimento. A morfologia celular e a confluência foram monitoradas rotineiramente por microscopia óptica antes de cada experimento. Todos os procedimentos de cultura celular foram realizados em um gabinete de biossegurança para minimizar o risco de contaminação. Para experimentos de tratamento, as células AC16 foram semeadas em placas de 6 poços e deixadas aderir durante a noite antes da administração do tratamento.

11. PCR de transcrição reversa quantitativa (RT-PCR)

As células AC16 foram tratadas com ácido palmítico (PA) de 200 μM ou 20 μM de mitotano por 24 horas após atingirem aproximadamente 60%–70% de confluência. A PA foi dissolvida na albumina sérica bovina (BSA), enquanto o mitotano foi dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO). Todos os reagentes potencialmente perigosos foram manuseados de acordo com os procedimentos padrão de segurança laboratorial, utilizando equipamentos de proteção individual apropriados, incluindo luvas e jalecos.

Após o tratamento, o RNA total foi extraído usando um kit de extração de RNA conforme as instruções do fabricante em condições livres de RNase. Procedimentos de extração de RNA foram realizados no gelo sempre que possível para minimizar a degradação do RNA. A concentração e pureza de RNA foram avaliadas antes dos experimentos posteriores, e apenas amostras com razão A260/A280 entre 1,8 e 2,0 foram usadas para análises subsequentes.

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado usando um kit de transcrição reversa conforme o protocolo do fabricante. A RT-PCR quantitativa foi posteriormente realizada usando o SYBR Green Master Mix em um sistema de detecção de PCR em tempo real. Cada reação foi preparada em um volume final de 10 μL contendo 5 μL de SYBR Green Master Mix, 0,4 μL de primer direto, 0,4 μL de reverse Primer, 1 μL de molde de cDNA e 3,2 μL de água sem nuclease. A amplificação foi realizada sob as seguintes condições de ciclagem: desnaturação inicial a 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 5 s e recozimento/extensão a 60 °C por 30 s. Cada experimento foi realizado com três réplicas biológicas, e todas as reações foram conduzidas em triplicado.

O GAPDH foi usado como gene de referência interno, e os níveis relativos de expressão de mRNA de CYP11A1 e KCNH2 foram calculados usando o método 2^−ΔΔCt . Um único pico na análise da curva de fusão foi considerado indicativo de amplificação específica. As sequências de espoletas usadas para RT-PCR estão listadas na Tabela Suplementar 2.

Resultados

Randomização mendeliana
Os resultados da RM que avaliaram os efeitos causais entre expressão gênica medicamentosa e IC foram apresentados na Tabela Suplementar 3. Um valor P ajustado pelo FDR inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Um total de 11 genes com associações causais significativas com a IC foram identificados (Figura 2). Entre eles, seis genes estavam associados a um risco aumentado de IC...

Discussão

Esta pesquisa avaliou sistematicamente os efeitos causais de genes medicamentosos sobre o risco de IC utilizando RM, identificando oito potenciais alvos terapêuticos. Incluíam quatro fatores de proteção (APOM, CHD4, IL11RA e LPAR5) e quatro fatores de risco (CYP11A1, GALT, KCNH2 e METRN). Essas associações foram ainda mais apoiadas pela análise de colocalização e pela SMR. Anotações funcionais por meio de análises de GO, enriquecimento KEGG e redes de PPI sugeriram que esses genes podem ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix	Abclonal	RK21203
AC16	HyCyte	TCH-C119
AC16 cell-specific culture medium	HyCyte	TCH-G119
cDNA reverse kit	Abclonal	RK20400
CFX96™ Real-Time system	Bio-Rad Laboratories
Mitotane	TargetMol	T1199
Palmitic acid	TargetMol	T2908
RNA extraction kit	Abclonal	RK30120