Isolamento, purificação e caracterização de mitocondrias funcionais derivadas do músculo esquelético de camundongos para transplante mitocondrial

Summary

Foi estabelecido um protocolo padronizado que combina digestão de tripsina e centrifugação diferencial para o isolamento, purificação e caracterização funcional de mitocôndrias a partir do músculo esquelético do camundongo, bem como para avaliar sua aplicação em transplante mitocondrial.

Abstract

Mitocôndrias são organelos essenciais que regulam o metabolismo energético, a transdução de sinais e a homeostase celular em células eucarióticas. A disfunção mitocondrial contribui para a patogênese de inúmeras doenças e motivou o desenvolvimento do transplante mitocondrial como uma estratégia terapêutica regenerativa. A aplicação bem-sucedida do transplante mitocondrial depende da disponibilidade de mitocôndrias altamente purificadas e funcionalmente intactas. O músculo esquelético é uma fonte doadora adequada devido ao seu alto teor mitocondrial, atividade metabólica e acessibilidade. Este estudo estabeleceu um protocolo padronizado e reprodutível para o isolamento, purificação e caracterização de mitocôndrias funcionais do músculo esquelético do camundongo e avaliou seu uso em transplantes mitocondriais. O procedimento consistia em duas etapas principais. Primeiro, as mitocôndrias foram isoladas do músculo esquelético de camundongos C57BL/6 usando digestão de tripsina seguida de centrifugação diferencial. Segundo, as mitocôndrias isoladas foram caracterizadas para avaliar pureza, ultraestrutura e atividade funcional. A pureza mitocondrial foi avaliada por quantificação da proteína do ácido bicinconínico (BCA) e análise por Western blot. A integridade ultraestrutural foi examinada por microscopia eletrônica de transmissão. A atividade funcional foi avaliada usando JC-1 e marcagem fluorescente mitocondrial, juntamente com medições de consumo de oxigênio, capacidade de produção de ATP e razão de controle respiratório, utilizando um sistema de respirometria de alta resolução. As mitocôndrias isoladas apresentaram potencial de membrana preservado, ultraestrutura intacta e atividade respiratória estável, indicando adequação para estudos funcionais posteriores e aplicações de transplante mitocondrial.

Introduction

Mitocôndrias são os principais locais de produção de trifosfato de adenosina (ATP) e desempenham papéis centrais na apoptose, homeostase do cálcio e no metabolismo de espécies reativas de oxigênio (ROS). A integridade funcional das mitocôndrias é, portanto, fundamental para manter a homeostase celular e determinar o destino celular ^1,2. Disfunção mitocondrial, incluindo mutações no DNA mitocondrial (mtDNA) e anormalidades na cadeia de transporte de elétrons (ETC), leva a metabolismo energético comprometido, estresse oxidativo e apoptose^{desregulada 3,4}. Essas anomalias estão associadas a uma ampla gama de doenças, incluindo distúrbios mitocondriais hereditários, doenças neurodegenerativas e doenças^{cardiovasculares 5,6}. Estratégias terapêuticas convencionais para disfunção mitocondrial, como antioxidantes e cofatores metabólicos, geralmente oferecem eficácia limitada porque aliviam os sintomas sem restaurar diretamente a função mitocondrial ^7,8. Consequentemente, o transplante mitocondrial emergiu como uma abordagem terapêutica promissora na medicina regenerativa. Essa estratégia envolve a entrega de mitocôndrias exógenas intactas em células danificadas ou disfuncionais para restaurar a atividade mitocondrial e o metabolismo energético celular ^9,10. Estudos anteriores demonstraram que as mitocôndrias exógenas podem ser internalizadas pelas células receptoras e incorporadas à rede mitocondrial endógena, resultando em melhor função bioenergética e maior sobrevivência^celular 11,12,13.

O músculo esquelético é considerado um doador adequado para isolamento mitocondrial devido ao seu alto teor mitocondrial, atividade metabólica e^{acessibilidade} 14,15,16. O transplante mitocondrial requer várias etapas críticas, incluindo isolamento mitocondrial, purificação, caracterização funcional e entrega eficiente nas células receptoras. No entanto, permanece uma variabilidade metodológica substancial entre os protocolos relatados até o momento, especialmente em procedimentos envolvendo homogeneização de tecidos, digestão enzimática, controle de temperatura e purificação. Essa variabilidade pode afetar o rendimento, pureza e integridade funcional das mitocôndrias, limitando assim a reprodutibilidade experimental.

Para melhorar a consistência metodológica e a reprodutibilidade, este estudo apresenta um protocolo padronizado para isolar e caracterizar mitocôndrias funcionais do músculo esquelético do camundongo, utilizando digestão de tripsina e centrifugação diferencial. As mitocôndrias isoladas foram avaliadas quanto à pureza, integridade ultraestrutural e atividade funcional utilizando quantificação de proteínas do ácido bicinconínico (BCA), Western bloting, microscopia eletrônica de transmissão, ensaios de potencial de membrana baseados em fluorescência e respirometria de alta resolução. Além disso, a captação de mitocôndrias isoladas por células receptoras foi avaliada para avaliar sua adequação para aplicações de transplante mitocondrial. Esse protocolo oferece um fluxo de trabalho reprodutível para obter mitocôndrias funcionais derivadas do músculo esquelético para estudos experimentais posteriores.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados em uma instalação específica livre de patógenos (SPF) e aprovados pelo Comitê de Ética e Uso Animal do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Médica da Força Aérea (Aprovação nº: IACUC-2024kq-065).

Machos C57BL/6 camundongos (6-8 semanas de idade, 18-20 g) foram adquiridos no Centro de Animais de Laboratório da Universidade Médica da Força Aérea (Licença de Produção: SCXK (Shaanxi) 2024-002). Os camundongos eram alojados em gaiolas ventiladas individualmente (IVCs) sob pressão positiva e condições de limpeza, com temperatura de 20-26 °C, umidade relativa de 40%-70%, um ciclo de 12 horas de luz para escuro e pelo menos 15 trocas de ar por hora. Dieta esterilizada, água potável e enriquecimento ambiental foram fornecidos.

Os reagentes, produtos químicos e instrumentos experimentais usados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Sacrifício animal e coleta de tecidos

1. Coloque o camundongo em uma câmara hermética de eutanásia e eutanásia por inalação gradual de dióxido de carbono (CO₂), de 30% a 70% do volume da câmara por minuto.
2. Confirme a morte por cessação espontânea da respiração e batimentos cardíacos, perda dos reflexos pupilares e ausência de resposta à estimulação mecânica.
3. Imerga os camundongos C57BL/6 eutanasiados em etanol a 75% por 5 minutos para desinfecção.
   NOTA: Para evitar fixação tecidual induzida pelo álcool e danos celulares, limite o tempo de imersão a 10 minutos. Use tecido fresco durante todo o protocolo porque o congelamento compromete a viabilidade mitocondrial e a integridade funcional.
4. Coloque o camundongo em uma placa de Petri estéril dentro de um capuz de fluxo laminar, com o abdômen voltado para cima para expor totalmente as regiões do abdômen e dos membros posteriores.
5. Levante a pele da parte inferior do abdômen, próxima à região genital, usando uma pinça e faça uma pequena incisão. Realize uma dissecação contundente para separar a pele do tecido subjacente. Estenda a incisão superiormente ao longo da linha média até o tornozelo e lateralmente em direção a ambos os membros posteriores para expor completamente os grupos musculares dos membros posteriores.
6. Identifique o músculo quadríceps femoral na parte anterior da coxa e separe cuidadosamente o músculo ao longo da direção das fibras musculares usando dissecação romba. Corte o ligamento patelado distal e o tendão proximal para isolar completamente o tecido muscular.
   NOTA: Lave o tecido três vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pré-resfriada, suplementada com 2% de penicilina-estreptomicina, utilizando uma placa de Petri fresca em cada lavagem para minimizar a contaminação.
7. Coloque o tecido muscular isolado imediatamente em PBS pré-resfriado e enxágue cuidadosamente para remover pelos e sangue da superfície do tecido.
8. Limpe suavemente o excesso de umidade do tecido usando gaze estéril. Divida o tecido em tubos microcentrífugas de 1,5 mL e pese as amostras. Use aproximadamente 100 mg de tecido por amostra para manter a consistência entre as preparações.

2. Redução de tecidos e homogeneização

1. Coloque o tubo da microcentrífuga contendo o tecido do Passo 1.8 sobre gelo. Triturar o tecido em pequenos fragmentos de aproximadamente 1-2^{mm 3} de tamanho usando tesouras estéreis.
2. Adicione 8 volumes de tripsina pré-refrigerada a 0,25% e digera os fragmentos de tecido no gelo por 15 minutos.
   NOTA: Calcule o volume necessário de tripsina de acordo com a massa do tecido (1 mg ≈ 1 μL). Por exemplo, adicione 640 μL de 0,25% de tripsina a 80 mg de tecido.
3. Centrifuge a mistura a 1.000 × g por 5 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e retenha o pellet de tecido. Ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão de isolamento mitocondrial pré-resfriado contendo D-manitol (215 mM), sacarose (75 mM), HEPES (20 mM), EGTA (1 mM) e albumina sérica bovina livre de ácidos graxos (0,5% p/v).
4. Transfira a suspensão para um homogeneizador de vidro mantido no gelo. Homogeneize o tecido usando 10-12 movimentos suaves para cima e para baixo até que a suspensão fique turva.
   NOTA: Evite girar o pilão de vidro lateralmente na parte inferior do homogeneizador, pois força mecânica excessiva pode danificar as membranas mitocondriais e prejudicar a função mitocondrial.

3. Centrifugação diferencial

1. Transfira o homogeneado para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL e centrifuge a 1.000 × g por 5 minutos a 4 °C.
2. Transfira o sobrenadante para um tubo microcentrífugo novo de 1,5 mL e centrifuge a 12.000 × g por 5 minutos a 4 °C para obter a pastilha mitocondrial bruta.
   NOTA: Colete cuidadosamente o sobrenadante usando uma seringa de 1 mL, evitando perturbações do pellet e resíduos de tecido.

4. Purificação e armazenamento mitocondrial

1. Ressuspenda suavemente o pellet mitocondrial bruto em um tampão de lavagem pré-resfriado contendo sacarose (250 mM), HEPES (10 mM, pH 7,4), EGTA (1 mM) e albumina sérica bovina (0,15% p/v). Centrifuge a suspensão a 1.000 × g por 5 minutos a 4 °C.
2. Transfira o sobrenadante para um tubo novo de centrífuga e centrifuge a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C para obter a pastilha mitocondrial purificada.
   NOTA: Use mitocôndrias recém-isoladas imediatamente sempre que possível. O armazenamento de curto prazo a 4 °C ou armazenamento de longo prazo a −80 °C em tampão de armazenamento mitocondrial contendo sacarose (0,25 M), Tris-MOPS (10 mM, pH 7,4) e EGTA (0,1 mM) é viável. No entanto, o congelamento pode prejudicar a atividade enzimática mitocondrial e a função respiratória. Use amostras congeladas principalmente para análise de proteínas.

5. Extração de proteínas mitocondriais e citosólicas e quantificação de BCA

1. Extração de proteínas mitocondriais
   1. Resuspenda o pellet mitocondrial purificado em 50 μL de tampão de lise RIPA por cada 100 mg de tecido inicial e incube a suspensão no gelo por 15 minutos.
   2. Centrifuge o lisado a aproximadamente 14.000 × g por 15 minutos a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um tubo microcentrífugo novo de 1,5 mL para obter a fração de proteína mitocondrial.
2. Extração de proteínas citosólicas
   1. Centrifuge o supernadante citosólico obtido no Passo 4.2 a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e retenha o pellet como fração citosólica enriquecida.
   2. Ressuspenda o pellet citosólico em 50 μL de tampão de lise RIPA e processe a amostra conforme descrito nos Passos 5.1.1-5.1.2.
      NOTA: Prepare o tampão de lise com inibidores de protease e realize todos os procedimentos no gelo para minimizar a degradação da proteína. Mitocôndrias usadas nessa etapa podem ser frescas ou congeladas.
3. Quantificação da proteína BCA
   1. Prepare a solução de trabalho BCA misturando o reagente A e o reagente B na proporção de 50:1 (v/v). Adicione 200 μL de solução de trabalho a cada poço de uma placa de 96 poços.
      NOTA: Prepare a solução de trabalho de BCA imediatamente antes do uso e utilize-a em até 1 hora em temperatura ambiente.
   2. Dilua a solução de estoque de albumina sérica bovina (BSA) (2 mg/mL) a 0,5 mg/mL e mantenha a solução no gelo até o uso.
   3. Prepare a curva padrão adicionando 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4 ou 0 μL de solução BSA a poços separados. Ajuste o volume final para 20 μL usando solução de NaCl.
   4. Adicione 4 μL de proteína mitocondrial e 16 μL de solução de NaCl em um conjunto de poços. Adicione 4 μL de proteína citosólica e 16 μL de solução de NaCl a outro conjunto de poços.
   5. Adicione 200 μL de solução de trabalho BCA a cada poço e incube a placa a 37 °C no escuro por 30 minutos. Meça a absorção a 562 nm usando um leitor de microplaca.
   6. Construa uma curva padrão de proteína com coeficiente de correlação (R²) ≥ 0,999. Calcule as concentrações de proteína (μg/μL) interpolando os valores de absorção a partir da curva padrão.

6. Avaliação da pureza de mitocôndrias derivadas do músculo esquelético

1. Diluir amostras de proteínas mitocondriais e citosólicas até uma concentração final de 1,5 μg/μL. Preparar misturas de reação de 20 μL contendo 30 μg de proteína e 4 tampões de carga ×. Ajuste o volume restante com solução de NaCl. Ferva as amostras por 10 minutos e armazene-as a −80 °C até o uso.
2. Separe amostras de proteína usando géis pré-moldados com gradiente de 4%-20%. Realize eletroforese em 140-150 V por 50 minutos.
3. Ative a membrana PVDF (0,22 μm) em metanol por 1 minuto. Transfira proteínas usando o tampão de transferência rápida a 400 mA por 30 minutos.
4. Remova a membrana PVDF do sanduíche de transferência e lave em TBST por 5 minutos. Bloqueie a membrana com leite desnatado a 5% em temperatura ambiente por 1 hora, com sacudidas suaves.
5. Diluir anticorpos primários (COX IV, citocromo c, β-actina) 1:1.000 em tampão de diluição de anticorpos. Incube a membrana com anticorpos primários durante a noite a 4 °C.
6. Lave a membrana três vezes com TBST por 10 minutos por lavagem.
7. Incube a membrana com anticorpos secundários diluídos 1:10.000 em temperatura ambiente por 1 hora.
8. Lave a membrana três vezes com TBST por 10 minutos cada. Revele o blot e capture as imagens.

7. Coloração MitoTracker de mitocôndrias derivadas do músculo esquelético

1. Dilua a solução de trabalho de coloração até uma concentração final de 200 nM em meio pré-aquecido imediatamente antes do uso.
2. Ressuspenda a pastilha mitocondrial em 100 μL da solução de trabalho e incube a 37 °C no escuro por 20 minutos.
3. Adicione cinco volumes de buffer de armazenamento pré-resfriado após a incubação. Centrifuge a suspensão a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C e descarte o sobrenadante contendo corante não ligado.
4. Transfira uma aliquota da suspensão mitocondrial manchada para uma lâmina de vidro e cubra a amostra com uma lâmina de cobertura.
5. Capture imagens de fluorescência usando um microscópio confocal de varredura a laser com configurações apropriadas de excitação e emissão para a detecção de corantes mitocondriais fluorescentes vermelhos.

8. Avaliação do potencial da membrana mitocondrial usando coloração com JC-1

1. Grupo de tratamento CCCP (cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona)
   1. Trate a suspensão mitocondrial com CCCP em concentração final de 10 μM e incube por 20 minutos para dissipar o potencial da membrana mitocondrial.
   2. Incube a suspensão mitocondrial tratada com CCCP com 250 μL de solução de coloração JC-1 a 37 °C por 20 minutos com agitação suave.
2. Grupo de tratamento JC-1
   1. Ressuspenda o pellet mitocondrial em 100 μL de solução de trabalho JC-1 e incube a 37 °C por 20 minutos protegido da luz.
   2. Prepare 1× tampão de coloração JC-1 diluindo a solução de 5× com água destilada na proporção de 2:8 (v/v) e mantenha o tampão sobre gelo.
   3. Remova a solução de coloração e lave o pellet mitocondrial duas vezes com um tampão de coloração JC-1 pré-resfri×ado.
   4. Resuspenda as mitocôndrias tingidas no PBS e fotografe-as usando um microscópio confocal de varredura a laser. Use configurações adequadas de excitação e emissão para a detecção de monômeros fluorescentes verdes JC-1 e agregados fluorescentes vermelhos JC-1.

9. Análise ultraestrutural de mitocôndrias isoladas dos músculos esqueléticos por microscopia eletrônica de transmissão

1. Fixe mitocôndrias recém-isoladas em glutaraldeído 2,5% preparado em tampão fosfato 0,2 M (pH 7,4) e incube as amostras durante a noite a 4 °C.
2. Lave as amostras com soro tampão fosfatado de 0,1 M (PBS, pH 7,4) e fixe as amostras em tetróxido de ósmio a 1% por 1 h em temperatura ambiente.
3. Desidrate as amostras por meio de uma série de etanol graduado, seguida de infiltração, embedding e polimerização em resina epóxi.
4. Corte as amostras embutidas com espessura de 50-70 nm usando um ultramicrôntomo.
5. Tinga duas vezes as seções com acetato de uranila e citrato de chumbo. Observe e fotografe as amostras usando um microscópio eletrônico de transmissão.

10. Captação celular de mitocôndrias derivadas do músculo esquelético

1. Cultura do clone NCTC 929 (L929; RRID: CVCL_0462) células obtidas de um fornecedor comercial em meio completo contendo MEM Alfa suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.
2. Quando as células atingirem 80%-90% de confluência, aspire o meio e lave as células duas vezes com PBS pré-aquecido. Adicione tripsina-EDTA e incube até que as células se desprendam.
3. Adicione meio completo para terminar a digestão e gerar uma suspensão de célula única por pipeteamento suave. Centrifuge a suspensão a 1.000 × g por 5 minutos e descarte o sobrenadante.
4. Ressuspenda a pelota celular em meio fresco e completo e semeie as células em novos recipientes de cultura com densidade apropriada. Incube as células a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂.
5. Faça a passagem de 5 células (P5) para placas de fundo de vidro de 35 mm e cultive as células durante a noite.
6. Rotule as mitocôndrias isoladas com um corante fluorescente vermelho específico para mitocôndrias a 37 °C no escuro por 20 minutos e lave as mitocôndrias com PBS para remover o corante não ligado.
7. Adicione mitocôndrias fluorescentes vermelhas marcadas com corantes (20 μg de proteína mitocondrial por prato) às células e incube por 24 horas a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂.
8. Tinga as células com uma sonda fluorescente de actina por 30 minutos para visualizar o citoesqueleto de actina e contra-colorir núcleos com um corante nuclear fluorescente.
   NOTA: Controle cuidadosamente a concentração sérica durante a coincubação, pois o excesso de soro pode reduzir a eficiência da absorção mitocondrial. As mitocôndrias usadas nessa etapa são recentes.

11. Medição da função respiratória mitocondrial usando respirometria de alta resolução

1. Preparação de instrumentos
   1. Limpe as câmaras respiratórias, compartimentos dos eletrodos e tampões.
   2. Coloque uma barra magnética de agitação em cada câmara e verifique a integridade da membrana do eletrodo de oxigênio.
2. Calibração de instrumentos
   1. Adicione 2,1 mL de buffer de respiração mitocondrial (MiR05, pH 7,10) em cada câmara respiratória e certifique-se de que não haja bolhas de ar.
   2. Equilibrar o sistema de respirometria de alta resolução a 37 °C por 30 minutos e realizar a calibração diária do ar após a estabilização da linha de base do oxigênio.
      NOTA: Evite introduzir bolhas de ar na câmara respiratória, pois elas interferem nos sinais do eletrodo de oxigênio e comprometem a qualidade dos dados. As mitocôndrias usadas nessa etapa são recentes.
3. Carregamento e equilíbrio da amostra
   1. Adicione mitocôndrias recém-isoladas contendo aproximadamente 30 μg de proteína na câmara respiratória e fele a câmara.
   2. Equilibre a câmara por 5-8 minutos e registre o consumo basal de oxigênio.
      NOTA: Mantenha as mitocôndrias no gelo e realize medições respiratórias imediatamente após o isolamento para preservar a atividade.
4. Protocolo SUIT
   1. Adicione 5 μL de piruvato (2 M), 10 μL de glutamato (2 M) e 10 μL de malato (400 mM) sequencialmente. Estabilize a reação por 5 minutos e registre a respiração do vazamento de infiltração do coche infiltrado.
   2. Adicione 10 μL de ADP (500 mM) para induzir a fosforilação oxidativa e registrar a respiração de CI OXPHOS. Adicione 10 μL de cloreto de magnésio (0,3 M).
   3. Adicione 20 μL de succinato (1 M) e registre a respiração CI+CII OXPHOS após a estabilização.
   4. Adicione 2 μL de inibidor de ATP sintase (0,01 mM) e registre a respiração por fuga de prótons.
   5. Adicione CCCP (1 mM) incrementalmente em três adições de 2 μL em intervalos de 2 minutos até que o consumo de oxigênio atinja um platô. Registre a capacidade máxima do sistema de transferência de elétrons.
   6. Adicione 1 μL de rotenona (1 mM) para inibir a atividade do I complexo.
   7. Adicione 1 μL de antimicina A (5 mM) para inibir a atividade do complexo III e registrar o consumo residual de oxigênio.
   8. Adicione 5 μL de ascorbato (800 mM) e 5 μL N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilendiamina (200 mM). Registre a máxima atividade respiratória IV complexa após a estabilização.
      NOTA: Aliquota todos os reagentes antes do congelamento para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. Adicione CCCP gradualmente, pois o desacoplamento excessivo inibe a respiração mitocondrial.
5. Análise de dados
   1. Obtenha parâmetros de respiração mitocondrial, incluindo Vazamento de CI, CI OXPHOS, CI+CII OXPHOS, Vazamento CI+CII, CI+CII ET, CII ET e CIV, utilizando o software de análise de dados.
   2. Calcule a razão de controle respiratório (RCR; Estado 3 respiração/Estado 4 respiração) e capacidade de produção de ATP. Manter todos os valores em três valores significativos para análise estatística. O software utilizado para análise de dados foi o Oroboros Datlab 8 (Oroboros Instruments).

Results

Uma visão esquemática do fluxo de trabalho de isolamento e purificação mitocondrial é mostrada na Figura 1. Todos os procedimentos foram realizados a 4 °C para preservar a integridade mitocondrial e a atividade funcional. O tecido muscular esquelético recém-isolado foi triturado e digerido com tripsina para facilitar a dissociação do tecido, e então homogeneizado em um tampão de isolamento isotônico usando um homogeneizador de vidro. Posteriormente, foi realizada centrifugação diferencial para separar mitocôndrias de detritos de tecido e contaminantes citosólicos. A centrifugação inicial a 1.000 × g removeu núcleos e grandes detritos, enquanto a centrifugação subsequente a 12.000 × g resultou em um pellet mitocondrial bruto. Etapas adicionais de lavagem e centrifugação reduziram ainda mais a contaminação citosólica, resultando em mitocôndrias purificadas adequadas para análises estruturais e funcionais a jusante (Figura 1).

Figura 1: Diagrama esquemático do isolamento e purificação mitocondrial. Mitocôndrias de alta pureza foram isoladas por meio de uma abordagem combinada de digestão controlada de tripsina e centrifugação diferencial. Todos os procedimentos foram realizados a 4 °C para preservar a integridade estrutural e funcional mitocondrial. O tecido muscular esquelético recém-isolado foi submetido a digestão enzimática, homogeneização e etapas sequenciais de centrifugação para obter mitocôndrias purificadas adequadas para análises funcionais e estruturais posteriores. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

A atividade funcional das mitocôndrias isoladas foi avaliada usando coloração JC-1 e marcação mitocondrial fluorescente (Figura 2). A coloração com JC-1 demonstrou forte fluorescência vermelha em mitocôndrias recém-isoladas sob condições basais, indicando preservação do potencial da membrana mitocondrial. Após o tratamento com cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona (CCCP), a fluorescência vermelha diminuiu e a fluorescência verde aumentou, consistente com despolarização da membrana mitocondrial. Esses achados confirmaram que as mitocôndrias isoladas mantiveram a resposta potencial da membrana e permaneceram funcionalmente ativas após o isolamento. A marcação fluorescente demonstrou ainda que as mitocôndrias apareciam como estruturas pontuadas discretas e uniformemente distribuídas em todo o campo, sem agregação óbvia ou precipitação de corantes. A baixa fluorescência de fundo e o padrão uniforme de coloração sugeriram preservação da integridade mitocondrial e do potencial membranar após o isolamento.

Figura 2: Caracterização da atividade funcional de mitocôndrias isoladas. (A) Avaliação do potencial da membrana mitocondrial por coloração com JC-1. Mitocôndrias purificadas foram coradas com JC-1 e observadas sob microscopia de fluorescência. Agregados fluorescentes vermelhos distintos foram observados no grupo de mitocôndrias controle, indicando potencial preservado da membrana mitocondrial. Após o tratamento com o desacoplador CCCP, a fluorescência se deslocou predominantemente para monômeros verdes JC-1, indicando despolarização da membrana e colapso do potencial da membrana (barra de escala = 50 μm). (B) Marcagem fluorescente mitocondrial de mitocôndrias purificadas. Mitocôndrias marcadas fluorescentemente apareceram como estruturas dispersas e pontuadas, sem agregação óbvia e com fluorescência de fundo mínima, indicando integridade mitocondrial preservada e potencial membranar estável (barra de escala = 100 μm). (C) Análise quantitativa das razões de intensidade de fluorescência do JC-1 em diferentes grupos após a coloração com JC-1. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 3). A significância estatística foi analisada usando um teste t não pareado (****P < 0,0001). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

A integridade ultraestrutural das mitocôndrias isoladas foi examinada por microscopia eletrônica de transmissão (Figura 3). Imagens de baixa ampliação revelaram mitocôndrias purificadas com morfologia predominantemente oval, enquanto imagens de alta ampliação demonstraram membranas externas intactas e estruturas de cristas claramente definidas. Não foi observado inchaço evidente, ruptura ou perturbação estrutural. Para avaliação quantitativa, cinco campos selecionados aleatoriamente contendo aproximadamente 40-60 mitocôndrias por campo foram analisados. Essas observações demonstraram que o procedimento de isolamento preservou efetivamente a ultraestrutura mitocondrial e gerou mitocôndrias adequadas para estudos funcionais posteriores.

Figura 3: Integridade ultraestrutural das mitocôndrias isoladas do músculo esquelético avaliada por microscopia eletrônica de transmissão. (Esquerda) Imagem representativa TEM em baixa ampliação (4.000×; barra de escala = 2 μm) mostrando mitocôndrias purificadas com morfologia predominantemente oval. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

(Direita) Imagem TEM de alta ampliação (40.000×; barra de escala = 200 nm) demonstrando membranas mitocondriais externas lisas e contínuas e estruturas cristais claramente definidas. Setas amarelas indicam membranas mitocondriais externas intactas, enquanto setas brancas indicam cristas mitocondriais bem organizadas. Não foi observada evidência de inchaço, ruptura ou perturbação estrutural. Cinco campos selecionados aleatoriamente contendo aproximadamente 40-60 mitocôndrias por campo foram analisados. Esses achados demonstram que o protocolo de isolamento preservou a integridade ultraestrutural mitocondrial e forneceu uma base estrutural confiável para ensaios funcionais posteriores.

O rendimento e a pureza mitocondrial foram posteriormente avaliados por quantificação de proteínas e análise de imunoblot (Figura 4). A comparação entre os métodos de digestão de tripsina (TD) e extração normal (NE) mostrou que o método DT produziu aproximadamente 2,3-2,4 μg de proteína mitocondrial por mg de tecido, enquanto o método NE produziu aproximadamente 1,7-1,8 μg/mg de tecido. A análise de imunoblot demonstrou forte enriquecimento de marcadores mitocondriais, citocromo c oxidase e COX IV, em frações mitocondriais, com detecção mínima em frações citosólicas. Em contraste, o marcador citosólico β-actina apresentou apenas sinais fracos nas frações mitocondriais, indicando contaminação citosólica limitada. A comparação entre os grupos TD e NE sugeriu que a digestão de tripsina melhorou o rendimento e a pureza mitocondrial. Coletivamente, essas descobertas demonstraram que o protocolo gerou mitocôndrias adequadas para análises moleculares e funcionais posteriores.

Figura 4: Comparação de rendimento e pureza de mitocôndrias purificadas. (A) Comparação do rendimento de proteínas mitocondriais por unidade de massa tissular obtida usando os métodos de digestão de tripsina (TD) e extração normal (NE). O grupo TD produziu aproximadamente 2,3-2,4 μg/mg de tecido, enquanto o grupo NE produziu aproximadamente 1,7-1,8 μg/mg de tecido. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 3). A significância estatística foi analisada usando um teste t não pareado (*P < 0,05). (B) Análise imunoblot de proteínas marcadores mitocondriais e citosólicas em frações mitocondriais isoladas usando os métodos TD e NE. (C-D) Análise quantitativa das proteínas marcadoras mitocondriais, citocromo c oxidase e COX IV. Marcadores mitocondriais foram fortemente enriquecidos em frações mitocondriais, mas apresentaram expressão mínima em frações citosólicas. O marcador citosólico β-actina apresentou apenas expressão fraca em frações mitocondriais, indicando a remoção eficiente de contaminantes citosólicos. Comparado ao grupo NE, o grupo TD demonstrou melhora na pureza mitocondrial. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 3). A significância estatística foi analisada usando um teste t não pareado (*P < 0,05; **P < 0,01). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Para avaliar melhor a função respiratória mitocondrial, o consumo de oxigênio foi medido por meio de respirometria de alta resolução (Figura 5). Mitocôndrias isoladas pelo método TD apresentaram valores de razão de controle respiratório (RCR) de aproximadamente 9-10, enquanto as mitocôndrias isoladas usando o método NE apresentaram valores de RCR de aproximadamente 8-9. Como valores de RCR maiores que 4 são geralmente considerados indicativos de atividade respiratória mitocondrial preservada, esses resultados demonstraram que as mitocôndrias isoladas usando ambos os métodos mantiveram integridade funcional. Os valores mais altos de RCR observados no grupo TD sugeriram melhor preservação da função respiratória mitocondrial do que no grupo NE. A eficiência do acoplamento bioquímico também foi avaliada usando a equação 1 − (taxa de respiração por fuga/taxa de transferência de elétrons), com valores próximos de 1 indicando acoplamento respiratório mais estreito e produção mais eficiente de ATP. Ambos os grupos apresentaram eficiências de acoplamento próximas de 1, indicando que a função bioenergética mitocondrial foi preservada após o isolamento.

Figura 5: Ensaio da função respiratória em mitocôndrias purificadas. (A) Comparação da razão de controle respiratório mitocondrial (RCR) entre os grupos de digestão de tripsina (TD) e extração normal (NE). Os valores de RCR em ambos os grupos foram maiores que 4, indicando preservação da atividade respiratória mitocondrial após o isolamento. O grupo TD apresentou valores de RCR ligeiramente maiores do que o grupo NE, sugerindo melhor preservação da função respiratória. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 3). A significância estatística foi analisada usando um teste t não pareado (**P < 0,01). (B) Comparação da eficiência de acoplamento bioquímico mitocondrial e da capacidade de síntese de ATP entre os grupos TD e NE. Os valores de eficiência de acoplamento se aproximaram de 1 em ambos os grupos, indicando respiração altamente acoplada e produção eficiente de ATP. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 3). A significância estatística foi analisada usando um teste t não pareado (*P < 0,05). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

A captação de mitocôndrias isoladas por células receptoras foi avaliada usando células L929 (Figura 6). As células foram coincubadas com mitocôndrias derivadas do músculo esquelético marcado com corante fluorescente vermelho, e o citoesqueleto de actina foi visualizado usando uma sonda fluorescente de actina. Microscopia confocal revelou estruturas fluorescentes vermelhas pontuadas distribuídas por todo o citoplasma, indicando que células L929 haviam ocupado mitocôndrias exógenas. A análise quantitativa demonstrou um aumento dependente do tempo na absorção mitocondrial em 12, 24 e 48 horas. No entanto, apenas um aumento modesto foi observado entre 24 h e 48 h, sugerindo que a eficiência de absorção se aproximava da saturação após 24 horas. Além disso, as células L929 receptoras apresentaram aumento do potencial da membrana mitocondrial após a absorção mitocondrial, indicando melhora na função mitocondrial. Esses achados demonstraram que mitocôndrias derivadas do músculo esquelético isoladas usando esse protocolo poderiam ser efetivamente internalizadas pelas células receptoras enquanto mantinham a atividade funcional.

Figura 6: Captação celular de mitocôndrias derivadas do músculo esquelético por células L929. (A) Absorção de mitocôndrias purificadas por células L929 em diferentes tempos de incubação (12 h, 24 h e 48 h). Mitocôndrias marcadas com corantes fluorescentes (vermelho) foram detectadas no citoplasma das células receptoras, enquanto a coloração por faloidina (verde) foi usada para visualizar o citoesqueleto de actina. A coloração nuclear foi realizada usando DAPI (azul). A microscopia confocal confirmou a internalização de mitocôndrias exógenas por células L929 (barra de escala = 50 μm). (B) Análise quantitativa da eficiência de absorção mitocondrial por células L929 em diferentes momentos de tempo. (C) Análise de coloração JC-1 do potencial da membrana mitocondrial em células L929 após a captação de mitocôndrias derivadas do músculo esquelético. (D) Análise quantitativa das razões de fluorescência agregado para monômero do JC-1 em células L929 receptoras após absorção mitocondrial. O potencial da membrana mitocondrial aumentou significativamente após a internalização de mitocôndrias ativas derivadas do músculo esquelético. Os dados são apresentados como média ± SEM (n = 3). A significância estatística foi analisada usando ANOVA unidirecional (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussion

O transplante mitocondrial é uma estratégia emergente em terapia celular e medicina regenerativa que restaura a função fisiológica em células com metabolismo energético comprometido por meio da entrega de mitocôndrias funcionalmente intactas. Além de regular o metabolismo energético celular, essa técnica pode modular processos biológicos chave como apoptose e estresse oxidativo, proporcionando assim novas oportunidades terapêuticas para uma variedade de doenças ^4,17,18,19. No entanto, a tradução clínica do transplante mitocondrial ainda enfrenta vários desafios, entre eles a falta de protocolos padronizados, eficientes e reprodutíveis de isolamento mitocondrial, que permanece como um grande gargalo.

Para abordar essa questão, o presente estudo estabeleceu um protocolo experimental padronizado e visualizado baseado na centrifugação diferencial para o isolamento eficiente de mitocôndrias livres funcionais do músculo esquelético de camundongos C57BL/6. Ao otimizar o procedimento de purificação e incorporar etapas de pré-digestão, lavagem e purificação da tripsina, esse método melhora efetivamente a dissociação tecidual, preserva a integridade estrutural mitocondrial e reduz a contaminação por componentes celulares não alvo.

O protocolo proposto alcança um equilíbrio favorável entre pureza e rendimento mitocondrial. Comparado aos métodos convencionais de extração baseados em moagem, o método atual é mais rápido, prático e mais econômico, tornando-o adequado para aplicações laboratoriais rotineiras e preparação mitocondrial doadora. Abordagens existentes de isolamento mitocondrial possuem certas limitações. Por exemplo, centrifugação por gradiente de densidade e purificação de imunoafinidade podem alcançar maior pureza, mas são demoradas e custosas, enquanto abordagens baseadas em sondas em nanoescala ainda não estão suficientemente desenvolvidas para uso^{rotineiro 20,21}. Para tecidos densos como o músculo esquelético, a etapa otimizada de pré-digestão da tripsina (0,25% de tripsina a 37 °C por 10-15 minutos), combinada com homogeneização suave, preserva melhor a integridade mitocondrial do que a centrifugação diferencial convencional isolada.

Neste estudo, um kit comercial de centrifugação diferencial foi utilizado sob condições de baixa temperatura durante todo o procedimento e seguindo um fluxo de trabalho padronizado, permitindo a rápida aquisição de mitocôndrias estruturalmente intactas. Para abordar possíveis problemas encontrados durante o processo de extração, incluindo baixo rendimento, contaminação proteica e potencial anormal de membrana, são propostas várias estratégias de solução de problemas.

Baixo rendimento mitocondrial é comumente causado por homogeneização insuficiente, quantidade inadequada de tecido ou perda centrífuga. Esses problemas podem ser minimizados garantindo pré-digestão adequada, realizando homogeneização suave (10-15 passagens usando um homogeneizador ajustado), usando pelo menos 100-150 mg de tecido muscular esquelético fresco, controlando rigorosamente as condições de centrifugação (1.000 × g para remoção de detritos e 10.000-12.000 × g para pelletagem mitocondrial) e ressistência de amostras usando pontas de pipeta de grande calibre. A contaminação proteica resulta principalmente da remoção incompleta de detritos ou interferência lipídica; Portanto, recomenda-se repetir a etapa de centrifugação de 1.000 × g, incorporar dois passos adicionais de lavagem de 12.000 × g e remover cuidadosamente o tecido adiposo. Potencial anormal da membrana mitocondrial está frequentemente associado a danos mecânicos ou flutuações de temperatura. Portanto, a homogeneização excessiva deve ser evitada, todo o procedimento deve ser realizado no gelo e concluído em 60-90 minutos, e os tampões de isolamento devem ser complementados com EGTA e 0,5% de BSA. A homogeneização incompleta pode ser melhorada garantindo digestão enzimática adequada, selecionando um homogeneizador apropriado e realizando filtragem pós-homogeneização.

Embora o protocolo atual melhore significativamente a eficiência e pureza do isolamento mitocondrial, várias limitações permanecem. Primeiro, o procedimento depende muito da frescura dos tecidos; Idealmente, as amostras de tecido devem ser processadas dentro de 1 hora após a morte. Segundo, a tripsina residual pode degradar proteínas da superfície mitocondrial, incluindo proteínas relacionadas à translocase, se não for adequadamente removida durante a lavagem, potencialmente afetando a eficiência subsequente da absorção celular. Terceiro, o tempo de armazenamento mitocondrial permanece limitado, pois o armazenamento prolongado a 4 °C ou criopreservação reduz substancialmente a atividade mitocondrial.

No nível translacional, ainda permanecem desafios adicionais, incluindo a melhoria da eficiência da entrega in vivo , a compreensão dos mecanismos de longo prazo da integração mitocondrial e a clarificação das possíveis interações entre mitocôndrias transplantadas e o genoma do hospedeiro. Com avanços contínuos em tecnologias de isolamento e purificação mitocondrial, espera-se que novas inovações metodológicas acelerem a tradução clínica da terapia de transplante mitocondrial.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	Caracterização Mitocondrial
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	Reduzir a fotobranqueamento de corantes fluorescentes
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	Ensaio de concentração de proteína
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	O anticorpo Beta-actin foi usado para detectar a pureza dos mitocondrios isolados
BSA	Sigma	A6003	Durante a isolamento, ele se liga a ácidos graxos livres para proteger a atividade mitocondrial.
Centrífuga	Eppendorf	5418R	Centrifugação a 4 °C
CCCP	Solarbio	C6700	para desacoplamento da fosforilação oxidativa mitocondrial e indução de máxima fuga de prótons
Microscópio confocal de varredura a laser	Olympus Corporation	FV4000	Observação de coloração imunofluorescente
Anticorpo policlonal COX IV	Proteintech	11242-1-AP	Caracterização Mitocondrial
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	Para contra-coloração nuclear
D-manitol	Solarbio	IM00402	manter o equilíbrio osmótico e prevenir o inchaço mitocondrial durante o isolamento
EGTA	Sigma	E4378	Comumente usado em tampões de isolamento mitocondrial para proteger a função mitocondrial, ligando-se especificamente a Ca2+
Soro bovino fetal	Every Green	11011-08611	Cultura de células L929
	Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	Usado para agarrar, segurar e levantar tecidos
	Homogenizador de vidro	Beyotime	FGH005	Usado para homogeneização de tecidos e isolamento de mitocôndrias
	Glutaraldeído	LEAGENE	DF0151	Fixa e estabiliza rapidamente a ultraestrutura celular por meio de ligação cruzada de proteínas, prevenindo a autolise para preservar a morfologia natural dos organelas.
HEPES	Thermo Fisher	J67485	Fornece um ambiente de pH estável.
Incubadora	Thermo Fisher	51032874	Cultura de células L929
JC-1	Solarbio	M8650	Detectando mudanças no potencial de membrana de mitocôndrias purificadas.
	Linha celular L929	Procell	CL-0137	Para o ensaio de endocitose mitocondrial
	Citrato de chumbo	Sigma	15326	para colorir seções ultrafinas para observação de estrutura subcelular fina.
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	Cultura de células L929
Metanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	Como componente do tampão de transferência, é usado para remover SDS e facilitar a transferência de proteínas do gel para a membrana de fase sólida.
Leitor de microplacas	Thermo Fisher	Varioskan LUX	Medir a absorbância das mitocôndrias coradas com JC-1
Kit de Detecção de Potencial de Membrana Mitocondrial	Solarbio	M8650	Detecção do Potencial de Membrana Mitocondrial no Músculo Esquelético
Tampão de isolamento mitocondrial	Solarbio	SM0020	Kits para Extração Baseados em Centrifugação Diferencial
	Tampão de armazenamento de mitocôndrias	Solarbio	SM0020	Para preservação de mitocôndrias
	Mito Tracker  Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	Caracterização Mitocondrial
	MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	Como um tampão na preparação da solução
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001 visa IgG de camundongo (H+L) no Western blot
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001 visa IgG de coelho (H+L) em ELISA e Western blot
	Leite em pó sem gordura	NCM Biotech	WB6503	É usado principalmente como um agente de bloqueio para reduzir o sinal de fundo, ocupando locais de ligação não específicos na membrana.
Osmio tetróxido	Sigma	75633	ou pós-fixação para preservar lipídios e melhorar o contraste de membrana em amostras TEM.
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	Limpeza de tecido muscular
Penicilina-Estreptomicina	Procell	PB180120	Cultura de células L929
Phalloidin-488	Beyotime	C1035		Marcação do citoesqueleto F-actina para imagem microscópica de fluorescência
Membrana de poli (fluoreto de vinilideno) (PVDF)	Millipore (Merck)	IPVH00010	Western blotting
PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050	Para separação de proteínas por eletroforese SDS-PAGE
Gel de poliacrilamida gradiente pré-moldeado (4–12%)	ACE Bioscience	ET12412LGel	Usado para separação por SDS-PAGE de proteínas totais mitocondriais e celulares
Inibidor de protease	Shaanxi Zhonghui Hecai Biomedical Technology	PL032	Inibe a atividade de proteases endógenas e exógenas, prevenindo a degradação de proteínas-alvo durante o processamento da amostra.
Tampão de lise RIPA	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PL001-2A	Usado para extração total de proteínas de tecidos animais e celulares
Injeção de cloreto de sódio (0,9%)	Xi’an Jingshuang Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd.	Número de aprovação H61020014	Tampão, enxágue e manutenção da pressão osmótica para células/tecidos experimentais
	Luvas estéreis	Jiangsu Yangzi Lide Medical Devices Co., Ltd.	YMZ000-1	Isolar contaminação e proteger operadores e amostras experimentais
Sacarose	Sacarose	S818048	Fornece suporte osmótico e mantém a morfologia mitocondrial e a integridade funcional.
TBST	NCM Biotech	WB20500	Lavagem para reduzir o fundo, servindo como um diluente para anticorpos e soluções