Preparação de Enxertos de Nervos Periféricos Humanos Descelularizados Utilizando Hidróxido de Sódio e Deoxicolato de Sódio

Resumo

Este protocolo descreve um método padronizado de descelularização assistida por alcalino que combina o tratamento com hidróxido de sódio a um sistema de troca de solução movido por bomba peristáltica para produzir enxertos de nervos periféricos humanos descelularizados com remoção celular eficaz e preservação da arquitetura nativa da matriz extracelular.

Resumo

As lesões dos nervos periféricos frequentemente exigem materiais enxertos que forneçam orientação estrutural para a regeneração axonal. Embora o enxerto nervoso autólogo permaneça o padrão-ouro clínico, seu uso é limitado pela morbidade no local doador e pela disponibilidade restrita de tecido. Essas limitações têm impulsionado o crescente interesse por enxertos de nervos periféricos humanos descelularizados como biomaterial alternativo para a regeneração nervosa. No entanto, os protocolos comuns de descelularização baseados em detergentes podem danificar a arquitetura da matriz extracelular (MEC) e deixar resíduos citotóxicos que podem comprometer a qualidade do enxerto. Neste artigo, descreve-se um protocolo padronizado para o preparo de enxertos de nervos periféricos humanos descelularizados utilizando uma abordagem de descelularização assistida por alcalino. O procedimento inicia-se com o tratamento por hidróxido de sódio (NaOH) para promover a disruptura celular eficiente, seguido por uma etapa suave com desoxicolanato de sódio (SDC), que remove os componentes celulares e imunogênicos remanescentes, preservando a organização nativa da MEC. Essa estratégia limita a exposição ao detergente, ao mesmo tempo que favorece a preservação da arquitetura nativa da MEC. O fluxo de trabalho inclui o preparo do nervo doador, tratamento controlado com NaOH, subsequente tratamento suave com SDC e lavagens extensivas sob troca contínua de solução, utilizando um sistema acionado por bomba peristáltica para facilitar a remoção de agentes residuais do processamento. São implementadas etapas adicionais de pós-processamento para manter a integridade estrutural e preparar os enxertos para embalagem final e esterilização. A eficiência da descelularização é avaliada por meio de análise histológica e quantificação do DNA residual, e a preservação da estrutura da MEC é examinada utilizando microscopia eletrônica de varredura. A ausência de resíduos de SDC e a biocompatibilidade dos enxertos processados foram confirmadas por testes de citotoxicidade. Este protocolo fornece uma abordagem prática para a produção de enxertos de nervos periféricos humanos descelularizados para pesquisas sobre regeneração nervosa periférica e aplicações translacionais.

Introdução

Lesões nos nervos periféricos podem levar a um comprometimento funcional grave e continuam sendo um desafio clínico significativo na medicina regenerativa e na cirurgia reconstrutiva. A regeneração de defeitos nervosos segmentares exige materiais de enxerto que não apenas preencham a lacuna da lesão, mas também forneçam orientação estrutural e sinais bioquímicos para apoiar a regeneração axonal e a reinervação. O enxerto nervoso autólogo é amplamente considerado o padrão-ouro clínico, pois preserva a arquitetura da matriz extracelular (ECM) nativa e fornece um microambiente favorável à regeneração nervosa^1,2. No entanto, seu uso clínico é limitado pela disponibilidade restrita de tecido doador, pela necessidade de procedimentos cirúrgicos adicionais e pela morbidade no local doador^3,4. Essas limitações têm impulsionado o desenvolvimento de materiais de enxerto alternativos, particularmente enxertos nervosos periféricos descelularizados que mantêm a arquitetura nativa da ECM enquanto minimizam componentes celulares imunogênicos^5,6,7,8.

O desempenho dos enxertos nervosos descelularizados depende fortemente do processo de descelularização. Os métodos convencionais geralmente utilizam reagentes à base de detergentes, como Triton X-100 e desoxicolanato de sódio (SDC), que removem os componentes celulares solubilizando as membranas lipídicas^9,10,11. No entanto, a exposição prolongada a esses detergentes pode danificar a microestrutura da matriz extracelular (ECM) e deixar substâncias citotóxicas residuais que afetam negativamente a viabilidade celular e os resultados regenerativos^12,13. Como resultado, estratégias alternativas de descelularização que permitam a remoção eficiente de células preservando a integridade da ECM estão sendo ativamente investigadas¹⁴. A descelularização alcalina utilizando hidróxido de sódio (NaOH) surgiu como uma abordagem alternativa potencial, pois condições extremas de pH podem degradar eficientemente componentes celulares, ácidos nucleicos e lipídios^15,16,17. Contudo, a exposição não controlada a condições fortemente alcalinas pode comprometer a integridade da ECM, destacando a importância de condições de processamento rigorosamente controladas^16,18.

Aqui, apresenta-se um protocolo padronizado de descelularização assistida por alcalino para enxertos de nervos periféricos humanos, incorporando um sistema contínuo de troca de solução movido por bomba peristáltica. Em comparação com os métodos convencionais de imersão estática, este processo dinâmico permite a troca contínua de solução, facilitando a remoção de detritos celulares e agentes residuais de processamento. Este artigo fornece uma demonstração visual passo a passo de todo o fluxo de trabalho, incluindo o preparo do nervo do doador, descelularização controlada assistida por alcalino e troca contínua de solução utilizando um sistema movido por bomba peristáltica. Os enxertos resultantes foram avaliados por meio de análise histológica, quantificação do DNA residual e microscopia eletrônica de varredura (MEV) para confirmar a eficiência da descelularização e a preservação da ultraestrutura da matriz extracelular (ECM). Ao permitir a visualização clara das etapas técnicas críticas, este artigo fornece um arcabouço bem definido para o preparo de enxertos nervosos descelularizados e para a ampliação futura do processo.

Protocolo

Nervos periféricos humanos doados foram obtidos de um banco de tecidos dos EUA mediante um acordo exclusivo com a L&C BIO e em conformidade com as regulamentações da American Association of Tissue Banks (AATB) e da U.S. Food and Drug Administration (FDA). As informações sobre os doadores, incluindo idade e sexo, histórico médico e resultados de testes sorológicos, foram fornecidas juntamente com os tecidos e revisadas e aprovadas por um diretor médico certificado. Após o recebimento, todos os tecidos passaram por inspeção inicial, incluindo verificação do rastreamento dos doadores, testes sorológicos e testes para patógenos relevantes; somente os tecidos que atenderam aos critérios pré-definidos de aceitação foram utilizados neste estudo. Todos os procedimentos envolvendo espécimes humanos foram realizados de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque. Como nenhum sujeito humano foi recrutado ou diretamente envolvido neste estudo, um número separado de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (IRB) não foi emitido.

1. Prepare as soluções (Dia 1)

1. Prepare uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,25 N dissolvendo 10 g de NaOH em 1 L de água destilada sob agitação magnética.
2. Prepare uma solução de desoxicolato de sódio (SDC) a 4% dissolvendo 40 g de SDC em 1 L de água destilada sob agitação magnética.
3. Transfira cada solução preparada para frascos de vidro estéreis.
   CAUTION: Manipule o desoxicolato de sódio (SDC) dentro de uma cabine de segurança química. Use equipamento de proteção individual apropriado, incluindo luvas, jaleco de laboratório e proteção ocular, para evitar inalação e contato com a pele.

2. Preparar os segmentos de nervo periférico para descelularização

1. Desinfete a superfície externa do nervo periférico embalado e abra a embalagem de forma asséptica.
2. Lave o nervo periférico várias vezes com água destilada estéril.
3. Remova o tecido adiposo residual, tecido conjuntivo, ramos desnecessários e tecido nervoso danificado utilizando tesoura e pinça estéreis. Lave novamente o nervo periférico com água destilada estéril.
4. Corte o nervo periférico em segmentos com comprimento de 2–5 cm. Classifique os segmentos preparados em três grupos de comprimento: 2–3 cm, >3–4 cm e >4–5 cm.
   NOTA: Processe cada grupo de comprimento separadamente, pois diferentes durações de tratamento com IPA, NaOH e SDC são aplicadas de acordo com o comprimento dos segmentos nervosos, conforme resumido na Tabela 1.

3. Configure o sistema de bomba peristáltica

1. Conecte tubos de silicone resistentes a produtos químicos de comprimento suficiente a ambas as extremidades da coluna de cromatografia.
2. Conecte uma extremidade do tubo à bomba peristáltica.
3. Conecte as extremidades livres dos tubos a um frasco de vidro de 1 L contendo álcool isopropílico (IPA) utilizando tubos da bomba, a fim de estabelecer um sistema de circulação em circuito fechado.
   NOTA: Fixe firmemente todas as conexões dos tubos, pois a pressão e a vibração da bomba peristáltica podem provocar a desconexão dos tubos da coluna ou do frasco.

4. Deslipidificar o nervo periférico

OBSERVAÇÃO: A menos que indicado em contrário, realize todas as etapas de troca de solução em temperatura ambiente (20–25 °C) usando uma bomba peristáltica ajustada em 90–186 mL/min, dependendo da configuração dos tubos. Mantenha a vazão selecionada constante durante toda a execução de cada processo.

1. Abra uma extremidade da coluna de cromatografia e preencha parcialmente a coluna com a solução de IPA para garantir que o tecido nervoso permaneça imerso imediatamente após a inserção.
2. Usando pinças estéreis, segure suavemente o tecido externo em uma extremidade de um único segmento de nervo periférico preparado. Evite comprimir ou segurar diretamente o corpo principal do nervo. Introduza cuidadosamente o segmento nervoso na solução dentro da coluna.
3. Com as pinças, alinhe suavemente o segmento nervoso e posicione-o longitudinalmente, paralelamente à direção do fluxo do fluido. Certifique-se de que o segmento não esteja dobrado, enrolado ou pressionado contra a parede interna da coluna ou contra o filtro de saída.
4. Feche a coluna e posicione-a com uma leve inclinação ascendente em direção à saída, com a saída ligeiramente mais elevada que a entrada. Essa orientação ajuda a evitar que o segmento nervoso se deposite contra qualquer um dos filtros nas extremidades, especialmente o filtro de saída.
   NOTA: Processe um único segmento de nervo periférico por coluna por procedimento. Nenhum dispositivo físico adicional de fixação é necessário. A flutuabilidade natural do tecido nervoso e o fluxo relativamente suave do fluido ajudam a manter o segmento em posição suspensa e estendida. Inspeccione a posição do tecido durante o processamento e reposicione-o suavemente com pinças estéreis caso adira à parede da coluna, ao filtro ou a si mesmo.
5. Conecte a solução de IPA ao sistema de bomba peristáltica. Realize a troca contínua da solução através da coluna por 1,5 h para segmentos nervosos de 2–3 cm, 2 h para segmentos de >3–4 cm ou 2,5 h para segmentos de >4–5 cm.
6. Drene a solução da coluna.
7. Adicione 40 mL de água destilada estéril à coluna. Inverta suavemente ou agite a coluna cinco vezes para lavar o nervo periférico.
8. Repita os passos 4.6 e 4.7 por um total de cinco lavagens.
9. Conecte um reservatório contendo 5 L de água destilada estéril ao sistema de bomba peristáltica. Realize a troca contínua da solução através da coluna durante a noite.
   PONTO DE PAUSA: Após concluir a lavagem noturna, o procedimento pode ser interrompido. Desligue a bomba peristáltica e armazene o nervo periférico completamente submerso em água destilada estéril a 4 °C por até 24 h antes de prosseguir para o passo 5.1.
   NOTA: Minimize a presença de bolhas de ar dentro da coluna para promover uma troca eficiente da solução. Ajuste o segmento nervoso periférico conforme necessário para mantê-lo suspenso na solução e evitar que adira à parede interna da coluna ou ao filtro.

5. Realize a primeira descelularização (Dia 2)

1. Conecte a solução de NaOH 0,25 N ao sistema de bomba peristáltica. Realize a troca contínua da solução através da coluna durante 6 h para segmentos nervosos medindo 2–3 cm, 8 h para segmentos medindo >3–4 cm, ou 10 h para segmentos medindo >4–5 cm.
2. Drene a solução da coluna.
3. Lave o nervo periférico conforme descrito nas etapas 4.6–4.8.
4. Conecte um reservatório contendo 5 L de água destilada estéril ao sistema de bomba peristáltica. Realize a troca contínua da solução através da coluna durante a noite.
   PONTO DE PAUSA: Após a conclusão da lavagem noturna, o procedimento pode ser interrompido. Pare a bomba peristáltica e armazene o nervo periférico completamente submerso em água destilada estéril a 4 °C por até 24 h antes de prosseguir para a etapa 6.1.

6. Realize a segunda descelularização (Dia 3)

1. Conecte a solução de SDC 4% (p/v) ao sistema de bomba peristáltica. Realize a troca contínua da solução através da coluna durante 6 h para segmentos nervosos medindo 2–3 cm, 8 h para segmentos medindo >3–4 cm, ou 10 h para segmentos medindo >4–5 cm.
2. Drene a solução da coluna.
3. Lave o nervo periférico conforme descrito nas etapas 4.6–4.8.
4. Conecte um reservatório contendo 5 L de água destilada estéril ao sistema de bomba peristáltica. Realize a troca contínua da solução através da coluna durante a noite.
   PONTO DE PAUSA: Após a conclusão da lavagem noturna, o procedimento pode ser interrompido. Pare a bomba peristáltica e armazene o nervo periférico completamente submerso em água destilada estéril a 4 °C por até 24 h antes de prosseguir para a etapa 7.1.

7. Esterilize o nervo periférico descelularizado (Dia 4)

1. Remova um pequeno volume de água destilada da coluna. Retire cuidadosamente o nervo periférico descelularizado, mantendo-o suspenso no líquido remanescente.
2. Embalage o nervo periférico junto com água destilada estéril.
3. Esterilize o nervo periférico embalado por irradiação gama com uma dose de 25 kGy.
   NOTA: Não drenar completamente a água destilada da coluna. Mantenha o segmento nervoso suspenso em um volume suficiente do líquido remanescente para evitar que adere à parede interna da coluna e para facilitar o manuseio suave, sem permitir que o líquido transborde.

Resultados

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing is shown in Figure 2A. Trimming and segmenting of the nerve were illustrated in Figure 2B–D. After completion of the process, the peripheral nerve maintained its overall morphology without visible structural disruption (Figure 2E).

Histological evaluation of the decellularization is shown in Figure 3. Hematoxylin and eosin (H&E) staining of the native peripheral nerve revealed abundant nuclei, whereas nuclei were largely absent in the decellularized samples (Figure 3A). Quantification of residual DNA, expressed as ng DNA/mg of dry tissue, demonstrated a substantial reduction in DNA content following decellularization (Figure 3B).

Ultrastructural analysis using scanning electron microscopy (SEM) is presented in Figure 4. The fibrous organization of the extracellular matrix (ECM) remained clearly visible after decellularization, indicating preservation of the native ECM architecture (Figure 4).

Assessment of residual detergent and cytocompatibility is shown in Figure 5. Residual SDC levels were minimal following the washing steps (Figure 5A). Cytotoxicity testing showed no significant cytotoxic response in cultured cells exposed to the decellularized peripheral nerve grafts (Figure 5B).

Figure 1: Schematic workflow for the preparation of decellularized human peripheral nerve grafts. Donated human peripheral nerve segments are first prepared by trimming and segmenting to remove surrounding connective tissue. The nerve segments then undergo delipidization using IPA-based solution exchange (Day 1). Sequential decellularization is performed using NaOH (Day 2) and SDC (Day 3) under continuous solution exchange in a peristaltic pump-driven system. The processed grafts are subsequently packaged and sterilized (Day 4) to obtain decellularized peripheral nerve grafts. Abbreviations: IPA = isopropanol; NaOH = sodium hydroxide; SDC = sodium deoxycholate. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2: Representative images of the peripheral nerve processing workflow. (A) Peristaltic pump-driven solution exchange system used for delipidization, decellularization, and washing. (B) Donated human peripheral nerve before trimming. (C) Peripheral nerve during trimming. (D) Peripheral nerve after trimming and segmenting. (E) Peripheral nerve after completion of the entire decellularization process. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 3: Evaluation of decellularization efficiency. (A) Representative hematoxylin and eosin (H&E)-stained images of native and decellularized human peripheral nerve tissues showing reduced cellular components after decellularization. Scale bars = 100 µm. (B) Quantification of residual DNA content in native and decellularized nerve tissues, expressed as ng DNA/mg of dry tissue. Data are presented as mean ± SD (n = 3). *p < 0.05. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 4: Scanning electron microscopy (SEM) analysis of nerve microarchitecture. Representative SEM images of native (left) and decellularized (right) human peripheral nerve tissues showing preserved extracellular matrix architecture following the decellularization process. Scale bars = 2 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 5: Evaluation of residual detergent and cytotoxicity. (A) Chromatograms of the SDC standard (left) and extracts from decellularized nerve grafts (right) used to assess residual detergent. The red box indicates the region corresponding to the SDC retention time (~3.2 min). (B) Cytotoxicity assessment of extracts from decellularized nerve grafts using L929 fibroblasts following ISO 10993-5 guidelines. Representative images after 48 h incubation show the reagent control, extract from decellularized nerve grafts, negative control, and positive control groups. Scale bars = 50 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Nerve segment length (cm)	IPA treatment (h)	NaOH treatment (h)	SDC treatment (h)
2–3	1.5	6	6
>3–4	2	8	8
>4–5	2.5	10	10

Table 1: Length-specific processing durations for peripheral nerve segments within the range evaluated in this study.

Discussão

Este estudo apresenta um protocolo padronizado de descelularização assistida por alcalino para fabricação de enxertos de nervo periférico humano descelularizados destinados à regeneração do nervo periférico. O protocolo integra o pré-tratamento do nervo do doador, a descelularização química controlada e um sistema de troca de solução movido por bomba peristáltica em um fluxo de trabalho claramente definido, permitindo a remoção eficiente dos componentes celulares e imunogênicos, ao mesmo tempo que preserva a arquitetura nativa da MEC.

Uma característica fundamental deste método é a integração do tratamento alcalino com exposição reduzida a detergentes. Protocolos convencionais baseados em detergentes, como o de Sondell (3% Triton X-100 e 4% SDC) e o método Hudson (sulfobetaina-10, sulfobetaina-16 e Triton X-200), dependem de tratamentos prolongados e em múltiplas etapas com detergentes para alcançar uma descelularização eficaz^9,10. Embora essas abordagens removam eficazmente os componentes celulares, a exposição prolongada a detergentes pode comprometer a integridade da MEC e contribuir para citotoxicidade relacionada a resíduos de detergentes^19,20,21. Em contraste, o presente protocolo incorpora NaOH para potencializar a remoção celular, ao mesmo tempo que limita a exposição ao SDC, reduzindo assim a carga total de detergentes e favorecendo a preservação da arquitetura nativa da MEC.

Outro aspecto crítico deste protocolo é o sistema de troca de solução movido por bomba peristáltica. Diferentemente das abordagens baseadas em perfusão, que podem impor pressão interna sobre o tecido e correr o risco de disruptura estrutural²¹, este sistema permite uma troca contínua e controlada de solução dentro de uma coluna de cromatografia. A eficácia desta abordagem é respaldada por múltiplos resultados analíticos. A análise histológica e a quantificação do DNA residual confirmaram a remoção eficiente dos componentes celulares, enquanto a análise por MEV demonstrou a preservação da arquitetura nativa da MEC. Além disso, os baixos níveis residuais de SDC e os resultados favoráveis de citocompatibilidade corroboram a biocompatibilidade do enxerto resultante. Em conjunto, esses achados sugerem que o protocolo alcança um equilíbrio entre a descelularização eficaz e a preservação estrutural.

Várias etapas técnicas são fundamentais para minimizar a variabilidade do procedimento e manter condições controladas de processamento. Primeiro, o manuseio cuidadoso do segmento nervoso durante o corte, transferência e lavagem é essencial. O tecido nervoso periférico é mecanicamente frágil, e compressão excessiva, dobramento ou tensão podem danificar a estrutura interna e comprometer a preservação da MEC^19,20. Portanto, os tecidos devem ser mantidos úmidos e manipulados com delicadeza durante todo o procedimento. Segundo, a troca uniforme de solução dentro da coluna é um fator determinante do desempenho do processo. As bolhas de ar dentro da coluna devem ser minimizadas, e o tecido deve permanecer totalmente imerso e suspenso na solução, em vez de aderir à parede da coluna ou ao filtro. A adesão do tecido pode resultar em troca desigual de solução, reduzindo a eficiência da lavagem e causando exposição inconsistente aos reagentes de processamento^21,22. Terceiro, o sistema acionado por bomba peristáltica deve operar de forma estável durante todo o procedimento. A circulação contínua é necessária para deslipidificação, descelularização e lavagem; portanto, todas as conexões de tubos devem ser firmemente fixadas para evitar desconexão devido à pressão ou vibração induzida pela bomba. Durante a recuperação da amostra, deve-se evitar o esvaziamento completo da coluna. Manter um volume suficiente de líquido ajuda a prevenir a adesão do tecido e facilita o manuseio delicado durante a coleta.

Segmentos nervosos medindo 2–3 cm foram processados com IPA, NaOH e SDC por 1,5, 6 e 6 h, respectivamente. Segmentos medindo >3–4 cm foram processados por 2, 8 e 8 h, respectivamente, enquanto segmentos medindo >4–5 cm foram processados por 2,5, 10 e 10 h, respectivamente. Assim, as durações do tratamento variaram de 1,5 a 2,5 h para a deslipidização com IPA e de 6 a 10 h para cada etapa de descelularização. Todos os demais parâmetros de processamento, incluindo concentrações de reagentes, volumes de solução e procedimentos de lavagem, foram mantidos consistentes entre os grupos de comprimento. Dependendo da configuração do tubo, a taxa de fluxo foi ajustada dentro da faixa especificada e mantida constante durante cada corrida de processamento. As condições de processamento específicas para cada comprimento são resumidas na Tabela 1. Ajustes com base no diâmetro do nervo, espessura, estrutura fascicular ou composição celular e da matriz não foram avaliados sistematicamente e exigem investigação adicional^23,24. Para aplicações em larga escala, um sistema de bomba peristáltica multicanal pode melhorar a produtividade; entretanto, as condições de fluxo consistentes entre os canais devem ser cuidadosamente verificadas para garantir um processamento uniforme.

Várias considerações permanecem para uma otimização adicional. Embora este protocolo reduza substancialmente a exposição geral ao detergente, o SDC ainda está incluído, e refinamentos futuros podem focar na minimização ou substituição do uso de detergentes, mantendo a eficiência da descelularização e a preservação da MEC^25,26. Além disso, o tecido do nervo periférico é inerentemente difícil de padronizar devido à variação na estrutura fascicular, diâmetro, espessura e composição celular e matricial^23,24. Durante a produção em larga escala, essas diferenças, juntamente com variações na carga tecidual e nas condições de fluxo, podem contribuir para a variabilidade entre lotes. No entanto, a reprodutibilidade entre doadores e entre lotes não foi avaliada sistematicamente no presente estudo. Portanto, será necessário um aprimoramento adicional por meio do uso de tecidos provenientes de múltiplos doadores e de lotes de produção independentes, a fim de estabelecer critérios apropriados de aceitação tecidual, padronizar os processos e garantir a reprodutibilidade entre lotes.

Uma limitação adicional diz respeito ao comprimento do enxerto. O desempenho regenerativo diminui com o aumento do comprimento do enxerto, e essa limitação dependente do comprimento pode ser mais acentuada em enxertos nervosos alogênicos acelulares do que em autograftos^3,27. Como os enxertos nervosos alogênicos acelulares não possuem células de Schwann viáveis residentes, dependem da migração e proliferação de células de Schwann do hospedeiro para sustentar a regeneração axonal²⁷. Saheb-Al-Zamani et al. relataram que a regeneração limitada em enxertos nervosos alogênicos acelulares longos estava associada ao aumento da senescência das células de Schwann²⁷.

No entanto, um estudo in vivo anterior demonstrou que enxertos nervosos humanos descelularizados à base de NaOH promoveram recuperação funcional e estrutural comparável à dos autoenxertos em um defeito de 15 mm do nervo ciático de coelho²⁸. Contreras et al. também demonstraram regeneração axonal e recuperação funcional utilizando um aloenxerto nervoso descelularizado em um defeito de 70 mm do nervo fibular em ovelhas²⁹. Esses estudos apoiam o potencial regenerativo dos enxertos nervosos descelularizados, embora seja necessário avaliar mais amplamente enxertos preparados com o presente protocolo em comprimentos clinicamente relevantes. Os autoenxertos também são limitados pela disponibilidade do nervo doador e exigem um procedimento adicional de coleta, resultando em um segundo sítio cirúrgico e morbidade no local doador⁴. Assim, aloenxertos nervosos acelulares podem representar uma alternativa clinicamente relevante quando não há tecido autólogo suficiente disponível ou quando a coleta do nervo doador é inviável.

Em resumo, este protocolo fornece uma estrutura prática e adaptável para o preparo de enxertos de nervos periféricos descelularizados. A ênfase na redução da exposição a detergentes, na troca controlada de soluções e na padronização do processo apoia tanto aplicações em pesquisa quanto o uso potencial translacional na regeneração de nervos periféricos. Estudos futuros devem focar no aprimoramento de abordagens livres de detergentes, na escalabilidade do sistema e na avaliação abrangente in vivo do desempenho regenerativo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BT100-1L Bomba Peristáltica Multicanal	Bomba Longa	BT100-1L	Utilizada para fornecer circulação contínua e troca de solução durante a delipidificação, descelularização e lavagem.
Coluna de Cromatografia Econo-Column, 2,5 × 10 cm	Bio-Rad	737-2512	Utilizada para acomodar segmentos de nervos periféricos durante a troca contínua de solução.
Álcool isopropílico (IPA)	Daejeong Chemicals	5035-4410	Utilizado para a delipidificação do tecido nervoso periférico.
Tubo de Bomba Peristáltica Masterflex Tygon E-LFL	Thermo Scientific	06440-16	Utilizado para conectar a bomba peristáltica, a coluna cromatográfica e os reservatórios de solução para a circulação contínua de solução.
Desoxicolato de sódio (SDC)	Sigma-Aldrich	30970-100G	Utilizado como detergente na segunda etapa de descelularização para remover componentes celulares residuais.
Hidróxido de sódio, NaOH	Duksan	1636	Para a ruptura celular.