Quantificando a Taxa de Letalidade Embrionária em Caenorhabditis elegans

Resumo

Esse protocolo oferece um procedimento simples e de baixo custo para quantificar a taxa de letalidade embrionária em Caenorhabditis elegans. Ele permite a detecção direta de anomalias embrionárias em populações, sem equipamentos especializados ou expertise em coleta de vermes. O protocolo pode ser usado para quantificar os efeitos de mutações genéticas, derrubamentos gênicos mediados por interferência de RNA e dieta.

Resumo

A letalidade embrionária é um fenótipo fundamental usado na pesquisa com Caenorhabditis elegans para caracterizar defeitos de desenvolvimento decorrentes de fatores como exposições tóxicas e mutações genéticas. Portanto, quantificar com precisão a penetrância da letalidade embrionária é fundamental para entender os mecanismos e o impacto dessas perturbações no desenvolvimento animal. Embora existam plataformas automatizadas de pontuação, essas abordagens frequentemente exigem investimentos financeiros substanciais e hardware ou software especializado. Este artigo descreve um ensaio de baixa tecnologia e baixo custo que quantifica a letalidade embrionária medindo a porcentagem de embriões que não conseguem eclodir. Notavelmente, essa versão do ensaio elimina a necessidade de um bico de minhoca, tornando-o excepcionalmente adequado para iniciantes. Uma vantagem adicional dessa abordagem é que cada ensaio técnico replica progenitores de múltiplos animais, evitando os possíveis vieses dos ensaios de verme único. Este protocolo inclui uma discussão de parâmetros críticos, como o número mínimo de descendentes necessários para capturar com precisão a penetrância do fenótipo e a justificativa da metodologia. Por fim, fornecemos orientações sobre como adaptar o ensaio para avaliar os efeitos do knockdown gênico por meio de interferência de RNA, tratamentos farmacológicos ou suplementação nutricional, adicionando uma ferramenta versátil e acessível ao conjunto de ferramentas dos pesquisadores de C. elegans .

Introdução

A letalidade embrionária é um fenótipo crítico para avaliar os papéis dos genes e fatores ambientais no desenvolvimento inicial. C. elegans é um modelo poderoso para estudar processos de desenvolvimento devido à sua linhagem celular invariante, corpo transparente e ciclo de vida^{rápido 1}. A letalidade embrionária de C. elegans pode ser usada para avaliar a integridade do desenvolvimento sob perturbações químicas, farmacológicas, nutricionais e^genéticas 2,3,4,5. Portanto, métodos acessíveis e versáteis para quantificar com precisão a taxa de letalidade embrionária beneficiariam a comunidade de pesquisa.

Métodos avançados de alto rendimento e alto conteúdo que estudam embriogênese dependem de sistemas e softwares especializados de imagem, frequentemente exigindo investimento financeiro^{substancial 4,6,7}, enquanto abordagens mais simples e de alto rendimento fornecem principalmente leituras^{qualitativas 8,9}. Métodos clássicos, por outro lado, utilizam uma abordagem manual e de baixo custo que normalmente envolve transferências repetidas de hermafroditas individuais com um picador de minhoca para avaliar a letalidade embrionária de toda a ^ninhada. No entanto, esse método pode ser tecnicamente desafiador para iniciantes e tem escalabilidade limitada. Além disso, ensaios clássicos baseados no tamanho da ninhada quantificam a viabilidade embrionária na prole de uma única mãe, o que pode introduzir viés não intencional.

O objetivo geral desse método é fornecer uma abordagem alternativa, simples, econômica e versátil para quantificar a viabilidade embrionária em média capacidade. Esse método mede taxas de letalidade embrionária na prole de múltiplos animais por réplica, não requer o uso de um picador de minhoca e evita equipamentos especializados ou caros. O estudo também mostra como o método pode ser aplicado a perturbações comuns, como interferência de RNA e testes de medicamentos ou nutrientes.

Protocolo

1. Manutenção de C. elegans

NOTA: Orientações detalhadas sobre a criação de C. elegans podem ser encontradas no WormBook¹¹.

1. Prepare as placas de manutenção com Meio de Crescimento Nematoide (NGM).
   1. Para produzir 1 L de NGM, combine 3 g de NaCl, 2,5 g de peptona bacteriológica e 17 g de ágar em uma garrafa de 2 L. Adicione 975 mL de água destilada e uma barra de mexer, depois faça autoclave por 20 minutos a 121 °C.
   2. Deixe o meio esfriar até 55 °C em banho-maria. Coloque o frasco sobre um prato de mexer e, usando técnica asséptica, adicione 25 mL de 1 M de tampão de fosfato de potássio e 1 mL de cada um dos seguintes: 1 M_{MgSO 4}, 1 M_{CaCl 2} e 5 mg/mL de colesterol. Despeje aproximadamente 25 mL em cada placa de 100 mm.
2. Prepare culturas OP50 de E. coli durante a noite.
   1. Usando a técnica asséptica, preencha um frasco Erlenmeyer de 1 L até um quinto do volume (200 mL) com meio LB. Inocule o meio com uma única colônia de E. coli OP50 usando um laço inoculante estéril. Incube durante a noite a 37 °C em um agitador orbital a 200 rpm.
3. Sementes placas de manutenção NGM com E. coli OP50 (Figura 1A).
   1. Transfira a cultura OP50 de E. coli para frascos de centrífuga autoclavados e centrifuge por 30 minutos a 3.500 x g em temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet bacteriano em um vigésimo do volume original. Use 1–1,5 mL de cultura concentrada para semear cada placa NGM de 100 mm.
   2. Incube as placas durante a noite em temperatura ambiente para permitir o crescimento das bactérias.
      NOTA: Essas placas de manutenção possuem alta densidade de bactérias para suportar até 4.000 minhocas por placa, o que é desejável ao realizar um grande número de ensaios ou trabalhar com uma cepa de crescimento lento de C. elegans. Placas de manutenção com sementes podem ser armazenadas na geladeira a 4 °C por até 1 mês.
4. Estabeleça uma cultura primária de C. elegans (Figura 1A).
   1. Use uma ponta de pipeta estéril para cortar um pequeno pedaço de ágar contendo ~1.000 vermes de uma placa de manutenção faminta. Coloque o pedaço de ágar sobre uma placa de NGM com sementes.
   2. Coloque o novo prato em um recipiente plástico e incube a 20 °C por 3 dias, até que as minhocas estejam grávidas e pondo ovos. Certifique-se de que o gramado bacteriano seja suficiente e que a população de minhocas não passe fome. Neste ponto, a população de vermes está pronta para o experimento.

2. Preparação de meios experimentais e culturas bacterianas

NOTA: Nesta etapa, prossiga com o Método 1 para testar o efeito do knockdown gênico mediado por RNAi ou com o Método 2 para investigar suplementos alimentares.

1. Método 1: Preparar placas experimentais de NGM para RNAi alimentando-as.
   1. Prepare 1 L de NGM conforme descrito no passo 1.1 e, usando a técnica asséptica, adicione 1 mL de 1 M IPTG e 1 mL de ampicilina de 50 mg/mL. Despeje aproximadamente 5 mL em cada placa de 35 mm.
   2. Inocule o número desejado de clones que alimentam RNAi com E. coli HT115 carregando plasmídeos de L4440 e que têm como alvo genes de interesse de C. elegans , juntamente com o controle de vetor vazio. Escolha uma única colônia com um laço inoculante e transfira para 1,5 mL de LB contendo 50 μg/mL de ampicilina. Incubar por 18 horas a 37 °C em um agitador orbital a 200 rpm.
   3. Semente placas NGM de 35 mm contendo ampicilina e IPTG com 100 μL de cultura E. coli HT115 durante a noite, preparando duas réplicas técnicas por condição. Incube as placas durante a noite em temperatura ambiente para permitir o crescimento bacteriano e induzir a produção de RNA de fita dupla. Armazene um número igual de pratos sem sementes a 4 °C para uso posterior na transferência de ovos.
2. Método 2: Prepare placas experimentais de NGM com um suplemento nutricional ou medicamentoso.
   1. Prepare 1,5x NGM concentrado seguindo as instruções do passo 1.1, mas adicione 642 mL de água destilada em vez de 975 mL. Mantenha o meio preparado em um banho-maria a 55 °C.
   2. Prepare um estoque à base de água do suplemento de interesse a 3x a concentração-alvo (por exemplo, para preparar placas contendo 40 mM de formato de sódio, faça um estoque de 120 mM). Calcule o volume de estoque necessário multiplicando o número de placas experimentais por 1,666 mL (um terço do volume da placa). Use um filtro de seringa para filtrar o caldo e depois aqueça a 55 °C em banho-maria.
   3. Em um tubo cônico de 50 mL, misture 2 partes 1,5x NGM com 1 parte do material suplementar. Para não controlar suplementos, misture 2 partes de 1,5x NGM com 1 parte de água quente e estéril. Misture suavemente invertendo o tubo 10 vezes e, usando a técnica asséptica, despeje rapidamente aproximadamente 5 mL de meio em cada placa de 35 mm.
      NOTA: 1,5x NGM é usado para compensar a diluição média quando grandes quantidades de suplemento são adicionadas. No entanto, se o estoque do medicamento ou metabólito estiver concentrado a 100× ou mais da concentração final, pode ser usado NGM regular em vez de 1,5× NGM. Ao suplementar com ácido orgânico, usar sua forma de sal de sódio ajuda a evitar uma queda no pH do médio.
   4. Usando técnica asséptica, preencha um frasco Erlenmeyer de 50 mL até um quinto do volume (10 mL) com meio LB. Inocule com uma colônia de E. coli OP50 e incube durante a noite a 37 °C em um agitador orbital a 200 rpm.
   5. Seme placas NGM de 35 mm com 100 μL de cultura OP50 de E. coli durante a noite, preparando duas réplicas técnicas por condição. Incube as placas durante a noite em temperatura ambiente. Armazene um número igual de pratos sem sementes a 4 °C para uso posterior na transferência de ovos.

3. Obtenção de uma população sincronizada de larvas L1

1. Prepare solução alcalina de água sanitária combinando 7 mL de água estéril, 2 mL de solução de hipoclorito de sódio a 5% e 1 mL de NaOH 5 N.
2. Prepare o tampão M9 dissolvendo 3 g de_{KH 2}PO₄, 6 g de_{Na 2}HPO₄ e 5 g de NaCl em 1 L de água destilada, depois ajuste o pH para 6,5. Autoclave por 20 minutos a 121 °C, deixe a solução esfriar e depois adicione assépticamente 1 mL de 1 M MgSO4.
3. Lave os vermes adultos grávidos (passo 1.4.2) da placa com tampão M9 e transfira-os para um tubo cônico de 15 mL. Centrifuge a 350 x g por 2 minutos, aspire o sobrenadante e encha o tubo com um tampão M9 novo. Repita a lavagem duas vezes.
4. Adicione 2 mL de tampão M9 e 2 mL de solução de água sanitária alcalina ao pellet de minhoca. Vórtice e agitação vigorosa, verificando periodicamente ao microscópio até que quase todos os vermes estejam dissolvidos.
5. Enche o tubo com o buffer M9 e centrifuge a 350 x g por 2 minutos. Remova o sobrenadante invertendo o tubo e lave quatro vezes com o buffer M9. Certifique-se de que a primeira lavagem seja realizada imediatamente após a lisagem das minhocas para evitar o descolorimento excessivo. Após a última lavagem, encha o tubo com 8 mL de tampão M9 e incube em um balancinador por 18–20 horas, até os ovos eclodir.

4. Cultivo de populações maternas

1. Coloque cinco gotas de 3 μL de suspensão de vermes em uma lâmina de vidro e conte o número de larvas L1 eclodidas ao microscópio. Divida a contagem total por 15 para obter a concentração por microlitro.
2. Placar 30 larvas L1 em cada placa semeada de 35 mm e incubar a 20 °C por 72 horas. Se as condições experimentais induzirem atraso no desenvolvimento, estenda o tempo de incubação até que os vermes fiquem grávidos e comecem a depositar ovos (Figura 1B).

5. Transferência de embriões para placas de eclosão

1. Retire os pratos de 35 mm sem sementes da geladeira e deixe-os atingir a temperatura ambiente.
2. Examine as placas de verme ao microscópio e confirme que elas contêm mais de 100 embriões, sem larvas de L1 eclodidas.
3. Enche cuidadosamente o prato com o buffer M9. Use uma linha de vácuo para aspirar o líquido e remover a população materna. Certifique-se de que nenhum verme adulto permaneça no prato.
4. Preencha a ponta da micropipeta com 200 μL de tampão M9 e pipete com força para cima e para baixo para desprender embriões do gramado bacteriano. Ao observar pelo microscópio, guie a ponta da pipeta em direção às áreas densas em embriões.
5. Pegue uma placa sem sementes e pipete uma gota de suspensão embrionária no centro. Examine a gotícula ao microscópio. Se não contiver 100–300 embriões, adicione mais suspensão embrionária até atingir essa faixa. Certifique-se de que nenhum verme da população parental seja transferido junto com os embriões.
6. Deixe o líquido secar, depois incube as placas de transferência a 20 °C por pelo menos 24 horas.
   NOTA: Se as larvas de L1 já estiverem presentes na placa experimental, use uma linha de vácuo em vez de uma lavagem M9 para remover toda a população materna uma a uma. Isso evita que os filhotes L1 sejam lavados, que não aderem ao gramado bacteriano como os embriões. Prossiga com a transferência da descendência, que agora incluirá tanto embriões quanto larvas de L1. Garanta que a mesma abordagem seja aplicada a todas as condições.

Figura 1: Linha do tempo experimental e esquema das etapas principais no ensaio de letalidade embrionária. (A) Cronograma de fluxograma representando a duração total do protocolo experimental, desde a preparação do meio de manutenção até a pontuação das placas de hachura. Procedimentos-chave são indicados para os dias correspondentes do experimento. (B) Esquema do ensaio de letalidade embrionária (etapas 4–6). No dia 4, larvas sincronizadas de L1 são adicionadas às placas experimentais de RNAi ou suplemento para estabelecer uma população materna. Após 72 horas, no Dia 7, quando as minhocas põem ovos, a população materna é levada enquanto os embriões permanecem presos ao gramado bacteriano. Os embriões são então lavados do gramado com uma pipeta e transferidos para uma placa de incubação, com pelo menos 100 embriões por placa. Após 24 horas de incubação, as larvas eclodidas e os embriões não chocados são contados. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

6. Placas de pontuação

1. Use um marcador permanente para desenhar uma grade de aproximadamente 4 mm × 4 mm na tampa de uma placa de Petri de 35 mm, depois coloque a tampa sob a placa. Use a grade como guia e, sob um microscópio, conte o número de larvas L1 e embriões não chocados com um contador de cliques portátil.
2. Combine contagens a partir de réplicas técnicas para garantir a ponderação adequada de cada réplica com base na contagem de descendentes. Especificamente, somar o número de embriões não chocados e larvas eclodidas entre réplicas técnicas.
3. Calcule uma taxa de letalidade embrionária por réplica biológica dividindo o número de embriões (vermes não chocados) pelo total de vermes e embriões, depois multiplicando por 100 para expressar o valor como porcentagem.
   NOTA: Se uma placa contiver apenas larvas eclodidas ou apenas embriões, essa etapa de contagem pode ser pulada, pois a taxa de letalidade embrionária é 0 (0%) ou 1 (100%), respectivamente.

7. Análise estatística

1. Repita todo o experimento pelo menos três vezes para obter réplicas biológicas independentes. Para cada réplica biológica, utilize duas placas de réplica técnica por condição, com um mínimo de 100 embriões por réplica técnica.
2. Determine se as taxas de letalidade embrionária diferem significativamente entre condições usando ANOVA unidirecional, seguido por testes t de Student par a par pós-hoc com correção múltipla de testes, como o método Benjamini-Hochberg.
   NOTA: A combinação de dois réplicas técnicas resulta em um mínimo de 200 embriões por réplica biológica. Isso atende ao requisito de tamanho da amostra (~184 embriões/condição) estimado pelo teste power.prop., função base R, para detectar uma diferença de 15% na letalidade (por exemplo, 20% vs. 35%) com 90% de potência e um nível de significância de α = 0,05.

Resultados

O ensaio de letalidade embrionária foi realizado em duas cepas: do tipo selvagem N2 e a cepa RNAi-hipersensível rrf-3(pk1426). Usando RNAi por alimentação, derrubamos genes anteriormente relatados como causadores de letalidade embrionária em triagens de alta capacidade ^9,12. A Figura 2 apresenta uma demonstração representativa do desempenho do ensaio. O knockdown de T04G9.4 produziu letalidade embrionária quase totalmente pe...

Discussão

Vários passos são críticos para a reprodutibilidade e precisão do ensaio. Primeiro, a etapa de branqueamento deve ser cuidadosamente cronometrada para dissolver os vermes adultos sem danificar os embriões. Outro ponto importante é transferir um número suficiente de embriões para contagem: poucos reduzem a precisão, enquanto muitos tornam a contagem desnecessariamente tediosa. Em seguida, a transferência de embriões deve ser realizada antes que os embriões comecem a eclodir. Caso contrári...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Bacteriological peptone	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center	N2	wild type
C. elegans NL2099	Caenorhabditis Genetics Center	NL2099	rrf-3(pk1426) II. RNAi hypersensitive
Calcium chloride, anhydrous	Sigma-Aldrich	746495
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045
Conical tubes, 15 mL	VWR	60818-725
Culture tubes, 14 mL	VWR	470150-966
Diaphragm vacuum pump	Amazon	TC-100
Dissecting microscope	AmScope	SM-2
Escherichia coli HT115	Caenorhabditis Genetics Center		RNAse III-deficient, used for RNAi by feeding experiments
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Granulated agar	Fischer Scientific	BP97445
Handheld tally counter	LabDepot	HTCP01
IPTG, dioxane free (Isopropyl-b-D-thiogalactoside)	US Biological	I8500
LB Broth (Miller)	US Biological	L1520	Para fazer o meio LB, dissolver 25 g de pó de LB em 1 L de água destilada. Autoclave por 20 min a 121,1 °C.
Luer Lok disposable syringe	BH Supplies	BH20LL
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Microscopy slides	Sail Brand	7101
Petri dishes, 100 mm	Tritech Research	T3371
Petri dishes, 35 mm	Tritech Research	T3501
Potassium Phosphate Buffer (PPB)			Para fazer o tampão de fosfato de potássio (1 M), dissolver 98 g de fosfato de potássio monobásico e 48 g de fosfato de potássio dibásico em 1 L de água destilada. Ajustar o pH para 6. Autoclave por 20 min a 121 °C.
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	529568
Rocker (nutating mixer)	Corning LSE	6720
Serological pipettes, 25 mL	Corning	4489
Serological pipettes, 5 mL	Celltreat	229235
Shaking incubator Infors Multitron	INFORS HT	NA
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium hydroxide solution, 5 N	Fisher Scientific	SS256-500
Sodium hypochlorite, 5%	LabDepot	LC246302
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sorvall ST1 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	75016030
Stir plate	ONilab	ONi28-S
Syringe filters	Semmerfeld	JQP033022QE1
Water bath	FOUR E's Scientific	WB401