Este estudo apresenta estratégias quimiogenéticas e baseadas em luz violeta para permitir um deslocamento de fase circadiano diurno confiável.
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Artigo de método
Induzir deslocamentos de fase circadianos diurnos usando abordagens quimiogenéticas e espectrais
Neste artigo
Resumo
Resumo
Em mamíferos, o deslocamento de fase circadiano durante o dia é limitado pela redução da resposta fótica do núcleo supraquiasmático (NSQ), restringindo a capacidade de manipular experimentalmente o relógio circadiano durante essa fase. Métodos confiáveis para induzir deslocamentos de fase diurnos são, portanto, essenciais para investigar os mecanismos de plasticidade circadiana e arrastamento fótico. Estratégias genéticas e espectrais complementares são descritas para permitir a manipulação robusta e temporalmente precisa do relógio circadiano durante o dia. A primeira abordagem, atualmente limitada a camundongos, emprega uma estratégia quimiogenética envolvendo a entrega intravítrea de Receptores Designers Exclusivamente Ativados por Medicamentos Designers (DREADDs) para ativar seletivamente células ganglionares retinianas intrinsecamente fotossensíveis (ipRGCs). Essa abordagem permite a ativação controlada da via retinohipotalâmica e induz deslocamentos de fase diurnos reprodutíveis, independentemente das condições de iluminação ambiente. A segunda abordagem utiliza estimulação óptica específica para comprimento de onda como alternativa não invasiva. A exposição à luz violeta explora a sensibilidade espectral dos ipRGCs para reduzir o bloqueio de despolarização e promover ativação sustentada, permitindo um reinício de fase confiável durante o dia subjetivo. Esse método é amplamente aplicável a sistemas mamíferos e não requer manipulação genética ou intervenção farmacológica. Protocolos detalhados são fornecidos para preparação experimental, temporização da estimulação, validação de deslocamentos de fase usando atividade locomotriva e avaliação da ativação neuronal via imunohistoquímica c-Fos. Considerações-chave, incluindo o tempo circadiano, parâmetros de estímulo e controles experimentais, são delineadas para facilitar a reprodutibilidade. Juntas, essas abordagens fornecem ferramentas versáteis e experimentalmente manejáveis para induzir deslocamentos de fase circadianos diurnos e permitem a investigação direta dos mecanismos subjacentes à resposta circadiana diurna.
Introdução
O núcleo supraquiasmático (NSQ), o relógio circadiano mestre do cérebro dos mamíferos, coordena ritmos diários essenciais na fisiologia e comportamento, incluindo ciclos sono–vigília e padrões de alimentação. Para manter o alinhamento com o ambiente externo, o SCN recebe entrada fótica direta de células ganglionares retinianas intrinsecamente fotossensíveis (ipRGCs), que transmitem informações de luz retiniana para sincronizar os ritmos circadianos internos com o diasolar 1,2.
Uma característica definidora dos sistemas circadianos em organismos é a resposta dependente de fase: o mesmo estímulo entregue em diferentes momentos circadianos pode produzir efeitos marcadamente distintos. Em mamíferos, a luz noturna induz de forma confiável deslocamentos de fase do relógio SCN, enquanto a exposição durante o dia subjetivo produz pouco ou nenhum reajuste 3,4. Essa aparente insensibilidade diurna tem sido observada consistentemente tanto em preparações in vivo quanto in vitro, onde tentativas de imitar entrada fótica falham em provocar mudanças de fasesignificativas 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 .
A insensibilidade diurna tem sido atribuída, ao menos em parte, à insuficiência do impulso retiniano para ativar mecanismos de reajuste de fase, juntamente com mecanismos de gate circadiano dentro do NSQ. Consistente com essa ideia, os ipRGCs não são uniformemente responsivos sob condições fototópicas; Um subconjunto entra no bloco de despolarização, limitando o potencial de ação sustentado aodisparo 17, 18 e 19. Essa restrição fisiológica pode reduzir a eficácia da estimulação fótica convencional durante o dia. Superar essa limitação permitiria uma interrogação direta da plasticidade dos relógios diurnos, uma fase tradicionalmente considerada refratária ao reajuste fótico.
Duas metodologias complementares são descritas para permitir um deslocamento robusto de fase do relógio circadiano durante o dia subjetivo. A primeira abordagem emprega uma estratégia quimiogenética para ativar seletivamente os ipRGCs, independentemente das condições de iluminação ambiente. Especificamente, camundongosOpn4 Cre/+ recebem injeções intravítreas de um vírus adeno-associado (AAV) que codifica o Receptor Designer Excitatório Exclusivamente Ativado por Medicamentos Designers (DREADD), hM3Dq, de forma dependente de Cre. A administração de clozapina-N-óxido (CNO) no tempo circadiano 4 (CT4) induz disparo semelhante a rajada de ipRGCs, proporcionando ativação sustentada da via retinohipotalâmica19. Os deslocamentos de fase são quantificados usando registros de atividade locomotora, e a ativação molecular dentro do SCN é avaliada pela imunohistoquímica do c-Fos.
A segunda abordagem utiliza estimulação óptica específica para comprimento de onda como uma estratégia não invasiva para uma aplicabilidade mais ampla. Camundongos do tipo selvagem são expostos à luz violeta (385 nm) no tempo circadiano 6 (CT6), durante o meio do dia subjetivo. A luz violeta produz um bloqueio de despolarização reduzido e suporta ativação sustentada de ipRGC em comparação com a luz azul oubranca 19. Os deslocamentos de fase são quantificados conforme descrito acima.
Ambas as abordagens visam aprimorar a sinalização impulsionada por ipRGC para o SCN, superando assim a resposta fótica reduzida característica do dia subjetivo. Juntas, essas metodologias fornecem estratégias robustas e experimentalmente manejáveis para manipular o relógio circadiano durante uma fase tradicionalmente resistente ao reinício fótico.
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Protocolo
Todos os procedimentos com animais foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso Animal do Instituto Nacional de Saúde Mental (NIMH) (ASP-SLCR-01). Todos os esforços foram feitos para minimizar a dor e reduzir o número de animais utilizados. As ferramentas de pesquisa utilizadas estão listadas na Tabela de Materiais.
1. Estratégia quimiogenética
- Injeção intravítrea do vírus adeno-associado em camundongosOpn4 Cre/+
- Limpe e esterilize a fase estereotáxica e todos os instrumentos cirúrgicos utilizando procedimentos de esterilização adequados. Monte o aparelho de injeção e conecte uma agulha capilar de vidro.
- Anestesie o rato usando isoflurano. Ajuste a taxa de fluxo de oxigênio para aproximadamente 1,5 L/min. Ajuste o isoflurano para 3%–5% para indução e reduza para 1–3% para manutenção durante todo o procedimento.
- Verifique a anestesia adequada usando uma pinça no dedo do pé. Considere o animal totalmente anestesiado quando não for observado reflexo de retirada ou sobressalto.
- Coloque o mouse em uma almofada térmica para manter a temperatura corporal durante todo o procedimento.
- Puxe agulhas capilares de vidro. As agulhas eram marcadas a ~1,5 mm da ponta usando um marcador fino sob um estereoscópio para garantir uma entrega consistente de profundidade de penetração.
- Aplique suavemente pressão na pálpebra inferior com uma pinça de ponta romba para protrudir levemente o globo ocular e expor o limbo dorsal. Utilizando uma abordagem dorsal, insira a agulha tangencialmente à superfície do olho e penetre a esclera 0,5–1 mm atrás do limbo, evitando regiões vascularizadas do limbo.
- Insira a agulha na câmara vítrea até a profundidade predeterminada. Retirar levemente para aliviar a pressão intraocular e evitar o bloqueio da ponta da agulha pelo tecido.
- Injetar um volume total de 1,5 μL de solução AAV (2,4 x 1013 GC/ml), administrada em cinco injeções sequenciais de 300 nL cada (na taxa de 50nl/s). Faça uma pausa de 5 segundos entre as injeções para permitir a difusão e minimizar o refluxo. Após a última injeção, espere 30 segundos antes de retirar a agulha lentamente. Repita o mesmo procedimento no olho contralateral usando parâmetros idênticos, tomando cuidado para minimizar traumas e refluxos.
- Administrar cetoprofeno (10 mg/kg, subcutâneo) imediatamente após a cirurgia.
- Permita que os camundongos se recuperem por pelo menos 2 semanas para garantir uma expressão viral adequada antes de transferi-los para a clínica comportamental.
- Atividade de roda e administração do CNO (Figura 1A)
- Ratos domésticos individualmente em gaiolas equipadas com rodas de corrida. Registrar a atividade de execução da roda usando um sistema automatizado de aquisição de dados.
- Camundongos treinados em um ciclo de 12:12 h claro-escuro por 4 a 7 dias. Confirme o arrastamento estável e depois faça a transição dos animais para a escuridão constante (DD).
- Determine o início da atividade usando um software de análise. Defina início da atividade como CT12 em roedores noturnos. Calcule CT4 de acordo.
- No oitavo dia na DD, os camundongos recebem injeções intraperitoneais de CNO (1 mg/kg) ou soro fisiológico na CT4 sob luz vermelha fraca.
- Devolva os animais às gaiolas e mantenha-os sob escuridão constante. Registre a atividade locomotora continuamente por 8 dias.
- Determinar o início da atividade e realizar análises de regressão nos períodos pré e pós-injeção. Calcule os deslocamentos de fase como a diferença entre o início projetado e observado da atividade.
- Imunohistoquímica do SNQ c-Fos após ativação quimiogenética
- Ratos treinados para um ciclo de 12:12 de luz e escuro e soltos em escuridão constante. No segundo dia no DD, administrar o CNO no CT6. Perfunda animais 30 minutos após a injeção.
Nota: CT4 foi usada em experimentos comportamentais para minimizar a possibilidade de efeitos do CNO se estenderem para a noite subjetiva, já que o CNO pode permanecer ativo por várias horas. Em contraste, o CT6 foi usado em experimentos de imunocoloração para avaliar os efeitos agudos do CNO no relógio circadiano, com animais perfundidos 30 minutos após a injeção. - Dissecar o cérebro e aplicar pós-fixação em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 °C. Crioprotege em 30% de sacarose até o tecido afundar. Seção coronal a 40 μm.
- Incubar seções em solução bloqueante, seguida pela incubação primária de anticorpos durante a noite a 4 °C. Lave e incube com anticorpos secundários por 1 hora. Contra-tinga com DAPI e monte seções.
- Adquira imagens usando configurações consistentes no microscópio. Processe imagens usando software de análise. Identificar regiões infectadas por AAV por células mCherry-positivas.
- Ratos treinados para um ciclo de 12:12 de luz e escuro e soltos em escuridão constante. No segundo dia no DD, administrar o CNO no CT6. Perfunda animais 30 minutos após a injeção.
2. Estratégia espectral
- Transfira camundongos do tipo selvagem para a instalação comportamental e os mantenha individualmente em gaiolas equipadas com rodas de corrida, conforme descrito acima. Mantenha os animais sob escuridão constante (DD) para monitorar a atividade circadiana em movimento livre.
- No dia 8 na DD, no tempo circadiano 6 (CT6), retire a gaiola do armário à prova de luz e exponha o camundongo a um pulso de luz de 15 minutos.
- Expor os camundongos a um pulso de luz azul (λmax = 470 nm; 1,8 × 1014–2,2 × 1014 fótons/cm 2/s) ou a um pulso de luz violeta (λmax = 385 nm; 1,45 × 1014–3,3 × 1014 fótons/cm 2/s), com intensidade medida no centro e em todos os quatro cantos da gaiola na altura dos olhos dos animais.
- Para ambas as condições de comprimento de onda, mantenha os camundongos em suas gaiolas caseiras com o topo removido. Posicione as gaiolas diretamente sob uma fonte de luz fixa de modo que o centro do feixe de luz fique alinhado com o centro da gaiola para garantir uma iluminação uniforme.
- Imediatamente devolva as gaiolas à posição original sob escuridão constante após a exposição à luz. Continue gravando a atividade de roda sem interrupções para análise de deslocamento de fase.
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Resultados
CamundongosOpn4 Cre/+ que expressaram AAV-DREADD e receberam soro fisiológico em CT4 não apresentaram um deslocamento de fase significativo na atividade de roda (n = 5; Figura 1B). Em contraste, a administração do CNO no CT4 produziu um atraso significativo de fase no início da atividade (média ± SEM: 5,03 ± 0,48 h; n = 5; Figura 1C, D), demonstrando que a ativação do DREADD nesse tempo circadiano des...
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Discussão
Os resultados demonstram que a ativação de ipRGCs durante o dia subjetivo pode induzir deslocamentos de fase circadianos em camundongos, um período tipicamente caracterizado por sensibilidade reduzida à estimulação fótica. Uma abordagem quimiogenética permitiu a ativação seletiva dos ipRGCs independentemente da luz externa e produziu atrasos robustos de fase no comportamento de roda de roda. Essa ativação também induziu a expressão aguda de c-Fos no NSQ, confirmando a ativação do marcapa...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecimentos
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | Vetor viral dependente de Cre que codifica DREADD excitatório (hM3Dq) fundido a mCherry para ativação seletiva de ipRGC |
| Anti-c-Fos antibody (rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 2250S | Anticorpo primário usado para detectar c-Fos como marcador de ativação neuronal |
| Anti-tdTomato antibody (goat) | LSBio | LS-C340696 | Anticorpo primário usado para detectar expressão do reporter mCherry/tdTomato |
| Blue LED driver | Thorlabs | LEDD1B | Fonte de alimentação para controlar a intensidade e saída do LED azul |
| Blue LED light source | Thorlabs | M470L5 | Fonte LED que emite luz azul (λmax ≈ 470 nm) para estimulação fótica |
| ClockLab software | Actimetrics | Versão 6.0.53 | Software para aquisição e análise de dados de atividade locomotora circadiana |
| Clozapine-N-oxide (CNO) | Sigma-Aldrich | C0832-5MG | Ligando usado para ativar os receptores DREADD hM3Dq in vivo |
| DAPI | Invitrogen | 62248 | Corante nuclear fluorescente para marcação de núcleos celulares |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21432 | Anticorpo secundário fluorescente para detecção de anticorpos primários de cabra |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Anticorpo secundário fluorescente para detecção de anticorpos primários de coelho |
| Fluoromount-G | Invitrogen | 00-4958-02 | Meio de montagem usado para preservar a fluorescência em secções de tecido |
| ImageJ (Fiji) software | NIH | Versão 2.16.0/1.54g | Software de código aberto para processamento de imagem e análise quantitativa |
| Opn4cre Mice | The Jackson Laboratry | RRID:IMSR_JAX:035925 | Camundongos usados para ativação quimiogênica |
| Violet LED driver | Mightex | SLA-1000-2 | Fonte de alimentação para controlar a saída do LED violeta |
| Violet LED light source | Mightex | BLS-LCS-0385-04-22 | Fonte LED que emite luz violeta (λmax ≈ 385 nm) para estimulação específica do comprimento de onda |
| Wild-type mice | The Jackson Laboratry | Jackson strain #101043 | Camundongos usados para o experimento de luz violeta |
Referências
- Hattar S, Liao HW, Takao M, Berson DM, Yau KW. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 2002;295(5557):1065–70.
- Jones JR, Simon T, Lones L, Herzog ED. SCN VIP neurons are essential for normal light-mediated resetting of the circadian system. J Neurosci. 2018;38(37):7986–95.
- Coursey PJ. Daily light sensitivity rhythm in a rodent. Science. 1960;131:33–35.
- Kornhauser JM, Ginty DD, Greenberg ME, Mayo KE, Takahashi JS. Light entrainment and activation of signal transduction pathways in the SCN. Prog Brain Res. 1996;111:133–46.
- Ding JM, Weber ET, Faiman LE, Rea MA, Gillette MU. Resetting the biological clock: mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO. Science. 1994;266(5191):1713.
- Mintz EM, Gillespie CF, Price KM, Albers HE. Activation of NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus produces light-like phase shifts of the circadian clock in vivo. J Neurosci. 1999;19(12):5124–30.
- Shirakawa T, Moore RY. Glutamate shifts the phase of the circadian neuronal firing rhythm in the rat suprachiasmatic nucleus in vitro. Neurosci Lett. 1994;178(1):47–50.
- Shibata S, Watanabe A, Hamada T, Ono M, Watanabe S. N-methyl-D-aspartate induces phase shifts in circadian rhythm of neuronal activity of rat SCN in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1994;267(2):R360–R364.
- Asai M, Yamaguchi S, Isejima H, Jonouchi M, Moriya T, et al. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr Biol. 2001;11(19):1524–27.
- Sladek M, Sumova A. Modulation of NMDA-mediated clock resetting in the suprachiasmatic nuclei of mPer2 (Luc) mouse by endocannabinoids. Front Physiol. 2019;10:361.
- Shibata S, Moore RY. Neuropeptide Y and optic chiasm stimulation affect suprachiasmatic nucleus circadian function in vitro. Brain Res. 1993;615(1):95–100.
- Jones JR, Tackenberg MC, McMahon DG. Manipulating circadian clock neuron firing rate resets molecular circadian rhythms and behavior. Nat Neurosci. 2015;18(3):373–75.
- Kim S, McMahon DG. Light sets the brain’s daily clock by regional quickening and slowing of the molecular clockworks at dawn and dusk. Elife. 2021;10:e70137.
- de Vries MJ, Treep JA, de Pauw ES, Meijer JH. The effects of electrical stimulation of the optic nerves and anterior optic chiasm on the circadian activity rhythm of the Syrian hamster: involvement of excitatory amino acids. Brain Res. 1994;642(1-2):206–12.
- Rusak B, Groos G. Suprachiasmatic stimulation phase shifts rodent circadian rhythms. Science. 1982;215(4538):1407–09.
- Duy PQ, Komal R, Richardson ME, Hahm KS, Fernandez DC, et al. Light has diverse spatiotemporal molecular changes in the mouse suprachiasmatic nucleus. J Biol Rhythms. 2020;35(6):576–87.
- Liu A, Milner ES, Peng YR, Blume HA, Brown MC, et al. Encoding of environmental illumination by primate melanopsin neurons. Science. 2023;379(6630):376–81.
- Milner ES, Do MTH. A population representation of absolute light intensity in the mammalian retina. Cell. 2017;171(4):865–876.e16.
- Komal R, Beier C, Nath A, et al. ipRGC properties prevent light from shifting the SCN clock during daytime. Nature. 2026;650(8103):942–50. .
- Jewett ME, Rimmer DW, Duffy JF, Klerman EB, Kronauer RE, et al. Human circadian pacemaker is sensitive to light throughout subjective day without evidence of transients. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1997;273(5):R1800–R1809.
- Revell VL, Molina TA, Eastman CI. Human phase response curve to intermittent blue light using a commercially available device. J Physiol. 2012;590(19):4859–68.
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Reimpressões e permissões
