Software de Mapeamento de Parâmetros Microgliais (MMPS): Uma ferramenta de código aberto e fácil de usar para análise quantitativa de morfologia da microglia

Resumo

O Software de Mapeamento de Parâmetros Microgliais (MMPS) é uma pipeline de análise amigável que não requer conhecimento em codificação e semiautomatiza a análise de morfologia microglial de célula única a partir de imagens de imunofluorescência. Validado em um modelo de neuroinflamação induzido por lipopolissacarídeos de roedores, o MMPS detecta reprodutivamente alterações morfológicas associadas à ativação e possibilita a fenotipagem microglial padronizada e escalável.

Resumo

A microglia são células imunológicas derivadas de mieloides do sistema nervoso central que mediam a degradação e remodelação dos tecidos após lesões neurológicas e surgiram como alvos terapêuticos promissores em várias doenças neurodegenerativas. A análise quantitativa da morfologia microglial pode revelar diferenças sutis entre subpopulações microgliais, preservando informações importantes in situ . No entanto, muitas plataformas de análise de morfologia microglial atualmente disponíveis não são publicamente acessíveis ou exigem expertise computacional especializada, limitando assim sua ampla adoção. Para resolver essas limitações, foi desenvolvida uma plataforma de análise de morfologia microglial de código aberto, chamada Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), usando Python 3.11. O MMPS é compatível com fluxos de trabalho baseados em imunofluorescência e não requer conhecimento de codificação para instalação ou operação. O software semiautomatiza a análise de morfologia microglial de célula única por meio de uma interface gráfica acessível e incorpora fluxos de trabalho personalizáveis de processamento de imagem e geração de máscaras. O estudo envolve validar o MMPS usando um modelo de neuroinflamação induzido por lipopolissacarídeos de roedores (LPS). A análise quantitativa em nível animal demonstrou que a microglia de animais tratados com LPS apresentou significativamente aumento da área do soma (p < 0,01) e redução do perímetro celular (p < 0,05) em comparação com controles tratados com veículo, consistente com características morfológicas associadas à ativação microglial e neuroinflamação. No geral, o MMPS oferece uma plataforma padronizada e reprodutível para análise quantitativa da morfologia microglial em laboratórios.

Introdução

A microglia são células imunes inatas do sistema nervoso central (SNC) que continuamente examinam seu entorno em busca de patógenos e danos nos^{tecidos 1}. Após a ativação, as microglias retraem seus processos e fazem a transição de uma morfologia homeostática e ramificada para um fenótipo^{ameboide 2,3}. Em doenças neurodegenerativas como AVC isquêmico ^4,5 e doença de Alzheimer ^6,7. A microglia frequentemente perpetua a neuroinflamação por meio da produção sustentada de citocinas, degradação extensa dos tecidos e^{fagocitose 2}. Esses processos contribuem para a perturbação da unidade neurovascular, agravando ainda mais a ativação microglial e a lesão^{do SNC 8}, tornando assim a microglia alvos terapêuticos^{promissores 9,10}.

Uma abordagem para identificar diferenças sutis entre subpopulações microgliais em doenças neurodegenerativas é por meio da análise morfológica. Isso é comumente realizado usando animais Cx3CR1-GFP com microscopia in vivo de dois fótons¹¹ ou por meio de marcagem por imunofluorescência (IF) de marcadores microgliais estabelecidos, como a molécula adaptadora ionizada de ligação ao cálcio-1 (Iba1) ou o receptor purinoceptor^{P2Y 12}. Embora a microglia frequentemente transite entre morfologias homeostática e ameboide após lesão, estudos anteriores demonstraram que a microglia também pode adotar fenótipos adicionais, incluindo microglia^{hiperramificada 3,13}, microglia em favo ^3,14, microglia ^{reativa 15} e microglia^{bastonete 3,16}. No entanto, estudos de morfologia microglial frequentemente dependem da categorização manual dos fenótipos homeostáticos e ameboides. Essas abordagens exigem pipelines de análise especializados que frequentemente carecem de padronização entre laboratórios e dificultam a diferenciação entre morfologias semelhantes, como fenótipos homeostáticos versus hiperramificados, até mesmo para pessoal^{treinado 17}. Além disso, a análise baseada em IF de alterações morfológicas sutis requer imagens de alta resolução, o que pode apresentar desafios técnicos adicionais.

Para resolver essas limitações, várias plataformas analíticas foram desenvolvidas que semi-automaticamente¹¹ ou^{automaticamente 18} detectam microglia e geram múltiplas representações binárias das células, chamadas de "máscaras", em áreas-alvo definidas pelo usuário (por exemplo, 200–800^{μm 2}). Essas abordagens reduzem o viés do usuário, melhoram a reprodutibilidade e aumentam a eficiência analítica. Apesar desses avanços, muitas plataformas de software atualmente disponíveis apresentam limitações que restringem a adoção ampla, incluindo falta de acessibilidade de código aberto¹⁷, requisitos para expertise em^{programação 11,19,20}, dependência de sistemas de microscopia de dois fótons in ^{vivo 11,19}, ausência de interfaces gráficas intuitivas 11,21,22, lenta velocidades de processamento¹¹, ou dependência de plataformas de software^{comerciais 12, 19, 21}. Embora estudos recentes tenham começado a abordar várias dessas questões, muitas plataformas existentes continuam pouco adequadas para fluxos de trabalho baseados em IF, que continuam sendo amplamente utilizadas para estudar a morfologia microglial.

Aqui é apresentada uma plataforma orientada ao usuário para análise de morfologia microglial chamada Mapping Microglial Parameters Software (MMPS). O MMPS não requer conhecimento em programação, integra-se com fluxos de trabalho estabelecidos baseados em ImageJ e é projetado especificamente para uso com imagens IF. O software foi desenvolvido em Python 3.11 e incorpora conceitos de plataformas morfológicas de código aberto publicadas^{anteriormente 11}. O MMPS possui uma interface gráfica intuitiva que permite importar e processar grandes lotes de imagens FI usando múltiplas opções personalizáveis de processamento de imagens. A plataforma também incorpora seleção manual de células para minimizar artefatos de superamostragem introduzidos durante a imagem de FI, além de delineamento manual de soma para evitar a inclusão de processos celulares nas medições de SOMA. Além disso, o MMPS inclui parâmetros personalizáveis de geração de máscaras e múltiplos recursos de garantia de qualidade para melhorar a precisão das máscaras. O software calcula vários parâmetros morfológicos comumente utilizados, incluindo perímetro, distância média do centroide, área da máscara, excentricidade, arredondamento e área do soma. Para estudos mais avançados, as saídas geradas por MMPS são compatíveis com múltiplos plugins ImageJ e podem ser analisadas adicionalmente usando plugins acompanhantes para análises fractais, esqueletas e de casco.

O MMPS foi validado usando um modelo de neuroinflamação induzido por lipopolissacarídeos de roedores (LPS), examinando alterações microgliais na camada cortical IV. A análise quantitativa demonstrou que a administração de LPS aumentou significativamente a área do soma microglial enquanto diminuía o perímetro celular em comparação com os controles tratados com veículo, indicando que o MMPS detecta com precisão mudanças morfológicas sutis associadas à ativação microglial.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade da Virgínia Ocidental (protocolo #2109047180) e o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde. Os equipamentos, reagentes e softwares usados nesse método estão listados na Tabela de Materiais.

1. Animais experimentais

1. Adquira 10 ratos Sprague-Dawley machos (2-3 meses de idade). Quando os ratos chegam à instalação para animais, devem ser alojados em grupo em um ciclo de 12 horas luz/escuro com acesso ad libitum a comida e água. Ao chegarem, os ratos são aclimatados por 3 dias antes do uso.
2. Atribuir aleatoriamente ratos a grupos tratados com veículos ou LPS (n = 5 ratos/grupo).
   NOTA: Devido ao pequeno número de ratos a serem utilizados, uma estratégia simples de randomização pode ser empregada, com números aleatórios gerados por computador para atribuir os ratos a um grupo de tratamento.
3. Monitore ratos após o tratamento para "comportamento de doença": perda de peso (>15%), secreção de porfirina, anormalidades respiratórias ou redução da atividade.
   NOTA: Sintomas de comportamento enjoativo frequentemente ocorrem nas primeiras 12 horas após a administração, então injete agentes cedo pela manhã (6-8h), monitore o comportamento ao longo do dia e devolva os ratos à unidade no final do dia (17h-19h).

2. Modelo de neuroinflamação

1. Prepare a solução de estoque LPS (O111:B4) (10 mg/mL) dissolvendo 50 mg de LPS em 5 mL de soro salino tamponado com fosfato.
   NOTA: LPS é uma endotoxina. Os pesquisadores devem seguir o procedimento padrão padrão de sua instituição para manuseio e descarte.
2. Pese ratos e injete intraperitonealmente LPS (10 mg/kg) ou PBS (veículo).
3. Com base no peso dos ratos, espera-se um volume de injeção entre 150–300 μL.
4. Eutanasiar ratos 24 horas após a injeção por perfusão cardíaca seguida de decapitação.
5. Anestesiar ratos com isoflurano inalado (5% em_O2) por 5–10 minutos. Confirme a anestesia pela ausência do reflexo de retirada do pedal.
6. Durante a anestesia, crie uma incisão torácica na linha média para expor o diafragma e o esterno. Pinça o processo xifoide usando hemostatos para revelar a cavidade torácica.
7. Corte o diafragma e a caixa torácica em direção aos membros anteriores para expor o coração.
8. Clampe a aorta descendente e a veia cava inferior com hemostatos. Insira uma agulha alada calibre 25 no ventrículo esquerdo.
9. Perfunda ratos com PBS gelado (25 mL a 30 mL/min) usando uma bomba peristáltica. Incenda o átrio esquerdo em poucos segundos após iniciar a perfusão para permitir a drenagem perfusada.
10. Perfusam ratos com 4% de paraformaldeído (25 mL a 30 mL/min).
    ATENÇÃO: Manuseie o paraformaldeído usando equipamentos de proteção individual adequados em um ambiente bem ventilado. Descarte resíduos de paraformaldeído conforme as regulamentações institucionais e locais.
11. Decapitar ratos com guilhotina após perfusão.
    NOTA: Siga as diretrizes da sua instituição sobre registro de decapitações e afiamento de lâminas.
12. Expõe o crânio retraindo o couro cabeludo em direção à pavelha.
13. Quebre o osso frontal usando hemostatos ou rongeurs inseridos nas órbitas orbitares.
14. Insira pinças no forame magnum e retire os ossos parietais.
15. Remova o cérebro usando pinças finas e incube durante a noite em paraformaldeído a 4%.
16. Transfira cérebros sequencialmente para 20% de sacarose e 30% de sacarose durante a noite para crioproteção.

3. Imunofluorescência

1. Congelar cérebros crioprotegidos no Composto Tissue Tek O.C.T. sobre gelo seco.
2. Seção do cérebro a 30 μm usando um criostato.
3. Colete seções em PBS e transfira-as para poços de rede inseridos em uma placa de 12 poços.
4. Selecione pelo menos duas seções por rato contendo o hipocampo dorsal anterior.
5. Lave as seções em PBS por 5 minutos duas vezes enquanto balança.
6. Permeabilize seções em 0,3% Triton X-100/PBS por 45 minutos enquanto balança.
   NOTA: Use 3 mL de solução por lavagem ou etapa de incubação, salvo especificação em contrário.
7. Lave as seções em PBS por 5 minutos duas vezes.
8. Dilua a solução de coleta de antígeno para 1x no PBS e adicione 2 mL por poço.
9. Incube as seções a 80°C por 20 minutos usando banho-maria.
10. Deixe as seções esfriarem até a temperatura ambiente antes de prosseguir.
11. Lave as seções em PBS por 5 minutos duas vezes.
12. Blocar seções em soro de burro 10% / 0,05% Triton X-100/PBS por 2 horas a 37°C enquanto agita a 75 rpm.
13. Lave as seções com soro de burro 1%/0,05% Triton X-100/PBS por 5 minutos e três vezes.
14. Transfira seções para uma nova placa de 12 poços sem os poços líquidos contendo 500 μL de solução primária de anticorpos anti-Iba1 preparada em soro de burro a 1%/0,05% Triton X-100/PBS.
15. Prepare controles negativos omitindo o anticorpo primário da solução de incubação.
16. Incube todas as seções durante a noite a 4°C em um oscilante orbital
17. Retorne as seções aos poços de rede.
18. Lave as seções com soro de burro 1%/0,05% Triton X-100/PBS por 10 minutos e três vezes.
19. Incube seções com anticorpo secundário anti-coelho (diluição 1:1000) em soro de burro a 1%/0,05% Triton X-100/PBS por 1,5 h em temperatura ambiente.
    NOTA: Minimize a exposição à luz durante todos os procedimentos subsequentes e envolva as placas em papel alumínio para evitar a degradação do fluoróforo.
20. Lave as seções em PBS por 5 minutos duas vezes.
21. Monte seções em lâminas de microscópio.
22. Desliza ao ar no escuro por >2 horas.
23. Seções de cobertura usando compostos solúveis em água.
24. Prepare os ferrolhos de controle negativo usando um meio de montagem.
25. Armazene os slides em uma caixa de slides em temperatura ambiente, em um ambiente escuro.

4. Imagem

1. Identifique o tamanho dos pixels de um sistema de imagem com ampliação de 40x. Se a escala não for encontrada, adicione uma barra de escala a cada imagem.
2. Utilize a coloração DAPI para identificar uma faixa densa de núcleos corticais em baixa ampliação correspondente à camada cortical IV.
3. Foque a imagem na região cortical identificada.
4. Troque para a ampliação 40x.
5. Ajuste as configurações de exposição do canal para maximizar a separação dos sinais DAPI e Iba1 da fluorescência de fundo.
6. Adquira imagens em Z-stack (> 30 passos) abrangendo toda a profundidade da microglia.
7. Gerar e salvar uma imagem composta de projeção de intensidade máxima a partir da pilha Z adquirida de ambas as colorações.
   NOTA: Otimize as configurações de exposição e de Z-stack para cada imagem para maximizar a separação do sinal entre DAPI/Iba1 e a fluorescência de fundo. A má separação de sinais reduz a precisão da geração de máscaras.

5. Software de mapeamento de parâmetros microgliais (MMPS)

1. Armazene todas as imagens compostas em um único diretório de imagens.
2. Crie um diretório de saída separado para os resultados gerados por MMPS.
3. Baixe o pacote independente MMPS ou script MMPS.py do repositório do GitHub.
4. Instale todas as dependências listadas no arquivo requirements.txt se for iniciar o MMPS pelo MMPS.py.
5. Abra o pacote MMPS ou execute MMPS.py script.
6. Selecione "Selecionar a Pasta de Imagens" e escolha o diretório de imagens.
7. Selecione "Selecionar Pasta de Saída" e escolha o diretório de saída.
8. Conceda permissões de acesso à pasta se solicitado pelo sistema operacional.
   NOTA: Instruções adicionais de instalação, orientações de solução de problemas e exemplos de uso são fornecidos na documentação suplementar e no repositório do GitHub.
9. Selecione "Rotulagem de Imagem" e atribua identificadores de animais e grupos de tratamento a cada imagem.
   NOTA: Se a rotulagem de imagens for omitida, o MMPS solicita identificadores de grupo de tratamento e de animais antes da exportação dos dados.
10. Insira o tamanho do pixel na aba "Parâmetros".
11. Selecione "Calibrar a partir da barra de escala" se o tamanho do pixel for desconhecido. Selecione os pontos de início e fim da barra de escala quando solicitado. Insira a distância conhecida da barra de escala em micrômetros.
12. Selecione o canal de fluorescência que contém o sinal microglial.
13. Selecione as imagens para processamento marcando a caixa ao lado de cada nome de imagem. Processe imagens individualmente quando a fluorescência de fundo difere substancialmente entre as imagens.
14. Revise as abas "Original", "Prévia", "Processado" e "Máscaras" para comparar as etapas de processamento de imagem.
15. Selecione "Pré-visualizar Imagem Atual" para avaliar as configurações de processamento de imagem.
16. Ajuste as configurações de subtração de fundo da bola rolante, redução de ruído e nitidez conforme necessário.
17. Use valores de bola rolante entre 5 e 150 pixels para subtração de fundo.
18. Use valores de redução de ruído entre 3 e 7 pixels para reduzir artefatos de iluminação irregulares.
19. Use valores de nitidez entre 1 e 2 para melhorar a definição das bordas.
20. Selecione "Processar Imagens Selecionadas" após otimizar as configurações de processamento de imagem.
    NOTA: O tempo de processamento de imagem varia dependendo do número da imagem e dos parâmetros selecionados.
21. Selecione "Escolher Somas (Todas as Imagens)."
22. Selecione "Mostrar cor (C)" para exibir imagens compostas RGB. Selecione "Canais..." e desmarcar canais não utilizados se a coloração da imagem parecer distorcida.
23. Selecione somas microgliais que exibam colocalização DAPI e Iba1. Evite selecionar células que encostam nas bordas da imagem. Remova marcadores soma selecionados incorretamente usando a tecla "Backspace" ou "Delete".
24. Pressione "Enter" ou "Return" para prosseguir para a próxima imagem.
25. Selecione "Resumir Somas (Todos)" após a seleção de Soma estar concluída.
26. Delinee o perímetro soma de cada célula microglial selecionada. Exclua processos celulares do contorno do soma e use pelo menos oito pontos de contorno por soma. Remova pontos de contorno colocados incorretamente usando "Desfazer o último ponto", "Excluir" ou "Retroceder".
27. Imprensa "Enter", "Return", duplo clique ou clique direito para finalizar cada esboço de soma.
28. Selecione "Refazer o Último Esboço" para repetir o esboço anterior do Soma, se necessário.
29. Selecione "Gerar Todas as Máscaras" após concluir o esboço do SOMA.
30. Aplique um valor mínimo de limiar para restringir a incorporação de pixels de fundo de baixa intensidade nas máscaras.
    NOTA: Valores mais altos mantêm a precisão do soma em detrimento do ramificamento, enquanto valores mais baixos mantêm a precisão do ramificado ao custo do soma. Valores de limiar entre 10–30% normalmente fornecem supressão equilibrada de fundo e preservação de ramos.
    NOTA: O tempo de geração da máscara varia dependendo do número de células selecionadas.
31. Selecione "QA All Masks" para iniciar a garantia de qualidade das máscaras.
32. As máscaras de revisão apresentaram do maior (800^{μm 2}) ao menor (200^{μm 2}).
33. Compare cada máscara com a microglia correspondente usando as abas "Processado" e "Máscara".
34. Aceite máscaras usando o atalho de teclado "A". Rejeite máscaras usando o atalho de teclado "R". Pressione "B" para desfazer uma aceitação ou rejeição. Navegue pelos tamanhos das máscaras usando as teclas de seta do teclado.
35. Selecione a maior máscara aceitável que capture com precisão a ramificação microglial sem incluir células vizinhas, fundo excessivo, bordas de imagem ou barras de escala.
    NOTA: Rejeite máscaras se houver dúvidas sobre sua precisão.
    NOTA: Selecione "Limpar Todas as Máscaras" e depois regenere as máscaras com um valor de limiar diferente se a maioria estiver incorreta.
36. Selecione "Calcular Características Simples" após a conclusão da garantia de qualidade da máscara para
    Calcule a distância média do centroide, área da máscara, perímetro, excentricidade, arredondamento e tamanho do Soma usando máscaras aceitas e contornos do SOMA.
37. Consulte a Tabela 1 para definições de parâmetros e tendências microgliais na neuroinflamação.
38. Baixar "Sholl.py", "FractalAnalysis_ImageJ.py" e "SkeletonAnalysisImageJ.py" para realizar análises adicionais.
39. Abra "FractalAnalysis_ImageJ.py" como um plugin de Fiji para análises fractais e de casco.
40. Insira a localização do diretório de saída e o tamanho do pixel quando solicitado. Selecione a opção "apenas maior máscara" se for desejada analisar apenas a maior máscara aceita.
41. Abra "Sholl.py" como um plugin Fiji para análise do Sholl.
42. Insira a localização do diretório de saída e o tamanho do pixel quando solicitado.
43. Insira o tamanho desejado do passo da análise de Sholl. Selecione "Use raio soma como raio inicial" para usar raios soma derivados de MMPS como raio inicial para análise de Sholl. Insira um valor fixo de raio soma se raios soma derivados de MMPS não forem usados.
44. Abra o "SkeletonAnalysisImageJ.py" como um plugin Fiji para análise de esqueletos.
45. Insira a localização do diretório de saída, o tamanho do pixel e a localização da pasta masks quando solicitado.
46. Exporte todos os resultados gerados por plugins como arquivos CSV para o diretório de saída quando terminar.

6. Fórmulas usadas no MMPS para cálculos de morfologia da microglia

NOTA: Todos os cálculos são realizados automaticamente pelo MMPS quando "Calcular Características Simples" é pressionado. Os cálculos dos parâmetros são mostrados abaixo.

1. Perímetro
   1. Calcule o perímetro usando a seguinte equação:
      
   2. Defina como perímetro, como o número de pixels nas bordas, e como o tamanho dos pixels em μm.
2. Distância média do centroide
   NOTA: A distância média do centroide também é chamada de dispersão celular¹¹.
   1. Identifique quatro pontos finais de ramificação com base nas coordenadas da célula:
      ramo superior: coordenada mínima Y,
      Ramo inferior: coordenada máxima Y,
      ramo esquerdo: coordenada x mínima,
      Ramo direito: coordenada máxima X.
   2. Calcule as coordenadas do centróide usando as seguintes equações:
      
      
   3. Defina c_x e _{c y} como coordenadas do centroide, x_i e _{y i} como coordenadas de pixel, e como o número total de pixels.
   4. Calcule a distância do ramo usando a seguinte equação:
      
   5. Defina d como distância de ramificação, x_i e _{y i} como coordenadas de extremidade de ramificação, e c_x e _{c y} como coordenadas do centroide.
   6. Calcule a distância média do centroide usando a seguinte equação:
      
   7. Defina como a distância média do centróide, como distância de ramificação, d_i e como tamanho de pixel em μm.
3. Área da máscara
   1. Calcule a área da máscara usando a seguinte equação:
      
   2. Defina como área da máscara em μm², como o número de pixels dentro da máscara, e como o tamanho dos pixels em μm.
4. Excentricidade
   1. Calcule segundos momentos centrais usando as seguintes equações:
      
      
      
   2. Defina μ₂₀, μ₀₂ e μ₁₁ como segundos momentos centrais, x_i e _{y i} como coordenadas de pixel, c_x e _{c y} como coordenadas centríde, e N como o número total de pixels.
   3. Calcule autovalores da matriz de covariância usando a seguinte equação:
      
   4. Defina λ₁ ≥ λ₂.
   5. Calcule os comprimentos dos eixos maior e menor usando as seguintes equações:
      
   6. Defina a como comprimento do eixo maior e b como comprimento do eixo menor.
   7. Calcule a excentricidade usando a seguinte equação:
      
   8. Defina como excentricidade.
5. Arredondamento
   1. Calcule a arredondamento usando a seguinte equação:
      
   2. Defina como arredondamento, comprimento do eixo maior e comprimento do eixo menor.
6. Tamanho Soma
   1. Calcule a área de soma usando a seguinte equação:
      
   2. Defina Sa como área soma em^{μm 2}, como o número de pixels dentro da máscara soma, e S como tamanho de pixel em μm.

7. Análise estatística

1. Realize todas as análises estatísticas usando a versão 4.3.2 do R.
2. Filtre conjuntos de dados usando a maior máscara aceita para cada célula.
3. Parâmetros celulares médios no nível animal antes da análise estatística.
4. Avalie normalidade e variância usando os testes de Shapiro–Wilk e Levene.
5. Realize testes t de Student ou ANOVA de médias repetidas com testes t corretidos por Holm post-hoc quando os conjuntos de dados satisfazem suposições paramétricas.
6. Realize testes de soma de ranks de Wilcoxon ou de Friedman com testes de rank sinalizado corrigidos por Holm quando os conjuntos de dados não satisfazem suposições paramétricas.
7. Defina significância estatística como p < 0,05 .

Resultados

Uma plataforma de análise de morfologia microglial de código aberto e independente, chamada Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), foi desenvolvida para fornecer um fluxo de trabalho acessível e padronizado para análise de morfologia microglial baseada em IF. A plataforma se baseia em metodologias anteriores de análise morfologica, não requer conhecimento em programação e incorpora uma interface gráfica acessível. O MMPS foi projetado para melhorar a detecção de ramificações microgliais sutis enquanto incorpora múltiplas salvaguardas para minimizar a superestimação das máscaras microgliais.

O MMPS foi validado usando um modelo de neuroinflamação de roedores induzido por LPS. Após o processamento do tecido e a aquisição da imagem (Figura 1), a especificidade do JI foi confirmada usando seções controle negativas sem coloração primária de anticorpos (Figura Suplementar 1). O processamento MMPS começa com a importação de imagens IF para a interface do software (Figura 2A). O software oferece múltiplas opções de processamento de imagem para melhorar a detecção de sinais microgliais e a separação de fundo. A subtração obrigatória de fundo é realizada usando o algoritmo rolling-ball implementado no pacote Scikit-image, enquanto filtros opcionais de redução de ruído e nitidez estão disponíveis via filtragem Gaussiana baseada em SciPy. Após o processamento de imagens, os somas microgliais são selecionados manualmente e identificados por marcadores de seleção vermelhos (Figura 2B). Os limites do soma são posteriormente delineados manualmente para cálculos morfológicos a jusante (Figura 2C).

Figura 1: Visão geral gráfica do modelo e processamento da neuroinflamação. Ratos foram injetados com LPS ou PBS e coletados por 24 horas com perfusão cardíaca seguida de decapitação. Cérebros foram extraídos e cortados em seções de 30 μm para serem então usados em FI para o marcador microglial Iba1, que foram processados com MMPS. Criado com Biorender. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Visão geral do uso do MMPS. (A) Exemplo de uma imagem de microglia cortical (vermelho, Iba1) com núcleos celulares (azul, DAPI) a ser referenciada em MMPS (barra de escala = 75 μm, 40x). Após o processamento de imagem usando MMPS, o fundo será reduzido e morfologias precisas serão avaliadas (B). Após o processamento da imagem em MMPS, os somas são selecionados manualmente com um círculo vermelho para serem usados nas etapas subsequentes detalhadas nos métodos (barra de escala = 75 μm, 40x). (C) Duas microglias representativas foram delineadas manualmente, e as imagens salvas do contorno do soma são mostradas abaixo. (D) A geração de máscaras de células selecionadas rastreia automaticamente ramos microgliais até 800^{μm 2}, mas requer garantia manual de qualidade. Aqui exibimos a máscara imprecisa de 800^{μm 2} seguida pela máscara mais precisa de 700^{μm 2} . Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Após o esboço do SOMA, o MMPS gera máscaras iterativamente em uma faixa de tamanho de 200–800^{μm 2} usando limiar adaptativo limitado por limiares de intensidade mínima definidos pelo usuário. Máscaras menores seguem mais de perto o limite definido pelo usuário, enquanto máscaras maiores relaxam progressivamente as restrições de limiar para maximizar a incorporação de filiais. Máscaras geradas passam por revisão manual de garantia de qualidade para evitar a inclusão de células vizinhas, incorporação excessiva de fundo ou truncamento por bordas de imagem ou barras de escala. Como mostrado na Figura 2D, a máscara de 800^{μm 2} para uma célula microglial representativa se estendia para uma célula vizinha. A rejeição da máscara de 800^{μm 2} e a seleção da máscara de 700^{μm 2} corrigiram o erro de segmentação, preservando a delimitação precisa das micróglias alvo.

Após o processamento do MMPS, a ativação microglial foi avaliada usando a maior máscara aceita para cada célula, pois essas máscaras capturaram com maior precisão a ramificação distal, minimizando a incorporação de fundo. Os parâmetros morfológicos calculados são resumidos na Tabela 1 e representados na Figura 3. A administração do LPS diminuiu significativamente a distância média do centroide e o perímetro celular em comparação com os controles tratados com veículo (p < 0,05; Figura 3A,B), consistente com retração dos processos microgliais durante a ativação. Não foram observadas diferenças significativas na área da máscara, arredondamento ou excentricidade entre os grupos de tratamento (Figura 3C–E), apesar de relatos anteriores associarem esses parâmetros a fenótipos microgliais^{ativados 3,23}. O presente estudo não foi estatisticamente validado para detectar diferenças sutis no formato do soma ou na área da máscara, e subpopulações microgliais podem adotar morfologias inflamatórias heterogêneas que não seguem uniformemente essas^{tendências 3}. Em contraste, a área de soma foi significativamente aumentada em animais tratados com LPS em comparação com os controles veiculares (p < 0,01; Figura 3F), apoiando ainda a remodelação morfológica associada à^{ativação 22}.

Figura 3: Comparação dos parâmetros morfológicos microgliais. Para todos os painéis, foram realizados testes de normalidade (Shapiro-Wilk e Levene) com valores não significativos encontrados em todos os casos (p>0,05), levando à utilização de testes t de Student. Os pontos representam animais individuais (n=5 por tratamento) (A) A distância média do centroide foi significativamente maior no grupo de veículos em comparação com o grupo de tratamento LPS. (B) O perímetro das células microglicais foi significativamente maior no grupo do veículo em comparação com o grupo de tratamento com LPS. (C) Não houve diferença significativa na área da máscara entre os grupos de tratamento. (D) Não houve diferença significativa na excentricidade dos soma entre os grupos. (E) Não há diferença significativa na redondez do soma entre os grupos de tratamento. (F) Houve um aumento significativo na área soma no grupo LPS * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Parâmetro	Definição	Relação com a Ativação Microglial
Distância média do centroide	Distância média do ramo mais distante nas posições superior, direita, inferior e esquerda	Diminuições
Perímetro	Medição do perímetro da cela	Diminuições
Área de Máscara	A área real da célula, não a área da máscara alvo	Diminuições
Excentricidade	Uma medição da elongação aproximada do soma celular (0: circular, 1: altamente alongado)	Diminuições
Arredondamento	Uma medição da circularidade aproximada do soma celular (0: alongado, 1: circular)	Aumentos
Tamanho Soma	A área da célula soma	Aumentos

Tabela 1: Parâmetros calculados a partir do MMPS e mudanças previstas na resposta à ativação da microglia. A tabela resume parâmetros morfológicos calculados pelo Software de Mapeamento de Parâmetros Gliais (MMPS), incluindo perímetro, distância média do centroide, área da máscara, excentricidade, arredondamento e área do soma.

A reprodutibilidade entre usuários foi posteriormente avaliada fornecendo o mesmo conjunto de imagens para usuários cegos e previamente não treinados para análise independente (Figura Suplementar 2). Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi detectada entre os usuários, e todos os usuários reproduziram tendências morfológicas consistentes com ativação microglial em animais tratados com LPS.

O MMPS também suporta análises morfológicas avançadas a jusante. A análise correlativa dos parâmetros gerados a partir da Figura 3 demonstrou relações entre características morfológicas distintas. Ratos tratados com veículos demonstraram apenas uma correlação fraca entre a arredondamento da microglia e o perímetro (R² = 0,17), enquanto ratos tratados com LPS apresentaram uma correlação mais forte (R² = 0,64), sugerindo que o aumento da ativação microglial estava associado a reduções simultâneas de arredondamento e perímetro (Figura 4A). Além disso, a área da máscara demonstrou fortes correlações positivas com a distância média do centroide tanto em grupos com veículo quanto em grupos tratados com LPS (R² = 0,71 e 0,88, respectivamente), consistentes com mudanças na complexidade de ramificação associadas ao status de ativação microglial (Figura 4B).

Figura 4: Análise avançada dos parâmetros microgliais. Todos os painéis são linhas de nível animal de melhor ajuste calculadas pelo método dos mínimos quadrados ordinários, exibidos com seu coeficiente de determinação (R²) e sombreados com seu intervalo de confiança de 95%. (A) A arredondamento do soma microglial e a tendência do comprimento total do perímetro na microglia formam fracamente o grupo do veículo (R² = 0,17), mas apresentam correlação mais forte após exposição ao LPS (R² = 0,64). (B) A distância média do centroide correlaciona-se com a área da microglia nos grupos do veículo (R² = 0,71) e LPS (R² = 0,88). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Validação do protocolo IF por controle negativo. Uma fatia cerebral da mesma região para cada rato passou pelo protocolo de FI sem adição primária de anticorpos para confirmar a ausência de autofluorescência (barra de escala = 75 μm) (A) Imagem representativa do tecido corado por veículo para DAPI (azul). (B) Imagem representativa do tecido corado por veículo para Iba1 (vermelho). (C) Imagem representativa do tecido corado por veículo para DAPI (azul) e Iba1 (vermelho). (D) Imagem representativa do tecido corado com LPS para DAPI (azul). (E) Imagem representativa do tecido corado com LPS para Iba1 (vermelho). (F) Imagem representativa do tecido corado com LPS para DAPI (azul) e Iba1 (vermelho). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Avaliação da Variação entre Usuários do MMPS. Vários usuários cegos utilizaram MMPS nas mesmas amostras da Figura 3 e os resultados em nível animal foram comparados. Para todos, os testes de normalidade (Shapiro-Wilk e Levene) foram não significativos (p>0,05), levando à utilização de uma ANOVA de médias repetidas com o teste t par corrigido pós-hoc (p>0,05). (A) Não houve diferença significativa em cada grupo entre usuários para a distância média do centroide (p>0,05). (B) Não houve diferença significativa em cada grupo entre os usuários para o perímetro (p>0,05). (C) Não houve diferença significativa em cada grupo entre usuários para área da máscara (p>0,05). (D) Não houve diferença significativa em cada grupo entre usuários quanto à excentricidade (p>0,05). (E) Não houve diferença significativa em cada grupo entre usuários quanto à arredondamento (p>0,05). (F) Não houve diferença significativa em cada grupo entre usuários da área soma (p>0,05). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O objetivo principal dessa metodologia é expandir o acesso à análise da morfologia microglial reduzindo barreiras técnicas comuns, preservando as forças das abordagens de avaliação morfológica já estabelecidas. O MMPS permite a detecção de alterações sutis de morfologia microglial mantendo a compatibilidade com análises avançadas, incluindo análises fractal, esqueleto, casco e Sholl. Comparado a abordagens publicadas anteriormente, o MMPS oferece uma interface gráfica acessível, cálculos integrados para parâmetros morfológicos comumente usados e eliminação dos requisitos de codificação, mantendo a compatibilidade com análises posteriores mais avançadas.

Vários passos metodológicos críticos influenciam fortemente a precisão analítica e a reprodutibilidade. Imagens de imunofluorescência (IF) de alta qualidade são essenciais para geração confiável de máscaras e cálculos morfológicos. A especificidade de anticorpos representa um fator importante para a qualidade da imagem, pois a marcação inespecífica aumenta a fluorescência de fundo e reduz a separação de sinais entre a microglia e o tecido ao redor. Da mesma forma, concentrações subótimas de anticorpos podem reduzir a intensidade da fluorescência e diminuir a resolução da imagem. A aquisição de imagens Z-stack também é crítica, pois a omissão da imagem Z-stack pode alterar artificialmente a complexidade aparente de ramificação microglial e a disseminação do processo, enviesando assim cálculos morfológicos.

Várias considerações adicionais são importantes durante o processamento do MMPS. Embora o MMPS suporte processamento de imagem em lote, a otimização individual de imagem costuma ser preferível porque as características de fundo e a qualidade da coloração podem variar substancialmente entre imagens. A qualidade da imagem influencia diretamente a precisão da geração de máscaras; portanto, a otimização durante o pré-processamento de imagem melhora substancialmente a reprodutibilidade e a robustez das análises posteriores. A seleção cuidadosa dos somas microgliais também é importante, especialmente a evitação de células em contato com as bordas da imagem, pois a seleção parcial pode reduzir artificialmente as medições de soma e distorcer a geração de máscaras. Durante a revisão de garantia de qualidade das máscaras, máscaras que incorporem células vizinhas, bordas de fundo ou imagens excessivas devem ser rejeitadas. Por outro lado, máscaras menores não devem ser rejeitadas apenas porque não capturam todos os processos distas, já que o algoritmo iterativo de geração de máscaras ajusta intencionalmente parâmetros locais de limiar de acordo com o tamanho da máscara e a intensidade regional dos pixels.

Essa metodologia é altamente adaptável e pode ser modificada para atender a requisitos experimentais específicos. Como o MMPS é de código aberto, a plataforma pode ser expandida para analisar quadros individuais de Z-stack ou incorporar algoritmos automatizados de detecção celular para gerar um pipeline totalmente automatizado de análise morfologica. Além disso, máscaras geradas e contornos soma permanecem compatíveis com fluxos de trabalho baseados em ImageJ para análises fractal, casco, esqueleto e Sholl. Como o MMPS foi desenvolvido em Python 3.11, análises adicionais também podem ser incorporadas diretamente ao software usando pacotes científicos de Python comumente disponíveis, sem a necessidade de plataformas externas.

Apesar dessas vantagens, várias limitações devem ser consideradas. O MMPS foi validado usando um modelo de neuroinflamação em uma região cerebral específica de ratos machos de Sprague-Dawley, e diferentes regiões cerebrais, modelos de doença, espécies ou sexo biológico podem influenciar os desfechos morfológicos. A aplicabilidade do MMPS a paradigmas experimentais alternativos deve, portanto, ser validada por meio de estudos piloto ou apoiada por comparações de literatura anterior. Além disso, a imagem baseada em SI captura incompletamente estruturas ramificadas tridimensionais, pois processos que se estendem diretamente acima ou abaixo do plano focal podem não ser detectados em imagens de projeção máxima. Aumentar o número de células analisadas pode ajudar a mitigar essa limitação. O MMPS também continua dependente da qualidade da aquisição de imagem e, portanto, requer otimização para sistemas individuais de imagem, protocolos de coloração e preparações de anticorpos. Imagens de baixa resolução podem inflar artificialmente o tamanho da máscara devido a limites borrados ao redor dos somas e galhos muito compactos. Por esse motivo, o atual protocolo incorpora métodos de IF flutuantes e múltiplas opções de processamento de imagem para maximizar a qualidade da imagem.

O MMPS também mantém algum potencial de variabilidade dependente do usuário, pois os usuários selecionam manualmente as células e contornam os somas. No entanto, o uso de colocalização DAPI e Iba1 reduz substancialmente a ambiguidade durante a seleção celular. Além disso, a análise interusuário cega demonstrou variabilidade mínima entre usuários previamente não treinados, apoiando a reprodutibilidade do fluxo de trabalho analítico.

Ao contrário de várias plataformas de morfologia microglial publicadas anteriormente, o MMPS não é totalmente automatizado. No entanto, esse design foi escolhido para priorizar a precisão da segmentação e a garantia de qualidade da máscara. Fluxos de trabalho automatizados poderiam ser incorporados por meio da modificação do código-fonte em Python para permitir a detecção automatizada de colocalização DAPI/Iba1, o contorno de soma baseado em contornos e a aceitação ou rejeição de máscaras por aprendizado de máquina. Além disso, o MMPS requer uma capacidade substancial de armazenamento em disco porque máscaras geradas e contornos soma são automaticamente salvos como arquivos .tiff para análises posteriores e garantia de qualidade. Os requisitos de armazenamento poderiam ser reduzidos modificando o software para gerar máscaras sequencialmente célula a célula, seguida de avaliação imediata de qualidade e extração de parâmetros.

Em conclusão, o MMPS amplia o acesso à análise quantitativa da morfologia microglial ao fornecer uma plataforma padronizada e de código aberto que não requer expertise em codificação ou capacidades de imagem in vivo . A plataforma facilita a análise reprodutível da morfologia microglial baseada em FI, mantendo a compatibilidade com abordagens analíticas avançadas a jusante.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
12-well plate	Fisher Scientific	07-200-82	Placa usada para incubação e lavagem de secções de tecido.
Aluminum foil	Fisher Scientific	01-213-101	Usado para proteger amostras fluorescentes da exposição à luz.
Antigen Retrieval Buffer (10×)	ThermoFisher Scientific	00-4955-58	Usado para melhorar a acessibilidade ao antígeno durante a coloração de imunofluorescência.
Anti-Iba1 primary antibody	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	Anticorpo primário usado para marcação imunofluorescente de microglia.
Cryostat	Fisher Scientific	95-710-0L	Instrumento usado para secionar tecido cerebral congelado em espessuras definidas.
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21428	Anticorpo secundário fluorescente usado para visualização de anticorpos primários de coelho.
Donkey Serum	Fisher Scientific	50-413-115	Reagente de bloqueio usado para reduzir a ligação não específica do anticorpo.
EVOS FL Auto 2 Imaging System	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Microscópio de fluorescência usado para aquisição de imagens.
Fiji (ImageJ) 2.16.0	NIH	fiji.sc	Plataforma de processamento de imagem usada para análises morfológicas e plugins de downstream.
Fluoromount-G	ThermoFisher Scientific	00-4959-52	Meio de montagem usado para preservar a fluorescência e fixar lamínulas.
Isoflurane	EntirelyPets Pharmacy	MWI502017	Anestésico inalatório usado durante procedimentos em animais.
Lipopolysaccharide	Millipore Sigma	L2630	Usado para induzir neuroinflamação sistémica e ativação microglial em roedores.
Matplotlib	https://pypi.org/project/matplotlib/		Biblioteca de plotagem Python usada para visualização de dados e geração de figuras.
MMPS (Mapping Microglial Parameters Software) v1.00	This work	https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00	Plataforma de software de código aberto desenvolvida para análise morfológica de microglia.
Net wells	Millipore Sigma	CLS3477	Inserções usadas para manter secções de tecido flutuantes livres durante os procedimentos de coloração.
Numpy	https://pypi.org/project/numpy/		Biblioteca Python usada para cálculos numéricos dentro do MMPS.
Objective lens (4×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4922	Objetivo de baixa magnificação usado para orientação anatômica e identificação de região.
Objective lens (40×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4625	Objetivo de alta magnificação usado para imagem da morfologia microglial.
opencv-python	https://pypi.org/project/opencv-python/		Biblioteca de visão computacional usada para funções de processamento de imagem dentro do MMPS.
Paraformaldehyde	ThermoFisher Scientific	169650025	Fixativo usado para perfusão e preservação de tecido antes da secagem.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Meio de montagem permanente usado para preservação de lâminas.
Phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP3991	Solução tampão usada para lavagem de tecido e preparação de reagentes.
Pillow	https://pypi.org/project/Pillow/		Biblioteca de imagem Python usada para operações de processamento de imagem.
PyQt5	https://pypi.org/project/PyQt5/		Framework GUI Python usado para gerar a interface gráfica do usuário do MMPS.
Python 3.11	Python Software Foundation	python.org	Ambiente de linguagem de programação usado para desenvolver e executar o MMPS.
R 4.3.2	R Foundation for Statistical Computing	r-project.org	Software estatístico usado para análise de dados e geração de gráficos.
Scikit-image	https://pypi.org/project/scikit-image/		Biblioteca de análise de imagem Python usada para processamento de imagem e segmentação.
Scipy	https://pypi.org/project/scipy/		Pacote Python de computação científica usado para filtragem e operações de processamento de imagem.
Sprague-Dawley Rats	Evingo	002	Animais experimentais usados para validação do modelo de neuroinflamação.
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	Crioprotector usado antes de congelar o tecido cerebral.
Tifffile	https://pypi.org/project/tifffile/		Pacote Python usado para ler e escrever arquivos de imagem TIFF.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Meio de incorporação usado para crioseção de amostras de tecido congelado.
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Detergente usado para permeabilização de membranas durante a imunofluorescência.