Indução assistida por laser de Contractura do pescoço da bexiga com Holmúrio:YAG em um modelo de rato

Resumo

Este protocolo demonstra ablação a laser transvesical Ho:YAG para criar um modelo reprodutível em rato da fibrose do pescoço da bexiga, estudando remodelação fibrótica induzida por lesão térmica e intervenções terapêuticas.

Resumo

A contratura do pescoço da bexiga (BNC) é um estreitamento fibrótico da saída urinária e uma complicação desafiadora após a resseção transuretral da próstata (RTUP). Modelos animais existentes frequentemente dependem da ligadura extravesical ou cauterização química, que não reproduzem adequadamente a fibrose causada por lesão térmica que se desenvolve após cirurgia endoscópica e pode apresentar reprodutibilidade limitada. Aqui, descrevemos um modelo de rato de fibrose do pescoço da bexiga induzida pela ablação transvesical do pescoço da bexiga com laser Holmium:YAG (laser Ho:YAG). Após uma pequena laparotomia na linha média inferior e cistotomia, uma fibra laser Ho:YAG de 200 μm é introduzida no lúmen da bexiga sob visualização direta. A energia do laser é entregue em modo de contato em 1,0 J e 10 Hz por 5 s por ponto nas posições 3 e 9 horas do pescoço da bexiga, correspondendo a 50 J por ponto e 100 J por animal. Quatro semanas depois, os animais tratados desenvolvem aumento grosseiro da bexiga, estreitamento do pescoço, espessamento da parede da bexiga e evidências histológicas de remodelação fibrótica, incluindo aumento da deposição de colágeno e aumento da expressão de colágeno dos tipos I e III. Esse protocolo fornece um modelo prático que imita cicatrizes localizadas induzidas por lesões térmicas na saída da bexiga. Como ratos fêmeas são usados e o teste urodinâmico funcional não foi realizado no estudo atual, o modelo é mais adequado para estudar fibrose do pescoço da bexiga e remodelação estrutural, em vez de reproduzir completamente o BNC masculino após cirurgia prostática. O modelo pode ser útil para estudar os mecanismos fibróticos da BNC e para avaliação pré-clínica de intervenções anti-fibróticas ou reconstrutivas.

Introdução

A contratura do pescoço da bexiga (BNC) é um estreitamento fibrótico do pescoço da bexiga que ocorre comumente após procedimentos transuretrais, especialmente a RTUP ^1,2,3. Sua base patológica é a formação excessiva de cicatrizes e a deposição de colágeno após lesão tecidular e cicatrização anormal ^{da ferida 4,5,6}. Como a BNC pode levar a disfunção persistente da micção, intervenções recorrentes e morbidade substancial, é necessário um modelo experimental reprodutível para investigar sua patogênese e^{tratamento 7}.

Vários modelos animais foram usados para estudar obstrução da saída da bexiga ou fibrose periuretral, incluindo a ligadura extravesical da uretra^{próxima 8} e outras abordagens cirúrgicas^{abertas 9}. Embora esses modelos possam induzir obstrução urinária e hipertrofia do detrusor, eles não reproduzem especificamente a lesão térmica localizada que se acredita iniciar a CNB pós-operatória após cirurgia endoscópica. Além disso, o alvo anatômico e o grau de lesão são frequentemente difíceis de padronizar, o que pode aumentar a variabilidade entre animais.

Um modelo ideal relacionado ao BNC deve atender a três critérios: deve atingir o pescoço anatômico da bexiga, reproduzir lesão térmica controlada semelhante à produzida por dispositivos de energia endoscópicos e gerar de forma confiável estreitamento fibrótico com complexidade cirúrgica aceitável. Para atender a essas necessidades, desenvolvemos um protocolo transvesical baseado em laser Ho:YAG em ratos fêmeas. Animais fêmeas foram selecionados para facilitar a exposição cirúrgica e isolar lesão térmica específica do pescoço da bexiga e remodelação fibrótica sem interferência do tecido prostático. Usando visualização intravesical direta, esse método permite a entrega precisa de energia do laser à mucosa e submucosa do pescoço da bexiga, produzindo um estreitamento fibrótico reprodutível da saída da bexiga.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal do Comitê de Ética do Bem-Estar Animal Experimental do Instituto de Medicina Tradicional Chinesa de Pequim (Nº de Aprovação. BJTCM-R-2025-03-02). Os animais eram alojados em condições padrão, com acesso ad libitum a comida e água. No protocolo atual, foram usados um total de 16 ratos, incluindo 8 ratos no grupo controle sem cirurgia e 8 ratos no grupo tratado com laser Ho:YAG. Dois animais do grupo tratado a laser com Ho:YAG morreram após a operação. Nenhum animal adicional foi excluído devido a perfuração, sangramento severo ou falha na indução do modelo.

1. Preparação pré-operatória

1. Prepare meloxicam de grau farmacêutico para analgesia perioperatória (Figura 1A), o sistema de anestesia por inalação de pequenos animais (Figura 1B), o sistema de laser Ho:YAG com fibra de laser de 200 μm (Figura 1C), instrumentos microcirúrgicos estéreis (Figura 1D), 8-0 Suturas trançadas absorvíveis (ácido poliglicólico revestido, PGA) para fechamento de cistotomia, suturas de poliglactina trançada 4-0 para fechamento da pele, soro fisiológico estéril, drapeados estéreis, cotonetes estéreis e lubrificante estéril (Figura 1E).
2. Induzir anestesia com 3%–4% de isoflurano em oxigênio em uma câmara de indução, e manter anestesia com 1,5%–2,5% isoflurano através de um cone nasal durante a cirurgia.
3. Ajuste a concentração de acordo com a frequência respiratória e o protocolo institucional aprovado para animais. Confirme a profundidade anestésica adequada pela ausência do reflexo de pinçar do dedo antes da incisão e reavalie a profundidade da anestesia durante todo o procedimento.
4. Corte o pelo bem do abdômen inferior para que o caimento cubra qualquer pelo restante e evite o contato entre instrumentos e pelos não presos.
5. Desinfete o campo cirúrgico com esfoliações alternadas de povidona-iodo e álcool isopropílico a 70%; Realize três aplicações de cada solução antes de drapear.
6. Coloque o animal em posição deitada sobre uma almofada térmica ajustada a 37 °C e mantenha condições estéreis durante todo o procedimento.
7. Se for necessário preenchimento da bexiga ou identificação intraoperatória do pescoço da bexiga, lubrifique um pequeno cateter ou cânula uretral estéril com lubrificante estéril, insira-o suavemente pelo meato uretral na bexiga e intenha lentamente soro fisiológico estéril. Evite inserção forçada ou enchimento excessivo. Remova ou fixe o cateter conforme a exposição cirúrgica planejada.

2. Exposição da bexiga

1. Faça uma incisão cutânea na linha média inferior de 3–4 cm sob condições estéreis (Figura 2A).
2. Usando pinças de ponta fina e microtesoura, divida o tecido subcutâneo e abra a linha alba para entrar na cavidade peritoneal.
3. Exteriorize suavemente a bexiga urinária com fórceps atraumáticos (Figura 2B).
4. Identifique o pescoço da bexiga como a junção entre a base da bexiga e a uretra proximal.
5. Coloque uma sonda obtusa sob o pescoço da bexiga para fornecer suporte suave e estabilizar a área alvo (Figura 2C).

3. Ablação a laser transvesical Ho:YAG

1. Distenda a bexiga com soro fisiológico estéril até que a parede da bexiga fique moderadamente tensa. Evite a sobredistensão, que pode obscurecer os pontos anatômicos ou aumentar a tensão no local da cistotomia.
2. Crie uma cistotomia longitudinal de 0,5 cm na cúpula anterior da bexiga usando uma microtesoura fina (Figura 2D).
3. Introduza a fibra de laser Ho:YAG preparada de 200 μm através da cistotomia até o lúmen da bexiga.
4. Avance a fibra sob visualização direta até o pescoço da bexiga.
5. Coloque delicadamente a ponta da fibra em contato direto com a mucosa do pescoço da bexiga. Mantenha o modo de contato sem marcação visível do tecido; Certifique-se de que a distância entre a ponta e o tecido seja aproximadamente 0 mm durante toda a entrega de energia.
6. Entregue energia do laser em 1,0 J e 10 Hz por 5 segundos na posição das 9 horas (Figura 3A) e repita na posição das 3 horas (Figura 3B). Essa configuração entrega 50 J por ponto e 100 J por animal, com potência fixa em 10 W para todos os animais.
   NOTA: Uma ablação bem-sucedida é indicada por clareamento uniforme da mucosa e formação de uma cratera rasa de mucosa a submucosa, sem carbonização.
7. Mantenha a fibra estável durante os 5 s de aplicação e evite empurrá-la contra a parede. Evite formação profunda de crateras ou perfurações de espessura total. Não direcione a fibra em direção aos orifícios ureterais ou à uretra distal.
8. Remova a fibra e irrige o lúmen da bexiga com soro estéril para remover detritos e confirmar a hemostasia.
9. Feche a cistotomia com 2–3 8-0 interrompidos pontos entrançados absorvíveis (PGA revestido) de forma estanque.
10. Reabasteça a bexiga com 0,5–1,0 mL de soro fisiológico estéril para confirmar a ausência de vazamento pela linha de fechamento (Figura 3C).
11. Feche a parede abdominal e a pele em camadas (Figura 3D).

4. Cuidados pós-operatórios

1. Mantenha o rato em uma bolsa térmica até que ele se recupere totalmente da anestesia.
2. Administre meloxicam em 1 mg/kg por via subcutânea para analgesia pós-operatória e continue uma vez ao dia por 1–3 dias, ou conforme o protocolo animal aprovado.
3. Monitore o animal diariamente por pelo menos 7 dias em busca de sinais de dor, sofrimento, hematúria, retenção urinária, deiscência da ferida ou infecção.
4. Ofereça suporte de hidratação e alimentos amolecidos conforme necessário durante o período inicial de recuperação.

5. Avaliação da contratura do pescoço da bexiga

1. Deixe os animais se recuperarem por 4 semanas após a cirurgia para permitir a remodelação fibrótica no pescoço da bexiga.
2. No desfecho experimental, eutanasia os animais usando overdose de pentobarbital de sódio (150 mg/kg, intraperitoneal) ou outro método aprovado pelo protocolo institucional animal, e confirme a morte antes da colheita de tecido. Colhe a bexiga, o pescoço e a uretra proximal em bloco.
3. Abra o espécime longitudinalmente e fotografe o pescoço da bexiga para documentar o estreitamento grosseiro.
4. Fixe o tecido em paraformaldeído a 4% a 4 °C por 24 horas, desidrate através de etanol graduado, limpe em xileno, infiltre em parafina e obtenha seções transversais seriadas de 4 μm pela região do pescoço da bexiga.
5. Seções de coloração com hematoxilina e eosina, tricromo de Masson e vermelho picrosirius de acordo com protocolos histológicos padrão ou instruções do fabricante para avaliar estreitamento do lúmen, espessamento da parede do pescoço da bexiga e deposição de colágeno.
6. Para imunohistoquímica, desparafinize seções, realize a recuperação de antígeno, bloqueie a peroxidase endógena e a ligação inespecífica, incube as seções com anticorpos contra o colágeno tipo I e colágeno tipo III, aplique o anticorpo secundário apropriado, se desenvolva com cromógeno e contra-colore com hematoxilina.
   NOTA: Os anticorpos são diluídos conforme as recomendações do fabricante.
7. Quantifique a área do lúmen e a área positiva para colágeno usando o ImageJ/Fiji ou software de análise de imagem equivalente.
   1. Calibre a escala de pixel-micrômetro usando a barra da balança do microscópio, delinee manualmente o lúmen do pescoço da bexiga e a região do tecido de interesse e meça a área do lúmen.
   2. Para a coloração tricromática de Masson, aplique um limiar de cor consistente para identificar pixels azuis positivos para colágeno dentro da região de interesse.
   3. Calcule a fração de área positiva para colágeno como área positiva para colágeno dividida pela área total do tecido.
   4. Realize medições em seções e campos comparáveis de cada animal e analise imagens de forma cega.
      NOTA: A indução bem-sucedida do modelo é apoiada pelo estreitamento grosseiro da saída da bexiga, juntamente com evidências histológicas de fibrose concêntrica e aumento da deposição de colágeno no local da lesão. A taxa de sucesso operacional foi de 6/8 no grupo tratado a laser Ho:YAG, baseada no desenvolvimento do fenótipo macroscópico e histológico esperado.

Resultados

Quatro semanas após a cirurgia, ratos tratados com laser Ho:YAG apresentaram alterações grosseiras e histológicas reprodutíveis consistentes com estreitamento fibrótico do pescoço da bexiga. Neste estudo, o grupo controle sem cirurgia incluiu 8 ratos, e o grupo tratado a laser com Ho:YAG incluiu 8 ratos. 6 de 8 animais tratados desenvolveram o fenótipo esperado; a rotatividade consistiu em 2 mortes pós-operatórias no grupo tratado a laser com Ho:YAG, sem exclusões adicionais. De forma gr...

Discussão

Neste estudo, estabelecemos um modelo de rato de estreitamento fibrótico do pescoço da bexiga usando ablação a laser transvesical Ho:YAG. A principal força desse método é que ele produz lesão térmica controlada no pescoço anatômico da bexiga, seguida de remodelação progressiva fibrótica. Isso difere dos modelos tradicionais de ligadura extravesical, que geram principalmente obstrução por compressão externa em vez da formação intrínseca^{da cicatriz 10}. Como a CNB pó...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Absorbable braided suture (coated PGA), 8-0	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd., Shanghai, China	R831
Anti-collagen I antibody, mouse monoclonal	Proteintech Group, Inc., Wuhan, China	66761-1-Ig
Anti-collagen III antibody, mouse monoclonal	Proteintech Group, Inc., Wuhan, China	68320-1-Ig
Coated Vicryl Plus suture (polyglactin 910), 4-0	Ethicon, Inc. (Johnson & Johnson)	VCP773D	SH 26 mm ½-circle taper needle; violet braided; absorbable; Lot: RLMCJX
Hematoxylin and eosin (HE) staining kit	Servicebio, Wuhan, China	2310005
Holmium-YAG Laser System (LITHO)	Quanta System S.p.A, Italy	https://www.quantasystem.com/laser/litho/	1 J, 10 Hz, 10 W, 200 μm fiber
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody	Boster, Wuhan, China	BA1050
Isoflurane	RWD	2025010601
Masson's trichrome staining kit	Zhuhai Baso Biotechnology Co., Ltd., Zhuhai, Guangdong, China	BA4079B
Meloxicam Injection	Qilu Animal Health, Shandong, China	E135H003
Paraformaldehyde (4%)	Servicebio, Wuhan, China	2510H0070148
Picrosirius red staining kit	Nanjing Senbeijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, Jiangsu, China	20250228
Safety intravenous catheter, 24 G	Guangdong Lily Medical Technology Co., Ltd., Foshan, Guangdong, China	AD4-240827
Small-animal inhalation anesthesia system	RWD Life Science, Shenzhen, China	https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/	Induce with 3%–4% isoflurane in oxygen