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Um Modelo de Camundongos Cardio-Oncológicos de Cardiotoxicidade Induzida por Antraciclina em Camundongos Imunocompetentes com Tumor Mamário

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DOI:

10.3791/71633

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1 de outubro de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM UMR-S 942 MASCOT, Cardiovascular Biomarkers, Pathophysiology, and Therapeutic Strategies - CIRCUS, Paris Cité University, 2Medical and Surgical Intensive Care Unit, University Hospital Avicenne, AP-HP

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Modelos de camundongos clinicamente relevantes de cardiotoxicidade induzida por antraciclinas são escassos. Aqui, propõe-se um modelo que utiliza camundongos imunocompetentes portadores de tumor submetidos a tratamento antineoplásico, simulando os protocolos clínicos de pacientes com câncer.

Resumo

A atualização recente da Sociedade Europeia de Cardiologia sobre modelos pré-clínicos de disfunção cardíaca relacionada à terapia anticâncer destaca a necessidade crítica de modelos mais representativos e translacionais in vivo modelos. Destaca a necessidade de desenvolver modelos que utilizem animais portadores de tumores e com sistema imunológico intacto, incorporando múltiplas linhagens e ambos os sexos, a fim de recapitular com maior precisão a heterogeneidade observada em populações clínicas. Assim, foi estabelecido um modelo clinicamente relevante de cardiotoxicidade induzida por antraciclinas (AIC) em animais portadores de tumor de mama. De acordo com o background genético dos camundongos, células 4T1Luc (200 mil células) ou células PY8119 (200 mil células) foram injetadas, respectivamente, em camundongos Balb/c ou C57Bl/6J, por via subcutânea na glândula mamária inferior de machos e fêmeas. O crescimento tumoral foi monitorado por bioluminescência e palpação. Assim que a massa tumoral foi detectável por palpação, duas semanas após a injeção das células tumorais, os animais receberam tratamento com o antineoplásico Doxorrubicina. A tolerância dos camundongos à Doxorrubicina foi dependente da linhagem. A função cardíaca foi avaliada antes do início do protocolo (valor basal) e semanalmente após, por meio de ultrassonografia cardíaca em camundongos anestesiados com cetamina. A cardiotoxicidade foi definida como uma redução na fração de encurtamento do ventrículo esquerdo de pelo menos 10% em relação ao valor basal, ou um valor absoluto <50% e uma frequência cardíaca >300 BPM. O protocolo foi reprodutível com 99% de sucesso no desenvolvimento do tumor e um >Taxa de sobrevivência de 80% nos camundongos. A cardiotoxicidade foi observada em >90% dos camundongos tratados com tumor e doxorrubicina.

Introdução

A cardio-oncologia tem como objetivo melhorar os desfechos cardiovasculares em pacientes com câncer antes, durante e após a quimioterapia. Modelos pré-clínicos desempenharam um papel fundamental para uma melhor compreensão da interação entre essas duas doenças. Recentemente, um estudo paradigmático observou que camundongos naturalmente predispostos a desenvolver pólipos intestinais espontâneos desenvolveram um maior número desses tumores após um infarto do miocárdio e um período com insuficiência cardíaca (IC), demonstrando o impacto direto de um evento cardiovascular sobre o crescimento tumoral1. Desde então, inúmeros estudos relataram achados consistentes em diversos tipos de tumores e linhagens murinas, frequentemente implicando vias moleculares ou proteínas específicas, reforçando assim o conceito de que a progressão do câncer é precipitada por doenças cardiovasculares (DCVs)2,3,4,5.

Inversamente, o impacto do câncer no risco de desenvolver doenças cardiovasculares tem sido estudado por várias décadas. Dados epidemiológicos mostram que sobreviventes de câncer sofrem mais com doenças cardiovasculares, tanto devido aos fatores de risco compartilhados por essas duas doenças quanto às diversas toxicidades conhecidas dos tratamentos anticâncer 6,7,8,9,10. Estudos pré-clínicos frequentemente utilizaram modelos de caquexia induzida por câncer para identificar alvos específicos que poderiam ser modulados em humanos para melhorar os desfechos cardiovasculares a longo prazo11,12,13,14. No entanto, pode-se argumentar que esses modelos dificilmente refletem uma situação clínica comum, já que os pacientes são frequentemente tratados antes de atingirem essa síndrome avançada de câncer, embora a caquexia global ainda seja suspeitada de contribuir amplamente para a mortalidade geral por câncer15.

Nas primeiras diretrizes de cardio-oncologia da Sociedade Europeia de Cardiologia (ESC), conclui-se que são necessárias mais pesquisas para compreender melhor a relação entre câncer e doenças cardiovasculares16. Mais precisamente, em uma atualização recente do grupo de trabalho da ESC sobre cardio-oncologia, afirmou-se que a pesquisa pré-clínica é de extrema importância para preencher essa lacuna de conhecimento, especialmente com modelos que utilizam animais portadores de tumores17. Além disso, é necessário um melhor paralelo entre estudos pré-clínicos e clínicos, já que a maioria dos estudos clínicos hoje é realizada com tratamentos anticâncer que são pouco estudados em ambientes pré-clínicos18.

Antraciclinas (ACs), como a Doxorrubicina (Dox), são comumente utilizadas na quimioterapia para um grande número de tumores sólidos e hematológicos. Mesmo com terapias mais modernas disponíveis atualmente, sua baixa custo, efeitos colaterais bem documentados e eficácia evidente levarão ao uso contínuo dessas drogas por muitos anos19,20. Uma grande quantidade de evidências sugere que as ACs provocam cardiotoxicidade dependente da dose, observada principalmente como disfunção do ventrículo esquerdo, que é um dos principais fatores limitantes para seu uso clínico atual e frequentemente representa uma preocupação para o cardio-oncologista21,22. Essa literatura provém principalmente de estudos sobre câncer de mama devido à sua alta incidência em humanos, mas estudos clínicos em linfomas, câncer de pulmão e leucemias fornecem observações semelhantes23. Assim, pesquisas pré-clínicas vêm sendo realizadas há várias décadas para compreender os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à cardiotoxicidade induzida por antraciclinas (AIC), demonstrando que estresse oxidativo, dano direto e indireto ao DNA, ferroptose e dano mitocondrial estão comumente envolvidos23,24.

No entanto, há na verdade evidências limitadas sobre como prevenir ou tratar a CIA. Medicamentos comuns para IC foram testados em ensaios clínicos com resultados mistos, e o momento ideal para o uso dos poucos candidatos potenciais tem sido difícil de determinar21,23,25,26,27,28. A dexrazoxana, uma droga moduladora do ferro, mostrou resultados promissores na prevenção da CIA, mas atualmente não é utilizada de forma sistemática21. A administração de ACs em formas diferentes da livre no sangue, por exemplo encapsulados em lipossomos, também demonstrou resultados promissores, mas ainda enfrenta dificuldades para substituir os ACs convencionais, em parte devido ao seu custo21.

Uma explicação para essa situação é a falta de modelos animais clinicamente relevantes para o estudo da CIA17. Em humanos, a Dox é administrada ao longo do tempo por meio de injeções repetidas, e a maior parte da CIA é observada durante o primeiro ano após o tratamento. No entanto, observa-se uma grande variação nos protocolos animais na literatura, conforme mostrado em uma revisão publicada recentemente29. Um exemplo clássico de um modelo de cardiotoxicidade aguda é o de camundongos livres de tumor recebendo uma única injeção de 20 mg/kg de Dox30. Em um modelo típico de cardiotoxicidade crônica, muitos estudos descrevem camundongos livres de tumor recebendo uma injeção semanal de 5 mg/kg de Doxorrubicina, totalizando uma dose cumulativa de 20 mg/kg29,31. Esse modelo de cardiotoxicidade crônica também pode ser observado em animais com tumor na mesma dose de Dox; no entanto, isso permanece muito incomum na literatura29,32.

Para contribuir para a redução dessa lacuna de conhecimento, foi desenvolvido um modelo pragmático e clinicamente relevante de camundongos imunocompetentes portadores de tumor de mama para estudar a CIA, especificamente em camundongos Balb/c portadores de 4T1, e sua robustez foi confirmada em camundongos C57Bl/6J portadores de PY8119, sendo esta última, até onde os autores têm conhecimento, a primeira vez que um modelo cardio-oncológico é criado com um câncer de mama triplo negativo em uma linhagem C57Bl/6J. Foi alcançada uma boa detecção do crescimento tumoral por meio de quantificação de bioluminescência antes do tratamento dos animais com Dox, que demonstrou cardiotoxicidade, e foi implementado um protocolo de coleta de órgãos para estudar o microambiente tumoral concomitantemente ao experimento cardio-oncológico. Além disso, foram observados resultados semelhantes aos descritos na literatura quanto à sensibilidade da linhagem e do sexo. Espera-se que este trabalho contribua para a padronização e aprimoramento de protocolos animais em futuros estudos cardio-oncológicos, já que camundongos C57Bl/6J são altamente valiosos por sua alta taxa de sobrevivência em experimentos de CIA29.

A vantagem do método proposto é o uso da linhagem C57Bl/6J, que é fácil de manipular geneticamente, possui um genoma bem caracterizado, é barata para aquisição e tolera altas doses cumulativas de ACs29,33,34. Se a inativação de um gene for necessária para um estudo específico com ACs, este modelo é muito adequado para esse propósito. Além disso, o uso de um câncer de mama triplo negativo derivado dessa linhagem tem interesse translacional, já que as mulheres com câncer de mama triplo negativo são as pacientes com maior probabilidade de receber ACs e com o pior prognóstico35. O uso deste modelo provavelmente melhorará o conhecimento sobre ICA especificamente para essas pacientes.

A força deste modelo também reside no fato de que os camundongos são pré-condicionados com um tumor, o que pode realmente impactar a remodelação cardiovascular36,37. Além disso, este modelo situa-se entre modelos agudos e crônicos completos de CIA, com a possibilidade de prolongar a duração do monitoramento dos animais devido à sua alta taxa de sobrevivência, o que pode ser de grande valor caso outros ciclos de CA sejam considerados.

No entanto, este modelo provavelmente não é o mais adequado para a caracterização específica do tumor ao final do protocolo, devido à sua abordagem pragmática para a inoculação tumoral. Uma versão adaptada da injeção do tumor deve ser realizada se isso for central para a hipótese científica. Além disso, a injeção de células 4T1 em camundongos Balb/c é um modelo bem estabelecido para uma abordagem mais oncológica, por exemplo, para estudar metástase, o que não é descrito aqui e deve ser levado em consideração se a metástase for essencial para a questão científica38. Este modelo é realizado em camundongos adultos; no entanto, se o objetivo for estudar AIC em um contexto pediátrico, camundongos mais jovens devem ser considerados, para os quais a resposta ao protocolo não foi estudada neste trabalho.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do comitê local de ética em experimentação animal (Lariboisière-Villemin) e aprovados pelo Ministério Francês de Ensino Superior e Pesquisa (MESRI) sob o número de protocolo APAFIS 46086. As regras dos 3R foram consideradas durante o planejamento do protocolo. Camundongos Balb/c e C57Bl/6J foram adquiridos de fornecedores de animais, como Janvier Labs ou Envigo. Para este protocolo, os camundongos tinham entre 10 e 18 semanas de idade na inclusão, correspondendo a adultos jovens, semelhante às mulheres que sofrem de câncer de mama triplo negativo. Os animais foram mantidos em grupos de 2 a 5 indivíduos em um ambiente com ciclos claros/escuros de 12 h, temperatura ambiente entre 20 °C e 24 °C e umidade entre 30% e 70%. Água e alimento foram fornecidos ad libitum. Durante o protocolo, tomou-se o cuidado de seguir critérios humanos pré-definidos antes do início do experimento, conforme descrito na Tabela Suplementar 1. Certifique-se de utilizar um filtro de isoflurano para coletar o gás residual, garantindo a segurança do usuário de isoflurano. Manipule os animais com cuidado, utilizando luvas e óculos protetores em todas as etapas deste protocolo. Todos os materiais perigosos devem seguir as regulamentações locais da instituição; neste caso, todas as amostras contaminadas (sangue, agulhas, frascos contendo dox, etc.) foram descartadas em lixeiras para resíduos biológicos de serviços de saúde. A visão geral do protocolo é apresentada na Figura 1A. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Semana 0: Preparação das células e injeção no animal

OBSERVAÇÃO: Os seguintes passos são descritos para células 4T1Luc e foram idênticos para o uso de células PY8119. No entanto, isso deve ser adaptado para cada linhagem celular, dependendo das recomendações do fabricante. Para otimizar o protocolo, uma pessoa pode realizar o preparo das células, enquanto outra realiza o preparo dos animais.

  1. Quando obtiver um frasco de cultura celular confluente (confluência de 80%–90%), aplique 3 mL de tripsina por 5 min a 37 °C e 5% CO2.
  2. Bata suavemente no frasco para destacar todas as células, evite agregados celulares e ressuspenda-as em meio de cultura celular.
  3. Conte as células utilizando uma câmara de Malassez (ou outra técnica, conforme disponível).
  4. Centrifugue as células a 300 × g por 5 min, depois ressuspenda em volume igual de PBS para injetar 200.000 células em 100 µL.
    NOTA: O número de células foi escolhido após revisão da literatura (ver Tabela Suplementar 2).
  5. Aspire cuidadosamente, usando uma seringa de 26 G, 500 µL da suspensão celular. Para evitar tempo excessivo com a suspensão celular na seringa, recomenda-se encher a seringa com volume menor do que o necessário para 5 animais.
  6. Simultaneamente (se possível), coloque os camundongos em uma câmara de isoflurano e induza rapidamente anestesia com 3% de isoflurano a 1 L/min em ar ambiente. Assim que o animal adormecer, posicione-o em decúbito dorsal com o focinho em um cone contendo isoflurano a 1%.
  7. Aplicar creme removedor de pelos suavemente com um cotonete na parede torácica e abdominal inferior esquerda do animal por 1 min. Remova os pelos e o creme com água, depois seque a pele com um lenço de papel.
  8. Verifique anestesia suficiente com um aperto leve no dedo do pé.
  9. Identifique o mamilo mamário esquerdo superior do abdômen. Segure-o suavemente com pinça e levante-o para cima (ver Figura 1B).
  10. Introduza a agulha da seringa subcutaneamente e insira-a até que a agulha esteja sob a glândula mamária.
  11. Injete 100 µL da suspensão celular. Uma bolha subcutânea deve se formar sob o mamilo (ver Figura 1C). Animais controle devem receber PBS. A randomização pode ser feita usando software de randomização (como o RandoMice, uma ferramenta online gratuita) ou alocando o tratamento aos camundongos em uma proporção pré-definida de 1 para 1 ou 2 para 2 (ou superior).
  12. Remova cuidadosamente a agulha e solte o mamilo segurado pela pinça.
  13. Pese o animal para obter um peso basal para o protocolo.
  14. Deixe o animal acordar em ar ambiente antes de devolvê-lo à sua gaiola.

2. Semana 1: Controle do crescimento tumoral com bioluminescência

OBSERVAÇÃO: Isso pode ser feito em qualquer dia após a injeção para controlar o crescimento. Além disso, pode ser realizado em múltiplos pontos temporais, caso a taxa de crescimento tumoral seja de interesse. No entanto, após 10–14 dias, o sinal pode desaparecer devido à seleção natural de células tumorais durante o crescimento do câncer. Também, o crescimento novamente do pelo não deve ser um problema para a captura adequada de fótons, se o protocolo for realizado corretamente desde o início. Veja Figura 2A,B para resultados representativos da quantificação da bioluminescência nos dias 2, 5, 8 e 11 após a injeção do tumor.

  1. Coloque os animais em uma câmara de isoflurano e induza rapidamente a anestesia com 3% de isoflurano.
  2. Uma vez que os animais estejam adormecidos, injete 10 µL/g de peso corporal de luciferina por via intraperitoneal (IP) usando uma seringa de 26 G. Evite injetar luciferina no lado esquerdo devido à presença do tumor, que às vezes já pode ser palpável após alguns dias.
  3. Posicione os camundongos no captador de fótons em posição supina para otimizar a captação de fótons, já que o tumor está localizado no lado abdominal. Introduza o focinho no cone nasal e reduza o isoflurano para 1%.
    OBSERVAÇÃO: Posicionar corretamente 5 animais em um captador de fótons leva algum tempo; comece a posicioná-los pelo menos 2 min antes do início da aquisição.
  4. Inicie a aquisição da atividade de luminiscência 10 min após a injeção de luciferina e mantenha-a por 5 min (Veja Figura 2A). O modo de aquisição para o equipamento utilizado aqui foi BLI com 89 ms por quadro, tamanho de imagem de 220 mm x 165 mm e tamanho de pixel BVR de 153 µm.
  5. Quando a aquisição estiver concluída, permita que o animal acorde em ar ambiente antes de devolvê-lo à sua gaiola.
  6. Utilize um software de quantificação adaptado para o captador de fótons, seguindo as recomendações do fabricante.

3. Semana 2: Tratamento com doxorrubicina

OBSERVAÇÃO: A avaliação ecocardiográfica deve ser realizada antes do início das injeções de Dox. Portanto, utilize a anestesia induzida após a ecocardiografia para administrar a injeção enquanto o animal está dormindo, a fim de minimizar o estresse provocado pela primeira injeção de Dox. Além disso, a dose cumulativa deve ser adaptada para cada linhagem de camundongo. Neste caso, utilizou-se 16 mg/kg para camundongos Balb/c e 24 mg/kg para C57Bl/6J, com base em dados prévios internos e na literatura29 (ver Figura 3A–C).

  1. Resuspenda e dilua o pó de doxorrubicina com solução salina. A diluição deve ser preparada de modo que 4 mg/kg de Dox corresponda a um volume de 240–360 µL. Assim, sugere-se preparar uma solução a 2 mg/mL e, em seguida, realizar uma diluição 6 vezes com solução salina (concentração final de 0,33 mg/mL).
  2. Duas semanas após a injeção do tumor, certifique-se de que o tumor seja palpável na parte inferior esquerda do abdômen, mas com menos de 1 cm.
  3. Pese o animal para controlar a perda de peso após o tratamento com Dox.
  4. Usando uma seringa de 26 G, injete o volume correspondente para atingir 4 mg/kg por via IP na parte inferior direita do abdômen. Os animais controle devem receber solução salina. A randomização pode ser feita como no passo 1.11.
  5. Repita este procedimento diariamente por 4 dias para atingir uma dose cumulativa de 16 mg/kg (adicione 2 dias para atingir 24 mg/kg em camundongos C57Bl/6J).

4. Semanas 2–5: Monitoramento da cardiotoxicidade

OBSERVAÇÃO: Isso pode ser realizado semanalmente. Avaliações mais frequentes exigirão cautela, pois os animais geralmente são mais vulneráveis durante as semanas 3 e 4 do protocolo, e porque algumas linhagens de camundongos são sensíveis à anestesia geral, o que poderia levar a uma maior mortalidade. A ecocardiografia é realizada sob anestesia com cetamina para otimizar as chances de registrar disfunção cardíaca, já que o isoflurano induz depressão miocárdica, utilizando-se 40 mg/kg para camundongos Balb/c e 80 mg/kg para camundongos C57Bl/6J39. Recomenda-se realizar um ultrassom antes do início da injeção do tumor para quantificar o efeito potencial do crescimento tumoral na função cardíaca antes da quimioterapia ser iniciada.

  1. Pese o animal. Se for observada perda significativa de peso, siga a Tabela Suplementar 1.
  2. Anestesie os animais com injeção IP usando seringa de 26 G de cetamina na dose de 40 mg/kg (camundongos Balb/c) ou 80 mg/kg (camundongos C57Bl/6J) para obter uma anestesia leve.
  3. Coloque o animal sobre uma plataforma aquecida para evitar hipotermia.
  4. Uma vez que o animal esteja adormecido, faça a depilação conforme descrito no passo 1.7 para obter uma região torácica livre de pelos.
  5. Dez minutos após a injeção de cetamina, realize ecocardiografia por no máximo 5 min. Utilize gel ultrassônico pré-aquecido. Dependendo do aparelho utilizado, foque no modo M e/ou realize a quantificação da deformação (strain).
  6. Se o modo M for utilizado, grave cortes mesoventriculares na vista longitudinal parasternal, com batimentos de pelo menos 4 s, pelo menos 3 vezes, para obter uma média representativa da função cardíaca do camundongo (veja Figura 4A,B). Neste caso, a taxa de quadros foi ajustada em 100 quadros/s, a frequência de transmissão em 38,4 MHz com potência de 100%, a frequência de recepção em 96 MHz, a velocidade do som em 1538 m/s e a velocidade de varredura em 1200 Hz.
  7. Após aproximadamente 5 min, o animal estará muito desperto para permitir a ecocardiografia. Devolva-o ao seu viveiro após remover o gel usado para a ultrassonografia.
  8. Quantifique cegamente a função cardíaca39,40. A disfunção relevante neste modelo é definida como 10% abaixo do valor basal e um valor absoluto <50% da fração de encurtamento ventricular esquerdo (FE) enquanto a frequência cardíaca permanece >300 BPM. Se o valor pré-tratamento da FE for muito baixo, considere excluir o animal da análise.
    NOTA: São necessários pelo menos 3 ciclos cardíacos para cada quantificação a partir dos trechos de 4 s, mas mais ciclos podem ser utilizados quando possível. Sempre que possível, utilize o mesmo pesquisador para toda a ecocardiografia e uma pessoa diferente para a quantificação, a fim de cegar a análise. Recomendações sobre controle de qualidade da ecocardiografia foram publicadas em outro lugar40.
  9. Realize análise estatística (veja o passo 6). O teste recomendado para analisar dois grupos ao longo de todo o protocolo é a ANOVA de dois fatores, já que dois fatores estão sendo comparados: tempo e tratamento.
  10. Realize este procedimento semanalmente. A disfunção aparece após apenas 1 semana de tratamento com doxorrubicina.
    NOTA: Se for necessário coletar sangue em algum momento após a Dox, por exemplo, para medir biomarcadores cardíacos, colete o sangue imediatamente após a ecocardiografia para evitar uma nova injeção de anestésico, minimizar o estresse do animal e otimizar o tempo.

5. Semana 5: Procedimento de sacrifício

OBSERVAÇÃO: idealmente, este protocolo de coleta de órgãos deve ser realizado com duas pessoas.

  1. Após a última ecocardiografia na semana 5, readministre aos animais cetamina por via intraperitoneal na dose de 100 mg/kg. Aplique anestesia local com uma gota de tetracaína a 1% no olho que será utilizado para a coleta de sangue.
  2. Utilizando um capilar heparinizado, realize sangria retro-orbitária para coletar o máximo de sangue possível em um tubo com heparina (ou capilar com EDTA em um tubo com EDTA).
  3. Quando não for mais possível obter sangue, realize a fratura cervical conforme protocolos aprovados institucionalmente. Coloque imediatamente o sangue coletado sobre gelo até o processamento, enquanto prossegue com o protocolo de sacrifício conforme descrito no passo 5.5.
  4. Centrifugue o sangue a 2000 x g durante 10 min a 4 °C para separar as células sanguíneas do plasma. Congele rapidamente o tubo de plasma com nitrogênio líquido e armazene a -80 °C até nova análise.
  5. Posicione o animal sobre uma tampa de isopor forrada com papel absorvente e fixe as quatro patas com pinos.
  6. O tumor deve apresentar tamanho significativo (pelo menos 2 cm). Realize a ressecção com margem ampla ao redor do tumor para destacá-lo. A dissecação adicional pode ser realizada após a coleta dos órgãos remanescentes descrita no passo 5.15.
  7. Em área separada, dissecione cuidadosamente o tumor com pequenas tesouras afiadas, segurando-o com pinça. Para aumentar a tensão sem danificar o tumor, fixe a pele excedente na tampa. Isso facilitará a dissecação.
  8. Uma vez bem dissecado, limpe suavemente o tumor com PBS para remover sangue, pelos e outros detritos soltos. Pese o tumor.
  9. Coloque uma peneira de nylon de 22 µm em um tubo de centrífuga de 5 mL, posicione o tumor suavemente sobre ela e mantenha-o sobre gelo até a centrifugação.
  10. Centrifugue o tubo a 100 x g durante 10 min a 4 °C para coletar o fluido intersticial (ver Figura 5A). O volume obtido varia de 1 a 20 µL, geralmente com coloração avermelhada (Figura 5B). Transfira-o para um tubo microcentrífugo de 200 µL e armazene a -80 °C até nova análise.
    NOTA: O restante do tumor pode ser cortado em fragmentos menores, colocado em tubos de armazenamento, congelado rapidamente em nitrogênio líquido e armazenado a –80 °C até nova análise.
  11. Para coletar a medula óssea, corte a pata direita com tesoura, dissecione o fêmur e a tíbia com bisturi e pinça, removendo todo o músculo, tecido conjuntivo e gordura. Corte as epífises em ambas as extremidades dos ossos com bisturi. Coloque os ossos limpos em PBS em placas de cultura de 12 poços enquanto finaliza a coleta de órgãos dos camundongos conforme descrito no passo 5.15.
    NOTA: Detalhes mais completos sobre o isolamento de medula óssea foram publicados em outro lugar41.
  12. Fure o fundo de tubos microcentrífugos de 500 µL com agulha 18 G, coloque os dois ossos dentro dele e posicione o tubo dentro de um tubo centrífugo de 1,5 mL contendo 400 µL de PBS.
  13. Centrifugue os tubos a 10.000 x g durante 1 min a 4 °C. Um pellet celular será visível no fundo do tubo de 1,5 mL; todas essas células são da medula óssea, enquanto o estroma da medula óssea permanece na solução de PBS. Aspire todo o sobrenadante (estroma da medula óssea) para um tubo de armazenamento separado, congele rapidamente o material em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C.
  14. Com tesoura, faça uma incisão transversal abaixo do tórax ao nível do diafragma e corte o esterno ao longo de seu eixo longitudinal para expor os pulmões e o coração.
    NOTA: Se necessário para análises posteriores, pode-se realizar aqui a remoção completa do sangue com solução salina.
  15. Colete todos os órgãos necessários para análises biomoleculares e histológicas. Pese-os e corte-os em fragmentos menores para facilitar análises biomoleculares futuras. Congele imediatamente todos os tubos em nitrogênio líquido assim que o órgão for dividido, e armazene-os a -80 °C.
  16. Para o coração, separe o ápice da parte superior do órgão e posicione-o em moldes plásticos preenchidos com OCT. Após colocá-lo em OCT, imergi-lo em isopentano frio antes de congelar rapidamente com nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C.

6. Análise estatística

OBSERVAÇÃO: Todas as análises estatísticas e gráficos foram realizados utilizando software estatístico e de geração de gráficos e seguem as recomendações do guia estatístico42.

  1. Os dados apresentados estão expressos como média ± erro padrão da média (SEM).
  2. Utilize a mesma escala para todos os gráficos de encurtamento fracional.
  3. Exiba cada unidade experimental individual (camundongo) em todos os gráficos.
  4. Realize o teste de Shapiro-Wilk para avaliar a normalidade das distribuições de cada grupo experimental, com um nível de significância alfa definido em p = 0,05.
  5. Para comparação entre dois grupos, utilize os testes de Welch ou de Mann-Whitney, dependendo da normalidade da distribuição (teste de Welch para distribuições normais em ambos os grupos, teste de Mann-Whitney se um ou ambos os grupos apresentarem distribuições não normais). Escolha as opções bicaudais, com um nível de confiança definido em 95%.
  6. Para comparação entre mais de dois grupos em um ponto temporal específico, novamente, determine se as distribuições dos grupos são normais conforme o passo 6.4. Realize uma análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida da correção de Holm-Sidak para comparações múltiplas, caso a distribuição seja normal.
    NOTA: Se a distribuição não for normal, deve-se realizar o teste de Kruskal-Wallis com correção de Dunn para comparações múltiplas. O limiar alfa global é definido em 0,05 para determinar significância.
  7. Para dados longitudinais, foi utilizado o ANOVA bidirecional com medidas repetidas, seguido da correção de Sidak para comparações múltiplas, para examinar as diferenças entre grupos em um ponto temporal específico. O limiar alfa global é definido em 0,05 para determinar significância.

Resultados

Este protocolo, conforme mostrado em Figura 1A, é um protocolo de 5 semanas que resulta nos seguintes grupos experimentais: camundongos sem tumor e livres de doxiciclina, camundongos sem tumor e tratados com doxiciclina, camundongos com tumor e livres de doxiciclina, e camundongos com tumor e tratados com doxiciclina. Esses grupos podem ser duplicados dependendo se ambos os sexos forem utilizados. As primeiras 2 semanas de crescimento tumoral, antes do início do tratamento com doxiciclina, são suficientes para que o tumor cresça após a injeção de 200.000 células no 4ºth glândula mamária esquerda dos animais (Figura 1B). A confirmação da injeção subcutânea deve ser obtida pela visualização de uma bolha sob a aréola ao injetar suavemente a suspensão de células tumorais (Figura 1C). Tabela 1 resume brevemente os principais parâmetros do protocolo para cada linhagem de camundongo, juntamente com os resultados principais que serão discutidos a seguir.

Figura 2A é uma imagem representativa do sinal de bioluminescência obtido quando um camundongo sem tumor (esquerda) e um camundongo com tumor (direita) são injetados com luciferina, e os fótons são coletados durante 5 min. Essa análise exige tumores que expressem o gene da luciferase para gerar fótons após a injeção de luciferina. No total, 33 camundongos Balb/c injetados com células 4T1Luc foram monitorados por 11 dias por meio de bioluminescência, enquanto 9 controles foram utilizados. Figura 2B confirma que o tumor cresce rapidamente, mas que a intensidade do sinal começa a estabilizar após o dia 8, e parece haver um crescimento inicialmente mais rápido do tumor em fêmeas em comparação com camundongos Balb/c machos, conforme mostrado na Figura 2C. Apenas 1 dos 45 camundongos Balb/c não apresentou tumor após 5 semanas, enquanto todos os camundongos C57Bl/6J tinham tumor após 5 semanas (Figura 2D).

Figura 3A  e Figura 3B demonstram que a redução cumulativa da dose de Dox leva a uma sobrevida melhorada 3 semanas após o início da Dox: enquanto nenhum camundongo Balb/c portador de tumor sobreviveu com 24 mg/kg, 50% sobreviveram com 16 mg/kg. No entanto, camundongos C57Bl/6J portadores de tumor são mais resistentes, mesmo com 24 mg/kg de Dox, já que >80% deles sobrevivem 3 semanas após o início da quimioterapia (Figura 3D). O sexo teve um impacto importante no resultado: fêmeas apresentaram uma sobrevida muito melhor do que machos em camundongos Balb/c (16 das 29 fêmeas sobreviveram em comparação com 3 dos 16 machos). Figura 3C demonstra as diferenças entre os sexos em camundongos Balb/c que receberam 16 mg/kg de Dox (nenhum teste estatístico foi realizado devido ao pequeno número de machos). Em camundongos C57Bl/6J, não houve diferenças estatisticamente significativas na sobrevida entre os dois sexos (ver Figura 3E).

Uma imagem representativa da função cardíaca saudável de camundongo, avaliada por ecocardiografia antes do tratamento com Dox, é mostrada na Figura 4A, e uma de um camundongo com disfunção cardíaca após Dox é mostrada na Figura 4B. A FE quantificada no modo M em 17 camundongos C57Bl/6J portadores de tumor tratados com 24 mg/kg de Dox mostra uma diminuição significativa duas semanas depois (59,3% antes da Dox vs 44,3% após a Dox, p < 0,0001, Figura 4C). Apenas 1 dos 12 camundongos sobreviventes (8%) não atendeu aos critérios pré-definidos de cardiotoxicidade. A frequência cardíaca diminui ligeira, mas significativamente, de 623 BPM antes da Dox para 569 BPM após a Dox (p < 0,05, Figura 4D). Todos os parâmetros quantificados pelo modo M podem ser encontrados na Tabela Suplementar 3.

A confirmação do efeito cardiotoxico da doxorrubicina é obtida por meio de análises macroscópica e microscópica. Figura 6A,B demonstra que o peso absoluto do coração é significativamente reduzido após o tratamento com Dox nos poucos camundongos fêmeos Balb/c portadores de tumor que sobrevivem, mas a normalização do peso cardíaco em relação ao peso corporal total mostra apenas uma tendência. Em um experimento com camundongos C57Bl/6 sem tumor, 24 mg/kg de Dox induziram as alterações esperadas no mRNA cardíaco dos seguintes genes uma semana após o início da Dox: Atrogin e Murf1 aumentaram, favorecendo a atrofia; NQO1 aumentou, indicando estresse oxidativo; e Bax aumentou, indicando uma condição pró-apoptótica (Figura 6C–F).

Figura 5A é uma representação esquemática do protocolo de fluido intersticial tumoral. Uma imagem representativa do fluido coletado é mostrada na Figura 5B: o volume obtido é pequeno.

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Figura 1: Ilustrações representativas do protocolo experimental. (A) Visão esquemática geral do protocolo experimental. Criado com BioRender (número da licença JE29USE7LU). (B) Representação esquemática da inoculação subcutânea de tumor. Criado com BioRender (número da licença SO29JHW7R6). (C) Representação esquemática do implante subcutâneo bem-sucedido de tumor. Criado com BioRender (número da licença SO29JHW7R6). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Imagem de bioluminescência e taxa de implantação tumoral. (A) Imagens representativas de bioluminescência de um camundongo controle (esquerda) e de um camundongo portador de tumor (direita). (B) Sinal de bioluminescência ao longo do tempo (média ± erro padrão da média; análise de variância [ANOVA] bidirecional com medidas repetidas; *P < 0,05). (C) Comparação dos sinais de bioluminescência entre camundongos Balb/c machos e fêmeas (média ± erro padrão da média). (D) Taxas de sucesso na implantação tumoral em ambas as linhagens de camundongos. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Análise de sobrevida de camundongos com tumor. (A) Curva de sobrevida de Kaplan–Meier de camundongos Balb/c tratados com 24 mg/kg de doxorrubicina (Dox). (B) Curva de sobrevida de Kaplan–Meier de camundongos Balb/c tratados com 16 mg/kg de Dox. (C) Curva de sobrevida de Kaplan–Meier comparando camundongos Balb/c machos e fêmeas tratados com 16 mg/kg de Dox. Nenhuma análise estatística foi realizada devido ao número limitado de camundongos machos. (D) Curva de sobrevida de Kaplan–Meier de camundongos C57BL/6J tratados com 24 mg/kg de Dox. (E) Curva de sobrevida de Kaplan–Meier comparando camundongos C57BL/6J machos e fêmeas tratados com 24 mg/kg de Dox (teste log-rank, P = 0,86). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Avaliação ecocardiográfica da cardiotoxicidade induzida por doxorrubicina. (A) Ecocardiograma representativo em modo M de um camundongo saudável. (B) Ecocardiograma representativo em modo M de um camundongo com cardiotoxicidade induzida por doxorrubicina. (C) Encurtamento fracional (FS) em camundongos C57BL/6J antes e 14 dias após o tratamento com doxorrubicina. (D) Frequência cardíaca (HR) em camundongos C57BL/6J antes e 14 dias após o tratamento com doxorrubicina. Os dados são apresentados para n = 17 camundongos. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando o teste t de Welch. *P < 0,05; ****P ≤ 0,0001. Abreviações: FS, encurtamento fracional; HR, frequência cardíaca. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Protocolo de coleta de órgãos. (A) Representação esquemática do protocolo de coleta do fluido intersticial tumoral. Criado com BioRender (licença nº HV29USD91R). (B) Imagem representativa mostrando a coleta do fluido intersticial tumoral durante a amostragem de órgãos. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Cardiotoxicidade induzida por doxorrubicina. (A) Peso cardíaco medido 3 semanas após o início do tratamento com 16 mg/kg de doxorrubicina em camundongos Balb/c com tumor. (B) Peso cardíaco normalizado em relação ao peso corporal total, medido 3 semanas após o início do tratamento com 16 mg/kg de doxorrubicina em camundongos Balb/c com tumor. (C) Expressão de mRNA de Atrogin no miocárdio de camundongos C57BL/6J uma semana após o início do tratamento com 24 mg/kg de doxorrubicina. (D) Expressão de mRNA de Murf1 no miocárdio de camundongos C57BL/6J uma semana após o início do tratamento com 24 mg/kg de doxorrubicina. (E) Expressão de mRNA de NQO1 no miocárdio de camundongos C57BL/6J uma semana após o início do tratamento com 24 mg/kg de doxorrubicina. (F) Expressão de mRNA de BAX no miocárdio de camundongos C57BL/6J uma semana após o início do tratamento com 24 mg/kg de doxorrubicina. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste t de Welch ou o teste U de Mann–Whitney, conforme apropriado com base na distribuição dos dados. ns, P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Linhas de camundongosBalb/cC57Bl/6J
Linhagem celular utilizada4T1LucPY8119
Quantidade de células injetadas200 000200 000
Sexo utilizadoMacho e fêmeaMacho e fêmea
Número de dias de injeção46
Dose diária4 mg/kg4 mg/kg
Dose cumulativa de doxorrubicina16 mg/kg24 mg/kg
Dose de cetamina40 mg/kg80 mg/kg
Incidente de cardiotoxicidade>90%>90%
Taxa de sobrevivência19/4516/19

Tabela 1: Parâmetros principais do protocolo para cada linhagem de camundongo. Comparação das principais variáveis experimentais e concentrações de reagentes utilizadas nos protocolos com camundongos Balb/c e C57BL/6J.

Tabela Suplementar 1: Critérios de bem-estar animal. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Visão geral da literatura sobre protocolos experimentais com 4T1. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3: Parâmetros ecocardiográficos medidos por modo M em 17 camundongos C57BL/6J portadores de tumor tratados com doxorrubicina a 24 mg/kg. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Aqui, foi desenvolvido um modelo de cardiotoxicidade induzida por doxorrubicina em camundongos com tumor de mama, o qual é considerado de grande relevância clínica para estudos futuros em cardio-oncologia. O objetivo foi simular a situação clínica do trajeto de um paciente desde sua chegada ao hospital com um câncer diagnosticado até o tratamento com uma quimioterapia potencialmente cardiotoxica. O protocolo segue um delineamento pragmático e utiliza camundongos imunocompetentes disponíveis mundialmente, permitindo que outras equipes o reproduzam em outros laboratórios. Sua alta taxa de sucesso na implantação tumoral o torna um forte candidato para futuros estudos de toxicidade cardio-oncológica.

As armadilhas comuns neste protocolo incluem a realização de ecocardiografia em camundongos com frequência cardíaca baixa, o que pode resultar em uma fração de encurtamento (FE) artificialmente baixa. Permitir que os camundongos se recuperem dos efeitos cronotrópicos negativos iniciais dos anestésicos antes da avaliação ecocardiográfica ajuda a garantir medidas precisas da FE. Em camundongos Balb/c, pode ser necessário reduzir ainda mais a dose do anestésico se a mortalidade permanecer alta. O mesmo pesquisador deve realizar todas as avaliações ecocardiográficas ao longo do estudo, pois a variabilidade entre observadores pode ser significativa43. Para o implante tumoral, retirar a seringa durante a injeção pode produzir um tumor com formato linear, que pode crescer mais do que tumores gerados por injeção adequada. A injeção na papila mamária correta também é fundamental, pois a colocação na papila abdominal superior pode interferir na avaliação ecocardiográfica nas fases posteriores do desenvolvimento tumoral. Recomenda-se a contagem manual das células na suspensão e a mistura cuidadosa antes da injeção para garantir que cada camundongo receba um número comparável de células, minimizando assim a variação no tamanho do tumor ao final do protocolo. Quando a coleta semanal de sangue for necessária, o volume coletado deve ser cuidadosamente controlado, pois os camundongos tornam-se mais frágeis após o tratamento com doxorrubicina. Recomenda-se um volume máximo total de sangue de 50 µL em cada ponto de coleta, já que volumes maiores podem aumentar a mortalidade durante o protocolo. A frequência e o volume de coleta de sangue também devem estar em conformidade com os requisitos locais de ética animal e as diretrizes do comitê de uso de animais da instituição. A reposição do volume sanguíneo coletado com um volume equivalente de solução salina administrado por via subcutânea pode ajudar a compensar a perda de fluidos após a coleta de sangue.

Para comparar este procedimento com a doxorrubicina, uma revisão publicada recentemente sobre modelos animais de cardiotoxicidade induzida por antraciclinas observou que a maioria dos modelos pré-clínicos (88%) utilizou injeções repetidas de doxorrubicina e avaliações dos resultados (frequentemente por ecocardiografia) várias semanas depois29. A maioria dos artigos relatou o uso da linhagem C57Bl/6J (73,8%), provavelmente devido à sua robustez e baixo custo29. Infelizmente, um número significativo de estudos desconsiderou o impacto de um tumor na biologia do animal antes da injeção de antraciclinas17,29. Apenas 46 dos 736 estudos relataram modelos com tumores, sendo que 12 deles utilizaram a linhagem celular 4T1 (câncer de mama semelhante ao triplo negativo) em camundongos Balb/c, e apenas um foi um modelo de câncer de mama em camundongos C57Bl/6J (mais especificamente câncer de mama semelhante ao positivo para EGFR2)29. Outro estudo utilizou C57Bl/6J com um câncer de mama semelhante ao positivo para EGFR-2, mas não permitiu o crescimento tumoral antes do início da quimioterapia, o que limita o aspecto translacional desse modelo32.

Modelos de xenotransplante utilizando camundongos imunodeficientes permitem o uso de linhagens celulares tumorais humanas, mas carecem de um sistema imunológico funcional, o que limita o estudo dos mecanismos de cardiotoxicidade mediada pelo sistema imunológico e representa uma limitação importante dada a crescente relevância da cardiotoxicidade relacionada a inibidores de pontos de controle imunológico. Modelos de animais grandes estão surgindo na área da cardio-oncologia, mas sempre terão as desvantagens de alto custo e capacidade limitada de engenharia genética44. Sistemas in vitro e baseados em células humanas em 2D/3D (por exemplo, cardiomiócitos derivados de iPSCs humanos, organoides cardíacos) permitem triagem mecanicista e toxicológica de alto rendimento, mas não conseguem recapitular a fisiologia integrada do organismo inteiro (hemodinâmica, regulação neuro-hormonal, comunicação imunológica) capturada por modelos in vivo. Em comparação com essas abordagens, este modelo alogênico, imunocompetente e portador de tumor oferece um contexto clinicamente mais relevante para estudar a interação entre a carga tumoral e a cardiotoxicidade induzida por quimioterapia, ao custo de maior variabilidade biológica, maior mortalidade em algumas linhagens e menor rendimento em comparação com modelos in vitro mais simples ou modelos in vivo sem tumor.

Modelos de cardiotoxicidade sem tumor, usados principalmente até hoje, oferecem alta reprodutibilidade, baixo custo e avaliações mais fáceis por ecocardiografia e sobrevida, mas não capturam os efeitos sistêmicos da carga tumoral, da inflamação associada ao câncer e da caquexia sobre o coração, os quais são cada vez mais reconhecidos como fatores de confusão relevantes na cardiotoxicidade em pacientes17,45. Além disso, o reprogramamento metabólico do coração e, consequentemente, sua função contrátil podem ser alterados por oncometabólitos secretados, como o D-2-hidroxiglutarato ou o succinato14. Portanto, se um modelo cardio-oncológico for criado para análise bioquímica cardíaca utilizando diversas abordagens ômicas (proteômica e metabolômica, por exemplo), a presença do tumor antes da quimioterapia é essencial. Há também algumas evidências de que o tumor por si só pode induzir disfunção cardíaca evidente, embora isso não seja consistente na literatura. Enquanto alguns modelos demonstraram um efeito prejudicial da inoculação tumoral sobre a fração de encurtamento (FS) ou parâmetros de condução elétrica, outros descobriram que a presença do tumor protegeu camundongos da remodelação induzida por constrição aórtica transversa11,13,46. Animais sem tumor também são necessários, dependendo da hipótese preliminar. Eles constituem o único cenário em que o efeito cardiotoxico direto do agente quimioterápico pode ser isolado da influência confundidora do próprio tumor, um pré-requisito essencial para estabelecer causalidade e elucidar mecanismos de ação específicos da droga. Esses animais servirão como controles para o efeito da terapia antineoplásica e sua interação com o tumor na cardiotoxicidade. Sem esse comparador, seria impossível distinguir qual componente do fenótipo cardíaco observado é atribuível à droga, ao tumor ou à sua interação. Essa distinção é crítica não apenas para o entendimento mecanicista, mas também para o desenho racional de estratégias cardioprotetoras. É, portanto, importante reconhecer que cada um desses modelos aborda questões científicas distintas e complementares e que nenhum modelo isoladamente é suficiente para recapitular plenamente a complexidade da cardio-oncologia clínica; o uso combinado ou sequencial de ambos é frequentemente necessário para se chegar a conclusões mecanicistas e translacionais robustas.

Neste protocolo, a cardiotoxicidade foi definida de acordo com as Diretrizes de 2022 da ESC em Cardio-oncologia, que definem disfunção cardíaca relacionada à terapia contra o câncer moderada e assintomática como uma redução da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) de >10% com uma FEVE entre 40% e 49%16. No entanto, a quantificação precisa da FEVE requer um módulo 3D no ultrassom39. Para evitar avaliação incorreta da função cardíaca sistólica e manter um protocolo simples que possa ser implementado em laboratórios que utilizam ultrassons menos recentes, optou-se por utilizar a fração de encurtamento (FE) como marcador de disfunção cardíaca, que é corretamente e facilmente obtida por meio da análise em modo-M em camundongos, com os mesmos critérios estabelecidos pela ESC. Utilizando este protocolo, 90% dos camundongos sobreviventes atendem aos critérios de cardiotoxicidade, tornando-o um forte candidato para futuros estudos translacionais. O efeito cardiotoxico da Dox foi confirmado por meio de avaliação macroscópica (redução do peso cardíaco) em camundongos Balb/c. Nenhum grupo somente com tumor em camundongos C57Bl/6 foi incluído aqui; portanto, nenhuma comparação nesta linhagem está disponível até o momento. Além disso, em camundongos C57Bl/6 sem tumor, a dose de Dox induziu alterações consistentes com a literatura prévia sobre os mecanismos de cardiotoxicidade por antraciclinas: aumento da atrofia, estresse oxidativo e apoptose19,20.

No entanto, variáveis mais modernas utilizadas em pacientes, como a deformação longitudinal global por rastreamento de speckle (GLS), não foram quantificadas aqui por razões técnicas. Se isso for viável localmente, seria de valor agregado quantificar a GLS, já que ela é geralmente considerada mais sensível para detectar danos cardíacos precoces23. Biomarcadores cardíacos circulantes, como a troponina, também podem ser avaliados para melhorar a certeza na detecção de cardiotoxicidade; no entanto, a quantidade de plasma tradicionalmente necessária para essas análises em camundongos pode ser um fator limitante devido ao baixo volume sanguíneo total desses animais. Além disso, a fragilidade desses animais após o tratamento com Dox pode aumentar as taxas de mortalidade durante ou após a coleta de sangue. Um último fator limitante é a sensibilidade desses ensaios para tais biomarcadores, o que muitas vezes pode dificultar a interpretação.

Embora o mesmo experimentador experiente tenha realizado todas as aquisições de ultrassom, observou-se uma alta variação semana a semana nos mesmos camundongos Balb/c, mesmo sem tratamento. Isso pode ser explicado pela sensibilidade da linhagem à anestesia com cetamina47. De fato, inicialmente foram notadas altas taxas de mortalidade durante procedimentos com anestesia, levando a um baixo número de animais que completaram o protocolo, o que resultou na redução da dose de cetamina utilizada de 80 mg/kg para 40 mg/kg em camundongos Balb/c. Ao analisar os gráficos de sobrevida de camundongos Balb/c com Dox, observa-se que parte da mortalidade ocorre no momento da anestesia (ecocardiografia semanal), mas a maioria das mortes acontece na biotério, sem qualquer procedimento ativo, enfatizando que a Dox é o principal fator contribuinte para a mortalidade nesses camundongos. Contudo, é importante considerar a mortalidade relacionada à anestesia ao interpretar gráficos de sobrevida desse modelo, especialmente ao comparar duas ou mais linhagens. Para reduzir o risco de fatalidade associada à anestesia, pode-se realizar ecocardiografia em camundongos conscientes, mas isso exige treinamento e aclimatação prévios antes da inclusão dos animais no protocolo. Em relação à Dox, mesmo em doses reduzidas, quase metade dos camundongos Balb/c não completou o protocolo. Poder-se-ia tentar induzir cardiotoxicidade com doses ainda menores de Dox, correndo o risco de reduzir o número de animais que atendem aos critérios de cardiotoxicidade. Outra estratégia poderia ser permitir mais tempo para recuperação do animal após cada injeção de Dox, o que não foi realizado aqui, mas há evidências na literatura de que isso melhora a sobrevida29.

As observações feitas durante a construção deste modelo, de que camundongos Balb/c são mais sensíveis à Dox do que camundongos C57Bl/6J, e de que fêmeas são mais resistentes à Dox do que machos, estão de acordo com a literatura anterior29. Além disso, os resultados semelhantes e reprodutíveis obtidos em ambas as linhagens de camundongos confirmam ainda mais a robustez deste modelo proposto. Ao atingir doses cumulativas elevadas por meio de doses diárias moderadamente altas em um curto período de tempo, obteve-se altas taxas de cardiotoxicidade com alta sobrevida. A construção de um modelo de câncer de mama (PY8119 é um câncer de mama semelhante ao triplo negativo) em C57Bl/6J será muito útil para estudos futuros, já que esses camundongos representam um dos principais backgrounds genéticos para modelos transgênicos34. A alta taxa de sucesso das inoculações tumorais, que apoia a eficácia do método de injeção escolhido, também é promissora para este modelo. Além disso, a alta tolerância à Dox desses camundongos abre caminho para estudos mais longos com reaplicações de Dox, imitando a situação clínica frequente de câncer secundário ou metástase. Por fim, o protocolo de coleta de órgãos permite a obtenção de todos os órgãos sólidos, tumores e seu fluido intersticial, bem como medula óssea e seu estroma, o que possibilita uma análise muito detalhada do modelo.

Este modelo apresenta algumas limitações. Devido ao seu design pragmático e para evitar cirurgia invasiva, a localização precisa do tumor (ou seja, a glândula mamária correta em vez da gordura subcutânea) não pode ser controlada com exatidão por meio de injeção subcutânea, o que pode ser de grande importância dependendo da questão científica em estudo48. Se for necessária injeção no local exato do câncer, uma cirurgia mais extensa pode ser mais adequada para realizar uma injeção ortotópica, embora isso pareça realmente importante principalmente se for planejada análise bioquímica do tumor, já que volume, latência e incidência apresentam resultados semelhantes independentemente do método de injeção48. Pode-se também argumentar que o uso exclusivo de ACs não está perfeitamente correlacionado com a situação clínica, na qual os pacientes frequentemente recebem regimes combinados, por exemplo, ciclofosfamida ou cisplatina. Isso poderia, de fato, ser o próximo passo no aprimoramento deste protocolo; no entanto, a adaptação da dose para cada quimioterápico utilizado deve ser cuidadosamente realizada. Além disso, uma mortalidade superior a 50% em camundongos Balb/c três semanas após o início do tratamento com Dox permanece muito elevada; a redução da dose poderia melhorar a sobrevida, talvez ao custo de uma cardiotoxicidade menos acentuada. Também no que se refere às doses utilizadas neste modelo, deve-se observar que elas são mais altas do que aquelas comumente usadas em humanos atualmente, o que pode limitar o potencial translacional deste modelo.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses com o manuscrito.

Agradecimentos

Agradecemos à equipe do biotério pela ajuda no monitoramento diário do bem-estar animal. Agradecemos a Léanne Borges, Elias Ait Assa e Clémence Chabaud pela assistência na elaboração do protocolo com animais. Pelo presente das células PY8119, agradecemos à Dra. Julie Helft da Unidade INSERM 932. Agradecimentos especiais ao Dr. Sylvain Provost e seu aluno Mel Gavens pela ajuda com a bioluminescência.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células 4T1LucATCCCRL-2539
Pó de doxorrubicinaCliniscience23214-92-8
EcocardiógrafoVisual SonicsVEVO LT-200
LuciferinaPerkin Elmer E1605
Malha de náilonMerckNY2002500
PhotonImager OptimaBioSpace Lab
Células PY8119Doação da Dra. Julie Helft

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