A superexpressão forçada de miR-486-3p suprime a atividade associada à proliferação, o crescimento clonogênico, o fechamento de feridas e a travessia de Matrigel em células de adenocarcinoma pulmonar A549 e H358. Esses efeitos acompanham a redução da expressão de WNT5B, DVL1, β-catenina e BCL-2, indicando uma associação in vitro com alterações relacionadas à via Wnt, sem estabelecer direcionamento direto ou causalidade da via.
Artigo de investigação
miR-486-3p Suprime Fenótipos Malignos e está Associado à Redução da Expressão de WNT5B, DVL1 e β-catenina em Células de Adenocarcinoma Pulmonar
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O adenocarcinoma pulmonar (LUAD) é o subtipo histológico predominante do câncer de pulmão de células não pequenas e continua associado a uma morbidade e mortalidade significativas. Estudos anteriores identificaram funções supressoras de tumor do miR-486-3p no LUAD, mas sua relação com alterações na expressão relacionadas a WNT5B, DVL1 e β-catenina ainda não foi claramente definida. Aqui, a abundância basal do miR-486-3p foi examinada em células de LUAD A549 e H358 e comparada com a de células epiteliais brônquicas Beas-2b mantidas sob suas respectivas condições rotineiras. Modelos estáveis de superexpressão do miR-486-3p foram gerados por transdução lentiviral. Atividades associadas ao crescimento celular, crescimento clonogênico, fechamento de ferida e travessia de membranas revestidas com Matrigel foram avaliadas utilizando os ensaios de kit de contagem celular-8, formação de colônias, cicatrização de ferida e Transwell. A abundância das proteínas WNT5B, DVL1, β-catenina e BCL-2 foi avaliada por meio de Western blotting, e os níveis de mRNA de WNT5B, DVL1, CTNNB1 e BCL2 foram adicionalmente examinados por RT-qPCR. Nas condições de cultivo utilizadas, a abundância do miR-486-3p foi menor nas células A549 e H358 do que nas células Beas-2b, e a transdução lentiviral produziu superexpressão estável em ambas as linhagens celulares de LUAD. A superexpressão forçada do miR-486-3p reduziu o sinal do CCK-8, a formação de colônias, o fechamento de ferida e a travessia de membranas revestidas com Matrigel, e foi acompanhada por menor abundância das proteínas WNT5B, DVL1, β-catenina total e BCL-2. A RT-qPCR também mostrou menor abundância dos transcritos de WNT5B, DVL1, CTNNB1 e BCL2 em ambas as linhagens celulares de LUAD após a superexpressão do miR-486-3p. Esses achados apoiam uma associação in vitro entre a expressão forçada do miR-486-3p, a atenuação de diversos indicadores de malignidade celular e alterações na expressão relacionada à via Wnt; entretanto, eles não estabelecem ligação direta entre o miRNA e seu alvo, atividade da via ou um mecanismo de sinalização linear causal.
Introdução
O adenocarcinoma pulmonar (LUAD) é o subtipo histológico mais comum do câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) e contribui significativamente para a morbidade e mortalidade relacionadas ao câncer de pulmão em todo o mundo1,2,3,4,5. A classificação molecular e as terapias direcionadas melhoraram os resultados para grupos selecionados de pacientes, mas o LUAD avançado continua difícil de tratar e é biologicamente heterogêneo1,2,3,4,5. Portanto, definir os processos regulatórios que contribuem para o comportamento celular maligno permanece relevante para o desenvolvimento de hipóteses terapêuticas testáveis.
A sinalização Wnt compreende ramificações dependentes e independentes de β-catenina que regulam proliferação, sobrevivência, polaridade e motilidade6,7,8,9. WNT5B está mais frequentemente associado à sinalização não canônica, embora seus efeitos biológicos variem conforme o receptor e o contexto celular10,11. DVL1 é uma proteína citoplasmática de transdução de sinal compartilhada por diversas ramificações da via Wnt e tem sido associada a comportamentos relacionados à β-catenina no câncer de pulmão12. Assim, alterações simultâneas em WNT5B, DVL1 e β-catenina não devem, por si só, ser interpretadas como evidência de uma única via linear.
MicroRNAs (miRNAs) são RNAs não codificantes curtos que regulam a expressão gênica por meio de interações dependentes de sequência com transcritos-alvo13,14,15. Como um único miRNA pode afetar múltiplos RNAs, a abundância alterada de miRNAs pode influenciar diversos fenótipos associados a tumores13,14,15,16,17,18. Vários miRNAs foram associados ao crescimento, motilidade e sinalização do câncer de pulmão, e a interação entre miRNAs e redes relacionadas à via Wnt foi descrita em múltiplos contextos de câncer16,17,18,19,20.
O locus MIR486 dá origem às fitas maduras miR-486-3p e miR-486-5p. A miR-486-3p demonstrou atividade supressora de tumor no câncer oral e no glioblastoma, enquanto um efeito promotor de tumor foi relatado no carcinoma de células escamosas cutâneo21,22,23,24,25. A miR-486-3p foi selecionada para o presente estudo por meio de uma estratégia baseada em hipótese, fundamentada em sua abundância reduzida em dados públicos de LUAD, em sua atividade supressora de tumor previamente relatada em LUAD e em previsões bioinformáticas que a associam a transcritos candidatos relacionados à via WNT. Tomioka et al. demonstraram efeitos supressores de tumor de ambas as fitas da miR-486 em LUAD e identificaram GINS4 por meio de triagem genômica de alvos26. Assim, o presente estudo não reivindica a primeira demonstração de um fenótipo antitumoral. Em vez disso, avalia se a expressão forçada da miR-486-3p é acompanhada por alterações na abundância de WNT5B, DVL1 e β-catenina e por mudanças fenotípicas reprodutíveis em duas linhagens celulares de LUAD. Essas análises avaliam associações e não estabelecem direcionamento direto, atividade da via ou um mecanismo linear WNT5B/DVL1/β-catenina.
Protocolo
Os reagentes e o equipamento utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
Cultura celular
Foram utilizadas as linhagens celulares de adenocarcinoma pulmonar humano (LUAD) A549 e H358, e a linhagem celular epitelial brônquica imortalizada Beas-2b. A549 (KRAS G12S) e H358 (KRAS G12C; deficiente em STK11) foram selecionadas como modelos de LUAD comumente utilizados, com diferentes backgrounds de mutação no KRAS, enquanto Beas-2b foi incluída como comparador epitelial brônquico não maligno. As células A549 e H358 foram mantidas em meio RPMI-1640, e as células Beas-2b foram mantidas em DMEM; cada meio continha 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-estreptomicina. As células foram cultivadas a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂. Como as linhagens celulares tumorais e a linhagem epitelial comparadora foram mantidas em meios de rotina diferentes, as comparações de expressão basal entre linhagens celulares foram interpretadas com cautela.
Transdução lentiviral e seleção estável de células
Vetores lentivirais carregando o precursor do hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) ou uma sequência controle negativa embaralhada (LV-NC) foram utilizados em um delineamento de ganho de função estável. Células A549 e H358 foram semeadas em placas de 6 poços a 5 × 104 células/poço e cultivadas durante a noite. No dia seguinte, as células foram expostas ao lentivírus em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10, na presença de 8 µg/mL de polibreno. Após 24 h, o inóculo viral foi substituído por meio completo fresco. As células transduzidas foram selecionadas com 2 µg/mL de puromicina por 7 dias. Após a seleção, as células sobreviventes tiveram permissão para se recuperar e foram expandidas para os ensaios moleculares e funcionais subsequentes. Nenhum braço com inibidor de miR-486-3p foi incluído, pois o presente estudo foi planejado especificamente para avaliar os efeitos da superexpressão forçada estável.
OBSERVAÇÃO: A MOI, o tempo de exposição à polibrena e as condições de seleção com puromicina devem ser mantidos idênticos entre os grupos LV-NC e LV-miR-486-3p para minimizar as diferenças relacionadas ao tratamento na viabilidade celular.
RT-qPCR
A RT-qPCR foi realizada para determinar os níveis de expressão do miR-486-3p e confirmar a eficiência da superexpressão por lentivírus em células A549 e H358. O RNA total foi isolado utilizando o reagente TRIzol, conforme as instruções do fabricante. A concentração e pureza do RNA foram avaliadas espectrofotometricamente, considerando aceitável uma razão A260/A280 entre 1,8 e 2,1. Para análise de mRNA, 1 µg de RNA total foi transcrito reversamente em cDNA utilizando um kit comercial de síntese de cDNA, de acordo com o protocolo do fabricante. Para análise de microRNA, a síntese de cDNA foi realizada utilizando um iniciador específico para microRNA com sequência em alça (stem-loop) para a transcrição reversa. A PCR quantitativa foi realizada em um volume total de reação de 20 µL, contendo 10 µL de SYBR Green Master Mix 2×, 0,4 µM de cada iniciador e 2 µL de molde de cDNA. O protocolo de amplificação consistiu em uma etapa inicial de desnaturação a 95 °C por 5 min, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 10 s e anelamento/extensão a 60 °C por 30 s. Uma análise de curva de dissociação foi posteriormente realizada para verificar a especificidade da amplificação. O RNA nuclear pequeno U6 foi utilizado como controle interno para a quantificação de miRNA, enquanto o GAPDH foi usado como gene de referência para a normalização do mRNA. Os níveis relativos de expressão foram determinados utilizando o método 2−ΔΔCq.
As sequências dos primers para miRNA foram as seguintes: primer de retrotranscrição com alça em stem-loop, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; primer direto miR-486-3p, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; primer reverso universal, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; primer direto U6, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; e primer reverso U6, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. As sequências dos primers para WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 e GAPDH, juntamente com os comprimentos dos amplicons e eficiências de amplificação, estão fornecidas na Tabela 1. A expressão de mRNA foi normalizada em relação a GAPDH, enquanto a expressão de miR-486-3p foi normalizada em relação a U6. Cada experimento incluiu três réplicas biológicas independentes, com três réplicas técnicas por réplica biológica.
Western blotting
Após a conclusão da seleção com puromicina de 7 dias e um período de recuperação, as células foram lisadas em tampão RIPA contendo inibidores de protease. As concentrações de proteína foram determinadas utilizando um ensaio de proteína BCA. Quantidades iguais de proteína (20 µg por poço) foram separadas em géis de SDS-PAGE a 10% e transferidas para membranas de PVDF por transferência úmida a 300 mA durante 120 min. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% preparado em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20 (TBST) por 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra WNT5B (1:1.000), DVL1 (1:1.000), β-catenina (1:1.000), BCL-2 (0,5 µg/mL) ou β-actina (1:5.000). Os fabricantes e números de catálogo de todos os anticorpos estão indicados na Tabela de Materiais. Após três lavagens de 10 min com TBST, as membranas foram incubadas com um anticorpo secundário de cabra anti-coelho IgG conjugado à HRP, diluído 1:5.000, por 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, as membranas foram lavadas três vezes com TBST, e as bandas proteicas foram visualizadas utilizando um substrato quimioluminescente e imagens foram obtidas com um sistema de documentação e imagem de géis. As intensidades das bandas foram quantificadas usando o ImageJ. A abundância de cada proteína-alvo foi normalizada ao sinal correspondente de β-actina da mesma amostra biológica. Apenas exposições dentro da faixa linear e não saturada de detecção foram utilizadas para análise densitométrica. Três experimentos biológicos independentes foram realizados.
Ensaio com o Kit de Contagem de Células-8
Células A549 e H358 transduzidas de forma estável com LV-NC ou LV-miR-486-3p foram semeadas em placas de 96 poços a 1,5 × 104 células/poço em 100 µL de meio completo. Após a adesão durante a noite, o meio foi substituído e a absorbância em 0 h foi medida imediatamente após a adição do reagente do Kit de Contagem de Células-8. Em 0 h, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h, 10 µL de reagente foram adicionados por poço e incubados por 1 h a 37 °C antes da leitura da absorbância em 450 nm. Para a análise revisada do curso temporal, cada grupo foi normalizado em relação ao seu próprio valor em 0 h antes da plotagem. Três experimentos biológicos independentes foram realizados, e os poços técnicos dentro de cada experimento foram médias antes da análise estatística.
Ensaio de formação de colônias
Células A549 e H358 estavelmente selecionadas foram preparadas como suspensões simples de células a 5 × 102 células/mL. Um mililitro de suspensão celular foi semeado em cada poço de uma placa de 6 poços, seguido por 3 mL de meio completo. As células foram cultivadas por 14 dias, com substituição do meio a cada 5 dias. As colônias foram lavadas com PBS, fixadas com paraformaldeído 4% por 20 minutos, coradas com violeta cristal por 20 minutos, lavadas e secas ao ar. Foram contadas as colônias contendo pelo menos 50 células no ImageJ. Três experimentos biológicos independentes foram realizados.
OBSERVAÇÃO: Uma suspensão uniforme de células isoladas e o mínimo de perturbação da placa durante o estabelecimento das colônias são necessários para evitar o agrupamento artificial das células.
Ensaio de migração celular
Células A549 e H358 transduzidas de forma estável foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas até a formação de uma monocamada confluente. Um arranhão reto foi feito com uma ponteira estéril de 10 µL, as células destacadas foram removidas e os mesmos campos marcados foram registrados em imagens aos 0 h, 24 h, 48 h e 72 h. A área da lesão foi medida no ImageJ, e o fechamento da ferida foi calculado como (área aos 0 h − área no tempo indicado) / área aos 0 h × 100%. Três experimentos biológicos independentes foram realizados. Nenhum bloqueador farmacológico da proliferação foi utilizado; portanto, este ensaio foi interpretado como uma medida de fechamento da ferida, e não como uma leitura específica de migração.
OBSERVAÇÃO: Os arranhões devem ser gerados com largura e pressão consistentes, e os mesmos campos devem ser seguidos ao longo de todo o curso do tempo.
Ensaio de invasão celular
Ensaios de invasão em Transwell foram realizados utilizando inserts de membrana de policarbonato de 24 poços com poros de 8 µm. A superfície superior de cada insert foi revestida com 100 µL de matriz de membrana basal Matrigel diluída 1:8 em DMEM sem soro, até uma concentração final aproximada de proteína de 1 mg/mL, e incubada a 37 °C por 4 h. As células A549 e H358 foram ressuspendidas em meio RPMI-1640 sem soro nas densidades de 8 × 105 células/mL e 4 × 105 células/mL, respectivamente. Uma alíquota de 200 µL da suspensão celular foi adicionada à câmara superior, correspondendo a 1,6 × 105 células A549 ou 8 × 104 células H358 por insert. A câmara inferior foi preenchida com 500 µL de meio RPMI-1640 contendo 20% de soro bovino fetal como quimioatraente. Após incubação a 37 °C em atmosfera úmida contendo 5% de CO₂ por 48 h, as células não invasoras que permaneceram na superfície superior da membrana foram cuidadosamente removidas com um cotonete. As células que haviam invadido através da membrana foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 20 min e coradas com violeta cristal a 0,1% por 20 min à temperatura ambiente. Cinco campos microscópicos selecionados aleatoriamente foram registrados para cada insert, e o número de células invadidas foi quantificado utilizando o ImageJ. A contagem média de células dos cinco campos foi considerada um único valor para cada insert, e o insert, e não o campo microscópico individual, foi tratado como unidade experimental. Três experimentos biológicos independentes foram realizados.
OBSERVAÇÃO: Remova as células não invasoras suave e consistentemente para evitar danificar a membrana ou desalojar as células que migraram para sua superfície inferior.
Análise estatística
Os dados são apresentados como média ± SD e n denota experimentos biológicos independentes, salvo indicação em contrário. Réplicas técnicas ou múltiplos campos microscópicos provenientes da mesma unidade experimental foram agrupados por média antes dos testes inferenciais. Para a comparação entre as três linhagens celulares, foi utilizada análise de variância unidirecional seguida de comparações pareadas ajustadas pelo método de Tukey. Para os cursos temporais do CCK-8 e do fechamento de ferimento, foi utilizada análise de variância bidirecional de medidas repetidas para avaliar os efeitos do tratamento, do tempo e da interação tratamento-por-tempo, seguida de comparações ajustadas pelo método de Šídák em pontos de tempo individuais. Comparações entre dois grupos foram analisadas utilizando o teste t de Student não pareado bicaudal. testes-t. As análises estatísticas e a visualização dos dados foram realizadas utilizando software de análise estatística e geração de gráficos. Exato pos valores são apresentados nos painéis das figuras ou nas tabelas de dados brutos. A significância estatística foi definida como p < 0.05; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001 e ****p < 0.0001.
Resultados
A análise do TCGA/starBase mostra redução na abundância de miR-486-3p no LUAD, e o TargetScan identifica sítios de ligação candidatos
Dados de expressão derivados do TCGA acessados por meio do starBase v3.0 mostraram que a abundância de miR-486-3p era significativamente menor em 512 amostras de adenocarcinoma pulmonar (LUAD) do que em 20 amostras pulmonares não tumorais (teste de Wilcoxon, p = 3,2 × 10⁻5; Figura 1). O TargetScanHuman identificou um sítio candidato 7mer-m8 pouco conservado para miR-486-3p nas posições 468–474 da região não traduzida 3′ (3′ UTR) de DVL1, com um índice de contexto++ de −0,23 e um percentil do índice de contexto++ de 80. Um sítio candidato 8mer pouco conservado foi identificado nas posições 913–920 da 3′ UTR de WNT5B, com um índice de contexto++ de −0,46 e um percentil do índice de contexto++ de 97 (Figura 2). Esses sítios preditos computacionalmente foram utilizados para gerar a hipótese experimental e não foram considerados evidência de ligação direta entre o miRNA e seu alvo. Os URLs de origem são fornecidos na Tabela 2.
A abundância de miR-486-3p é reduzida em linhagens celulares de LUAD e aumenta acentuadamente após a transdução lentiviral
Sob suas respectivas condições rotineiras de cultivo, a análise por RT-qPCR mostrou que a abundância de miR-486-3p era menor nas células A549 e H358 do que nas células epiteliais brônquicas Beas-2b. Comparações ajustadas por Tukey após análise de variância de um fator revelaram diferenças significativas entre as células A549 e Beas-2b (p < 0,01) e entre as células H358 e Beas-2b (p < 0,001; Figura 3A).
A transdução estável com LV-miR-486-3p aumentou significativamente a abundância de miR-486-3p em relação aos grupos correspondentes de LV-NC. A expressão aumentou aproximadamente 1.470 vezes nas células A549 e 220 vezes nas células H358, com ambas as comparações atingindo significância estatística (p < 0,001; Figura 3B,C). Esses resultados confirmaram o estabelecimento bem-sucedido de modelos celulares estáveis com superexpressão de miR-486-3p.
A expressão forçada de miR-486-3p está associada à redução da expressão de WNT5B, DVL1, β-catenina e BCL-2
A análise por Western blot mostrou menor abundância proteica de WNT5B, DVL1, β-catenina total e BCL-2 em células transduzidas com LV-miR-486-3p em comparação com os respectivos controles LV-NC (Figura 4A–E). Em células A549, a expressão forçada de miR-486-3p esteve associada à redução na abundância proteica de β-catenina (p = 0,022), WNT5B (p = 0,0008), DVL1 (p = 0,019) e BCL-2 (p = 0,0017). Reduções correspondentes também foram observadas em células H358 para β-catenina (p = 0,001), WNT5B (p = 0,0002), DVL1 (p = 0,0003) e BCL-2 (p = 0,0018).
RT-qPCR foi posteriormente realizada para determinar se alterações nos níveis de transcritos acompanharam os achados proteicos (Figura 4F–I). Em células A549, a expressão forçada de miR-486-3p reduziu o mRNA de CTNNB1 para 0,226 vezes em relação ao grupo LV-NC (p = 0,004), o mRNA de WNT5B para 0,180 vezes (p = 0,004), o mRNA de DVL1 para 0,278 vezes (p = 0,006) e o mRNA de BCL2 para 0,259 vezes (p = 0,003).
Alterações semelhantes nos níveis de transcritos foram detectadas em células H358. O mRNA de CTNNB1 foi reduzido para 0,288 vezes em relação ao grupo LV-NC (p = 0,028), o mRNA de WNT5B para 0,250 vezes (p = 0,019), o mRNA de DVL1 para 0,271 vezes (p = 0,020) e o mRNA de BCL2 para 0,534 vezes (p = 0,003). Assim, a direção das alterações nos níveis de transcritos foi consistente com os achados correspondentes em nível proteico em ambas as linhagens celulares. Esses resultados demonstram alterações coordenadas na expressão, mas não comprovam o direcionamento direto nem a atividade de um mecanismo de sinalização linear WNT5B/DVL1/β-catenina.
A expressão forçada de miR-486-3p reduz o sinal de CCK-8 associado ao crescimento
As medidas de CCK-8 foram normalizadas em relação ao valor correspondente em 0 h para cada grupo experimental. O sinal de CCK-8 normalizado aumentou ao longo do tempo tanto nas células transduzidas com LV-NC quanto com LV-miR-486-3p, mas valores mais baixos foram geralmente observados após a expressão forçada de miR-486-3p (Figura 5).
Em células A549, comparações ajustadas pelo método de Šídák após análise de variância de duas vias com medidas repetidas mostraram sinais CCK-8 significativamente menores no grupo LV-miR-486-3p nas horas 24, 48 e 96 em comparação com o grupo LV-NC (p < 0,05), enquanto a diferença observada em 72 h não foi estatisticamente significativa (Figura 5A). Em células H358, o sinal CCK-8 foi significativamente menor no grupo LV-miR-486-3p nas horas 24, 48, 72 e 96 (p < 0,05; Figura 5B). Esses resultados indicam que a expressão forçada de miR-486-3p reduziu a atividade metabólica associada ao crescimento, com um efeito mais consistente ao longo do curso temporal em H358.
A expressão forçada de miR-486-3p reduz o crescimento clonogênico
Ensaios de formação de colônias foram realizados para avaliar o crescimento clonogênico de longo prazo. Células A549 transduzidas com LV-miR-486-3p formaram significativamente menos colônias do que as células LV-NC correspondentes (p = 0,013; Figura 6A). Uma redução significativa no número de colônias também foi observada em células H358 (p = 0,006; Figura 6B). A redução foi mais acentuada em células H358 do que em células A549, indicando que a magnitude do efeito clonogênico diferiu entre os dois modelos de LUAD.
A expressão forçada de miR-486-3p reduz o fechamento da ferida
O fechamento da ferida foi quantificado em 24 h, 48 h e 72 h após o arranhão (Figura 7). Em culturas de A549, o grupo LV-miR-486-3p apresentou fechamento da ferida significativamente menor do que o grupo LV-NC em 24, 48 e 72 h (p < 0,05 para cada comparação; Figura 7A,C).
Da mesma forma, o fechamento da ferida foi reduzido em culturas de H358 transduzidas com LV-miR-486-3p em 24 h e 48 h (p < 0,05) e em 72 h (p < 0,01; Figura 7B,D). Como o ensaio foi realizado sem um inibidor farmacológico da proliferação, esses resultados foram interpretados como fechamento reduzido da ferida, e não como evidência de um efeito exclusivamente específico para migração.
A expressão forçada de miR-486-3p reduz a travessia de membranas revestidas com Matrigel
A capacidade das células de atravessar membranas Transwell revestidas com Matrigel foi avaliada após 48 h. Um número significativamente menor de células coradas com violeta de cristal foi detectado na superfície inferior da membrana no grupo A549 LV-miR-486-3p em comparação com o grupo A549 LV-NC (p = 0,0001; Figura 8A). Uma redução semelhante foi observada nas células H358 (p = 0,0007; Figura 8B).
Cinco campos microscópicos foram analisados em média para cada inserto, e o inserto foi considerado como unidade experimental. Esses resultados demonstram uma redução na travessia de membranas revestidas com Matrigel após a expressão forçada de miR-486-3p nas condições utilizadas neste ensaio.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Todos os dados brutos que fundamentam as figuras estão incluídos no Arquivo Suplementar 1, incluindo arquivos de origem de bancos de dados, dados de RT-qPCR, imagens de Western blot sem recorte, valores de densitometria, imagens de microscopia, registros de contagem, medições de CCK-8 e arquivos de análise estatística.
Figura 1: Abundância de miR-486-3p em amostras de CA pulmonar e pulmão normal do TCGA/starBase. Os dados de expressão derivados do TCGA foram obtidos por meio do starBase v3.0 em maio de 2026 e incluíram 512 amostras de adenocarcinoma pulmonar (LUAD) e 20 amostras de pulmão normal. Os grupos foram comparados utilizando o teste de soma de postos de Wilcoxon (p = 3,2 × 10⁻5). LUAD, adenocarcinoma pulmonar. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sítios candidatos de ligação do miR-486-3p previstos pelo TargetScan nas regiões 3′ UTR de DVL1 e WNT5B. O TargetScanHuman identificou um sítio candidato 7mer-m8 nas posições 468–474 da região 3′ não traduzida (3′ UTR) de DVL1 e um sítio candidato 8mer nas posições 913–920 da 3′ UTR de WNT5B. As URLs de origem são fornecidas na Tabela 2. Essas previsões computacionais foram utilizadas para geração de hipóteses e não constituem evidência experimental de ligação direta. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Abundância basal de miR-486-3p e verificação da superexpressão lentiviral. (A) Análise por RT-qPCR da abundância de miR-486-3p em células A549, H358 e Beas-2b mantidas em seus respectivos meios de cultura de rotina. (B,C) Verificação por RT-qPCR da superexpressão de miR-486-3p em células A549 (B) e H358 (C) transduzidas com LV-NC ou LV-miR-486-3p. A expressão foi normalizada em relação a U6. Os dados são apresentados como média ± DP de três experimentos biológicos independentes. (A) foi analisado por ANOVA de um fator seguido de comparações múltiplas ajustadas por Tukey. (B,C) foram analisados utilizando testes t de Student não pareados bicaudais. *p < 0,01; **p < 0,001. LV-NC, lentivírus controle negativo; RT-qPCR, PCR quantitativo com transcrição reversa; DP, desvio padrão. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: A expressão forçada de miR-486-3p está associada à redução da expressão de genes candidatos. (A) Blots representativos de Western mostrando a abundância de β-catenina, WNT5B, DVL1, BCL-2 e β-actina em células A549 e H358 transduzidas com LV-NC ou LV-miR-486-3p. As massas moleculares são indicadas em quilodaltons. (B–E) Quantificação densitométrica de β-catenina (B), WNT5B (C), DVL1 (D) e BCL-2 (E), normalizado para β-actina. (F–I) Análise de RT-qPCR de CTNNB1 (F), WNT5B (G), DVL1 (H), e BCL2 (I) abundância de transcritos, normalizada para GAPDH. Os dados são apresentados como média ± DP de três experimentos biológicos independentes; cada ponto representa uma réplica biológica independente. Os grupos foram comparados utilizando o teste t de Student não pareado bicaudal t-testes. Exato p-valores e mudanças relativas são fornecidos nos respectivos painéis. kDa, quilodaltons; LV-NC, lentivírus controle negativo; RT-qPCR, PCR quantitativo de transcrição reversa; DP, desvio padrão. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5: A expressão forçada de miR-486-3p reduz os sinais associados ao crescimento no kit CCK-8 ao longo do tempo. Células A549 (A) e H358 (B) transduzidas com LV-NC ou LV-miR-486-3p foram analisadas aos 0 h, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h. Os valores de OD450 foram normalizados em relação ao valor correspondente de 0 h dentro de cada grupo. Os dados são apresentados como média ± DP de três experimentos biológicos independentes. Os efeitos do tratamento, do tempo e da interação tratamento-por-tempo foram analisados por meio de ANOVA de medidas repetidas bidirecional, seguida por comparações ajustadas pelo teste de Šídák entre os grupos em cada ponto temporal. *p < 0,05. CCK-8, Kit de contagem celular-8; LV-NC, lentivírus controle negativo; OD450, densidade óptica a 450 nm; DP, desvio padrão. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 6: A expressão forçada de miR-486-3p reduz o crescimento clonogênico. Imagens representativas de poços inteiros e contagens quantitativas de colônias são mostradas para células A549 (A) e H358 (B) transduzidas com LV-NC ou LV-miR-486-3p. As colônias foram quantificadas utilizando o ImageJ com configurações idênticas de análise para todos os grupos. Os dados são apresentados como média ± DP de três experimentos biológicos independentes e foram analisados utilizando testes t de Student não pareados bicaudais. Os valores exatos de p são fornecidos nos respectivos painéis. LV-NC, lentivírus controle negativo; DP, desvio padrão. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 7: A expressão forçada de miR-486-3p reduz o fechamento da ferida. Imagens representativas e medidas quantitativas do fechamento da ferida são mostradas para células A549 (A,C) e H358 (B,D) em 0 h, 24 h, 48 h e 72 h após o arranhão. O fechamento da ferida foi calculado da seguinte forma: (área da ferida em 0 h − área da ferida no ponto de tempo indicado) / área da ferida em 0 h × 100%. Os dados são apresentados como média ± DP de três experimentos biológicos independentes. Os efeitos do tratamento, do tempo e da interação tratamento-por-tempo foram analisados usando ANOVA de duas vias com medidas repetidas, seguida por comparações ajustadas por Šídák entre os grupos em cada ponto de tempo. Barras de escala, 200 µm. *p < 0,05; **p < 0,01. LV-NC, lentivírus controle negativo; DP, desvio padrão. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 8: A expressão forçada de miR-486-3p reduz a travessia de membranas Transwell revestidas com Matrigel. Campos microscópicos representativos corados com cristal violeta e contagens quantitativas de células por inserto são mostrados para A549 (A) e H358 (B) células transduzidas com LV-NC ou LV-miR-486-3p. Inserts Transwell com um 8-µm tamanho dos poros foram utilizados. Cinco campos microscópicos foram analisados em média para cada inserto, e cada inserto foi tratado como uma unidade experimental. Os dados são apresentados como média ± DP de três experimentos biológicos independentes e foram analisados utilizando o teste t de Student não pareado bicaudal t-testes. Barras de escala, 200 µm. Exato p-valores são fornecidos nos respectivos painéis. LV-NC, lentivírus controle negativo; DP, desvio padrão. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Gene | Sequências dos primers | Comprimentos dos amplicons | Eficiências de amplificação | |
| WNT5B | Sentido: 5'-AAATGCCACGGCGTCTCG-3', | 118 pb | 101% | |
| Antissentido: 5'-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3' | ||||
| DVL1 | Sentido: 5'-GAGGGTGCTCACTCGGATG-3', | 158 pb | 95,60% | |
| Antissentido: 5'-GTGCCTGTCTCGTTGTCCA-3' | ||||
| CTNNB1 | Sentido: 5'-GCGCCATTTTAAGCCTCTCG-3', | 140 pb | 96,30% | |
| Antissentido: 5'-AAATACCCTCAGGGGAACAGG-3' | ||||
| BCL2 | Sentido: 5'-GTCATGTGTGTGGAGAGCGT-3', | 139 pb | 97,20% | |
| Antissentido: 5'-ATAGTTCCACAAAGGCATCC-3' | ||||
| GAPDH | Sentido: 5'-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3', | 107 pb | 98,30% | |
| Antissentido: 5'-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3' | ||||
Tabela 1: Sequências de iniciadores utilizadas para RT-qPCR.
| Alvo | Informações da previsão | Fonte | ||
| DVL1 | 7mer-m8, posições 468–474 | URL do TargetScan (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000397196.2&taxid=9606&members=miR-486-3p&showcnc=1& shownc=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
| WNT5B | 8mer, posições 913–920 | URL do TargetScan (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000378891.5&taxid=9606&members=miR-486-3p&showcnc=1& shownc=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
Tabela 2: Banco de dados TargetScan e URL correspondente.
Arquivo Suplementar 1: Dados que apoiam as descobertas deste estudo.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
O presente estudo de ganho de função avaliou os efeitos da expressão estável e forçada do miR-486-3p em células de adenocarcinoma pulmonar (LUAD) A549 e H358. Em ambos os modelos, a superexpressão do miR-486-3p esteve associada à redução de sinais do CCK-8 relacionados ao crescimento, menor crescimento clonogênico, menor fechamento de ferida e menor número de células atravessando membranas Transwell revestidas com Matrigel. Essas alterações fenotípicas foram acompanhadas por redução na abundância proteica de WNT5B, DVL1, β-catenina total e BCL-2, juntamente com níveis mais baixos de transcritos de WNT5B, DVL1, CTNNB1 e BCL2. Em conjunto, esses achados sustentam uma associação entre a expressão forçada do miR-486-3p, atenuação de diversos fenótipos celulares malignos e alterações coordenadas em moléculas selecionadas relacionadas à via Wnt. No entanto, eles não estabelecem ligação direta entre o miRNA e seu alvo, atividade da via ou uma sequência causal de sinalização.
O fenótipo geral supressor de tumor observado neste estudo é consistente com relatos anteriores e não deve ser interpretado como a principal descoberta inovadora. Tomioka et al. demonstraram previamente que tanto o miR-486-3p quanto o miR-486-5p suprimem fenótipos malignos em células de LUAD e identificaram o GINS4 por meio de uma estratégia de triagem de alvos não tendenciosa26. A contribuição do presente estudo é mais específica: a expressão forçada de miR-486-3p foi acompanhada por reduções na abundância de WNT5B, DVL1 e β-catenina em dois modelos de células de LUAD. Além disso, o estudo fornece um fluxo de trabalho experimental integrado que combina transdução lentiviral estável, RT-qPCR, Western blotting, análise com CCK-8, formação de colônias, fechamento de ferimento e ensaios em Transwell revestidos com Matrigel. Essa distinção é importante porque o trabalho atual amplia as observações moleculares associadas à superexpressão de miR-486-3p, sem reivindicar a primeira demonstração de sua atividade antitumoral em LUAD.
Os achados relacionados à via Wnt exigem interpretação cautelosa. WNT5B é comumente descrito como um ligante Wnt não canônico e pode ativar a sinalização da polaridade celular planar ou a via Wnt/Ca2⁺ de maneira dependente do receptor e do contexto. Em alguns ambientes celulares, a sinalização Wnt não canônica também pode antagonizar a sinalização dependente de β-catenina10,11. DVL1 é um mediador intracelular comum que pode participar tanto da sinalização Wnt canônica quanto da não canônica e tem sido associado a fenótipos relacionados à β-catenina no câncer de pulmão de células não pequenas12. Portanto, a redução simultânea de WNT5B, DVL1 e β-catenina total não demonstra uma via linear WNT5B→DVL1→β-catenina. Os dados apresentados indicam, em vez disso, reduções concomitantes na expressão de WNT5B e na abundância de DVL1 e β-catenina após a expressão forçada de miR-486-3p.
Os resultados no nível de transcritos foram direcionalmente consistentes com os achados do Western blot. A expressão forçada de miR-486-3p reduziu a abundância dos transcritos WNT5B, DVL1 e CTNNB1 em células A549 e H358. Essa concordância sugere que as alterações observadas nos níveis proteicos podem estar acompanhadas por mudanças na abundância dos transcritos, em vez de resultarem exclusivamente de alterações na estabilidade proteica. No entanto, a redução nos níveis de transcritos e proteínas não comprova a ligação direta do miR-486-3p às regiões não traduzidas 3′ previstas. Ensaios de repórter de dupla luciferase utilizando sítios de ligação selvagens e mutantes, juntamente com experimentos de resgate, seriam necessários para determinar se WNT5B ou DVL1 são regulados diretamente pelo miR-486-3p. De forma semelhante, a redução na abundância de BCL-2 indica uma alteração em uma proteína associada à sobrevivência celular, mas, na ausência de ensaios validados de morte celular, não pode ser interpretada como evidência de aumento da apoptose.
Os ensaios funcionais também apresentam limitações específicas do ensaio. O CCK-8 mede a atividade metabólica celular em vez de determinar diretamente o número de células, e as alterações na absorbância podem refletir mudanças na proliferação, metabolismo ou viabilidade. A formação de colônias fornece uma medida de longo prazo da capacidade clonogênica, mas a magnitude do efeito diferiu entre as duas linhagens celulares, com uma redução moderada nas células A549 e uma redução maior nas células H358. Essa diferença sugere que a resposta à expressão forçada de miR-486-3p pode depender do contexto molecular e celular.
Foi observada uma redução no fechamento de feridas em ambas as linhagens celulares, mas nenhum inibidor de proliferação foi utilizado durante o ensaio. Como a expressão forçada de miR-486-3p também afetou medições associadas ao crescimento, a proliferação reduzida pode ter contribuído para o fenótipo de fechamento de ferida. Os resultados devem, portanto, ser interpretados como um fechamento de ferida reduzido, e não como um efeito específico de migração. Da mesma forma, o ensaio de Transwell com revestimento de Matrigel de 48 h pode ser influenciado por diferenças na travessia da membrana, proliferação, sobrevivência ou adesão. A redução observada nas células na superfície inferior da membrana apoia, consequentemente, uma travessia prejudicada nas condições testadas, mas não isola um mecanismo específico de invasão.
Uma consideração adicional é a magnitude da superexpressão de miR-486-3p. A transdução lentiviral aumentou a abundância de miR-486-3p em aproximadamente 1.470 vezes nas células A549 e 220 vezes nas células H358 em relação aos grupos controle correspondentes. Essa expressão supra-fisiológica pode aumentar a repressão de alvos não específicos dependentes da região semente, afetar a disponibilidade de componentes do complexo de silenciamento mediado por RNA ou induzir estresse celular inespecífico. Como nenhuma série de resposta à dose foi realizada, a relação entre a abundância de miR-486-3p e os fenótipos observados não pôde ser definida. Além disso, a ausência de um experimento de perda de função baseado em inibidores impede conclusões sobre o papel fisiológico endógeno do miR-486-3p em células de CAEP. Os resultados apresentados devem, portanto, ser interpretados especificamente como consequências da superexpressão forçada e estável.
Várias limitações devem ser consideradas. Apenas duas linhagens celulares de LUAD com mutação em KRAS foram examinadas, e o uso de meios de cultura diferentes limita a interpretação das comparações com as células Beas-2b. A autenticação das linhagens celulares e os testes para micoplasma não foram realizados durante o estudo, e o U6 foi utilizado como única referência para a quantificação do miR-486-3p. O estudo também não incluiu ensaios de perda de função, resposta à dose, repórter, resgate ou funcionais da via Wnt. Além disso, os resultados dos ensaios de fechamento de ferimento e do Transwell podem ter sido influenciados por diferenças na proliferação, viabilidade ou adesão. Por fim, não foram incluídos modelos animais, espécimes de pacientes ou coortes de validação clínica. Portanto, os achados estão limitados a este sistema in vitro de expressão forçada e não estabelecem direcionamento direto, causalidade da via ou utilidade clínica.
Em conclusão, a expressão estável forçada de miR-486-3p reduziu diversas medidas associadas ao crescimento e à motilidade em células de CAUP A549 e H358 e foi acompanhada por menor expressão de WNT5B, DVL1, β-catenina total e BCL-2. Esses achados fornecem uma base para investigações mecanicistas adicionais, mas não estabelecem WNT5B ou DVL1 como alvos diretos, uma via linear WNT5B/DVL1/β-catenina ou o valor clínico do miR-486-3p.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
O Plano de Ciência e Tecnologia Médica e de Saúde da Província de Zhejiang (2025KY349) e a Disciplina de Apoio Chave da Cidade de Jiaxing (2023-zc-014) forneceram apoio financeiro para este estudo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tris-HCl 1 M (pH 6,8) | Solarbio | T1020 | Preparação do gel de empilhamento SDS-PAGE |
| Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) | Solarbio | T1010 | Preparação do gel de separação SDS-PAGE |
| Tampão TBS 20× | Solarbio | 71080 | Tampão estoque para lavagem em western blot e diluição de anticorpos |
| Solução de acrilamida/bis-acrilamida 30% (29:1) | Solarbio | A1010 | Preparação de géis SDS-PAGE |
| Fixador de paraformaldeído 4% | Servicebio | G1101 | Fixação para ensaios de formação de colônias e Transwell |
| Tampão de carregamento de proteína 5× | Beyotime | P0015 | Preparação de amostras proteicas para SDS-PAGE |
| Persulfato de amônio | Solarbio | 427A038 | Iniciador da polimerização do gel SDS-PAGE |
| Kit de ensaio de proteína BCA | Beyotime | P0009-1 | Determinação da concentração proteica |
| Anticorpo BCL-2 | Boster Biological Technology | A00040-2 | Anticorpo policlonal de coelho; western blot na diluição 1:5.000 |
| Kit de contagem celular-8 (CCK-8) | TargetMol | C0005 | Ensaio de atividade metabólica associada ao crescimento celular; 10 μL por 100 μL de meio de cultura |
| Sistema de imagem por quimioluminescência | Bio-Rad | ChemiDoc MP | Obtenção de imagens em western blot |
| Clorofórmio | Servicebio | G3005 | Separção de fases durante extração de RNA com TRIzol |
| Solução de coloração com violeta de cristal | Servicebio | G1014 | Coloração de colônias e membranas Transwell |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Meio de cultura rotineiro para células Beas-2b |
| Anticorpo DVL1 | Signalway Antibody | 53180 | Anticorpo primário de coelho; western blot na diluição 1:5.000 |
| Soro bovino fetal (FBS) | Biosharp | BL203B | Suplemento a 10% (v/v) para cultura celular rotineira; 20% (v/v) na câmara inferior Transwell |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | Versão 8 | Preparação de gráficos e análise estatística |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (sem Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | PCR quantitativa baseada em SYBR Green |
| Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix para qPCR (com digestor de gDNA) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | Transcrição reversa para RT-qPCR de mRNA |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Versão 22,0 | Análise estatística |
| ImageJ | National Institutes of Health | Versão 1,53 | Densitometria em western blot, medição da área do ferimento, contagem de colônias e contagem de células em Transwell |
| Microscópio invertido | Olympus | CKX53 | Obtenção de imagens em ensaios de cicatrização de ferimento e Transwell |
| Isopropanol | Servicebio | G3006 | Precipitação de RNA durante extração com TRIzol |
| Preparações lentivirais LV-miR-486-3p e LV-NC | GenePharma | Síntese personalizada | Vetor de superexpressão estável de miR-486-3p e vetor controle negativo embaralhado |
| Matriz de membrana basal Matrigel | Corning | 354234 | Diluída 1:8 em DMEM sem soro; concentração final de proteína de aproximadamente 1 mg/mL |
| Metanol | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | Ativação de membrana PVDF |
| Leitor de microplacas | BioTek | ELx800 | Medição da absorbância em 450 nm |
| Espectrofotômetro UV-Vis de microvolume | Allsheng | Nano-600 | Avaliação da concentração de RNA e pureza A260/A280 |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Suplemento a 1% (v/v) para cultura celular rotineira |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Servicebio | G0002 | Lavagem de células e membranas |
| Cocktail de inibidores de protease | APExBIO | K1007 | Adicionado ao tampão de lise RIPA |
| Escada de proteínas | Biosharp | BL712A | Referência de peso molecular para western blot |
| Membrana PVDF | Millipore | K2MA8350E | Membrana de transferência proteica para western blot |
| Sistema de PCR em tempo real QuantStudio 5 | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | Aquisição de dados de RT-qPCR |
| Tampão de lise RIPA | Beyotime | P0013B | Extração de proteínas celulares totais |
| Reagente de extração de RNA (tipo TRIzol) | Servicebio | G3013 | Extração de RNA total |
| Meio RPMI 1640 | Servicebio | G4510 | Meio de cultura rotineiro para células A549 e H358 e suspensão celular Transwell sem soro |
| SDS | Solarbio | S8010 | Reagente para SDS-PAGE |
| Pó de leite desnatado | BD | 2271470 | Solução bloqueadora a 5% para western blot |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | Análise de expressão de miR-486-3p derivada do TCGA |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | Previsão de sítios de ligação candidatos para miR-486-3p |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | Catalisador da polimerização do gel SDS-PAGE |
| Insertos Transwell, 24 poços, tamanho de poro 8 μm | Corning | 3428 | Ensaio de travessia em membrana revestida com Matrigel |
| Tripsina | Servicebio | G4000 | Desanexação celular |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | Preparação do tampão de lavagem para western blot |
| Sistema eletroforético vertical | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | Separção proteica por SDS-PAGE |
| Reagente luminol substrato HRP para western blot | Affinity Biosciences | KF001 | Detecção por quimioluminescência em western blot |
| Sistema de transferência úmida | Bio-Rad | 1703930 | Transferência proteica para membrana PVDF |
| Anticorpo WNT5B | Signalway Antibody | 56808 | Anticorpo primário de coelho; western blot na diluição 1:5.000 |
| Anticorpo β-actina | Abcam | ab8227 | Controle de carregamento; western blot na diluição 1:5.000 |
| Anticorpo β-catenina | Signalway Antibody | 21725 | Anticorpo primário de coelho; western blot na diluição 1:5.000 |
Referências
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