Este estudo investigou a interação entre FGD5-AS1 e miR-93-5p em modelos experimentais de hemorragia intracerebral e descobriu que o knockdown do FGD5-AS1 estava associado à redução de lesão neurológica, inflamação e estresse oxidativo.
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Artigo de investigação
* These authors contributed equally
Este estudo investigou a interação entre FGD5-AS1 e miR-93-5p em modelos experimentais de hemorragia intracerebral e descobriu que o knockdown do FGD5-AS1 estava associado à redução de lesão neurológica, inflamação e estresse oxidativo.
A hemorragia intracerebral (ICH) é um distúrbio neurológico associado a altas taxas de mortalidade e incapacidade, podendo levar a lesão neurológica grave. Este estudo investigou o papel e o mecanismo subjacente da FGD5-AS1 na ICH. Modelos in vitro e in vivo de ICH foram estabelecidos. A reação em cadeia da polimerase quantitativa por transcrição reversa (RT-qPCR) foi usada para medir a expressão de FGD5-AS1 e miR-93-5p. Déficits neurológicos foram avaliados usando o Escore de Severidade Neurológica (mNSS) modificado, e o edema cerebral foi avaliado usando o método do peso seco-úmido. O ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) foi usado para medir citocinas inflamatórias e marcadores de estresse oxidativo. A viabilidade celular foi avaliada usando um kit de ensaio de viabilidade e proliferação celular. A interação entre FGD5-AS1 e miR-93-5p foi examinada usando ensaios com repórter de dupla-luciferase e análise de correlação de Pearson. A ICH experimental foi acompanhada por uma expressão elevada de FGD5-AS1 tanto em modelos animais quanto celulares. A supressão da FGD5-AS1 aliviou o inchaço cerebral, melhorou o desempenho neurológico, reduziu a lesão inflamatória e oxidativa, e aumentou a sobrevivência das células endoteliais. A inibição do miR-93-5p diminuiu esses efeitos protetores, apoiando uma interação regulatória entre as duas moléculas. A FGD5-AS1 regulou negativamente a expressão de miR-93-5p, e a inibição de miR-93-5p atenuaram os efeitos observados após a queda da FGD5-AS1. Esses resultados indicam que o FGD5-AS1 pode contribuir para a lesão cerebral associada à ICH-ICH por meio da regulação do miR-93-5p e que o eixo FGD5-AS1/miR-93-5p pode representar um alvo potencial para investigação adicional em ICH experimental.
A hemorragia intracerebral (ICH) é um distúrbio neurológico com altas taxas de mortalidade e incapacidade, representando de 10% a 20% de todos os casos deAVC 1,2. Devido à falta de alvos terapêuticos eficazes, o tratamento da PCI atualmente se limita à cirurgia e cuidados de suporte3. Pinho et al. validaram previsões de mortalidade por ICH, resultados funcionais e fração de crescimento do hematoma, oferecendo uma nova perspectiva para profissionaisde saúde 4. Apesar do progresso no tratamento da PCI, os resultados dos pacientes continuam ruins. Portanto, identificar novos alvos terapêuticos para a CHI é importante para melhorar o prognóstico a longo prazo.
RNAs longos não codificantes (lncRNAs) compreendem uma classe de transcritos não codificadores de proteínas com mais de 200 nucleotídeos de comprimento que regulam a expressão gênica por meio de diversos mecanismos, incluindo processos transcricionais, pós-transcricionais eepigenéticos 5. Evidências acumuladas demonstraram que a expressão aberrante de RNAs de lncRNA está implicada na patogênese de uma série de distúrbios neurológicos, como AVC, lesão cerebral traumática, hemorragia intracerebral (IC) e hemorragiasubaracnoide 6. Entre essas moléculas reguladoras, FGD5-AS1 tem sido associada a vários processos celulares, incluindo proliferação, apoptose, sinalização inflamatória e respostas ao estresse oxidativo. Por meio de mecanismos como atividade endógena de RNA concorrente, regulação transcricional e modificação epigenética, o FGD5-AS1 influencia a expressão de múltiplos alvos a jusante. A expressão desregulada de FGD5-AS1 foi relatada em várias condições patológicas, incluindo malignidades, distúrbios cardiovasculares e doençasmetabólicas 7,8,9,10,11. No entanto, sua importância biológica em doenças neurológicas permanece incompletamente compreendida. Estudos anteriores mostraram que o FGD5-AS1 participa da progressão do glioma e doglioblastoma 12,13 e contribui para lesão neuronal sob condições de privação/reperfusão de oxigênio-glicose14. Essas observações sugerem que o FGD5-AS1 pode desempenhar um papel regulador na lesão neural; no entanto, sua contribuição para danos cerebrais após ICH não foi totalmente esclarecida.
MicroRNAs (miRNAs) são RNAs curtos e não codificantes que regulam a expressão gênica interagindo com sequências complementares dentro dos RNAs mensageirosalvo 15. Estudos mostraram que os miRNAs também desempenham papéis importantes na ICH. Especificamente, o miR-143-3p promove a migração transendotelial de neutrófilos após lesão cerebral aguda ao direcionar ATP6V1A16. o miR-195-5p exerce um efeito protetor contra lesão cerebral induzida por ICH, inibindo a expressão de MMP-9 eMMP-217. O MiR-93-5p também foi identificado como alvo terapêutico para melhorar os resultados após a ICH18. Embora estudos tenham confirmado a expressão anormal de FGD5-AS1 e miR-93-5p na ICH e seu envolvimento na progressão da disfunção neurológica após a ICH, pesquisas anteriores focaram principalmente em seus efeitos biológicos individuais. A relação regulatória competitiva entre FGD5-AS1 e miR-93-5p como RNAs endógenos ainda não foi claramente estabelecida.
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1. Animais experimentais
Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Popular de Ganzhou (Aprovação nº 20230789) e foi conduzida em estrita conformidade com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Ratos SD fêmeas de grau SPF (6–8 semanas de idade, 180–230 g) foram usados neste estudo. Os ratos foram alojados com livre acesso a comida e água sob condições controladas de 22 °C ± 3 °C e um ciclo de 12 horas de luz/escuro. Os animais foram deixados se aclimatar por 7 dias antes do experimento. Os produtos químicos, reagentes e equipamentos usados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
2. Estabelecimento do modelo in vivo do PCI
Para gerar o modelo experimental de hemorragia intracerebral (ICH), 0,23 U de colagenase tipo VII foi dissolvido em 1 μL de soro fisiológico estéril. Os ratos eram anestesiados com pentobarbital de sódio intraperitoneal (50 mg/kg), após o que a solução de colagênase era estereotaticamente infundida no estriado a 0,5 μL/min (0,2 mm atrás do ponto frontal, 3,0 mm lateralmente à linha média e 6 mm de profundidade na superfície do crânio). Os animais do grupo controle passaram pelo mesmo procedimento, mas receberam o mesmo volume de soro fisiológico em vez de colagênase. Uma visão geral esquemática do desenho experimental é fornecida na Figura Suplementar 1.
Figura suplementar 1: Diagrama de desenho de experimentos em animais. Os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: um grupo usou colagênase tipo VII 0,23U para construir um modelo ICH; Um grupo usou soro fisiológico como grupo controle. Os ratos do grupo modelo foram divididos aleatoriamente em dois lotes para analisar o papel do FGD5-AS1 no ICH e o efeito sinérgico do eixo FGD5-AS1/miR-93-5p. Uma hora após a indução da CHI, o reagente de transfecção foi injetado no cérebro do rato. Avaliar a função neurológica de ratos usando mNSS nos dias 0, 1, 3 e 7; Colete tecido cerebral após induzir a ICH por 7 dias. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos. Um grupo foi usado para analisar o papel da FGD5-AS1 na ICH e foi ainda dividido em quatro subgrupos: Controle, ICH, ICH + lentivírus (LV)-shNC e ICH + LV-shFGD5-AS1. O outro grupo foi usado para analisar os efeitos sinérgicos do eixo FGD5-AS1/miR-93-5p e foi dividido em cinco subgrupos: ICH, ICH + LV-shNC, ICH + LV-shFGD5-AS1, ICH + LV-shFGD5-AS1 + antagomiro NC, e ICH + LV-shFGD5-AS1 + miR-93-5p antagomir. Cada grupo incluía 12 ratos. 1 hora após a indução da ICH, o reagente de transfecção foi injetado no cérebro do rato em uma dose de 2 mg/kg.
3. Cultura e processamento celular
As células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) servem como um modelo chave para o estudo da barreira hematoencefálica, dos mecanismos subjacentes a distúrbios neurológicos e à administraçãode medicamentos 20. Um modelo in vitro de ICH foi estabelecido usando tratamento de privação de oxigênio-glicose (OGD)/hemin nosBMECs 3. Os BMECs foram cultivados em DMEM sem glicose e soro sob uma mistura gasosa de 5% deCO2 e 95% deN2 por 10 minutos. As células foram então tratadas com hemin (10μM) e transferidas para uma câmara anaeróbica contendo 5% de CO2 e 95% deN2 por 2 horas. A OGD foi interrompida ao retornar as células às condições normais de cultivo. O grupo controle foi tratado com PBS sob as mesmas condições.
As células foram transfectadas conforme as instruções do fabricante. As células foram transfectadas com siRNA FGD5-AS1 de 20 nM (si-FGD5-AS1), siRNA controle negativo (si-NC), inibidor de miR-93-5p ou inibidor controle em branco (inibidor NC).
4. Teste de severidade neurológica modificada
Após o estabelecimento do modelo in vivo de ICH, a função neurológica foi avaliada usando o Escore de Severidade Neurológica (mNSS) modificado nos dias 0, 1, 3 e 7. As pontuações foram quantificadas com base em quatro domínios: função motora, função sensorial, equilíbrio e função reflexa. Escores de 1–4 indicaram comprometimento leve, 5–9 indicaram comprometimento moderado e 10–14 indicaram comprometimento severo.
5. Coleta de amostras
7 dias após a indução da ICH, os ratos foram anestesiados com injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódio, seguida de eutanásia por luxação cervical e coleta de tecido cerebral.
6. Avaliação do edema cerebral
O edema cerebral foi avaliado usando o método do pesoseco-úmido 19. O cérebro era pesado imediatamente após a extração para obter o peso úmido. O tecido era então secado em um forno a 100 °C por 24 horas e pesado novamente para obter o peso seco. O teor de água do tecido foi calculado da seguinte forma:
[(peso molhado - peso seco) / peso molhado] × 100%
7. PCR quantitativa em tempo real
O RNA total foi isolado de amostras de tecido e células usando um reagente de extração de RNA, conforme o protocolo do fabricante. O DNA complementar foi posteriormente sintetizado usando um kit de transcrição reversa. A análise quantitativa por PCR foi então realizada usando uma plataforma de PCR em tempo real, com GAPDH e U6 como genes de referência endógenos. O protocolo de amplificação consistia em uma etapa inicial de desnaturação a 95 °C por 10 minutos, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 15 s e recozimento/extensão a 60 °C por 60 s. Os níveis relativos de expressão gênica foram calculados usando o método 2−ΔΔCt . As sequências de primers utilizadas neste estudo são fornecidas na Tabela Suplementar 1.
Tabela Suplementar 1: As sequências de espoletas e sequências de reagentes relacionadas utilizadas neste estudo. As sequências envolvidas em experimentos qPCR em tempo real e as sequências relevantes dos reagentes usados em experimentos in vitro . Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
8. Ensaio de proliferação celular
Células transfectadas foram semeadas em placas de 96 poços. Após cultivos por 0, 24, 48 e 72 horas, 10 μL de reagente CCK-8 foram adicionados a cada poço. As células foram incubadas a 37 °C por 2 horas, e a densidade óptica foi medida em 450 nm usando um leitor de microplaca.
9. Ensaio repórter com dupla luciferase
Wild-type (WT) e mutante (MUT) 3′-UTRs de FGD5-AS1 contendo o sítio de ligação miR-93-5p foram clonados no vetor pGL3. O vetor foi co-transfectado com um miR-93-5p mimic usando um reagente de transfecção. A atividade relativa da luciferase foi medida usando um sistema de repórter duplo de luciferase.
10. Ensaio imunossorvente ligado a enzimas
Amostras de tecido cerebral (20–50 mg) foram homogeneizadas em tampão de lise RIPA gelado com uma proporção tecido-tampão de 1:9. Após a homogeneização, as amostras foram centrifugadas a 12.000 × g por 20 minutos a 4 °C, e os supernadantes resultantes foram coletados para análise. BMECs de cada grupo experimental foram colhidos e centrifugados a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C, após o que os supernadantes foram mantidos. As concentrações de MDA, IL-1β, IL-6 e TNF-α foram posteriormente determinadas usando os kits de ensaio correspondentes, de acordo com as instruções do fabricante.
11. Análise estatística
Todos os dados são apresentados como a média ± SD. Os dados foram visualizados usando software estatístico. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes. O teste At foi usado para comparar dois grupos, e a análise unilateral da variância seguida pelo teste post hoc de Tukey foi usada para comparar mais de dois grupos. Um valor de P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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Efeito da FGD5-AS1 em ratos do ICH
A expressão de FGD5-AS1 foi significativamente maior no grupo ICH do que no grupo controle (P < 0,0001; Figura 1A). Após a transfecção com LV-shFGD5-AS1, a expressão de FGD5-AS1 foi significativamente reduzida em comparação com o grupo LV-shNC (Figura 1B). A avaliação do edema cerebral revelou edema cerebral mais grave em ratos ICH do que em ratos co...
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O dano cerebral após hemorragia intracerebral resulta não apenas do evento inicial de sangramento, mas também de uma série de respostas patológicas secundárias que evoluem ao longo dotempo 21. Embora o hematoma primário cause uma perturbação mecânica direta do tecido ao redor, a lesão subsequente é mediada por processos como ativação inflamatória, danos oxidativos e morte celular programada. Esses mecanismos secundários contribuem substancialmente para a deteriora...
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Os autores não têm interesses financeiros ou não financeiros relevantes a divulgar.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Antagomir NC | GenePharma, China | B04007 | Antagomir controle negativo |
| BMECs | ATCC, USA | CRL-8270 | Células endoteliais microvasculares cerebrais humanas |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Beyotime, China | C0038 | Kit de avaliação da viabilidade celular |
| DMEM medium | Gibco, USA | 12430054 | Meio sem glicose, sem soro |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega, USA | E2920 | Detecção de atividade da luciferase |
| Electronic balance | Sartorius | Secura224-1CN | Balança de precisão para pesagem de tecidos |
| GAPDH and U6 primers | Sangon Biotech | Serviço de síntese de primers personalizadas | Primers de referência interna |
| Graphpad Prism 8.0 | GraphPad Software, USA | —— | Software de análise estatística |
| Hemin | MCE, China | HY-19424 | Reagente de hemina para indução de lesão celular |
| IL-1 beta ELISA kits | Abcam, UK | ab197742 | Quantificação de citocinas inflamatórias |
| IL-6 ELISA kits | Abcam, UK | ab222503 | Quantificação de citocinas inflamatórias |
| LightCycler 96 PCR system | Roche,Switzerland | 5815916001 | Instrumento de PCR em tempo real |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen, USA | L3000001 | Reagente de transfecção |
| MDA assay kit | Beyotime, China | S0131 | Teste de peroxidação lipídica |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Medição de absorbância OD450 |
| miR-93-5p antagomir | GenePharma, China | B05001 | Inibidor miR-93-5p para experimentos in vivo |
| PBS | Solarbio, China | P1020 | Soro fisiológico tamponado com fosfato |
| Pentobarbital sodium | Sigma, Merck KGaA | 11715 | Agente anestésico |
| pGL3-Promoter | NovoPro, China | V011541 | Vetor reporter luciferase |
| PrimeScript RT Mix kit | Takara, Japan | RR037A | Kit de transcrição reversa |
| RIPA | Beyotime, China | P0013B | Tampõe de lise de proteínas/tecido |
| ShFGD5-AS1 lentivirus | GenePharma, China | D02001 | Vetor de knockdown FGD5-AS1 |
| SPF-grade female SD rat | Vital River | —— | 6–8 semanas de idade, grau SPF |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Takara, Japan | RR420A | Reagente de PCR quantitativo |
| TNF-α ELISA kits | Abcam, UK | ab208348 | Quantificação de citocinas inflamatórias |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | Reagente de extração de RNA total |
| Type VII collagenase | Sigma, Merck KGaA | C0773 | De Clostridium histolyticum; indução de ICH |
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