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Artigo de método

Um modelo de camundongo ex vivo para inflamação do tecido adiposo com dieta rica em gordura

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DOI:

10.3791/71651

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14 de julho de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Anatomy, Leipzig University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Usando um modelo explantado ex vivo , pequenos pedaços da porção rostral do tecido adiposo branco visceral de camundongos magros são cultivados por 7 a 10 dias, permitindo a indução e o estudo da inflamação do tecido adiposo conforme ocorre durante a alimentação rica em gordura.

Resumo

Este protocolo descreve um modelo camundongo ex vivo que recapitula características celulares e inflamatórias selecionadas observadas no tecido adiposo visceral (IVA) após alimentação com dieta rica em gordura (HFD), sem intervenção dietética in vivo. Pequenos explantes de IVA de camundongos magros são cultivados por 7 a 10 dias, durante os quais desenvolvem espontaneamente um fenótipo inflamatório que se assemelha muito ao do IVA de animais alimentados com HFD. Importante, o modelo preserva a arquitetura do tecido adiposo (AT), permitindo a investigação de processos inflamatórios em um contexto fisiologicamente relevante. Durante a cultura, surgem características importantes da inflamação relacionada à obesidade, incluindo a formação de estruturas em forma de coroa (CLS), o acúmulo de macrófagos (MMes) metabolicamente ativados e o aumento da produção de citocinas inflamatórias. Apesar da morte dos adipócitos, outros fatores que impulsionam a inflamação relacionada à obesidade, incluindo estressores metabólicos como ácidos graxos saturados, alteração do manejo dos lipídios, excesso de glicose, estresse oxidativo, hipóxia, desequilíbrio das adipocinas e sinalização paracrina entre adipócitos e células imunes, podem ser parcialmente representados no modelo. O sistema suporta uma ampla gama de aplicações a jusante, incluindo imagens ao vivo, citometria de fluxo, PCR quantitativa, ELISA, imunocoloração e sequenciamento de RNA em massa ou de célula única. Além disso, tratamentos farmacológicos e baseados em citocinas podem ser aplicados para investigar vias de sinalização e respostas específicas de tipo celular. Esse modelo facilmente personalizável está alinhado com os princípios das 3R ao reduzir o uso de animais em estudos alimentares in vivo . O modelo é reproduzível, econômico e simples de implementar, fornecendo uma plataforma versátil para estudar a morte de adipócitos, dinâmica das células imunes e estratégias terapêuticas na inflamação da AT.

Introdução

O tecido adiposo (AT) é um órgão metabolicamente ativo composto por aproximadamente 20% de adipócitos e uma mistura heterogênea de células imunológicas, fibroblastos, células progenitoras e vasculares emhumanos 1. A AT é classificada em tecido adiposo branco unilocular (WAT), tecido adiposo marrom multilocular (BAT) e tecido adiposo bege intermediário, refletindo heterogeneidade na composição, função e localização anatômica. A WAT é distribuída entre depósitos subcutâneos (SCAT), viscerais (VAT), perivasculares e de tutano adiposo, que diferem em origem do desenvolvimento, perfis de expressão gênica e função metabólica. Além de seu papel no armazenamento de lipídios, a AT funciona como um órgão endócrino secretando citocinas, hormônios eadipocinas 2. Comparado ao SCAT, o VAT é mais metabolicamente ativo e enriquecido em células inflamatórias, tornando-o particularmente relevante para estudos sobre inflamação da AT e doenças metabólicas, como diabetestipo 2 3,4,5.

A AT é um regulador fundamental da saúde metabólica e desempenha um papel central na obesidade, que está associada a diversas comorbozidades. A obesidade promove hipertrofia dos adipócitos, hiperplasia eproliferação 6, enquanto a expansão e inflamação da AT se correlacionam fortemente com hiperglicemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia e tolerância à glicoseprejudicada 3. Presume-se que a expansão do AT seja acompanhada por aumento da morte dos adipócitos, com aproximadamente 10% de renovação celularanualmente 7, desencadeando o recrutamento de macrófagos essencial para a limpeza e remodelação dostecidos 8. Como os adipócitos são substancialmente maiores (100–200 μm) que os macrófagos, a fagocitose eficiente por essas células, aproximadamente cinco vezes menores, é desafiadora, prejudicando assim a homeostase tecidual e promovendo inflamação crônica daAT 9. Macrófagos do tecido adiposo (ATMs) mediam a eliminação de adipócitos moribundos de grande porte, seja fundindo-se em células gigantes multinucleadas (MGCs) ou formando estruturas semelhantes a coroas (CLS) ao redor dos adipócitos mortos e degradando-os por exocitoselisossômica 10,11,12. A abundância de CLS correlaciona-se com inflamação associada àobesidade 11,13.

Em AT saudável, os caixas eletrônicos são predominantemente macrófagos anti-inflamatórios semelhantes a M2, enquanto a obesidade promove uma mudança para um fenótipo pró-inflamatório semelhante aoM1 14,15. Subconjuntos meccanicamente distintos de macrófagos surgem, incluindo macrófagos metabolicamente ativados (MMes) e macrófagos associados a lipídios (LAMs), que desempenham papéis importantes na eliminação de adipócitos mortos por meio da exocitoselisossômica 16,17,18.

Para investigar a inflamação da AT em um ambiente multicelular fisiologicamente relevante, o protocolo estabeleceu um modelo de camundongos ex vivo baseado em culturas organotípicas explantadas de VAT derivadas de camundongos magros. Explantações de IVA cultivadas por 7–10 dias desenvolvem um fenótipo inflamatório comparável ao observado após pelo menos 12 semanas de alimentação rica em gordura (HFD) no que diz respeito à formação de CLS, fenótipo de macrófagos e produção de citocinasinflamatórias 9,19. Importante, essa abordagem reduz o uso de animais, elimina a necessidade de aprovação de intervenções dietéticas e contribui para os princípios dos 3R ao reduzir a dependência de estudos de intervenção dietética de longo prazo. Comparado aos sistemas convencionais de cultura celular bidimensional (2D), como modelos de cultura unicelular (por exemplo, células 3T3-L1 ou culturas primárias de adipócitos), esse método preserva a complexidade dos tecidos e a diversidade celular, permitindo assim a investigação das interações fisiológicas célula-célula, incluindo aquelas entre células imunes e adipócitos.

Explantações AT cultivadas são compatíveis com uma ampla gama de abordagens analíticas. Imagens confocais ao vivo permitem o monitoramento do acúmulo de ATM, formação de CLS e formação deMGC 9,19. A digestão de colagênase permite o isolamento da fração vascular estromalical (SVF) para análises citométricas de fluxo, incluindo ensaios de proliferação e determinação dosfenótipos 12 do tipo M1, M2 ou MMe. Análises de expressão gênica, incluindo PCR quantitativa (qPCR) e sequenciamento de RNA, podem ser realizadas em explantas inteiras, células SVF ou macrófagosclassificados 9. A expressão proteica e a atividade enzimática podem ser avaliadas por Western blot ou ELISA 12,20,21, enquanto a arquitetura tecidular e a expressão de marcadores podem ser visualizadas por coloração em montagem total e imunofluorescência 9,22. Além disso, intervenções farmacológicas e genéticas, incluindo a depleção do ATM e o tratamento com citocinas, são facilmente viáveis 21,23,24.

Em resumo, este modelo ex vivo de camundongo de inflamação AT semelhante a HFD permite a investigação da morte de adipócitos, observação direta in situ do comportamento celular e manipulações farmacológicas ou genéticas relevantes para a imunologia da AT (Figura 1).

figure-introduction-1
Figura 1: Resumo gráfico do fluxo de trabalho. O tecido adiposo visceral (AT) é isolado de camundongos, cortado em pequenos explantes e cultivado por 7 a 10 dias. Durante o período de cultivo, os explantes desenvolvem um fenótipo inflamatório, possibilitando o estudo da inflamação do tecido adiposo sob condições controladas ex vivo . Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Protocolo

Os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais e aprovados pelas autoridades reguladoras apropriadas. Csf1r-eGFP-Adipoq-ERT2-Cre-CAG-tdMouse de tomate ("MacFat", RRID: Csf1r-eGFP: RRID:IMSR_JAX:018549, Adipoq-iCreERT2: RRID:IMSR_JAX:025124, CAG-tdTomato: RRID:IMSR_JAX:007914)27,28 foram usados para experimentos de microscopia representativa. Essa linha repórter permite a visualização de macrófagos pela expressão de GFP e adipócitos por expressão de tdTomate. Como a expressão do tdTomato se perde após a morte dos adipócitos, a viabilidade dos adipócitos pode ser monitorada durante a cultura. Camundongos repórteres Csf1r-eGFP ("MacGreen", RRID:IMSR_JAX:018549)28 foram usados para visualização de macrófagos e análises de citometria de fluxo. Os camundongos C57BL/6J (RRID:IMSR_JAX:000664) foram usados em experimentos não de imagem, incluindo análises de scRNA-seq e qPCR. Todas as linhas transgênicas foram mantidas como camundongos heterozigóticos em um fundo C57BL/6J.

Os experimentos com animais seguiam os 'Princípios do cuidado com animais de laboratório' (publicação do NIH nº 85e23, revisada em 1985) e leis nacionais específicas, sendo aprovados pelas autoridades locais do estado da Saxônia: Landesdirektion em Leipzig, Alemanha (aplicação experimental animal: TV11-21-MEZ). Segundo autoridades locais, os experimentos descritos não constituem testes em animais, pois afirma que "se um vertebrado for morto apenas para usar seus órgãos ou tecidos para fins científicos, isso não é considerado teste em animais sob o § 7(2) da Lei de Bem-Estar Animal (TierSchG), mas sim como assassinato sob o § 4(3) da Lei de Bem-Estar Animal (TierSchG)." A morte dos animais deve ser relatada em um 'relatório animal'. Este relatório está incluído na aplicação de experimentação animal. O comitê de ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Leipzig também aprovou os projetos de pesquisa. De acordo com as diretrizes da aplicação experimental animal TV11-21-MEZ, os camundongos são eutanasiados por overdose do anestésico inalado isoflurano. Uma concentração efetiva de gás (5% em gás portador O₂) é entregue por meio de um vaporizador de isoflurano. O procedimento de eutanásia é concluído quando a parada circulatória definitiva (ausência de respiração [teste de pena] e batimentos cardíacos [palpação]) é confirmada.

Os camundongos foram alojados em uma instalação controlada de temperatura (22 ± 2 °C), livre de patógenos específicos, na Universidade de Leipzig, em grupos irmãos de 3 a 5 animais sob um ciclo de luz e escuridão de 12 horas. Os animais tinham acesso ad libitum à água e a uma dieta padrão de comida (9% kcal de gordura; Sniff GmbH, Alemanha). Experimentos representativos foram realizados usando camundongos machos e fêmeas. Os reagentes, produtos químicos e kits usados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparativos

  1. Prepare reagentes e equipamentos
    1. Prepare o meio de cultura em condições estéreis, suplementando RPMI-1640 com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de solução antibiótica.
    2. Aqueça o meio de cultura e o PBS estéril a 37 °C.
    3. Limpe todos os equipamentos e a área de trabalho dentro da capela de cultura de tecidos com 70% de etanol.
  2. Prepare os animais
    1. Sacrifique-os de acordo com as diretrizes institucionais. Opcionalmente, pese os animais.
    2. Coloque os animais em um béquer de vidro contendo 70% de etanol.
    3. Limpe o exterior do béquer de vidro com etanol e transfira para o capuz de cultura de tecidos.

2. Isolamento do tecido adiposo (Figura 2)

  1. Prepare o rato
    1. Coloque o mouse em posição deitada em um recipiente de vidro usando pinça sem embutido, ou prenda-o em uma tábua de dissecação.
    2. Adicione uma camada fina de PBS pré-aquecido a uma placa de Petri.
    3. Troque por um par de luvas novas.
    4. Levante a pele abdominal inferior com pinças e faça uma pequena incisão horizontal com tesoura para abrir a cavidade abdominal.
    5. Faça uma incisão vertical (~2 cm do caudal ao rostral) que se estenda a partir do corte inicial para expor os órgãos internos.
  2. Isole a almofada adiposa
    1. Usando tesouras pequenas e afiadas e pinças pontiagudas, localize e retire o tecido adiposo branco. Use um conjunto separado de instrumentos para evitar contaminação.
    2. Camundongos machos: A gordura gonadal está ligada apenas ao epidídimo e ao testículo. Levante cuidadosamente a almofada adiposa e corte acima do epidídimo, ou retire o epidídimo e testículos junto com a gordura gonadal, e remova-os depois.
    3. Fêmeas: A gordura gonadal está ligada ao chifre uterino e aos ovários e é mais proeminente do que nos machos. Levante cuidadosamente a almofada adiposa e excise ao longo do chifre uterino e dos ovários.
    4. Coloque as almofadas de gordura isoladas na placa de Petri preenchida com PBS.
    5. Remova epidídimo residual, testículos, ovários ou vasos sanguíneos usando uma lâmina de barbear.
    6. Transfira a almofada de gordura limpa para uma segunda placa de Petri contendo PBS pré-aquecido. Opcionalmente, pese as almofadas de gordura.
      NOTA: Pesar as almofadas de gordura antes da cultura permite a normalização da massa do tecido entre as condições experimentais.

figure-protocol-1
Figura 2: Isolamento e cultura de explantações viscerais de tecido adiposo. (A,B) Abertura da cavidade abdominal e exposição do tecido adiposo visceral. (C, D) Isolamento do tecido adiposo epidídimo de camundongos machos, a gordura está ligada ao epidídimo (círculos vermelhos) e ao testículo (círculos azuis). (E, F) Isolamento do tecido adiposo gonadal de camundongos fêmeas, a gordura é fixada ao chifre uterino (círculos verdes) e aos ovários. (G, H) Preparação e apara dos explantes de tecido adiposo. (I, J) Transferência de explantações para poços de cultura e colocação de insertos de cultura celular. (K, L) Imagens representativas dos explantios durante o cultivo em placas de 6 poços. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Preparação e cultivo de explantação

  1. Prepare os explantações
    ATENÇÃO: Lâminas de barbear são afiadas e podem causar ferimentos. Manuseie e descarte as lâminas com cuidado de acordo com os procedimentos de segurança institucionais.
    1. Corte a almofada de gordura em tiras e depois em cubos de aproximadamente 10 mm3 (~10 mg por explantação) usando uma lâmina de barbear.
  2. Estabelecer culturas de explantação
    1. Adicione 1–1,5 mL de meio de cultura a cada poço de uma placa de 6 poços.
      NOTA: Para normalização, use aproximadamente 50 mg de tecido adiposo por 1 mL de meio de cultura.
    2. Transfira cinco explantações para cada poço usando uma colher ou espátula estéril.
    3. Organize os explantações uniformemente em um padrão circular.
    4. Cubra os explantios com um inserto de cultura celular usando pinças estériles.
      NOTA: Evite introduzir bolhas de ar ao posicionar as inserções e certifique-se de que os explantes estejam centralizados dentro delas.
    5. Incube os explantos a 37 °C, 5% de CO₂ e 21% de O₂ por 7 a 10 dias.
      NOTA: Use PBS pré-aquecido e meio de cultivo para melhorar a viabilidade do tecido. Trabalhe rapidamente para minimizar o tempo em que as almofadas de gordura permanecem fora da incubadora. Evite contaminação com pelo de camundongo. Se o cabelo aderir ao tecido, remova-o e enxágue o tecido com PBS morno.

4. Análises a jusante

  1. Após o período de cultivo de 7 a 10 dias, colete explantos, células da fração vascular estromais ou cultive supernadantes para análises posteriores, incluindo microscopia, citometria de fluxo, qPCR, ELISA ou sequenciamento de RNA, conforme necessário para o ponto final experimental.

5. Análise estatística

  1. Realize análises estatísticas usando o GraphPad Prism 10.2. Analise conjuntos de dados para valores atípicos usando o teste ROUT (Q = 1%) e avalie a normalidade usando o teste de Shapiro–Wilk (α = 0,05).
  2. Compare dois grupos usando testes t de Student pareados ou testes de par pareado de Wilcoxon, conforme apropriado. Compare múltiplos grupos usando ANOVA unidirecional seguido pelo teste post hoc de Dunnett. Considere diferenças estatisticamente significativas em p < 0,05.
  3. Apresente os dados como média ± SEM. A menos que indicue o contrário, defina n como o número de réplicas biológicas (camundongos individuais).

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Resultados

A viabilidade geral dos tecidos foi mantida durante todo o período de cultura e monitorada usando várias abordagens complementares. A viabilidade tecidual pode ser avaliada por microscopia confocal usando corantes de viabilidade comoCalceína 25, coloração por anticorpos contra Perilipina para avaliar a integridade da membranados adipócitos 17,26, ou expressão de proteína repórter transgênica em adipócitos....

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Discussão

Dada a crescente prevalência global de doenças metabólicas e diabetes, compreender os mecanismos subjacentes à inflamação do tecido adiposo (AT) continua sendo um objetivo importante da pesquisa. Para atender a essa necessidade , foi desenvolvido um sistema de cultivo ex vivo por explantação que permite a indução e análise da inflamação da AT sob condições experimentais controladas.

Um requisito crítico desse método é a preservação da viabilidade do t...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Constance Hobusch e Florian Kirmse pela excelente assistência técnica. Análises de citometria de fluxo foram realizadas na Unidade Central de Tecnologias de Fluorescência, Universidade de Leipzig, com apoio técnico de Kathrin Jäger e Pia Glöckner. Esse trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa), Projeto Número 209933838 – SFB 1052 (Projeto B09).

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Materiais

```html
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BD OptEIA Mouse TNF ELISA KitBD Biosciences560478
Bodipy 558/568 C12Flow cytometry: 1:10000; Staining: 1:2000InvitrogenD3835
Bovine Serum Albumin3%SigmaA9647
CD107a (LAMP1) – AF647Staining: 1:100; Flow cytometry: 1:200BioLegend121610
CD11c – BV605Flow cytometry: 1:100BioLegend117334
CD16/32Flow cytometry: 1:100Invitrogen14-0161-82
CD301 – AF647Flow cytometry: 1:50Bio-RadMCA2392A647
CD36 – PEFlow cytometry: 1:400BioLegend102606
CD45 – PEFlow cytometry: 1:100BD Pharmingen555483
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 350 Flow Cytometry Assay KitEdU: 5 µMInvitrogenC10632
Clodronate Liposomes500 µg/ml clodronateLiposoma
Collagenase Type 21 mg/ml, 315 U/mgWorthingtonLS004176
CyQUANT LDH Cytotoxicity Assay KitInvitrogenC20301
DAPIFlow cytometry: 0.2 µg/mlThermo Fisher62248
Ethanol70%Carl RothT913.1
F4/80 – AF647Flow cytometry: 1:100InvitrogenMF48021
F4/80 – PE-Cy7Flow cytometry: 1:200Invitrogen25-4801-82
Fetal Calf Serum1.10Gibco10270106
Fetal Calf Serum1.20Gibco10270106
HBSS (-Mg, -Ca)Gibco14170138
HEPES13 mMRothHN77.2
Hoechst 333421:10,000Life TechnologiesH3570
LysoTracker – AF647Flow cytometry: 1:20000; Staining: 1:10000InvitrogenH34477
MAC-2Staining: 1:1000CedarlaneCL8942AP
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µmMerck MilliporePICM0RG50
PBS (-Mg, -Ca)Gibco14190169
PBS (-Mg, -Ca)Gibco14190169
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/ml)0.111111111Gibco11548876
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/ml)0.111111111Gibco11548876
Perilipin2 µg/mlAbcamab3526
Plexxicon 562240 µMPlexxicon Inc.HY-114153
RPMI-Media 1640with 11 mM glucoseSigma AldrichR8758
RPMI-Media 1640SigmaR8758
TC-Insert for 6-well platesSarstedt83.3930.040
TPP tissue culture test plate 6TPP92006
Triton X-1001%Carl Roth3051.2
Zinc chloride0.8 mMSigmaZ0152
Zinc formalinePolyscience21516-3.75
```

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