Compartilhando Experiências sobre Sobrevivência a Longo Prazo em Um Modelo de Transplante de Fígado de Rato Não Arterializado

Resumo

O objetivo deste protocolo apresentado é compartilhar a experiência cirúrgica otimizada para estabelecer um modelo de transplante de fígado de rato não arterializado, focando especificamente em aprimoramentos técnicos que garantam a sobrevivência animal a longo prazo além de 100 dias.

Resumo

Em transplantes experimentais de fígado, o modelo de ratos é o padrão ouro para investigar a imunologia e os processos metabólicos de transplante; No entanto, reconstruir a artéria hepática extremamente fina (~0,5 mm) apresenta um desafio técnico formidável. Para contornar isso, o modelo simplificado de transplante de fígado de rato não arterializado (NArLT) é amplamente utilizado. Infelizmente, complicações biliares graves — como vazamento biliar e colangite isquêmica — decorrentes da privação arterial frequentemente restringem a sobrevivência a longo prazo dos receptores. Esse obstáculo limita significativamente a pesquisa sobre temas-chave, incluindo imunocompatibilidade hospedeiro-enxerto a longo prazo e rejeição crônica. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para o modelo NArLT que incorpora refinamentos técnicos críticos para superar com sucesso essas lesões biliares isquêmicas. As principais melhorias incluem uma fase anhepática significativamente mais curta, uma técnica de dissecção biliar "no-touch", lavagem completa do trato biliar e um método otimizado de stenting biliar interno. Após a implementação desse procedimento aprimorado, a taxa de sobrevivência dos receptores ultrapassou 94% durante o período de observação de 100 dias. Em última análise, esse protocolo otimizado oferece uma plataforma altamente reprodutível e robusta para investigar os mecanismos subjacentes à tolerância a transplantes de longo prazo, apoiando assim o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas na medicina de transplantes.

Introdução

O modelo de transplante de fígado de rato serve como a plataforma experimental mais amplamente utilizada para pesquisa básica em transplantes. No entanto, sua aplicação mais ampla é frequentemente dificultada por uma curva de aprendizado notoriamente íngreme, que pode dificultar significativamente o progresso dos estudos experimentais^{posteriores 1,2}. Além disso, modelos convencionais de transplante hepático de rato frequentemente apresentam sucesso cirúrgico subótimo e baixas taxas de sobrevivência a longo prazo. Ao otimizar criticamente os procedimentos cirúrgicos, refinar meticulosamente os detalhes cirúrgicos e realizar reconstruções vasculares e biliares sob visualização direta, a curva de aprendizado associada a esse modelo microcirúrgico complexo pode ser substancialmente^{abreviada 3,4}. O transplante de fígado continua sendo a única terapia curativa para doenças hepáticas em estágio terminal, tornando o estabelecimento de modelos de transplante de fígado em ratos profundamente significativo para a pesquisa^{científica 5,6}.

O modelo de transplante hepático de rato não arterializado (NArLT) oferece vantagens significativas na cirurgia experimental: evita o desafio formidável da anastomose arterial microvascular, reduz o tempo cirúrgico total e reduz a duração da anestesia para os ratos. Apesar da privação do suprimento arterial de sangue, a resposta biliar resultante neste modelo oferece uma perspectiva única para investigar lesões biliares isquêmicas. No entanto, modelos convencionais de NArLT estão associados a uma alta taxa de complicações biliares pós-operatórias de até 30^{%, o} que compromete severamente a sobrevivência a longo prazo. No modelo clássico tradicional de transplante de fígado de rato, a taxa de sobrevivência a longo prazo do receptor é inferior a 70%–85^%8. Para resolver isso, este estudo introduz um protocolo otimizado utilizando um stent biliar mole tratado com heparina. Ao empregar uma técnica de dissecação biliar "no-touch" para maximizar a preservação da rede microvascular pericular, juntamente com um flushing biliar completo por perfusão fria, essa abordagem visa mitigar fundamentalmente as complicações biliares por meio de suporte físico e proteção^{isquêmica 9}, fornecendo, em última análise, uma plataforma robusta e estável para monitoramento imunológico de longo prazo.

Portanto, maximizar as taxas de sucesso dos procedimentos e prolongar a sobrevivência dos receptores são os principais objetivos de qualquer inovação técnica no transplante de fígado de ratos. Alcançar esses objetivos é um pré-requisito fundamental para garantir a progressão oportuna e ininterrupta da pesquisa experimental a^{jusante 10}.

Protocolo

Todos os experimentos e cirurgias com animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética Experimental de Animais da Universidade de Qingdao (nº 20260301SD5020260401065). Faça todos os esforços para minimizar o sofrimento dos animais.

1. Preparação Pré-Operatória

1. Animais experimentais
   1. Utilize ratos machos adultos de Sprague–Dawley (SD), com idades entre 8 e 10 semanas e pesando entre 220 e 250 g, como doadores. Certifique-se de que o peso do receptor seja um pouco maior que o do doador, com a diferença dentro de 50 g.
   2. Ratos domésticos sob condições específicas livres de patógenos, a uma temperatura controlada de 22°C ± 2°C e umidade relativa de 50% ± 10%.
   3. Mantenha um ciclo de 12 horas claro/escuro com uma densidade de gaiola de 2 a 3 ratos por gaiola.
   4. Ofereça uma dieta padrão de laboratório para roedores. Permita que os ratos se aclimatem ao ambiente de laboratório por pelo menos 1 semana antes da intervenção cirúrgica.
   5. Animais rápidos por 12 horas antes da cirurgia. Permita acesso à água de forma improvisada.
      NOTA: O jejum antes da cirurgia ajuda a minimizar o risco de aspiração durante a anestesia e previne a dilatação gástrica, que pode comprometer a função respiratória e obstruir a exposição cirúrgica.
2. Instrumentos e materiais cirúrgicos
   1. Use os instrumentos necessários para a cirurgia de transplante, conforme mostrado na Figura 1. Liste os detalhes dos consumíveis usados na cirurgia na Tabela de Materiais.
   2. Selecione bainhas epidurais 5F e 6F comparando o diâmetro externo dos cateteres com os diâmetros fisiológicos internos dos vasos-alvo em ratos machos SD pesando entre 220 e 250 g.
   3. Use uma bainha 5F (aproximadamente 1,67 mm) para a veia porta (PV). Use uma bainha 6F (aproximadamente 2,00 mm) para a veia cava inferior infra-hepática (IHIVC).
      NOTA: Selecione o tamanho do cateter com base em uma combinação de padrões anatômicos e estimativa visual intraoperatória sob microscópio cirúrgico. Realize uma comparação em tempo real entre o diâmetro externo do cateter e o lúmen interno do recipiente alvo. Uma correspondência adequada é alcançada quando o cateter ocupa aproximadamente 70%–80% do lúmen do vaso, permitindo uma inserção suave sem esticar demais a parede do vaso ou deixar folga excessiva. Para ratos SD dentro da faixa de peso especificada, diâmetros anatômicos predefinidos dos vasos podem ser usados para a seleção inicial do tamanho, que deve ser ajustada intraoperatório com base na variação individual. Os operadores devem comprovar essa compatibilidade vaso-cateter por meio de treinamento microcirúrgico prévio.
   4. Para ratos SD de 8 a 10 semanas, selecione as bainhas epidurais 5F e 6F como manguitos para PV e IHIVC, respectivamente (Figura 2A).
   5. Prepare manguitos com comprimento funcional total (corpo tubular) de 2,0 a 2,5 mm. Mantenha um comprimento de extensão de 3,0–4,0 mm para manuseio com pinça.
   6. Prenda a parede do manguito com as mandíbulas das pinças mosquito para criar um sulco circunferencial localizado aproximadamente 0,5–1,0 mm da borda proximal do manguito (veja a Figura 2A para detalhes). Mantenha uma profundidade de sulco de aproximadamente 0,1–0,2 mm para facilitar a amarração segura dos nós e a fixação subsequente.
   7. Certifique-se de que o sulco evite que a ligadura de fixação 7-0 escorra da superfície rígida do cateter.
   8. Corte um cateter intravenoso de 22G para criar um stent biliar com extremidades inclinadas ou chanfradas. Garanta um comprimento de 5–7 mm.
   9. Prefiro um comprimento de stent de 7 mm. Ajuste o comprimento com base na variação anatômica usando o nível horizontal da veia gástrica direita como referência. Estime a distância desse ponto de referência até o hilo hepático para guiar a seleção do comprimento do stent.
   10. Encurte o stent (para aproximadamente 5–6 mm) se a distância estimada for limitada ou se houver resistência durante a inserção. Certifique-se de que aproximadamente 2–3 mm do stent possam ser inseridos no ducto biliar sem dobrar, dobrar ou protuberância.
   11. Deixe o stent de molho em soro fisiológico heparinizado (100 IU/mL) em temperatura ambiente (23°C ± 2°C). Mantenha o stent imerso por no mínimo 30 minutos antes do uso para evitar a coagulação biliar intraluminal ao ser inserida no lúmen biliar do doador (Figura 2A).
       NOTA: Prepare o braço antes da cirurgia e use pinças antimosquito para criar sulcos na parede do punho, facilitando o aperto e a fixação após a canulação bem-sucedida. Certifique-se de que as extremidades do stent biliar aparado não estejam excessivamente afiadas para evitar a perfuração do ducto biliar. Sob um microscópio cirúrgico (ampliação 10×–16×), confirme que a borda cortada está limpa e livre de rebarbas plásticas irregulares; Se a ponta parecer uma agulha, embote-a levemente com uma microtesoura. Durante a manipulação, use apenas micro-pinças finas e sem dentes para manusear o stent. Evite aplicar força externa excessiva, conforme indicado por qualquer achatamento, ovalização ou dobramento do lúmen do stent; descarte e recoloque qualquer stent deformado, pois o estreitamento luminal aumenta o risco de complicações biliares pós-operatórias.

Figura 1. Instrumentos cirúrgicos usados no procedimento de transplante. (A) Bacia de rins de aço inoxidável. (B) Suportes para microagulhas. (C) Microtesoura. (D) Micropinça (reta e curva). (E) Clipes microvasculares e pequenos grampos estilo bulldog no estilo mosquito. (F) Suporte padrão para agulhas. (G) Pinças hemostáticas retas (pinças mosquito). (H) Pinça vascular. (I) Tesoura cirúrgica padrão. (J) Elástico (feito a partir do punho de uma luva cirúrgica estéril). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2. Braços cirúrgicos personalizados, stent biliar e incisões abdominais planejadas. (A) Preparação dos manguitos vasculares e do stent biliar junto com uma régua milimétrica. Da esquerda para a direita: uma bainha epidural 6F usada para a manguita da veia cava inferior infra-hepática (IHIVC), uma bainha 5F usada para a manga da veia porta (PV) e um stent biliar de 5–7 mm cortado a partir de um cateter intravenoso 22G. (B) Uma incisão cruzada marcada no abdômen do rato doador para maximizar a exposição cirúrgica. (C) Incisão padrão de laparotomia na linha média marcada no abdômen do rato receptor. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

2. Operação com Doador

1. Passos iniciais
   1. Anestesie o rato doador usando isoflurano a 5% com uma taxa de fluxo de ar de 1 L/min na câmara de indução. Avalie a profundidade da anestesia confirmando a ausência de movimento espontâneo dos membros e reflexo de retirada.
      NOTA: A profundidade da anestesia é avaliada observando a ausência de movimento espontâneo dos membros, a ausência de reflexo de abstinência e a frequência respiratória. Para garantir o progresso tranquilo e seguro da cirurgia, esses parâmetros são rigorosamente reavaliados a cada 20 minutos durante todo o procedimento.
   2. Administrar 1% de pentobarbital (40–45 mg/kg) por injeção intraperitoneal na parte inferior direita do abdômen, aproximadamente 1–2 cm lateralmente à linha média (linha alba) e 1–2 cm cranial ao ligamento inguinal direito. Confirme anestesia adequada beliscando a pata traseira e garantindo que não haja reflexo de abstinência.
   3. Posicione o rato doador em posição deitada em uma almofada térmica de 37°C para manter a temperatura corporal durante a cirurgia.
   4. Raspe a área cirúrgica abdominal. Desinfete a área com povidona-iodo três vezes.
2. Procedimentos antes da perfusão hepática
   1. Faça uma incisão cruzada que se estende até o processo xifoide, descendo até a sínfise púbica e lateralmente até a linha axilar média para maximizar a exposição do campo cirúrgico (Figura 2B).
      NOTA: Realize a laparotomia em duas camadas. Primeiro, incise a pele e o tecido subcutâneo. Depois, cubra a linha alba com pinças e faça uma pequena incisão inicial para permitir a entrada de ar, fazendo as vísceras caírem. Estenda a incisão com tesoura, mantendo a lâmina inferior paralela à parede abdominal para evitar lesão nos órgãos.
   2. Enrole os intestinos com gaze embebida em soro. Coloque-as no campo de operação estéril do lado esquerdo do abdômen para expor a área operatória.
      NOTA: É fundamental manter a umidade contínua dos intestinos eviscerados durante todo o procedimento para evitar dessecação isquêmica e hipotermia. Reidrate periodicamente a gaze de cobertura aplicando gotas de soro normal morno (37°C) aproximadamente a cada 10–15 minutos, ou imediatamente assim que a gaze começar a secar sob a iluminação cirúrgica.
   3. Divida o ligamento falciforme. Clampe e retraia o processo xifoide de forma craniana para expor a VVI supra-hepática (SHIVC) e a veia frênica inferior esquerda.
   4. Divida o ligamento triangular esquerdo. Ligue a veia frênica esquerda próxima ao SHIVC usando um 7-0 ou 8-0 sutura (Figura 3A).
      NOTA: Ao ligar a veia frênica inferior esquerda, posicione a ligadura próxima ao SHIVC. Esteja ciente de que a agulha de sutura pode facilmente perfurar o diafragma e causar pneumotórax; Sutura próxima ao vaso sanguíneo.
   5. A eletrocauterização é recomendada para a divisão dos vasos, a fim de alcançar uma hemostásia rápida e reduzir o tempo operatório, melhorando assim a consistência e a reprodutibilidade do procedimento.
      NOTA: A eletrocauterização padroniza a hemostasia, reduz o tempo cirúrgico e melhora a reprodutibilidade entre os operadores.
   6. Mobilize os lobos caudado e papilar (Figura 3B).
   7. Use pinças microscópicas para remover gordura e tecido conjuntivo da superfície do VHII.
      NOTA: Remova o tecido conjuntivo até que a parede do vaso pareça lisa e translúcida. A exposição adequada é alcançada quando as pinças vasculares podem ser aplicadas sem interferência e não resta tecido residual que possa comprometer a sutura ou a sutura.
   8. Liga a veia adrenal direita encostada ao IHIVC. Isole a veia renal direita e ligue-a até que a lave com o VHIH.
   9. Continue dissecando o IHIVC caudal até um nível logo acima da veia renal esquerda (Figura 3C).
      NOTA: Certifique-se de que o VHICV esteja completamente esqueletado (separar os vasos sanguíneos o máximo possível do tecido conjuntivo adiposo) durante a dissecação. Isso facilita procedimentos subsequentes de explantação hepática e fixação do manguito.
   10. Eleve suavemente o fígado usando um cotonete. Dissecar as fixações ligamentares entre o lobo hepático inferior direito e o retroperitônio.
       NOTA: Identifique o SHIVC como um vaso azulado curto, largo e de parede fina no polo superior do fígado. A dissecação para parar assim que sua superfície anterior for limpa e as fibras diafragmáticas adjacentes se tornarem visíveis.
   11. Pare a dissecação ao chegar ao SHIVC.
       NOTA: Manuseie o fígado com extremo cuidado para evitar lesões parênquimatosas. Tenha cuidado para proteger a VCI durante a dissecção retroperitoneal craniana.
   12. Dissecar o tecido conjuntivo entre o PV e o AH correto. Isole o PV.
   13. Liga a veia gástrica direita (veia pilórica) com a PV. Continue a dissecação até a raiz da veia esplênica.
   14. Expõe a porta hepatis. Identifique o tecido adiposo conjuntivo semelhante a cordão localizado à esquerda do PV, encapsulando o ducto biliar comum (CBD) e o HA.
   15. Faça uma incisão em formato de "V" na parede anterior do CBD, 3–5 mm distal em relação à bifurcação do ducto hepático.
   16. Use microfórceps para segurar o stent. Insira o stent aproximadamente 3 mm no trato biliar, mantendo o alinhamento paralelo com o ducto.
       NOTA: Avance o stent suavemente, sem resistência. Certifique-se de não ter protuberância lateral, angulação ou acampamento nas paredes do duto. Se ocorrer resistência ou deformação, retire-se e realinhe antes da reinserção.
   17. Prenda o stent com uma gravata de seda circunferencial 7-0. Ligue o AH no nível da incisão e o transecto proximalmente (Figura 3D).
       NOTA: Evite estritamente a "esqueletização" excessiva ao dissecar o CBD doador. Preserve o tecido conjuntivo peribiliar, plexos nervosos e redes microvasculares para promover a circulação colateral precoce e a cicatrização biliar pós-operatória. Como a extremidade distal do ducto doador é a região mais isquêmica, mantenha-se o local anastomótico próximo ao hilo hepático para minimizar a carga isquêmica.
3. Perfusão hepática
   1. Expõe a aorta abdominal. Insira uma agulha para veias cabeludos de calibre 23 (23 G) (aproximadamente 1 cm) conectada a uma seringa de 20 mL preenchida com solução fria (4°C) da Universidade de Wisconsin (UW).
      NOTA: Insira a agulha na aorta abdominal em um ângulo raso (15°–20°). Confirme a entrada observando o retorno sanguíneo do sangue, depois avance levemente e alinhe a agulha paralela ao vaso para evitar perfuração da parede posterior.
   2. Remova o ar da seringa antes da infusão. Pinze e conserte a aorta abdominal e a agulha usando uma pinça vascular.
      NOTA: Remova todo o ar da seringa batendo para desalojar as bolhas e expelindo o fluido até que uma gota contínua fique visível na ponta da agulha. Confirme a ausência de ar no cubo da agulha antes da canulação.
   3. Inicie a perfusão lentamente pressionando manualmente a seringa a uma taxa constante de 3–3,5 mL/min (Figura 3E).
      NOTA: Confirme a colocação correta da intravascular observando o retorno sanguíneo no tubo.
   4. Incisa o diafragma. Expõe totalmente a VCI torácica e a aorta torácica.
   5. Pinze a VCI torácica em sua junção com o átrio direito, junto com a aorta torácica, usando pinças vasculares.
   6. Transecte a CCI torácica imediatamente abaixo da pinça para permitir o efluxo de perfusado.
      NOTA: Aplique a pinça o mais cranialmente possível e transecto abaixo dela para preservar o comprimento do vaso. Inicie a perfusão imediatamente para prevenir a coagulação e preservar a qualidade do enxerto.
   7. Continue a perfusão em ritmo constante (3–3,5 mL/min) até um volume total de aproximadamente 40 mL.
   8. Interrompa a perfusão assim que o parênquima hepático fica completamente pálido (marrom-amarelo) (Figura 3F).
      NOTA: Perfusão adequada é confirmada quando o fígado fica uniformemente pálido (amarelo-marrom) e o efluente do IHIVC transectado é transparente, sem sangue residual.
   9. Transecte o IHIVC com a veia renal esquerda. Transecte o PV no nível da veia esplênica.
      NOTA: Evite injeções rápidas ou violentas de perfusado para evitar lesões endoteliais e parênquimatos.
   10. Aumente a incisão diafragmática. Colhe o enxerto hepático em bloco com o diafragma anexado.
   11. Coloque o enxerto em uma placa de Petri estéril contendo uma solução fria de preservação UW.
   12. Mantenha o enxerto em solução fria de UW a 4°C. Transplante completo em até 2 horas após a compra.

Figura 3. Etapas cirúrgicas chave durante a mobilização do fígado doador e a perfusão in situ. (A) Exposição e ligadura da veia frênica inferior esquerda. (B) Isolamento e divisão dos ramos comunicantes hepato-esofágicos. (C) Dissecação do CIHICV, demonstrando a ligadura das veias adrenal direita e renais direitas. (D) Inserção do stent biliar personalizado no ducto biliar comum (CBD) usando a técnica "no-touch" para preservar o tecido conjuntivo peribiliar. (E) Canulação da aorta abdominal para iniciar a perfusão in situ fria. (F) Fígado doador totalmente perfundido com aparência uniformemente pálida, indicando lavagem sanguínea bem-sucedida. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Preparação de Enxertos Ex Vivo

NOTA: Realize toda a preparação de enxertos ex vivo em gelo (Figura 4A). Mantenha o enxerto em solução de UW entre 4°C ± 2°C e monitore a temperatura periodicamente para garantir uma preservação adequada a frio.

Figura 4. Preparação ex vivo do enxerto de fígado doado. (A) O enxerto de fígado colhido colocado em uma placa de Petri estéril contendo solução fria de preservação de UW, posicionado sobre gelo triturado para manter a hipotermia. (B) Punção do PV doador por eversão sobre um manguito personalizado e fixação com uma ligadura circunferencial. (C) Preparação completa do manguito para PV e IHIVC, com o stent biliar no lugar. (D) Preparação da VCI supra-hepática (SHIVC) com suturas de estai colocadas em ambos os cantos laterais para facilitar a anastomose subsequente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

1. Preparação do manguito PV
   1. Segure a cauda do manguito PV com pinças mosquito e prenda-a de modo que a extremidade da cauda fique direcionada para baixo, perpendicular à base da placa de Petri.
   2. Passe a microfórceps pelo lúmen da manguita. Puxe o PV através da manguita.
   3. Ajuste a parede anterior do PV. Everta aproximadamente 3 mm da parede do vaso sobre a extremidade alargada da cauda de manguito.
   4. Prenda o vaso evertido à parede externa do punho usando uma gravata de seda 7-0 circunferencial (Figura 4B).
      NOTA: Certifique-se de que o vaso e o braço estejam alinhados sem torção ou angulação. Após a fixação, lave o manguito PV com aproximadamente 1 mL de solução UW e confirme a permeabilidade observando o efluxo do SHIVC.
2. Preparação do punho IHIVC
   1. A preparação e o enfaçamento do IHIVC são realizados usando exatamente os mesmos passos descritos para o PV no Passo 3.1. Resumidamente, isso inclui mobilização, ajuste e fixação de manguito do vaso seguindo o mesmo protocolo padronizado para garantir consistência experimental e reprodutibilidade. (Figura 4C).
      NOTA: Confirme a permeabilidade do manguito do VHICV observando o fluxo desobstruído do SHIVC após o flushing.
3. Lavagem do trato biliar
   1. Lave suavemente o ducto biliar através do stent biliar usando uma seringa de 1 mL contendo 0,5 mL de solução UW.
   2. Certifique-se de que não haja vazamento de fluido durante a lavagem.
      NOTA: A ausência de vazamento de fluido confirma a integridade do ducto biliar.
4. Preparação do SHIVC
   1. Aparar o SHIVC do enxerto hepático removendo o diafragma residual.
   2. Certifique-se de que o SHIVC esteja completamente esqueleto, conforme definido na Etapa 2.2.7.
5. Colocação de pontos de permanência
   1. Use 7-0 ou 8-0 Suturas baseadas na preferência do operador.
      NOTA: Em termos de resultados cirúrgicos (incluindo patência anastomótica e sobrevivência do receptor), ambos os tamanhos de sutura são funcionalmente equivalentes neste modelo. A escolha entre os dois pode ser baseada inteiramente na preferência pessoal do operador ou na disponibilidade laboratorial sem afetar a reprodutibilidade do procedimento.
   2. Achatem suavemente o toco do SHIVC. Coloque pontos nos cantos laterais esquerdo e direito passando a agulha de dentro para fora, aproximadamente 1 mm da borda (Figura 4D).

4. Operação do Destinatário

1. Passos iniciais
   1. Anestesie o rato receptor usando o mesmo protocolo descrito para o doador (Passo 2.1.1).
   2. Coloque o rato receptor em uma almofada térmica controlada termostaticamente mantida a 37°C.
   3. NOTA: Pese o rato receptor antes da anestesia. Certifique-se de que seu peso corporal exceda o do doador em aproximadamente 50 g.
2. Mobilização do fígado receptor
   1. Realize uma laparotomia na linha média.
   2. Retraa a parede abdominal lateralmente usando quatro retratores elásticos. Posicione os dois retratores superiores lateralmente às margens costais bilaterais e os dois retratores inferiores laterais às regiões inguinais bilaterais para alcançar a exposição ideal.
      NOTA: Aplique retração suficiente para expor o campo operatório enquanto evita tensão excessiva que possa causar branqueamento dos tecidos ou prejudicar a respiração.
   3. Liga a veia frênica inferior esquerda (LIPV) da mesma forma descrita para o procedimento com doador (veja o Passo 2.2.1).
   4. Dissecar os ligamentos entre o lobo do fígado esquerdo e o retroperitônio. Mobilize os lobos caudado e papilar.
   5. Divida os ligamentos e ramos comunicantes entre o esôfago e o lobo esquerdo do fígado usando eletrocautério.
      NOTA: A eletrocauteriação é recomendada para garantir hemostasia rápida, reduzir o tempo cirúrgico e melhorar a reprodutibilidade dos procedimentos.
   6. Dissecar diretamente o VHICV até o nível da veia renal direita.
   7. Isolar e ligar cuidadosamente a veia adrenal esquerda aproximadamente 2 mm de sua confluência com o IHIVC.
   8. Gerencie o lobo inferior direito do fígado da mesma forma descrita no procedimento com doador (veja o Passo 2.2.4).
   9. Passe um elástico (feito a partir do punho de uma luva cirúrgica estéril, com aproximadamente 10 cm de comprimento) transversalmente atrás do SHIVC.
      NOTA: Aplique tração suave para expor o SHIVC sem restringir o movimento respiratório.
   10. Deixe o elástico no lugar para uso durante a subsequente transeção do SHIVC.
   11. Dissecar e isolar o PV do hilo hepático até o nível do ramo da veia pilórica.
       NOTA: Limite a dissecação da PV à região anastomótica. Preserve os afluentes ao redor para reduzir o trauma cirúrgico.
   12. Isole o HA no hilúdio hepático.
   13. Ligue o HA ao hilo e transeite proximalmente.
   14. Identifique a confluência dos ductos hepáticos esquerdo e direito formando o CBD abaixo do hilo hepático. Ligue o CBD neste local usando um ponto Prolene 7-0 e transeite (Figura 5A).
       NOTA: Minimize o trauma cirúrgico nesta região. Preserve o comprimento máximo possível do AH, juntamente com o tecido conjuntivo peribiliar, plexos nervosos e rede microvascular para facilitar o estabelecimento precoce da circulação colateral.
3. Hepatectomia do receptor
   1. Aplique clamps microvasculares para ocluir imediatamente o IHIVC cefalado na veia renal direita.
   2. Aplique uma pinça microvascular para ocluir a PV logo acima de sua junção com a veia pilórica.
   3. Confirme a oclusão vascular bem-sucedida observando o escurecimento visível do parênquima hepático.
      NOTA: Confirme oclusão vascular por escurecimento uniforme (cianose) do fígado, perda de turgor parênquimatosa e colapso do PV.
   4. Insira uma agulha de 23G para veias cabeludos presa a uma seringa de 5 mL no PV.
   5. Infunde 2 mL de solução de glicose a 5% por aproximadamente 30 segundos para enxaguar o sangue intra-hepático na circulação sistêmica.
      NOTA: Injete lentamente pelo PV próximo ao hilo hepático para liberar o sangue intra-hepático na circulação sistêmica.
   6. Aplique tração para baixo no elástico para expor o SHIVC.
   7. Faça a pinça cruzada do SHIVC usando uma pinça vascular (Figura 5B).
   8. Transecte o IHIVC, PV e SHIVC com o parênquima hepático.
   9. Remova completamente o fígado nativo da cavidade abdominal.
      NOTA: Mantenha a fase anhepática em até 26 minutos (não excedendo 30 minutos). Os vasos do transecto se alinham com o fígado para preservar o comprimento adequado e garantir coto vascular liso.
4. Implantação do enxerto de fígado
   1. Reconstrução do SHIVC
      1. Posicione o enxerto de fígado em sua orientação anatômica ortotópica.
      2. Use o ponto 7-0 pré-colocado no canto esquerdo para iniciar a sutura contínua da parede posterior em direção ao canto direito.
      3. Fixe o ponto ao ponto de apoio no canto direito.
      4. Continue o ponto de corrida ao longo da parede anterior para completar a anastomose (Figuras 6A–6C).
      5. Mantenha uma distância de entrada da agulha de 0,5–1,0 mm a partir da borda do recipiente.
      6. Mantenha uma inclinação de sutura de 1,0–1,5 mm.
         NOTA: Mantenha espaçamento consistente das agulhas e passo dos pontos para garantir uma anastomose segura e sem tensão.
      7. Aperte o ponto após cada ponto para eliminar espaços mortos e manter a tensão adequada.
         NOTA: Antes de concluir a sutura da parede anterior, lave o SHIVC com solução UW usando uma agulha de permanência para expulsar o ar residual e prevenir embolia aérea.
   2. Reconstrução PV
      1. Coloque suturas de estai 7-0 nos cantos esquerdo e direito do toco PV receptor.
      2. Aplique tração de três pontos para criar uma abertura triangular.
      3. Insira o PV doador com manguito no lúmen.
      4. Fixe usando uma ligadura 7-0 amarrada ao redor do sulco circunferencial (Figuras 6D–6F).
   3. Reconstrução do IHIVC
      1. Reconstrua o IHIVC usando a mesma técnica da reconstrução PV (veja o Passo 4.4.2) (Figura 6G–6I).
   4. Reperfusão
      1. Libere sequencialmente as pinças vasculares do SHIVC, PV e IHIVC.
      2. Confirme a reperfusão bem-sucedida observando a restauração uniforme da cor do enxerto sem congestão, hemorragia ou vazamento (Figura 7A).
         NOTA: A produção ativa de bile pelo ducto biliar indica restauração da perfusão hepática e da função precoce do enxerto.
   5. Reconstrução biliar
      1. Faça uma pequena incisão transversal (metade do diâmetro do ducto) na parede anterior do coto de CBD do receptor.
      2. Insira o stent biliar doador aproximadamente 3 mm no lúmen de CBD.
      3. Fixe o stent com um ponto circunferencial 7-0 (Figura 7B).
         NOTA: Observe o efluxo biliar ativo da ponta distal do stent doador antes da conclusão da reconstrução. Isso confirma a patência e a função precoce do enxerto.
5. Reaquecimento do receptor
   1. Irrigar a cavidade peritoneal com 150 mL de soro fisiológico normal a 37°C antes do fechamento abdominal.
      NOTA: Esta etapa remove o sangue residual, restaura a temperatura corporal e permite a inspeção da hemostase nas anastomoses SHIVC, IHIVC e PV.
6. Fechamento abdominal e cuidados pós-operatórios
   1. Feche a camada musculofascial usando um ponto contínuo com fio absorvível 4-0, dando mordidas de 5 mm em intervalos de 1 cm.
   2. Feche a pele usando um ponto contínuo com linha de seda 4-0.
   3. Administre buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea a cada 12 horas, totalizando 2 doses.
   4. Transfira o rato receptor para uma gaiola limpa e com temperatura controlada.
   5. Monitore continuamente até a recuperação total da anestesia e a retomada do movimento espontâneo normal.

Figura 5. Etapas cirúrgicas importantes durante a mobilização hepática do receptor e hepatectomia. (A) Identificação e ligadura do CBD receptor próximo à bifurcação hilar. (B) Exposição e fixação do SHIVC. Um elástico é colocado atrás do SHIVC para fornecer tração e melhorar a visualização durante o clampamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6. Etapas cirúrgicas chave para a reconstrução vascular durante a implantação de enxertos hepáticos. Reconstrução do SHIVC: (A) alinhamento usando suturas de estai de canto, (B) sutura contínua da parede posterior e (C) sutura completa da parede anterior. Reconstrução PV usando a técnica do manguito: (D) tração em três pontos, (E) inserção do PV doador com manguito e (F) ligadura fixando o manguito. Reconstrução do VHII usando a mesma técnica de manguito: (G) exposição, (H) inserção e (I) ligadura. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7. Verificação da função do enxerto, reconstrução biliar e recuperação pós-operatória. (A) Avaliação da função precoce do enxerto após a reperfusão, com efluxo biliar visível do stent biliar doador. Reconstruções PV e IHIVC são visíveis. (B) Conclusão da reconstrução biliar com inserção e fixação do stent biliar doador no CBD receptor. (C) Rato receptor representativo demonstrando recuperação pós-operatória completa com postura normal e atividade espontânea. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Resultados

Para garantir qualidade cirúrgica consistente e reprodutibilidade entre os modelos NArLT, todos os procedimentos foram realizados pelo mesmo microcirurgião experiente. Um total de 50 transplantes de fígado de rato foram realizados durante o período do estudo. As durações médias dos procedimentos cirúrgicos foram as seguintes: a cirurgia com doador teve média de 25,3 ± 2,6 minutos, a preparação ex vivo do enxerto teve média de 13,1 ± 2,1 minutos, a cirurgia do receptor teve média de 43,0 ...

Discussão

O modelo NArLT é uma pedra angular para a pesquisa experimental de transplante devido à sua evitação da anastomose arterial^{microvascular complexa 11}. No entanto, os métodos convencionais de NArLT são historicamente afetados por altas taxas de complicações biliares — até 30% — que limitam severamente a sobrevivência a longo prazo e dificultam estudos imunológicos^{crônicos 2}. A importância do método proposto está em sua capacidade de contornar...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sutura Absorvível 4-0	Ethicon	W9109H	Usado para fechamento da camada musculofascial (linea alba)
Sutura de seda 4-0	Ethicon	VCP304H	Usado para fechamento da pele
7-0 ou 8-0 Sutura / Gravata de seda	Ethicon	Z1711E	Usado para ligação de vasos (por exemplo, veia frênica esquerda)
Cateter Intravenoso 22G	B. Braun	4252098B	Cortado para 5– 7 mm com extremidades inclinadas para preparar o stent biliar
Agulha de Veia no Couro Cabeludo 23G	Shandong Qinkai Medical Industry Co., Ltd.	MDLSSVS	Usado para inserção na aorta abdominal para perfusão hepática
Buprenorfina	Instituto de Pesquisa Farmacêutica de Tianjin Pharmaceutical Co., Ltd.	H12020275	Administrada como analgésia subcutânea após a cirurgia
Cotonete	Aoocn	216-236	Usado para elevar suavemente o fígado durante a dissecação
Gelo Triturado	N/A	N/A	Usado para manter a temperatura do enxerto durante a preparação ex vivo
Retratores elásticos	N/A	N/A	Usado para retrair a parede abdominal durante a laparotomia
Bainhas de cateter epidural,	Jiangsu Maichuang Medical Device Co., Ltd.	20173084015	Tamanhos 5F e 6F; usados como algemas para PV e IHIVC
Gaze	Central Medical Technology Co., Ltd.	CH-1001	Embebidas em soro; usado para cobrir e proteger intestinos
Solução de glicose (5%)	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H20044307	Usado para lavar sangue intra-hepático durante hepatectomia do receptor
Soro fisiológico	Shenzhen Life Biotechnology Co., Ltd.	H2012003	100 UI/mL; usado para deixar de molho no stent biliar
Agulha Interna	B. Braun	4254074B	Usado para lavar SHIVC para remover o ar antes de completar a anastomose
Isoflurano	Jinan Guangshengyuan Biotechnology Co., Ltd.	153107015	5% de concentração; Usado para indução de anestesia
Grampos Microvasculares	Shanghai Medical Devices Co., Ltd.	JCZ200	Usado para oclusão de vasos durante cirurgia
Pinça para Mosquitos	Shanghai Medical Devices Co., Ltd.	J31010	Usado para manipulação fina e preparação de punhos
Soro fisiológico normal (0,9%)	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H20044304	Usado para irrigação e imersão com gaze (37° C)
Pentobarbital (1%)	Shanghai Yuansi Technology Co., Ltd.	P0500000	40– 45 mg/kg; Usado para anestesia cirúrgica
Cateter Venoso Inserido Periféricamente (PIVC)	Covidien	8888145015	Usado para lavar PV algemada e confirmar a permeabilidade
Povidona-Iodo	Shanxi Trinda Biotechnology Co., Ltd.	41836054	Usado para desinfecção do local cirúrgico
Elástico (da Luva Cirúrgica)	Ansell	N/A	Usado para tração SHIVC durante cirurgia de receptor
Sprague– Dawley Rats	Huafukang (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.	22001A	Ratos machos adultos, 8 e ndash; 10 semanas, 220 e um traço; 250 g
Placa de Petri estéril (10 cm)	Shandong Enyou Biotechnology Co., Ltd.	H905001	Usado para segurar enxerto em solução de UW durante preparação ex vivo
Seringa (20 mL)	Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd.	20163141593	Usado para perfusão hepática controlada (3– 3,5 mL/min)
Solução de Preservação da UW	Ponte para a Vida	BTL-UW-1L	Mantido em 4° C; Usado para perfusão de fígado doado e preservação de enxertos