miR-486-3p Suprime Fenótipos Malignos e está Associado à Redução da Expressão de WNT5B, DVL1 e β-catenina em Células de Adenocarcinoma Pulmonar

Wanli Cheng; Weibo Qi; Niu Niu; Junjie Zhao

doi:10.3791/71545

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Artigo de investigação

miR-486-3p Suprime Fenótipos Malignos e está Associado à Redução da Expressão de WNT5B, DVL1 e β-catenina em Células de Adenocarcinoma Pulmonar

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DOI:

10.3791/71545

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21 de agosto de 2026

Wanli Cheng^*¹ , Weibo Qi^*¹ , Niu Niu¹ , Junjie Zhao¹

¹Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jiaxing

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A superexpressão forçada de miR-486-3p suprime a atividade associada à proliferação, o crescimento clonogênico, o fechamento de feridas e a travessia de Matrigel em células de adenocarcinoma pulmonar A549 e H358. Esses efeitos acompanham a redução da expressão de WNT5B, DVL1, β-catenina e BCL-2, indicando uma associação in vitro com alterações relacionadas à via Wnt, sem estabelecer direcionamento direto ou causalidade da via.

Resumo

O adenocarcinoma pulmonar (LUAD) é o subtipo histológico predominante do câncer de pulmão de células não pequenas e continua associado a uma morbidade e mortalidade significativas. Estudos anteriores identificaram funções supressoras de tumor do miR-486-3p no LUAD, mas sua relação com alterações na expressão relacionadas a WNT5B, DVL1 e β-catenina ainda não foi claramente definida. Aqui, a abundância basal do miR-486-3p foi examinada em células de LUAD A549 e H358 e comparada com a de células epiteliais brônquicas Beas-2b mantidas sob suas respectivas condições rotineiras. Modelos estáveis de superexpressão do miR-486-3p foram gerados por transdução lentiviral. Atividades associadas ao crescimento celular, crescimento clonogênico, fechamento de ferida e travessia de membranas revestidas com Matrigel foram avaliadas utilizando os ensaios de kit de contagem celular-8, formação de colônias, cicatrização de ferida e Transwell. A abundância das proteínas WNT5B, DVL1, β-catenina e BCL-2 foi avaliada por meio de Western blotting, e os níveis de mRNA de WNT5B, DVL1, CTNNB1 e BCL2 foram adicionalmente examinados por RT-qPCR. Nas condições de cultivo utilizadas, a abundância do miR-486-3p foi menor nas células A549 e H358 do que nas células Beas-2b, e a transdução lentiviral produziu superexpressão estável em ambas as linhagens celulares de LUAD. A superexpressão forçada do miR-486-3p reduziu o sinal do CCK-8, a formação de colônias, o fechamento de ferida e a travessia de membranas revestidas com Matrigel, e foi acompanhada por menor abundância das proteínas WNT5B, DVL1, β-catenina total e BCL-2. A RT-qPCR também mostrou menor abundância dos transcritos de WNT5B, DVL1, CTNNB1 e BCL2 em ambas as linhagens celulares de LUAD após a superexpressão do miR-486-3p. Esses achados apoiam uma associação in vitro entre a expressão forçada do miR-486-3p, a atenuação de diversos indicadores de malignidade celular e alterações na expressão relacionada à via Wnt; entretanto, eles não estabelecem ligação direta entre o miRNA e seu alvo, atividade da via ou um mecanismo de sinalização linear causal.

Introdução

O adenocarcinoma pulmonar (LUAD) é o subtipo histológico mais comum do câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) e contribui significativamente para a morbidade e mortalidade relacionadas ao câncer de pulmão em todo o mundo¹^,²^,³^,⁴^,⁵. A classificação molecular e as terapias direcionadas melhoraram os resultados para grupos selecionados de pacientes, mas o LUAD avançado continua difícil de tratar e é biologicamente heterogêneo¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Portanto, definir os processos regulatórios que contribuem para o comportamento celular maligno permanece relevante para o desenvolvimento de hipóteses terapêuticas testáveis.

A sinalização Wnt compreende ramificações dependentes e independentes de β-catenina que regulam proliferação, sobrevivência, polaridade e motilidade⁶^,⁷^,⁸^,⁹. WNT5B está mais frequentemente associado à sinalização não canônica, embora seus efeitos biológicos variem conforme o receptor e o contexto celular¹⁰^,¹¹. DVL1 é uma proteína citoplasmática de transdução de sinal compartilhada por diversas ramificações da via Wnt e tem sido associada a comportamentos relacionados à β-catenina no câncer de pulmão¹². Assim, alterações simultâneas em WNT5B, DVL1 e β-catenina não devem, por si só, ser interpretadas como evidência de uma única via linear.

MicroRNAs (miRNAs) são RNAs não codificantes curtos que regulam a expressão gênica por meio de interações dependentes de sequência com transcritos-alvo¹³^,¹⁴^,¹⁵. Como um único miRNA pode afetar múltiplos RNAs, a abundância alterada de miRNAs pode influenciar diversos fenótipos associados a tumores¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Vários miRNAs foram associados ao crescimento, motilidade e sinalização do câncer de pulmão, e a interação entre miRNAs e redes relacionadas à via Wnt foi descrita em múltiplos contextos de câncer¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

O locus MIR486 dá origem às fitas maduras miR-486-3p e miR-486-5p. A miR-486-3p demonstrou atividade supressora de tumor no câncer oral e no glioblastoma, enquanto um efeito promotor de tumor foi relatado no carcinoma de células escamosas cutâneo²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵. A miR-486-3p foi selecionada para o presente estudo por meio de uma estratégia baseada em hipótese, fundamentada em sua abundância reduzida em dados públicos de LUAD, em sua atividade supressora de tumor previamente relatada em LUAD e em previsões bioinformáticas que a associam a transcritos candidatos relacionados à via WNT. Tomioka et al. demonstraram efeitos supressores de tumor de ambas as fitas da miR-486 em LUAD e identificaram GINS4 por meio de triagem genômica de alvos²⁶. Assim, o presente estudo não reivindica a primeira demonstração de um fenótipo antitumoral. Em vez disso, avalia se a expressão forçada da miR-486-3p é acompanhada por alterações na abundância de WNT5B, DVL1 e β-catenina e por mudanças fenotípicas reprodutíveis em duas linhagens celulares de LUAD. Essas análises avaliam associações e não estabelecem direcionamento direto, atividade da via ou um mecanismo linear WNT5B/DVL1/β-catenina.

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Protocolo

Os reagentes e o equipamento utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

Cultura celular

Foram utilizadas as linhagens celulares de adenocarcinoma pulmonar humano (LUAD) A549 e H358, e a linhagem celular epitelial brônquica imortalizada Beas-2b. A549 (KRAS G12S) e H358 (KRAS G12C; deficiente em STK11) foram selecionadas como modelos de LUAD comumente utilizados, com diferentes backgrounds de mutação no KRAS, enquanto Beas-2b foi incluída como comparador epitelial brônquico não maligno. As células A549 e H358 foram mantidas em meio RPMI-1640, e as células Beas-2b foram mantidas em DMEM; cada meio continha 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-estreptomicina. As células foram cultivadas a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂. Como as linhagens celulares tumorais e a linhagem epitelial comparadora foram mantidas em meios de rotina diferentes, as comparações de expressão basal entre linhagens celulares foram interpretadas com cautela.

Transdução lentiviral e seleção estável de células

Vetores lentivirais carregando o precursor do hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) ou uma sequência controle negativa embaralhada (LV-NC) foram utilizados em um delineamento de ganho de função estável. Células A549 e H358 foram semeadas em placas de 6 poços a 5 × 10⁴ células/poço e cultivadas durante a noite. No dia seguinte, as células foram expostas ao lentivírus em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10, na presença de 8 µg/mL de polibreno. Após 24 h, o inóculo viral foi substituído por meio completo fresco. As células transduzidas foram selecionadas com 2 µg/mL de puromicina por 7 dias. Após a seleção, as células sobreviventes tiveram permissão para se recuperar e foram expandidas para os ensaios moleculares e funcionais subsequentes. Nenhum braço com inibidor de miR-486-3p foi incluído, pois o presente estudo foi planejado especificamente para avaliar os efeitos da superexpressão forçada estável.

OBSERVAÇÃO: A MOI, o tempo de exposição à polibrena e as condições de seleção com puromicina devem ser mantidos idênticos entre os grupos LV-NC e LV-miR-486-3p para minimizar as diferenças relacionadas ao tratamento na viabilidade celular.

RT-qPCR

A RT-qPCR foi realizada para determinar os níveis de expressão do miR-486-3p e confirmar a eficiência da superexpressão por lentivírus em células A549 e H358. O RNA total foi isolado utilizando o reagente TRIzol, conforme as instruções do fabricante. A concentração e pureza do RNA foram avaliadas espectrofotometricamente, considerando aceitável uma razão A260/A280 entre 1,8 e 2,1. Para análise de mRNA, 1 µg de RNA total foi transcrito reversamente em cDNA utilizando um kit comercial de síntese de cDNA, de acordo com o protocolo do fabricante. Para análise de microRNA, a síntese de cDNA foi realizada utilizando um iniciador específico para microRNA com sequência em alça (stem-loop) para a transcrição reversa. A PCR quantitativa foi realizada em um volume total de reação de 20 µL, contendo 10 µL de SYBR Green Master Mix 2×, 0,4 µM de cada iniciador e 2 µL de molde de cDNA. O protocolo de amplificação consistiu em uma etapa inicial de desnaturação a 95 °C por 5 min, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 10 s e anelamento/extensão a 60 °C por 30 s. Uma análise de curva de dissociação foi posteriormente realizada para verificar a especificidade da amplificação. O RNA nuclear pequeno U6 foi utilizado como controle interno para a quantificação de miRNA, enquanto o GAPDH foi usado como gene de referência para a normalização do mRNA. Os níveis relativos de expressão foram determinados utilizando o método 2^−ΔΔCq.

As sequências dos primers para miRNA foram as seguintes: primer de retrotranscrição com alça em stem-loop, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; primer direto miR-486-3p, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; primer reverso universal, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; primer direto U6, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; e primer reverso U6, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. As sequências dos primers para WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 e GAPDH, juntamente com os comprimentos dos amplicons e eficiências de amplificação, estão fornecidas na Tabela 1. A expressão de mRNA foi normalizada em relação a GAPDH, enquanto a expressão de miR-486-3p foi normalizada em relação a U6. Cada experimento incluiu três réplicas biológicas independentes, com três réplicas técnicas por réplica biológica.

Western blotting

Após a conclusão da seleção com puromicina de 7 dias e um período de recuperação, as células foram lisadas em tampão RIPA contendo inibidores de protease. As concentrações de proteína foram determinadas utilizando um ensaio de proteína BCA. Quantidades iguais de proteína (20 µg por poço) foram separadas em géis de SDS-PAGE a 10% e transferidas para membranas de PVDF por transferência úmida a 300 mA durante 120 min. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% preparado em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20 (TBST) por 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra WNT5B (1:1.000), DVL1 (1:1.000), β-catenina (1:1.000), BCL-2 (0,5 µg/mL) ou β-actina (1:5.000). Os fabricantes e números de catálogo de todos os anticorpos estão indicados na Tabela de Materiais. Após três lavagens de 10 min com TBST, as membranas foram incubadas com um anticorpo secundário de cabra anti-coelho IgG conjugado à HRP, diluído 1:5.000, por 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, as membranas foram lavadas três vezes com TBST, e as bandas proteicas foram visualizadas utilizando um substrato quimioluminescente e imagens foram obtidas com um sistema de documentação e imagem de géis. As intensidades das bandas foram quantificadas usando o ImageJ. A abundância de cada proteína-alvo foi normalizada ao sinal correspondente de β-actina da mesma amostra biológica. Apenas exposições dentro da faixa linear e não saturada de detecção foram utilizadas para análise densitométrica. Três experimentos biológicos independentes foram realizados.

Ensaio com o Kit de Contagem de Células-8

Células A549 e H358 transduzidas de forma estável com LV-NC ou LV-miR-486-3p foram semeadas em placas de 96 poços a 1,5 × 10⁴ células/poço em 100 µL de meio completo. Após a adesão durante a noite, o meio foi substituído e a absorbância em 0 h foi medida imediatamente após a adição do reagente do Kit de Contagem de Células-8. Em 0 h, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h, 10 µL de reagente foram adicionados por poço e incubados por 1 h a 37 °C antes da leitura da absorbância em 450 nm. Para a análise revisada do curso temporal, cada grupo foi normalizado em relação ao seu próprio valor em 0 h antes da plotagem. Três experimentos biológicos independentes foram realizados, e os poços técnicos dentro de cada experimento foram médias antes da análise estatística.

Ensaio de formação de colônias

Células A549 e H358 estavelmente selecionadas foram preparadas como suspensões simples de células a 5 × 10² células/mL. Um mililitro de suspensão celular foi semeado em cada poço de uma placa de 6 poços, seguido por 3 mL de meio completo. As células foram cultivadas por 14 dias, com substituição do meio a cada 5 dias. As colônias foram lavadas com PBS, fixadas com paraformaldeído 4% por 20 minutos, coradas com violeta cristal por 20 minutos, lavadas e secas ao ar. Foram contadas as colônias contendo pelo menos 50 células no ImageJ. Três experimentos biológicos independentes foram realizados.

OBSERVAÇÃO: Uma suspensão uniforme de células isoladas e o mínimo de perturbação da placa durante o estabelecimento das colônias são necessários para evitar o agrupamento artificial das células.

Ensaio de migração celular

Células A549 e H358 transduzidas de forma estável foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas até a formação de uma monocamada confluente. Um arranhão reto foi feito com uma ponteira estéril de 10 µL, as células destacadas foram removidas e os mesmos campos marcados foram registrados em imagens aos 0 h, 24 h, 48 h e 72 h. A área da lesão foi medida no ImageJ, e o fechamento da ferida foi calculado como (área aos 0 h − área no tempo indicado) / área aos 0 h × 100%. Três experimentos biológicos independentes foram realizados. Nenhum bloqueador farmacológico da proliferação foi utilizado; portanto, este ensaio foi interpretado como uma medida de fechamento da ferida, e não como uma leitura específica de migração.

OBSERVAÇÃO: Os arranhões devem ser gerados com largura e pressão consistentes, e os mesmos campos devem ser seguidos ao longo de todo o curso do tempo.

Ensaio de invasão celular

Ensaios de invasão em Transwell foram realizados utilizando inserts de membrana de policarbonato de 24 poços com poros de 8 µm. A superfície superior de cada insert foi revestida com 100 µL de matriz de membrana basal Matrigel diluída 1:8 em DMEM sem soro, até uma concentração final aproximada de proteína de 1 mg/mL, e incubada a 37 °C por 4 h. As células A549 e H358 foram ressuspendidas em meio RPMI-1640 sem soro nas densidades de 8 × 10⁵ células/mL e 4 × 10⁵ células/mL, respectivamente. Uma alíquota de 200 µL da suspensão celular foi adicionada à câmara superior, correspondendo a 1,6 × 10⁵ células A549 ou 8 × 10⁴ células H358 por insert. A câmara inferior foi preenchida com 500 µL de meio RPMI-1640 contendo 20% de soro bovino fetal como quimioatraente. Após incubação a 37 °C em atmosfera úmida contendo 5% de CO₂ por 48 h, as células não invasoras que permaneceram na superfície superior da membrana foram cuidadosamente removidas com um cotonete. As células que haviam invadido através da membrana foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 20 min e coradas com violeta cristal a 0,1% por 20 min à temperatura ambiente. Cinco campos microscópicos selecionados aleatoriamente foram registrados para cada insert, e o número de células invadidas foi quantificado utilizando o ImageJ. A contagem média de células dos cinco campos foi considerada um único valor para cada insert, e o insert, e não o campo microscópico individual, foi tratado como unidade experimental. Três experimentos biológicos independentes foram realizados.

OBSERVAÇÃO: Remova as células não invasoras suave e consistentemente para evitar danificar a membrana ou desalojar as células que migraram para sua superfície inferior.

Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± SD e n denota experimentos biológicos independentes, salvo indicação em contrário. Réplicas técnicas ou múltiplos campos microscópicos provenientes da mesma unidade experimental foram agrupados por média antes dos testes inferenciais. Para a comparação entre as três linhagens celulares, foi utilizada análise de variância unidirecional seguida de comparações pareadas ajustadas pelo método de Tukey. Para os cursos temporais do CCK-8 e do fechamento de ferimento, foi utilizada análise de variância bidirecional de medidas repetidas para avaliar os efeitos do tratamento, do tempo e da interação tratamento-por-tempo, seguida de comparações ajustadas pelo método de Šídák em pontos de tempo individuais. Comparações entre dois grupos foram analisadas utilizando o teste t de Student não pareado bicaudal. testes-t. As análises estatísticas e a visualização dos dados foram realizadas utilizando software de análise estatística e geração de gráficos. Exato pos valores são apresentados nos painéis das figuras ou nas tabelas de dados brutos. A significância estatística foi definida como p < 0.05; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001 e ****p < 0.0001.

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Resultados

A análise do TCGA/starBase mostra redução na abundância de miR-486-3p no LUAD, e o TargetScan identifica sítios de ligação candidatos

Dados de expressão derivados do TCGA acessados por meio do starBase v3.0 mostraram que a abundância de miR-486-3p era significativamente menor em 512 amostras de adenocarcinoma pulmonar (LUAD) do que em 20 amostras pulmonares não tumorais (teste de Wilcoxon, p = 3,2 × 10⁻⁵; Figura 1). O ...

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Discussão

O presente estudo de ganho de função avaliou os efeitos da expressão estável e forçada do miR-486-3p em células de adenocarcinoma pulmonar (LUAD) A549 e H358. Em ambos os modelos, a superexpressão do miR-486-3p esteve associada à redução de sinais do CCK-8 relacionados ao crescimento, menor crescimento clonogênico, menor fechamento de ferida e menor número de células atravessando membranas Transwell revestidas com Matrigel. Essas alterações fenotípicas foram acompanhadas por redução na abundância proteica de WNT5B, DVL1,...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

O Plano de Ciência e Tecnologia Médica e de Saúde da Província de Zhejiang (2025KY349) e a Disciplina de Apoio Chave da Cidade de Jiaxing (2023-zc-014) forneceram apoio financeiro para este estudo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tris-HCl 1 M (pH 6,8)	Solarbio	T1020	Preparação do gel de empilhamento SDS-PAGE
Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)	Solarbio	T1010	Preparação do gel de separação SDS-PAGE
Tampão TBS 20×	Solarbio	71080	Tampão estoque para lavagem em western blot e diluição de anticorpos
Solução de acrilamida/bis-acrilamida 30% (29:1)	Solarbio	A1010	Preparação de géis SDS-PAGE
Fixador de paraformaldeído 4%	Servicebio	G1101	Fixação para ensaios de formação de colônias e Transwell
Tampão de carregamento de proteína 5×	Beyotime	P0015	Preparação de amostras proteicas para SDS-PAGE
Persulfato de amônio	Solarbio	427A038	Iniciador da polimerização do gel SDS-PAGE
Kit de ensaio de proteína BCA	Beyotime	P0009-1	Determinação da concentração proteica
Anticorpo BCL-2	Boster Biological Technology	A00040-2	Anticorpo policlonal de coelho; western blot na diluição 1:5.000
Kit de contagem celular-8 (CCK-8)	TargetMol	C0005	Ensaio de atividade metabólica associada ao crescimento celular; 10 μL por 100 μL de meio de cultura
Sistema de imagem por quimioluminescência	Bio-Rad	ChemiDoc MP	Obtenção de imagens em western blot
Clorofórmio	Servicebio	G3005	Separção de fases durante extração de RNA com TRIzol
Solução de coloração com violeta de cristal	Servicebio	G1014	Coloração de colônias e membranas Transwell
DMEM	Servicebio	G4511	Meio de cultura rotineiro para células Beas-2b
Anticorpo DVL1	Signalway Antibody	53180	Anticorpo primário de coelho; western blot na diluição 1:5.000
Soro bovino fetal (FBS)	Biosharp	BL203B	Suplemento a 10% (v/v) para cultura celular rotineira; 20% (v/v) na câmara inferior Transwell
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	Versão 8	Preparação de gráficos e análise estatística
Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (sem Rox)	Yeasen Biotechnology	11201ES08	PCR quantitativa baseada em SYBR Green
Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix para qPCR (com digestor de gDNA)	Yeasen Biotechnology	11141ES60	Transcrição reversa para RT-qPCR de mRNA
IBM SPSS Statistics	IBM	Versão 22,0	Análise estatística
ImageJ	National Institutes of Health	Versão 1,53	Densitometria em western blot, medição da área do ferimento, contagem de colônias e contagem de células em Transwell
Microscópio invertido	Olympus	CKX53	Obtenção de imagens em ensaios de cicatrização de ferimento e Transwell
Isopropanol	Servicebio	G3006	Precipitação de RNA durante extração com TRIzol
Preparações lentivirais LV-miR-486-3p e LV-NC	GenePharma	Síntese personalizada	Vetor de superexpressão estável de miR-486-3p e vetor controle negativo embaralhado
Matriz de membrana basal Matrigel	Corning	354234	Diluída 1:8 em DMEM sem soro; concentração final de proteína de aproximadamente 1 mg/mL
Metanol	Xilong Scientific	GB/T 683-2006	Ativação de membrana PVDF
Leitor de microplacas	BioTek	ELx800	Medição da absorbância em 450 nm
Espectrofotômetro UV-Vis de microvolume	Allsheng	Nano-600	Avaliação da concentração de RNA e pureza A260/A280
Penicilina-estreptomicina	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15240062	Suplemento a 1% (v/v) para cultura celular rotineira
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Servicebio	G0002	Lavagem de células e membranas
Cocktail de inibidores de protease	APExBIO	K1007	Adicionado ao tampão de lise RIPA
Escada de proteínas	Biosharp	BL712A	Referência de peso molecular para western blot
Membrana PVDF	Millipore	K2MA8350E	Membrana de transferência proteica para western blot
Sistema de PCR em tempo real QuantStudio 5	Thermo Fisher Scientific	QuantStudio 5	Aquisição de dados de RT-qPCR
Tampão de lise RIPA	Beyotime	P0013B	Extração de proteínas celulares totais
Reagente de extração de RNA (tipo TRIzol)	Servicebio	G3013	Extração de RNA total
Meio RPMI 1640	Servicebio	G4510	Meio de cultura rotineiro para células A549 e H358 e suspensão celular Transwell sem soro
SDS	Solarbio	S8010	Reagente para SDS-PAGE
Pó de leite desnatado	BD	2271470	Solução bloqueadora a 5% para western blot
StarBase v3.0	Sun Yat-sen University	https://rnasysu.com/encori/	Análise de expressão de miR-486-3p derivada do TCGA
TargetScanHuman	Whitehead Institute for Biomedical Research	https://www.targetscan.org/vert_80/	Previsão de sítios de ligação candidatos para miR-486-3p
TEMED	Sigma-Aldrich	T8090	Catalisador da polimerização do gel SDS-PAGE
Insertos Transwell, 24 poços, tamanho de poro 8 μm	Corning	3428	Ensaio de travessia em membrana revestida com Matrigel
Tripsina	Servicebio	G4000	Desanexação celular
Tween-20	Solarbio	815A043	Preparação do tampão de lavagem para western blot
Sistema eletroforético vertical	Liuyi Biotechnology	DYCZ-24DN	Separção proteica por SDS-PAGE
Reagente luminol substrato HRP para western blot	Affinity Biosciences	KF001	Detecção por quimioluminescência em western blot
Sistema de transferência úmida	Bio-Rad	1703930	Transferência proteica para membrana PVDF
Anticorpo WNT5B	Signalway Antibody	56808	Anticorpo primário de coelho; western blot na diluição 1:5.000
Anticorpo β-actina	Abcam	ab8227	Controle de carregamento; western blot na diluição 1:5.000
Anticorpo β-catenina	Signalway Antibody	21725	Anticorpo primário de coelho; western blot na diluição 1:5.000

Referências

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