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Artigo de método

Preparação de Enxertos de Nervos Periféricos Humanos Descelularizados Utilizando Hidróxido de Sódio e Deoxicolato de Sódio

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DOI:

10.3791/71578

⸱

1 de setembro de 2026

 ,  ,  , 
1R&D Center, L&C BIO Co., Ltd.

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método padronizado de descelularização assistida por alcalino que combina o tratamento com hidróxido de sódio a um sistema de troca de solução movido por bomba peristáltica para produzir enxertos de nervos periféricos humanos descelularizados com remoção celular eficaz e preservação da arquitetura nativa da matriz extracelular.

Resumo

As lesões dos nervos periféricos frequentemente exigem materiais enxertos que forneçam orientação estrutural para a regeneração axonal. Embora o enxerto nervoso autólogo permaneça o padrão-ouro clínico, seu uso é limitado pela morbidade no local doador e pela disponibilidade restrita de tecido. Essas limitações têm impulsionado o crescente interesse por enxertos de nervos periféricos humanos descelularizados como biomaterial alternativo para a regeneração nervosa. No entanto, os protocolos comuns de descelularização baseados em detergentes podem danificar a arquitetura da matriz extracelular (MEC) e deixar resíduos citotóxicos que podem comprometer a qualidade do enxerto. Neste artigo, descreve-se um protocolo padronizado para o preparo de enxertos de nervos periféricos humanos descelularizados utilizando uma abordagem de descelularização assistida por alcalino. O procedimento inicia-se com o tratamento por hidróxido de sódio (NaOH) para promover a disruptura celular eficiente, seguido por uma etapa suave com desoxicolanato de sódio (SDC), que remove os componentes celulares e imunogênicos remanescentes, preservando a organização nativa da MEC. Essa estratégia limita a exposição ao detergente, ao mesmo tempo que favorece a preservação da arquitetura nativa da MEC. O fluxo de trabalho inclui o preparo do nervo doador, tratamento controlado com NaOH, subsequente tratamento suave com SDC e lavagens extensivas sob troca contínua de solução, utilizando um sistema acionado por bomba peristáltica para facilitar a remoção de agentes residuais do processamento. São implementadas etapas adicionais de pós-processamento para manter a integridade estrutural e preparar os enxertos para embalagem final e esterilização. A eficiência da descelularização é avaliada por meio de análise histológica e quantificação do DNA residual, e a preservação da estrutura da MEC é examinada utilizando microscopia eletrônica de varredura. A ausência de resíduos de SDC e a biocompatibilidade dos enxertos processados foram confirmadas por testes de citotoxicidade. Este protocolo fornece uma abordagem prática para a produção de enxertos de nervos periféricos humanos descelularizados para pesquisas sobre regeneração nervosa periférica e aplicações translacionais.

Introdução

Lesões nos nervos periféricos podem levar a um comprometimento funcional grave e continuam sendo um desafio clínico significativo na medicina regenerativa e na cirurgia reconstrutiva. A regeneração de defeitos nervosos segmentares exige materiais de enxerto que não apenas preencham a lacuna da lesão, mas também forneçam orientação estrutural e sinais bioquímicos para apoiar a regeneração axonal e a reinervação. O enxerto nervoso autólogo é amplamente considerado o padrão-ouro clínico, pois preserva a arquitetura da matriz extracelular (ECM) nativa e fornece um microambiente favorável à regeneração nervosa1,2. No entanto, seu uso clínico é limitado pela disponibilidade restrita de tecido doador, pela necessidade de procedimentos cirúrgicos adicionais e pela morbidade no local doador3,4. Essas limitações têm impulsionado o desenvolvimento de materiais de enxerto alternativos, particularmente enxertos nervosos periféricos descelularizados que mantêm a arquitetura nativa da ECM enquanto minimizam componentes celulares imunogênicos5,6,7,8.

O desempenho dos enxertos nervosos descelularizados depende fortemente do processo de descelularização. Os métodos convencionais geralmente utilizam reagentes à base de detergentes, como Triton X-100 e desoxicolanato de sódio (SDC), que removem os componentes celulares solubilizando as membranas lipídicas9,10,11. No entanto, a exposição prolongada a esses detergentes pode danificar a microestrutura da matriz extracelular (ECM) e deixar substâncias citotóxicas residuais que afetam negativamente a viabilidade celular e os resultados regenerativos12,13. Como resultado, estratégias alternativas de descelularização que permitam a remoção eficiente de células preservando a integridade da ECM estão sendo ativamente investigadas14. A descelularização alcalina utilizando hidróxido de sódio (NaOH) surgiu como uma abordagem alternativa potencial, pois condições extremas de pH podem degradar eficientemente componentes celulares, ácidos nucleicos e lipídios15,16,17. Contudo, a exposição não controlada a condições fortemente alcalinas pode comprometer a integridade da ECM, destacando a importância de condições de processamento rigorosamente controladas16,18.

Aqui, apresenta-se um protocolo padronizado de descelularização assistida por alcalino para enxertos de nervos periféricos humanos, incorporando um sistema contínuo de troca de solução movido por bomba peristáltica. Em comparação com os métodos convencionais de imersão estática, este processo dinâmico permite a troca contínua de solução, facilitando a remoção de detritos celulares e agentes residuais de processamento. Este artigo fornece uma demonstração visual passo a passo de todo o fluxo de trabalho, incluindo o preparo do nervo do doador, descelularização controlada assistida por alcalino e troca contínua de solução utilizando um sistema movido por bomba peristáltica. Os enxertos resultantes foram avaliados por meio de análise histológica, quantificação do DNA residual e microscopia eletrônica de varredura (MEV) para confirmar a eficiência da descelularização e a preservação da ultraestrutura da matriz extracelular (ECM). Ao permitir a visualização clara das etapas técnicas críticas, este artigo fornece um arcabouço bem definido para o preparo de enxertos nervosos descelularizados e para a ampliação futura do processo.

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Protocolo

Nervos periféricos humanos doados foram obtidos de um banco de tecidos dos EUA mediante um acordo exclusivo com a L&C BIO e em conformidade com as regulamentações da American Association of Tissue Banks (AATB) e da U.S. Food and Drug Administration (FDA). As informações sobre os doadores, incluindo idade e sexo, histórico médico e resultados de testes sorológicos, foram fornecidas juntamente com os tecidos e revisadas e aprovadas por um diretor médico certificado. Após o recebimento, todos os tecidos passaram por inspeção inicial, incluindo verificação do rastreamento dos doadores, testes sorológicos e testes para patógenos relevantes; somente os tecidos que atenderam aos critérios pré-definidos de aceitação foram utilizados neste estudo. Todos os procedimentos envolvendo espécimes humanos foram realizados de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque. Como nenhum sujeito humano foi recrutado ou diretamente envolvido neste estudo, um número separado de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (IRB) não foi emitido.

1. Prepare as soluções (Dia 1)

  1. Prepare uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,25 N dissolvendo 10 g de NaOH em 1 L de água destilada sob agitação magnética.
  2. Prepare uma solução de desoxicolato de sódio (SDC) a 4% dissolvendo 40 g de SDC em 1 L de água destilada sob agitação magnética.
  3. Transfira cada solução preparada para frascos de vidro estéreis.
    CAUTION: Manipule o desoxicolato de sódio (SDC) dentro de uma cabine de segurança química. Use equipamento de proteção individual apropriado, incluindo luvas, jaleco de laboratório e proteção ocular, para evitar inalação e contato com a pele.

2. Preparar os segmentos de nervo periférico para descelularização

  1. Desinfete a superfície externa do nervo periférico embalado e abra a embalagem de forma asséptica.
  2. Lave o nervo periférico várias vezes com água destilada estéril.
  3. Remova o tecido adiposo residual, tecido conjuntivo, ramos desnecessários e tecido nervoso danificado utilizando tesoura e pinça estéreis. Lave novamente o nervo periférico com água destilada estéril.
  4. Corte o nervo periférico em segmentos com comprimento de 2–5 cm. Classifique os segmentos preparados em três grupos de comprimento: 2–3 cm, >3–4 cm e >4–5 cm.
    NOTA: Processe cada grupo de comprimento separadamente, pois diferentes durações de tratamento com IPA, NaOH e SDC são aplicadas de acordo com o comprimento dos segmentos nervosos, conforme resumido na Tabela 1.

3. Configure o sistema de bomba peristáltica

  1. Conecte tubos de silicone resistentes a produtos químicos de comprimento suficiente a ambas as extremidades da coluna de cromatografia.
  2. Conecte uma extremidade do tubo à bomba peristáltica.
  3. Conecte as extremidades livres dos tubos a um frasco de vidro de 1 L contendo álcool isopropílico (IPA) utilizando tubos da bomba, a fim de estabelecer um sistema de circulação em circuito fechado.
    NOTA: Fixe firmemente todas as conexões dos tubos, pois a pressão e a vibração da bomba peristáltica podem provocar a desconexão dos tubos da coluna ou do frasco.

4. Deslipidificar o nervo periférico

OBSERVAÇÃO: A menos que indicado em contrário, realize todas as etapas de troca de solução em temperatura ambiente (20–25 °C) usando uma bomba peristáltica ajustada em 90–186 mL/min, dependendo da configuração dos tubos. Mantenha a vazão selecionada constante durante toda a execução de cada processo.

  1. Abra uma extremidade da coluna de cromatografia e preencha parcialmente a coluna com a solução de IPA para garantir que o tecido nervoso permaneça imerso imediatamente após a inserção.
  2. Usando pinças estéreis, segure suavemente o tecido externo em uma extremidade de um único segmento de nervo periférico preparado. Evite comprimir ou segurar diretamente o corpo principal do nervo. Introduza cuidadosamente o segmento nervoso na solução dentro da coluna.
  3. Com as pinças, alinhe suavemente o segmento nervoso e posicione-o longitudinalmente, paralelamente à direção do fluxo do fluido. Certifique-se de que o segmento não esteja dobrado, enrolado ou pressionado contra a parede interna da coluna ou contra o filtro de saída.
  4. Feche a coluna e posicione-a com uma leve inclinação ascendente em direção à saída, com a saída ligeiramente mais elevada que a entrada. Essa orientação ajuda a evitar que o segmento nervoso se deposite contra qualquer um dos filtros nas extremidades, especialmente o filtro de saída.
    NOTA: Processe um único segmento de nervo periférico por coluna por procedimento. Nenhum dispositivo físico adicional de fixação é necessário. A flutuabilidade natural do tecido nervoso e o fluxo relativamente suave do fluido ajudam a manter o segmento em posição suspensa e estendida. Inspeccione a posição do tecido durante o processamento e reposicione-o suavemente com pinças estéreis caso adira à parede da coluna, ao filtro ou a si mesmo.
  5. Conecte a solução de IPA ao sistema de bomba peristáltica. Realize a troca contínua da solução através da coluna por 1,5 h para segmentos nervosos de 2–3 cm, 2 h para segmentos de >3–4 cm ou 2,5 h para segmentos de >4–5 cm.
  6. Drene a solução da coluna.
  7. Adicione 40 mL de água destilada estéril à coluna. Inverta suavemente ou agite a coluna cinco vezes para lavar o nervo periférico.
  8. Repita os passos 4.6 e 4.7 por um total de cinco lavagens.
  9. Conecte um reservatório contendo 5 L de água destilada estéril ao sistema de bomba peristáltica. Realize a troca contínua da solução através da coluna durante a noite.
    PONTO DE PAUSA: Após concluir a lavagem noturna, o procedimento pode ser interrompido. Desligue a bomba peristáltica e armazene o nervo periférico completamente submerso em água destilada estéril a 4 °C por até 24 h antes de prosseguir para o passo 5.1.
    NOTA: Minimize a presença de bolhas de ar dentro da coluna para promover uma troca eficiente da solução. Ajuste o segmento nervoso periférico conforme necessário para mantê-lo suspenso na solução e evitar que adira à parede interna da coluna ou ao filtro.

5. Realize a primeira descelularização (Dia 2)

  1. Conecte a solução de NaOH 0,25 N ao sistema de bomba peristáltica. Realize a troca contínua da solução através da coluna durante 6 h para segmentos nervosos medindo 2–3 cm, 8 h para segmentos medindo >3–4 cm, ou 10 h para segmentos medindo >4–5 cm.
  2. Drene a solução da coluna.
  3. Lave o nervo periférico conforme descrito nas etapas 4.6–4.8.
  4. Conecte um reservatório contendo 5 L de água destilada estéril ao sistema de bomba peristáltica. Realize a troca contínua da solução através da coluna durante a noite.
    PONTO DE PAUSA: Após a conclusão da lavagem noturna, o procedimento pode ser interrompido. Pare a bomba peristáltica e armazene o nervo periférico completamente submerso em água destilada estéril a 4 °C por até 24 h antes de prosseguir para a etapa 6.1.

6. Realize a segunda descelularização (Dia 3)

  1. Conecte a solução de SDC 4% (p/v) ao sistema de bomba peristáltica. Realize a troca contínua da solução através da coluna durante 6 h para segmentos nervosos medindo 2–3 cm, 8 h para segmentos medindo >3–4 cm, ou 10 h para segmentos medindo >4–5 cm.
  2. Drene a solução da coluna.
  3. Lave o nervo periférico conforme descrito nas etapas 4.6–4.8.
  4. Conecte um reservatório contendo 5 L de água destilada estéril ao sistema de bomba peristáltica. Realize a troca contínua da solução através da coluna durante a noite.
    PONTO DE PAUSA: Após a conclusão da lavagem noturna, o procedimento pode ser interrompido. Pare a bomba peristáltica e armazene o nervo periférico completamente submerso em água destilada estéril a 4 °C por até 24 h antes de prosseguir para a etapa 7.1.

7. Esterilize o nervo periférico descelularizado (Dia 4)

  1. Remova um pequeno volume de água destilada da coluna. Retire cuidadosamente o nervo periférico descelularizado, mantendo-o suspenso no líquido remanescente.
  2. Embalage o nervo periférico junto com água destilada estéril.
  3. Esterilize o nervo periférico embalado por irradiação gama com uma dose de 25 kGy.
    NOTA: Não drenar completamente a água destilada da coluna. Mantenha o segmento nervoso suspenso em um volume suficiente do líquido remanescente para evitar que adere à parede interna da coluna e para facilitar o manuseio suave, sem permitir que o líquido transborde.

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Resultados

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing ...

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Discussão

Este estudo apresenta um protocolo padronizado de descelularização assistida por alcalino para fabricação de enxertos de nervo periférico humano descelularizados destinados à regeneração do nervo periférico. O protocolo integra o pré-tratamento do nervo do doador, a descelularização química controlada e um sistema de troca de solução movido por bomba peristáltica em um fluxo de trabalho claramente definido, permitindo a remoção eficiente dos componentes celulares e imunogênicos, ao mesmo tempo que preserva a arquitetura ...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

This work was supported by the Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) grant funded by the Korea Government (MOTIE) (P0011947, Korea-Czech Bilateral Co-funding R&D Projects).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BT100-1L Bomba Peristáltica MulticanalBomba LongaBT100-1LUtilizada para fornecer circulação contínua e troca de solução durante a delipidificação, descelularização e lavagem.
Coluna de Cromatografia Econo-Column, 2,5 × 10 cmBio-Rad737-2512Utilizada para acomodar segmentos de nervos periféricos durante a troca contínua de solução.
Álcool isopropílico (IPA)Daejeong Chemicals5035-4410Utilizado para a delipidificação do tecido nervoso periférico.
Tubo de Bomba Peristáltica Masterflex Tygon E-LFLThermo Scientific06440-16Utilizado para conectar a bomba peristáltica, a coluna cromatográfica e os reservatórios de solução para a circulação contínua de solução.
Desoxicolato de sódio (SDC)Sigma-Aldrich30970-100GUtilizado como detergente na segunda etapa de descelularização para remover componentes celulares residuais.
Hidróxido de sódio, NaOHDuksan1636Para a ruptura celular.

Referências

  1. Kornfeld T, Vogt PM, Radtke C. Nerve grafting for peripheral nerve injuries with extended defect sizes. Wien Med Wochenschr. 2019;169(9):240-251.
  2. Siemionow M, Brzezicki G. Current techniques and concepts in peripheral nerve repair. Int Rev Neurobiol. 2009;87:141-172.
  3. Hoben GM, et al. Increasing nerve autograft length increases senescence and reduces regeneration. Plast Reconstr Surg. 2018;142(4):952-963.
  4. Gaudin R, et al. Approaches to peripheral nerve repair: Generations of biomaterial conduits yielding to replacing autologous nerve grafts in craniomaxillofacial surgery. Biomed Res Int. 2016;2016:3856262.
  5. Lans J, et al. A systematic review and meta-analysis of nerve gap repair: Comparative effectiveness of allografts, autografts, and conduits. Plast Reconstr Surg. 2023;151(5):814e-827e.
  6. Huang H, et al. A comparative study of acellular nerve xenografts and allografts in repairing rat facial nerve defects. Mol Med Rep. 2015;12(4):6330-6336.
  7. Rana D, et al. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. J Tissue Eng Regen Med. 2017;11(4):942-965.
  8. Zhang Y, et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2010;31(20):5312-5324.
  9. Sondell M, Lundborg G, Kanje M. Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction. Brain Res. 1998;795(1-2):44-54.
  10. Hudson TW, et al. Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration. Tissue Eng. 2004;10(11-12):1641-1651.
  11. Rinker B, et al. Use of processed nerve allografts to repair nerve injuries greater than 25 mm in the hand. Ann Plast Surg. 2017;78(6 Suppl):S292-S295.
  12. Zvarova B, et al. Residual detergent detection method for nondestructive cytocompatibility evaluation of decellularized whole lung scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 2016;22(5):418-428.
  13. Fox DA, Epstein ML, Bass P. Surfactants selectively ablate enteric neurons of the rat jejunum. J Pharmacol Exp Ther. 1983;227(2):538-544.
  14. Singh G, et al. Impact of various detergent-based immersion and perfusion decellularization strategies on the novel caprine pancreas derived extracellular matrix scaffold. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1253804.
  15. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006;27(19):3675-3683.
  16. Tsuchiya T, et al. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 2014;20(12):1028-1036.
  17. Sengyoku H, et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 2018;14(2):94-106.
  18. Jones EM, Cochrane CA, Percival SL. The effect of pH on the extracellular matrix and biofilms. Adv Wound Care (New Rochelle). 2015;4(7):431-439.
  19. Nieto-Nicolau N, et al. Effective decellularization of human nerve matrix for regenerative medicine with a novel protocol. Cell Tissue Res. 2021;384(1):167-177.
  20. Philips C, et al. Qualitative and quantitative evaluation of a novel detergent-based method for decellularization of peripheral nerves. Ann Biomed Eng. 2018;46(11):1921-1937.
  21. Wüthrich T, et al. Development of vascularized nerve scaffold using perfusion-decellularization and recellularization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;117:111311.
  22. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011;32(12):3233-3243.
  23. Hopf A, et al. Optimized decellularization protocol for large peripheral nerve segments: Towards personalized nerve bioengineering. Bioengineering (Basel). 2022;9(9):412.
  24. Penkert G. Anatomy of the peripheral nerve system. In: Focal Peripheral Neuropathies: Imaging, Neurological, and Neurosurgical Approaches. Springer; 2014:3-9.
  25. Vasudevan S, et al. Detergent-free decellularized nerve grafts for long-gap peripheral nerve reconstruction. Plast Reconstr Surg Glob Open. 2014;2(8):e201.
  26. García-García ÓD, et al. Comprehensive ex vivo and in vivo preclinical evaluation of novel chemoenzymatic decellularized peripheral nerve allografts. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1162684.
  27. Saheb-Al-Zamani M, et al. Limited regeneration in long acellular nerve allografts is associated with increased Schwann cell senescence. Exp Neurol. 2013;247:165-177.
  28. Kim S, et al. Enhancing peripheral nerve regeneration through NaOH-based decellularization of human nerve tissue. Bioeng Transl Med. 2025;10(6):e70072.
  29. Contreras E, et al. Repair of long nerve defects with a new decellularized nerve graft in rats and in sheep. Cells. 2022;11(24):4074.

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