Protocolo para Avaliação Padronizada da Função Microvascular Sistêmica na Microcirculação Cutânea Humana Usando Imagem de Contraste Speckle a Laser

Summary

Este protocolo descreve um método padronizado e não invasivo para avaliar a função microvascular sistêmica na microcirculação cutânea humana, utilizando imagem de contraste de speckles a laser combinada com iontoforese farmacológica e estímulos fisiológicos para avaliar a reatividade microvascular em ambientes de pesquisa clínica.

Abstract

A imagem de contraste de speckle a laser (LSCI) é uma técnica óptica de alta resolução e não invasiva que permite visualização em tempo real e campo completo da perfusão sanguínea microvascular. Este protocolo apresenta uma metodologia padronizada para avaliar a função microvascular sistêmica na microcirculação cutânea humana usando LSCI. Como as medições obtidas com essa técnica são altamente sensíveis a fatores de confusão ambientais e fisiológicas, o protocolo enfatiza procedimentos rigorosos de padronização para melhorar a reprodutibilidade e a confiabilidade experimental. O protocolo detalha controles ambientais essenciais, incluindo estabilização em temperatura ambiente em 23°C ± 1°C, posicionamento dos participantes, procedimentos de aclimatação e minimização de interferências externas durante a aquisição da imagem. A metodologia integra o LSCI com duas manobras provocativas complementares para avaliar a reatividade microvascular cutânea. A hiperemia reativa pós-oclusiva é usada para avaliar a reatividade microvascular integrada, enquanto desafios farmacológicos impulsionados por iontoforese são usados para avaliar a função endotelial. Especificamente, a acetilcolina é administrada para avaliar a vasodilatação dependente do endotélio, e nitroprusside de sódio é administrado para avaliar a vasodilatação independente do endotélio. Este protocolo visualizado passo a passo tem como objetivo facilitar a adoção de metodologias padronizadas de LSCI em ambientes de pesquisa clínica e translacional. A abordagem foi aplicada com sucesso para identificar comprometimento microvascular em várias condições clínicas, incluindo hipertensão resistente, diabetes e doença arterial coronariana. Ao possibilitar a avaliação reprodutível e não invasiva da reatividade microvascular, essa metodologia oferece uma ferramenta valiosa para investigar a saúde vascular sistêmica, monitorar a progressão da doença e avaliar a eficácia de intervenções voltadas para a microvasculatura.

Introduction

O objetivo principal deste protocolo é fornecer uma metodologia padronizada e reprodutível para avaliar a função microvascular sistêmica e a reatividade usando imagem de contraste a laser (LSCI), combinada com manobras provocativas fisiológicas e farmacológicas. A microcirculação, composta por vasos sanguíneos terminais — arteríolas, capilares e venulas — com diâmetro menor que aproximadamente 100 μm (¹), é o principal local de troca metabólica e um determinante crítico da resistência vascular^{periférica 2}. A disfunção endotelial nesses pequenos vasos frequentemente precede alterações macrovasculares e serve como um biomarcador precoce para doenças cardiovasculares, incluindo hipertensão, diabetes e doença das artérias^coronárias. Importante destacar que, embora a comprometimento microvascular contribua significativamente para danos aos órgãos extremos, ele atua em conjunto com a aterosclerose macrovascular e a inflamação crônica sistêmica dentro de um processo patológico multifatorial. Portanto, a avaliação não invasiva da reatividade microvascular é essencial tanto para o diagnóstico precoce quanto para o monitoramento da eficácia terapêutica na pesquisa^{translacional 4}.

A justificativa para o uso da microcirculação cutânea como substituto para a saúde vascular sistêmica está em sua acessibilidade e em seu papel como janela representativa para a função endotelial^{global 5,6}. Tradicionalmente, a fluxometria Doppler a laser (LDF) tem sido considerada o padrão ouro para avaliação cutânea^{não invasiva 7}. No entanto, a LDF é limitada pela baixa resolução espacial porque fornece medições pontuais, altamente sensíveis à heterogeneidade inerente da perfusão^{cutânea 8}. Em contraste, o LSCI oferece vantagens significativas ao fornecer visualização em tempo real e em campo completo da perfusão tecidular com alta resolução temporal e^{espacial 9}. Ao analisar o padrão de interferência gerado pelo espalhamento da luz a laser, o LSCI permite a avaliação simultânea de múltiplas regiões vasculares sem necessidade de contato físico ou corantes^{exógenos 10,11}.

Na literatura mais ampla, a integração do LSCI com provocações farmacológicas impulsionadas por iontoforese, como acetilcolina (ACh) e nitroprussídeo de sódio (SNP), foi validada como uma abordagem robusta para avaliar vias vasodilatatórias dependentes e independentes de^{endotélio 12,13}. Além disso, a hiperemia reativa pós-oclusiva (PORH) fornece uma avaliação integrada da reatividade microvascular envolvendo mediadores endoteliais, nervos sensoriais neurogênicos e função do músculo liso^{vascular 12}. Apesar de suas vantagens, a alta sensibilidade do LSCI à variabilidade ambiental e fisiológica exige procedimentos rigorosos de padronização. Este protocolo aborda esses desafios detalhando controles ambientais críticos, incluindo estabilização à temperatura ambiente em 23°C ± 1°C e posicionamento padronizado dos participantes, para melhorar a reprodutibilidade intrasujeita e^{intersujeita 10}. Essa metodologia é adequada para pesquisadores clínicos e translacionais que buscam uma abordagem metodologicamente fundamentada e não invasiva para investigar a fisiopatologia microvascular em diversas populações de pacientes.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados de acordo com os padrões éticos do Instituto Nacional de Cardiologia (Ministério da Saúde, Brasil), em conformidade com regulamentos nacionais (Comitê Nacional de Ética para Pesquisa – INAEP – conforme a Lei nº 14.874, maio de 2024) e a Declaração de Helsinque (revisada em 2024).

1. Preparação dos Participantes e Controle Ambiental

1. Estabilizar o ambiente de exame
   1. Estabilize a temperatura da sala de exame (RT; 23°C ± 1°C) usando um termostato dedicado para manter um ambiente térmico estável.
   2. Monitore o RT a cada 10 minutos usando um termômetro digital calibrado (precisão de ±0,1°C).
      NOTA: A função microvascular cutânea é altamente sensível a flutuações de temperatura.
2. Prepare o participante antes da avaliação
   1. Instrua os participantes a abster-se de fumar, consumir cafeína ou álcool e realizar exercícios vigorosos por 24 horas antes da avaliação.
   2. Instrua os participantes a jejuarem por pelo menos 2 horas antes da avaliação, permitindo a ingestão de água.
      NOTA: A abstinência de cafeína e exercícios vigorosos minimizam a interferência externa no tônus vascular cutâneo. A cafeína, como antagonista dos receptores de adenosina, e o exercício, por meio dos efeitos sobre o impulso simpático e termorregulação, podem induzir alterações sustentadas na reatividade microvascular que persistem por várias horas após a exposição ^4,14.
3. Posicione o participante para aquisição de imagem
   1. Posicione o braço não dominante do participante na altura do coração usando almofadas corporais para manter o antebraço em posição horizontal e estável.
   2. Use a superfície ventral do antebraço como local de avaliação.
      NOTA: O antebraço não dominante minimiza a influência da remodelação vascular lateralizada associada às atividades diárias. O antebraço ventral oferece características anatômicas favoráveis para a imagem óptica, incluindo menor densidade de pelos e redução da espessura da pele, minimizando assim artefatos de sinal e melhorando a reprodutibilidade da administração de fármacos iontoforéticos.
4. Permitir estabilização cardiovascular
   1. Mantenha o participante em repouso por pelo menos 20 minutos antes de iniciar os registros microvasculares.
   2. Ressista o participante de falar, mover o membro avaliado ou usar dispositivos eletrônicos durante o período de descanso.
      NOTA: O período de estabilização minimiza as flutuações autonômicas e cardiovasculares antes da aquisição do ponto de partida.
5. Minimizar artefatos de movimento
   1. Coloque o antebraço não dominante do participante sobre um sistema de almofada a vácuo.
   2. Ajuste a almofada para manter a superfície ventral do antebraço em uma posição horizontal estável durante a aquisição da imagem.
6. Prepare a superfície da pele
   1. Selecione áreas de pele sem pelos visíveis para todas as medidas.
   2. Remova os pelos usando um cortador cirúrgico 24 horas antes da avaliação, quando necessário.
      ATENÇÃO: Não use barbeador para depuração de pelos, pois irritações na pele podem interferir nas medições microvasculares.
7. Meça a pressão arterial arterial
   1. Selecione o tamanho do punho de acordo com a circunferência do braço do participante.
   2. Realize três medições consecutivas de pressão arterial usando um dispositivo oscilométrico automático calibrado, com um intervalo de 1 minuto entre as medições.
   3. Descarte a primeira medição e calcule a média das duas últimas medições para determinar a pressão arterial média (MAP), de acordo com as diretrizes cardiovasculares ESC/ESH e AHA.

2. Configuração do Sistema LSCI e Configuração de Software

1. Prepare o sistema LSCI
   1. Ligue o sistema LSCI pelo menos 10 minutos antes da aquisição da imagem para permitir a estabilização da fonte do laser.
   2. Verifique a estabilização do laser usando o indicador de status do software antes de iniciar a gravação.
2. Posicione a cabeça do laser
   1. Posicione a cabeça do laser diretamente acima do antebraço do participante.
   2. Ajuste a cabeça do laser para uma distância exatamente de 15 cm da superfície da pele usando a ferramenta de medição de distância fornecida pelo fabricante (Figura 1A)
      NOTA: Manter uma distância fixa de aquisição garante o foco ótimo da imagem e um campo de visão consistente entre os participantes.
3. Configure o software de aquisição
   1. Inicie o software de aquisição de imagens e crie um novo arquivo de estudo.
   2. Insira as informações demográficas do participante e o MAP previamente calculado.
      NOTA: Inclua instruções detalhadas de operação do software e capturas de tela representativas como material suplementar, quando aplicável.
4. Configure os parâmetros de aquisição
   1. Defina a taxa de amostragem de aquisição para 1 imagem/s (1 Hz).
   2. Ajuste a resolução espacial para aproximadamente 0,1 mm/pixel para a área de aquisição do alvo.
      NOTA: Uma taxa de amostragem de 1 Hz fornece um equilíbrio adequado entre resolução temporal e relação sinal-ruído, ao mesmo tempo em que captura adequadamente a cinética hiperêmica e farmacológica da resposta.
5. Minimizar a interferência da luz ambiente
   1. Realize uma verificação de ruído de fundo ou subtração de quadro escuro de acordo com os requisitos do sistema antes da aquisição da imagem.
   2. Diminua as luzes do ambiente e bloqueie a luz solar externa usando cortinas opacas durante todas as gravações quando a subtração do quadro escuro não estiver disponível.
      NOTA: Iluminação ambiente padronizada minimiza interferências ópticas e melhora a reprodutibilidade do sinal.
6. Defina as regiões de interesse (ROIs)
   1. Crie pelo menos três ROIs circulares de aproximadamente 80^{mm 2} na tela de prévia ao vivo dentro do software de aquisição.
   2. Posicione dois ROIs sobre os sítios de eletrodos de iontoforese e um ROI sobre o local de avaliação do PORH.
   3. Coloque todos os ROIs no antebraço ventral, aproximadamente 5 cm distal da fossa antecubital, evitando veias superficiais visíveis.
      NOTA: Padronizar a área do ROI minimiza a influência da heterogeneidade espacial na perfusão cutânea e reduz artefatos de borda associados às câmaras de entrega de fármacos.
7. Obtenha o registro de perfusão de referência
   1. Registre perfusão cutânea de sangue em repouso continuamente por 5 minutos antes da estimulação vascular.
   2. Monitore o sinal de perfusão em tempo real e confirme a ausência de picos induzidos pelo movimento durante a aquisição basal.
   3. Defina estabilidade de base como uma variação do sinal de perfusão de <10% durante um intervalo contínuo de 2 minutos.
8. Permitir a análise de condutivância vascular cutânea (CVC)
   1. Insira o MAP do participante no software de aquisição.
   2. Ative o cálculo automático do CVC nas configurações do software.
9. Registrar dados de perfusão e condutância
   1. Configure o software para calcular CVC automaticamente, dividindo valores de perfusão em tempo real (APU) pelo MAP.
   2. Registre simultaneamente as unidades brutas de perfusão (PU) e os valores calculados de CVC durante todo o protocolo.
      
      NOTA: Expressar perfusão microvascular como CVC minimiza a influência confusa das flutuações sistêmicas da pressão arterial e permite comparações mais confiáveis entre participantes com diferentes perfis hemodinâmicos.

Figura 1. Configuração experimental para avaliação da perfusão microvascular cutânea usando imagem de contraste de speckles a laser (LSCI) combinada com iontoforese. (A) Configuração experimental representativa usada para avaliação microvascular cutânea usando imagem de contraste de speckles a laser e iontoforese de agentes vasodilatadores. (B) Resposta representativa de perfusão microvascular durante a entrega transdérmica iontoforética de doses cumulativas de acetilcolina (ACh). (C) Imagem representativa da iontoforese ACh. (D) Imagem representativa de um eletrodo de controle contendo veículo. As etiquetas indicam os seguintes componentes: (1) cabeça do imager; (2) eletrodos de administração de fármacos por iontoforese; e (3) eletrodo dispersivo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Iontoforese e Provocação Farmacológica

1. Prepare a pele para a iontoforese
   1. Limpe as áreas selecionadas da pele ventral do antebraço usando uma solução fisiológica sem álcool ou um limpador suave para a pele.
   2. Dê tapas suaves na pele antes de colocar o eletrodo.
      NOTA: Evite estimulação mecânica excessiva durante a preparação da pele, pois a vasodilatação induzida mecanicamente pode interferir nas medições de base.
2. Posicione os eletrodos de administração do medicamento
   1. Fixe dois eletrodos de administração de medicamentos nos locais da pele preparada usando discos adesivos de dois lados (Figura 1A).
   2. Mantenha uma distância entre eletrodos de aproximadamente 5 cm para evitar interferência de corrente elétrica.
3. Prepare a solução ACh
   1. Encha a primeira câmara de eletrodos com 200 μL de uma solução de 2% ACh preparada em soro^14,15% a 0,9^%.
   2. Use o eletrodo ACh para avaliar a vasodilatação dependente de endotélio.
      NOTA: A concentração selecionada do medicamento foi otimizada para induzir uma resposta microvascular robusta dependente de dose, minimizando irritações inespecíficas e artefatos galvânicos.
4. Prepare a solução SNP
   1. Encha a segunda câmara de eletrodos com 200 μL de uma solução SNP a 2% preparada em soro salino a 0,9%.
   2. Use o eletrodo SNP para avaliar a vasodilatação independente do endotélio.
      ATENÇÃO: SNP é sensível à luz. Proteja a solução da exposição à luz usando papel alumínio e utilize a solução dentro de 4 horas após a preparação para manter a estabilidade farmacológica.
      NOTA: A concentração selecionada de SNP facilita a vasodilatação estável do platô enquanto minimiza os efeitos elétricos inespecíficos.
5. Remova bolhas de ar presas
   1. Inspecione as câmaras dos eletrodos em busca de bolhas de ar presas antes da fixação da pele.
   2. Remova as bolhas de ar visíveis batendo suavemente na câmara do eletrodo ou usando uma ponta plástica estéril de seringa.
      NOTA: Bolhas de ar podem obstruir o fluxo de corrente e produzir entrega de medicamentos não homogênea.
6. Posicione o eletrodo de referência
   1. Fixe o eletrodo de referência (neutro) aproximadamente 15 cm proximal aos eletrodos de entrega do medicamento usando gel condutor ou adesivo (Figura 1A).
   2. Confirme o contato estável do eletrodo antes de iniciar a iontoforese.
      NOTA: A separação espacial entre regiões farmacológicas e de avaliação do PORH minimiza interações de confusão e previne a sobreposição do flare do reflexo axônico induzido por ACh com a área de medição do PORH.
7. Conecte o sistema de iontoforese
   1. Conecte todos os eletrodos à unidade de entrega de iontoforese antes da aplicação atual.
   2. Confirme a polaridade do eletrodo antes de iniciar o protocolo (anódico para ACh; cátodo para SNP).
      ATENÇÃO: Polaridade incorreta do eletrodo pode prejudicar a eficiência da administração de medicamentos e alterar as respostas vasculares.
8. Administrar o protocolo atual de iontoforese
   1. Administre seis doses incrementais de corrente de 30, 60, 90, 120, 150 e 180 μA para ambos os agentes farmacológicos.
   2. Aplique cada dose atual por 10 segundos.
      NOTA: O protocolo de corrente incremental permite a construção de uma curva dose-resposta e facilita a avaliação da sensibilidade microvascular e das respostas ao^{platô 11}. A combinação de baixas amplitudes de corrente e intervalos curtos de estimulação minimiza a vasodilatação galvânica inespecífica.
9. Mantenha o intervalo entre as estimulações
   1. Mantenha um intervalo de 60 s entre aplicações consecutivas de corrente.
   2. Monitore o sinal de perfusão durante o período de estabilização entre as doses.
      NOTA: O intervalo selecionado permite a estabilização da resposta microvascular enquanto mantém a administração local do medicamento sem efeitos sistêmicos.
10. Registre a resposta microvascular
    1. Registre o sinal de perfusão microvascular continuamente durante todas as estimulações da iontoforese.
    2. Continue a gravação por pelo menos 10 minutos após a aplicação final da corrente para capturar a resposta máxima do platô. Uma resposta representativa dependente da dose é mostrada na Figura 2A.

Figura 2. Registros representativos da perfusão microvascular cutânea durante iontoforese e hiperemia reativa pós-oclusiva (PORH). (A) Registro representativo do fluxo sanguíneo microvascular cutâneo obtido usando LSCI durante iontoforese de 2% ACh entregue usando correntes anodais crescentes de 30, 60, 90, 120, 150 e 180 μA por intervalos de 10 s separados por 1 min. (B) Registro representativo obtido durante a avaliação do PORH. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Hiperemia Reativa Pós-Oclusiva (PORH)

1. Posicione a manguita de oclusão
   1. Posicione um braço pneumático padrão (largura aproximadamente 12 cm) no braço superior do mesmo membro usado para a gravação LSCI.
   2. Coloque o manguito proximal ao local de avaliação microvascular selecionado.
2. Defina a região de avaliação do PORH
   1. Crie um terceiro ROI no antebraço ventral, adjacente aos sítios dos eletrodos de iontoforese.
   2. Posicione o ROI dentro de uma área de pele livre de tratamento para evitar interferência farmacológica.
      NOTA: Mantenha a separação espacial entre os sítios de estimulação farmacológica e a região de avaliação do PORH para preservar respostas vasculares independentes.
3. Adquirir a gravação de linha de base do PORH
   1. Registro de perfusão cutânea em repouso contínuo por 5 minutos antes da oclusão arterial.
   2. Monitore o sinal de perfusão de base para confirmar a estabilidade do sinal antes da inflação do manguito.
4. Induzir oclusão arterial
   1. Encha rapidamente o braço pneumático em < 5 s usando um insuflador automático ou uma lâmpada de inflação manual.
   2. Aumente a pressão no manguito para 50 mmHg acima da pressão sistólica (SBP) previamente medida pelo participante.
      ATENÇÃO: Confirme a oclusão arterial completa antes de iniciar o período de oclusão, pois a oclusão incompleta pode comprometer a resposta hiperêmica.
5. Mantenha o período de oclusão
   1. Mantenha a oclusão arterial continuamente por exatamente 3 minutos.
   2. Verifique a oclusão completa confirmando que o sinal LSCI diminui para um platô zero biológico (< 10 APU).
      NOTA: O sinal zero biológico reflete o movimento residual das células sanguíneas independentemente do fluxo sanguíneo direcionado, incluindo o movimento browniano.
6. Solte o braço de oclusão
   1. Libere a pressão do manguito instantaneamente usando a válvula de escape rápido.
   2. Permitir a restauração imediata do fluxo sanguíneo para iniciar a resposta hiperêmica reativa.
7. Registre a resposta hiperêmica
   1. Continue a gravação do LSCI por pelo menos 5 minutos após a liberação do punho.
   2. Capture a resposta de pico de perfusão e o retorno subsequente aos níveis de perfusão basais. Uma resposta representativa do PORH é mostrada na Figura 2B.
8. Quantifique a resposta do PORH
   1. Calcule o pico de CVC dentro do software de aquisição de imagem.
   2. Calcule a área sob a curva (AUC) do sinal de resposta hiperêmica usando o software de análise.

5. Extração de Dados e Análise Estatística

1. Abra e verifique os dados registrados
   1. Abra os arquivos de aquisição gravados usando o software de análise de imagem.
   2. Verifique se todos os ROIs predefinidos permanecem corretamente posicionados sobre os respectivos locais de medição.
      NOTA: Reposicionar os ROIs apenas quando artefatos de movimento ou derivação de aquisição comprometem a posição original.
2. Defina os intervalos de análise
   1. Identifique os intervalos de análise específicos nos gráficos de tendência de perfusão e CVC.
   2. Selecione um intervalo contínuo de 60 s imediatamente antes do primeiro estímulo vascular.
   3. Selecione os últimos 30 segundos de cada intervalo de 60 segundos após a estimulação por iontoforese para capturar a resposta microvascular do platô.
      NOTA: Defina estabilidade de base como um coeficiente de variação (CV) < 5% no sinal de perfusão para minimizar a influência das oscilações vasomotoras e artefatos de movimento antes da análise dos dados.
3. Identificar variáveis de resposta PORH
   1. Identifique o sinal biológico zero durante a fase de oclusão arterial do protocolo PORH.
   2. Identifique o valor máximo de CVC imediatamente após a liberação do manguito.
4. Calcule os valores médios dos intervalos
   1. Calcule o valor médio de CVC para cada intervalo de análise pré-definido usando o software de análise de imagem.
   2. Verifique a ausência de artefatos de movimento antes de confirmar os valores finais calculados.
5. Organize os dados extraídos
   1. Exporte ou transcreva manualmente a média bruta de PU e os valores médios de CVC em uma planilha estruturada.
   2. Organize o conjunto de dados de acordo com grupos de estudo e estímulos vasculares, incluindo acetilcolina, nitroprussídeo de sódio e respostas ao PORH.
      NOTA: Mantenha nomes consistentes de arquivos e códigos de identificação de participantes durante o processamento dos dados para minimizar erros de transcrição.
6. Calcule os resultados vasculares secundários
   1. Calcule o aumento percentual a partir dos valores iniciais de perfusão ou CVC para determinar a reatividade vascular.
   2. Calcule o AUC quando necessário para análise de endpoints secundários.
7. Realizar análise estatística
   1. Analise os dados usando um software de análise estatística.
      NOTA: Inclua capturas de tela representativas ou instruções de fluxo de trabalho para análises baseadas em software como material suplementar, quando aplicável.
   2. Avaliar a distribuição dos dados
      1. Avalie a normalidade dos dados usando o teste de Shapiro-Wilk.
      2. Expresse dados normalmente distribuídos como média ± desvio padrão (SD).
      3. Expresse dados não normalmente distribuídos como mediana e intervalo interquartil (IQR).
   3. Compare as respostas microvasculares
      1. Compare conjuntos de dados de dois grupos usando um teste t independente quando as suposições de normalidade forem satisfeitas.
      2. Compare múltiplos grupos usando ANOVA unidirecional seguido pelo teste pós-hoc de Tukey.
   4. Defina critérios de significância estatística
      1. Defina significância estatística como p < 0,05.
      2. Lidar com dados ausentes causados por artefatos de movimento usando exclusão ou exclusão par a par da análise afetada.
         NOTA: Aplique a mesma estratégia de dados faltantes de forma consistente em todos os grupos de estudo para preservar a integridade analítica.

Results

A aplicação bem-sucedida desse protocolo gera uma linha de base estável, seguida de respostas microvasculares claras e distinguíveis a cada estímulo vascular. Em um experimento tecnicamente bem-sucedido, o registro de linha de base demonstra um sinal de perfusão estável com flutuações mínimas, definido como um DS de < 10% do sinal médio. Durante a iontoforese de ACh e SNP, espera-se um aumento gradual da APU, refletindo vasodilatação dependente de dose. Uma resposta bem-sucedida da PORH é caracterizada por uma rápida redução da perfusão para um zero biológico estável durante a oclusão arterial, seguida por um pico hiperêmico agudo imediatamente após a liberação do manguito, normalmente atingindo valores várias vezes acima dos níveis iniciais em sujeitos saudáveis. A Figura 1A ilustra o sistema experimental utilizado para avaliação microvascular cutânea, utilizando LSCI e iontoforese. As Figuras 1B–1D mostram respostas representativas da iontoforese e posicionamento dos eletrodos. A Figura 2A apresenta uma resposta microvascular representativa dependente de dose durante a iontoforese ACh, enquanto a Figura 2B demonstra uma resposta representativa de PORH.

Gravações subótimas ou tecnicamente malsucedidas são comumente caracterizadas por instabilidade de sinal ou artefatos relacionados ao movimento. Picos de alta frequência ou flutuações abruptas na linha de base normalmente indicam movimento dos participantes ou estabilização insuficiente do sistema de suporte de almofada de vácuo. Uma resposta vasodilatatória reduzida ou ausente durante a iontoforese em um participante saudável geralmente indica contato ruim entre eletrodo e pele ou bolhas de ar aprisionadas dentro da câmara do eletrodo, resultando em compromisso na entrega de corrente elétrica. A Figura 3 apresenta um exemplo representativo de uma gravação inaceitável caracterizada por instabilidade de sinal relacionada ao movimento.

Figura 3. Exemplo representativo de um registro inaceitável de perfusão microvascular durante a iontoforese. Registro representativo do fluxo sanguíneo microvascular cutâneo obtido usando LSCI durante a iontoforese ACh, demonstrando instabilidade de sinal e artefatos relacionados ao movimento inadequados para análise quantitativa. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

A falha em alcançar um zero biológico estável durante a fase de oclusão da PORH indica oclusão arterial incompleta, comumente causada por posicionamento incorreto do manguito ou pressão insuficiente de inflação do manguito. Nessas condições, a resposta hiperêmica subsequente torna-se atenuada e inadequada para interpretação confiável.

Protocolos executados com sucesso geram curvas de perfusão reprodutível e CVC. O platô máximo do CVC observado durante a iontoforese SNP reflete a capacidade vasodilatatória total e a integridade estrutural vascular, enquanto a resposta mediada por ACh reflete principalmente a função microvascular dependente do endotelial. A comparação padronizada dessas respostas vasculares permite diferenciar padrões consistentes com função microvascular preservada e comprometida. Parâmetros microvasculares quantitativos representativos obtidos de indivíduos jovens saudáveis e pacientes com hipertensão arterial resistente são apresentados na Tabela 1.

Parâmetro Microvascular	Unidade	Controles Jovens Saudáveis (n = 25)	Pacientes com Hipertensão Arterial Resistente (n = 50)	valor-p
CVC de base	APU/mmHg	0,37 ± 0,13	0,29 ± 0,12	0.01
Pico de CVC induzido por ACh	APU/mmHg	0,67 ± 0,23	0,51 ± 0,19	0.004
CPV de pico induzido por SNPs	APU/mmHg	0,60 ± 0,21	0,41 ± 0,17	0.0003
PORH Peak CVC	APU/mmHg	0,87 ± 0,18	0,60 ± 0,16	< 0,0001

Tabela 1: Parâmetros representativos de reatividade microvascular em jovens saudáveis e pacientes com hipertensão arterial resistente. Os valores são expressos como média ± desvio padrão (DE). Os valores p foram calculados usando um teste t independente para comparações entre grupos. Abreviações: ACh, acetilcolina; SNP, nitroprussídio de sódio; PORH, hiperemia reativa pós-oclusiva; CVC, condutância vascular cutânea; APU, unidades de perfusão arbitrárias. Os dados representam resultados não publicados do laboratório dos autores.

Discussion

A LSCI oferece uma abordagem padronizada e não invasiva para avaliar a função microvascular sistêmica com alta resolução espacial e temporal. Comparado ao LDF, que é limitado a medições de ponto único e altamente sensível à heterogeneidade espacial da perfusão cutânea, o LSCI permite imagens de campo completo e avaliação simultânea de múltiplos ROIs. Essa característica melhora substancialmente a reprodutibilidade da medição e reduz o coeficiente de variação em estudos clínicos microvasculares. Além disso, a natureza sem contato do LSCI minimiza artefatos de pressão local comumente associados a técnicas baseadas em sondas, aumentando sua adequação para avaliações repetidas em ambientes de pesquisa translacional e clínica.

Um componente crítico desse protocolo é a normalização dos dados de perfusão para MAP para calcular CVC. Como a perfusão sanguínea cutânea é fortemente influenciada pela pressão sistêmica de perfusão, a interpretação apenas da APU crua pode levar a confusões significativas, especialmente em populações com perfis hemodinâmicos alterados, como hipertensão ou dislipidemia. Por esse motivo, o protocolo recomenda reportar tanto os valores de PU bruto quanto os valores normalizados de CVC para melhorar a interpretação da função microvascular sob diferentes condições fisiológicas e patológicas. Outro aspecto crítico do protocolo é a estabilização ambiental rigorosa e do participante, incluindo controle da temperatura ambiente, minimização de artefatos de movimento e posicionamento padronizado dos participantes, todos essenciais para alcançar gravações reprodutíveis.

Várias limitações do LSCI também devem ser consideradas. A técnica avalia principalmente a microcirculação cutânea superficial em profundidade de aproximadamente 0,5–1 mm e, portanto, pode não representar totalmente leitos vasculares mais profundos. Além disso, a pigmentação da pele e a interferência da luz ambiente podem afetar a relação sinal-ruído, reforçando a importância dos controles ambientais descritos neste protocolo. Outra limitação é o uso de uma única medição MAP de base para o cálculo do CVC durante todo o procedimento. Embora a pressão arterial sistêmica possa flutuar durante o período de registro de aproximadamente 40 minutos, a inflação repetida do manguito foi intencionalmente evitada porque medições recorrentes de pressão arterial podem induzir ativação simpática e artefatos de movimento que interferem no sinal do speckle do laser. Estudos futuros que integrem monitoramento hemodinâmico contínuo não invasivo podem melhorar ainda mais a interpretação fisiológica das medições de condutância microvascular.

Passos críticos do protocolo incluem estabilização ambiental, controle de movimento, posicionamento de eletrodos e oclusão arterial completa durante a PORH. Registros instáveis de linha de base são comumente causados por movimentos dos participantes ou períodos de descanso insuficientes e podem ser minimizados pela reestabilização do sistema de almofadas a vácuo e pela extensão do período de aclimatação. Respostas iontoforéticas embotadas frequentemente indicam contato inadequado entre eletrodo e pele ou bolhas de ar presas dentro da câmara de entrega; Preenchimento cuidadoso da câmara e reposicionamento dos eletrodos geralmente resolvem essas questões. A falha em atingir zero biológico durante a fase de oclusão do PORH geralmente reflete oclusão arterial incompleta causada por inflação inadequada do manguito ou posicionamento incorreto do manguito. Nessas condições, a resposta hiperêmica resultante torna-se atenuada e inadequada para interpretação confiável.

A integração de provocações fisiológicas e farmacológicas representa uma grande força desse protocolo, pois essas abordagens avaliam aspectos complementares da regulação microvascular. O PORH fornece uma avaliação fisiológica integrada da reatividade microvascular envolvendo os mecanismos dos músculos lisos endoteliais, neurogênicos e vasculares desencadeados por isquemia transitória e tensão^{de cisalhamento 16}. Em contraste, a iontoforese possibilita a avaliação seletiva das vias vasodilatatórias dependentes e independentes de^{endotelial 15}. A ACh avalia a vasodilatação mediada pelo óxido nítrico dependente de endotelial, enquanto o SNP, um doador direto de óxido nítrico, avalia a resposta do músculo liso vascular independentemente da sinalização^{endotelial 15}. A interpretação comparativa dessas respostas permite diferenciar entre comprometimento endotelial funcional e remodelação estrutural microvascular. Essa distinção é particularmente relevante no envelhecimento, hipertensão resistente, diabetes e doenças metabólicas crônicas, onde sinalização endotelial comprometida e rarefação microvascular podem^{coexistir 14,17}.

Em resumo, esse protocolo padronizado de LSCI fornece um método reprodutível e translacionalmente relevante para a avaliação não invasiva da saúde microvascular humana. A combinação da iontoforese farmacológica com testes fisiológicos de isquemia-reperfusão permite a caracterização detalhada da função endotelial e estrutural vascular, minimizando a variabilidade experimental por meio de rigorosa padronização ambiental e hemodinâmica. Dada sua sensibilidade para detectar precocemente disfunção microvascular em diversos distúrbios cardiovasculares e metabólicos, essa abordagem representa uma ferramenta valiosa para pesquisa clínica, monitoramento longitudinal e avaliação terapêutica em medicina vascular translacional.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipamento
Monitor Oscilométrico Automático de BP	Omron Healthcare	HEM-7120	Usado para avaliação da pressão arterial média (MAP) de base (3 medições)
Termômetro Digital Calibrado	Delta OHM	HD2301.0	Precisão & maismn; 0,1° C para monitoramento da temperatura ambiente
Eletrodo dispersivo (Referência)	Perimed AB	PF 384	Grande eletrodo neutro de área de superfície
Eletrodos de Administração de Medicamentos	Perimed AB	PF 383 / LI 611	Câmaras de iontoforese não invasivas (aproximadamente 80 mm²)
Controlador de Energia de Iontoforese	Perimed AB	Sistema de Diagnóstico Microvascular PeriOntal	Controlador de corrente de canal duplo (até 200 & micro; A)
Sistema de Imagem por Contraste de Speckle a Laser (LSCI)	Perimed AB	PeriCam PSI NR	Imageador de perfusão sanguínea de alta resolução
Almofada de vácuo de grau médico	AB Germa	N/A	Usado para posicionamento estável do antebraço na altura do coração
Bomba de vácuo operada manualmente	AB Germa	N/A	Usado para evacuação de almofadas de vácuo
Insuflador Rápido de Braço	D.E. Hokanson, Inc.	Insuflador Rápido de Punho E20	Usado para oclusão arterial padronizada de 3 minutos
Reagentes e Consumíveis
Cloreto de Acetilcolina (ACh)	Sigma-Aldrich	A6625	Vasodilatador dependente de endotélio preparado a 2%
Absorventes de Preparação para Álcool	Becton Dickinson	326895	Absorventes de álcool isopropílico 70% para preparação da pele
Água desionizada	Sigma-Aldrich	38796	Usado para enxágue final de eletrodos
Cloreto de sódio (0,9% de soro)	Fornecedor Local	N/A	Solvente para preparação de medicamentos e limpeza de pele
Nitroprusside de Sódio (SNP)	Sigma-Aldrich	S0501	Vasodilatador independente de endotélio preparado a 2%
Gaze Estéril	Fornecedor Local	N/A	Usado para secar a superfície da pele após a limpeza
Software
Software de Análise de Perfusão	Perimed AB	PIMSoft	Software para aquisição de dados LSCI e análise de ROI
Software de Análise Estatística	GraphPad Software	Prisma 10	Usado para ajuste da curva dose-resposta e cálculo de área sob a curva (AUC)