Imagem Padronizada por Imunofluorescência de Nanotubos de Tunelamento e Transferência Mitocondrial entre Astrócitos e Neurônios

Resumo

Esse protocolo padroniza métodos de fixação, coloração e imagem confocal para visualizar nanotubos de tunelamento e transferência mitocondrial entre astrócitos e neurônios in vitro.

Resumo

Mitocôndrias são organelos essenciais que regulam a produção de energia, a sinalização celular e a homeostase metabólica nas células neurais. Nanotubos tunelantes (TNTs) são estruturas membranosas finas que mediam a comunicação intercelular a longa distância e facilitam a transferência de componentes celulares, incluindo mitocôndrias, entre células conectadas. A visualização confiável de TNTs e transferência mitocondrial requer manuseio cuidadoso da amostra, pois essas estruturas são altamente frágeis e sensíveis a condições de fixação, lavagem e imagem. Este protocolo descreve procedimentos padronizados para fixação, coloração e imagem confocal de TNTs em astrócitos e sistemas de cocultura astrócito-neurônio. O fluxo de trabalho inclui coloração de membrana e citoesqueleto para visualização de TNT, marcagem mitocondrial para rastreamento da localização mitocondrial e coloração por imunofluorescência para análise de colocalização por Miro1. Passos críticos para preservar a morfologia do TNT, incluindo lavagem suave e manuseio protegido contra a luz, são enfatizados ao longo de todo o procedimento. O protocolo também descreve abordagens de imagem para a caracterização de TNTs e mitocôndrias em preparações de células fixas. Esses métodos fornecem uma estrutura experimental reprodutível para estudar a formação de TNT e a transferência mitocondrial entre células neurais in vitro.

Introdução

As mitocondrias atuam como fábricas de energia da célula, fornecendo a energia necessária para as atividades celulares por meio da produção de trifosfato de adenosina, além de desempenhar papéis importantes na transdução de sinais celulares e no equilíbrio^{redox 1}. No sistema nervoso, os metabólitos mitocondriais podem aumentar a complexidade e a excitabilidade dos processos neuronais, apoiando assim o crescimento e desenvolvimento^{neuronal 2}. Mitocôndrias não são organelos estáticos; elas alteram continuamente sua morfologia, localização e distribuição para se adaptar a vários estresses intracelulares e extracelulares e demandas^{metabólicas 3}. A transferência mitocondrial intercelular contribui para a manutenção da homeostase dos tecidos e promove o desenvolvimento sob condições fisiológicas, enquanto sob condições patológicas, participa da reparação de danos, regulação imune e progressão^{da doença 4,5}.

A comunicação intercelular de materiais e energia é essencial para vários processos biológicos, incluindo homeostase celular, reparo de tecidos e regulação de redes neurais. Estudos atuais revelaram múltiplos modos de comunicação intercelular, entre os quais os nanotubos de tunelamento (TNTs) representam um dos mecanismos mais amplamente estudados associados à transferência mitocondrial^{intercelular 6}. Os TNTs são estruturas de membrana em forma de ponte, baseadas em F-actina, com morfologia tubular, variando de 50 a 200 nm de diâmetro e estendendo-se até vários diâmetros celulares em comprimento⁷. Pesquisas mostraram que os TNTs podem funcionar como conexões físicas entre células neurais e estão intimamente associados ao início e progressão de doenças neurodegenerativas, câncer cerebral e outros distúrbios. Por exemplo, a transferência mitocondrial da microglia para os neurônios via TNTs foi relatada como salvadora de células^{neuronais 8,9}.

Pesquisas atuais sobre TNTs frequentemente enfrentam vários desafios, incluindo a fragilidade estrutural dos TNTs, que os torna propensos a quebras e podendo, consequentemente, afetar os resultados experimentais; dificuldade em distinguir TNTs de filópódios ou outras protuberâncias membranais; e desafios associados à quantificação precisa de TNTs intercelulares. Para melhorar a reprodutibilidade e consistência dos estudos relacionados ao TNT, são necessários métodos padronizados para lavagem, fixação, coloração e imagem dos TNTs para permitir uma avaliação precisa de sua estrutura e distribuição, minimizando a variabilidade experimental. Fatores como densidade celular antes da fixação, proteção contra a luz, intensidade de lavagem, duração da fixação e condições de coloração pós-fixação podem influenciar a estrutura e estabilidade dos TNTs. Neste estudo, descrevemos procedimentos para pré-tratamento, coloração e imagem confocal de TNTs e estruturas de TNT associadas a mitocôndrias em sistemas de cultura de astrócitos e de neurônios-astrócitos.

Esse protocolo de pesquisa pode ser geralmente aplicado à maioria dos ambientes laboratoriais. A validação em astrócitos primários e em uma linhagem neuronal do hipocampo de camundongos confirmou que o protocolo é adequado tanto para células neurais primárias quanto para linhagens celulares imortalizadas. No entanto, esse protocolo ainda apresenta várias limitações. A microscopia confocal oferece menor resolução espacial do que as abordagens de imagem de superresolução para visualização de TNT, e a avaliação baseada em MitoTracker da transferência mitocondrial pode ser afetada por vazamento de corante e interferência de sinal não^{mitocondrial 10}.

Protocolo

Este estudo não envolveu indivíduos humanos nem animais vertebrados vivos; Apenas linhas celulares comercialmente obtidas ou estabelecidas foram usadas, e não era necessária aprovação ética.

1. Coloração para TNTs em Astrócitos

1. Semeadura de Células
   1. Semente isola astrócitos primários de ratos na passagem 3 (P3) em recipientes de cultura de fundo de vidro de 35 mm com densidade de 5 × 10⁴ células por prato. Adicione 2 mL do meio completo Modified Eagle/Nutrient Medium F-12 (DMEM/F-12) da Dulbecco, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de mistura tripla de antibióticos (penicilina G, estreptomicina e anfotericina B). Cultive as células a 37°C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO₂.
   2. Incube as células por aproximadamente 24 horas até que ocorra a união.
2. Pré-tratamento e fixação
   1. Transfira os recipientes de cultura para uma bancada limpa sob condições protegidas pela luz após a fixação da célula.
      NOTA: Minimize movimentos e vibrações desnecessários durante o manuseio para preservar a integridade do TNT.
   2. Remova o meio de cultura delicadamente sob condições de pouca luz.
      NOTA: Evite o secamento completo da superfície celular durante a remoção do meio, pois os TNTs podem colapsar e se fixar no substrato da cultura.
   3. Lave suavemente as células uma vez com 500 μL de soro salino tamponado com fosfato (PBS) sem íons de cálcio e magnésio (pH 7,3–7,5). Adicione e remova o PBS lentamente ao longo da parede do prato de cultura para evitar perturbar os TNTs intercelulares durante a lavagem.
   4. Remova o PBS com cuidado.
   5. Fixe as células com uma solução fixadora comercial de 4% contendo paraformaldeído (pH 7,2–7,4) por 30 minutos à temperatura ambiente (RT; 20°C–25°C) em condições de luz fraca.
      ATENÇÃO: Manuseie soluções fixadoras usando equipamentos de proteção individual adequados e realize todos os procedimentos de acordo com as diretrizes institucionais de segurança química.
   6. Remova a solução fixativa.
   7. Lave as células uma vez com PBS.
3. Permeabilização Celular e Coloração Fluorescente
   1. Permeabilize as células com 500 μL de solução de permeabilização Triton X-100 pronta para uso por 20 minutos em RT.
      ATENÇÃO: O Triton X-100 pode perturbar estruturas frágeis de TNT. Minimize a agitação excessiva durante a permeabilização.
   2. Remova a solução de permeabilização.
   3. Lave as células uma vez com PBS.
   4. Prepare a solução de mancha imediatamente antes do uso. Dilua o corante de coloração F-actina no PBS até uma concentração final de 1 μM e use 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) como coloração nuclear pronta para uso. Misture bem as duas soluções de tingimento antes de usar.
      NOTA: Reagentes de coloração à base de faloidinas podem ser usados como alternativas para a visualização da F-actina.
   5. Misture as soluções de F-actina e coloração nuclear em proporção 1:1 (volumes iguais) sob condições de proteção à luz.
   6. Adicione a solução de tingimento preparada aos pratos de cultura.
   7. Incube as células por 30 minutos a 37°C no escuro.
   8. Remova a solução de mancha.
   9. Lave as células três vezes com PBS usando 500 μL por lavagem por 1 minuto em cada lavagem.
   10. Adicione 1 mL de PBS para evitar que as células sequem durante a preparação por imagem.
4. Imagem Confocal
   1. Adquira imagens usando um microscópio confocal invertido Nikon equipado com uma lente objetiva ×20. Use excitação de 405 nm para DAPI e excitação de 488 nm para coloração de F-actina. Capture imagens com resolução de 1024 × 1024 pixels sob condições de proteção à luz em RT.
   2. Realize avaliação qualitativa e quantificação manual usando pelo menos cinco campos de visão selecionados aleatoriamente por amostra. Quantifique o número de TNTs e o número de células TNT-positivas contendo uma ou mais células TNTs em cada campo de visão (Figuras 1A e 1B).
      NOTA: Adquira imagens imediatamente após a coloração para minimizar a perda de fluorescência e a perturbação estrutural dos TNTs.

Figura 1: Coloração por fluorescência de nanotubos de túnel (TNTs) em astrócitos. (A) Imagens representativas de microscopia confocal mostrando coloração nuclear e F-actina em astrócitos cultivados em placas de cultivo com fundo de vidro. (B) Vista ampliada da região encaixotada no painel A. Setas brancas indicam estruturas semelhantes a TNT entre células adjacentes. (C) Imagens representativas mostrando estruturas semelhantes a TNT desintegradas após manuseio inadequado da amostra. (D) Vista ampliada da região encaixotada no painel C. Setas amarelas indicam estruturas semelhantes a TNT perturbadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

2. Coloração para transferência mitocondrial de astrócitos para neurônios via TNTs

1. Semeadura de Astrócitos e Marcagem Mitocondrial
   1. Semente isola astrócitos primários de ratos na passagem 3 (P3) em recipientes de cultura de fundo de vidro de 35 mm com densidade de 3 × 10⁴ células por prato. Adicione 2 mL de meio completo DMEM/F-12 suplementado com 10% de FBS e 1% de mistura antibiótica tripla (penicilina G, estreptomicina e anfotericina B). Cultive as células a 37°C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO₂.
   2. Incube as células por aproximadamente 24 horas até que ocorra a união.
   3. Transfira os pratos de cultura para uma bancada limpa sob condições de luz fraca após a fixação da célula.
      NOTA: Minimize movimentos e vibrações desnecessários durante o manuseio para preservar a integridade do TNT.
   4. Remova o meio de cultivo suavemente sob condições de proteção à luz. Evite interromper os TNTs durante a remoção do meio.
      NOTA: Evite o secamento completo da superfície celular durante a remoção do meio, pois os TNTs podem colapsar e se fixar no substrato da cultura.
   5. Reconstitua 50 μg de corante MitoTracker liofilizado em dimetil sulfóxido (DMSO) para preparar uma solução de estoque de 1 mM e armazene a solução de estoque a −20°C. Antes do uso, dilua a solução original em 400 μL de meio completo DMEM/F-12 suplementado com mistura de 10% FBS e 1% de antibiótico triplo para obter uma concentração final de MitoTracker de 50 μM.
      ATENÇÃO: Proteja os corantes fluorescentes da exposição direta à luz durante os procedimentos de preparação e incubação.
   6. Adicione a solução de trabalho de coloração mitocondrial aos pratos de cultura.
   7. Incube as células a 37°C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO₂ por 30 minutos sob condições protegidas à luz.
   8. Remova a solução de coloração mitocondrial em condições de proteção à luz.
   9. Lave suavemente as células uma vez com 500 μL de PBS sem íons de cálcio e magnésio (pH 7,3–7,5). Adicione e remova o PBS lentamente ao longo da parede do prato de cultura para evitar perturbar os TNTs intercelulares durante a lavagem.
   10. Remova o PBS com cuidado.
2. Cocultura Astrócito-Neurônio
   1. Semente imortalizou células neuronais do hipocampo de camundongos na passagem 3 (P3) para os pratos de cultura contendo astrócitos com densidade de 3 × 10⁴ células por prato. Adicionar células em um volume total de 2 mL, consistindo em uma mistura 1:1 de DMEM e meio completo DMEM/F-12 suplementada com 10% de FBS e 1% de mistura tripla de antibióticos. Estabeleça a cocultura usando um método de contato direto, sem inserção Transwell. Cultive as células a 37°C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO₂.
      NOTA: Adicione células neuronais suavemente para minimizar a perturbação das estruturas pré-existentes de TNT.
   2. Mantenha a cocultura por 24 horas sob condições padrão de incubadora, protegendo as amostras de exposições desnecessárias à luz durante os procedimentos de manuseio.
3. Fixação e permeabilização
   1. Remova o meio de cultivo em condições de proteção à luz.
   2. Lave as células uma vez com PBS.
   3. Fixe as células com solução fixadora de células de tecido a 4% contendo paraformaldeído por 30 minutos em temperatura retal (RT) sob condições de luz fraca.
      ATENÇÃO: Manuseie soluções fixadoras usando equipamentos de proteção individual adequados e realize todos os procedimentos de acordo com as diretrizes institucionais de segurança química.
   4. Remova a solução fixativa.
   5. Lave as células uma vez com PBS.
   6. Permeabilize as células com 500 μL de solução de permeabilização Triton X-100 pronta para uso por 20 minutos em RT sob condições de luz fraca.
      ATENÇÃO: O Triton X-100 pode perturbar estruturas frágeis de TNT. Minimize a agitação excessiva durante a permeabilização.
   7. Remova a solução de permeabilização.
   8. Lave as células uma vez com PBS.
4. Coloração e Imagem por Fluorescência
   1. Prepare a solução de mancha imediatamente antes do uso. Dilua o corante de coloração F-actina no PBS até uma concentração final de 1 μM e use DAPI como corante nuclear pronto para uso. Misture bem as soluções de mancha antes de usar.
      NOTA: Reagentes de coloração à base de faloidinas podem ser usados como alternativas para a visualização da F-actina.
   2. Misture as soluções de F-actina e coloração nuclear em proporção 1:1 (volumes iguais) sob condições de proteção à luz imediatamente antes do uso.
   3. Adicione a solução de tingimento preparada aos pratos de cultura.
   4. Incube as células por 30 minutos a 37°C no escuro.
   5. Remova a solução de mancha.
   6. Lave as células três vezes com PBS usando 500 μL por lavagem por 1 minuto em cada lavagem.
   7. Adicione 1 mL de PBS para evitar que as células sequem durante a preparação por imagem.
   8. Adquira imagens usando um microscópio confocal invertido Nikon equipado com uma lente objetiva ×20. Use excitação de 405 nm para DAPI, excitação de 488 nm para coloração com F-actina e excitação de 665 nm para coloração com MitoTracker. Capture imagens com resolução de 1024 × 1024 pixels sob condições de proteção à luz em RT.
   9. Realize uma avaliação qualitativa usando pelo menos cinco campos de visão selecionados aleatoriamente por amostra. Avalie a presença de estruturas semelhantes a TNT e sinais de fluorescência associados a mitocôndrias nas conexões intercelulares da membrana (Figuras 2A e 2B).
      NOTA: Adquira imagens imediatamente após a coloração para minimizar a perda de fluorescência e a perturbação estrutural dos TNTs.

Figura 2: Coloração por fluorescência de mitocôndrias e TNTs em um sistema de cocultura de astrócito-neurônio. (A) Imagens representativas de microscopia confocal mostrando coloração nuclear, mitocondrial e F-actina em astrócitos e neurônios cultivados em placas de cultura com fundo de vidro. Os astrócitos apresentavam morfologias irregulares semelhantes a estrelas ou poligonais com processos celulares estendidos, enquanto as células neuronais apareciam redondas ou ovais com extensões esbeltas semelhantes a neuritas. (B) Vista ampliada da região encaixotada no painel A. Setas brancas indicam estruturas semelhantes a TNT associadas a mitocôndrias entre as células. As duas populações celulares foram distinguidas com base em sua morfologia celular característica. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Coloração por Colocalização por Imunofluorescência para Mitocôndrias e Miro1 em TNTs

1. Semeadura de Astrócitos e Marcagem Mitocondrial
   1. Semente isola astrócitos primários de ratos na passagem 3 (P3) em recipientes de cultura de fundo de vidro de 35 mm com densidade de 3 × 10⁴ células por prato. Adicione 2 mL de meio completo DMEM/F-12 suplementado com 10% de FBS e 1% de mistura antibiótica tripla (penicilina G, estreptomicina e anfotericina B). Cultive as células a 37°C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO₂.
   2. Incube as células por aproximadamente 24 horas até que ocorra a união.
   3. Transfira os pratos de cultura para uma bancada limpa sob condições de luz fraca após a fixação da célula.
      NOTA: Minimize movimentos e vibrações desnecessários durante o manuseio para preservar a integridade do TNT.
   4. Remova o meio de cultivo suavemente sob condições de proteção à luz. Evite interromper os TNTs durante a remoção do meio.
      NOTA: Evite o secamento completo da superfície celular durante a remoção do meio, pois os TNTs podem colapsar e se fixar no substrato da cultura.
   5. Reconstitua 50 μg de corante MitoTracker liofilizado em DMSO para preparar uma solução de 1 mM e armazene a solução de estoque a −20°C. Antes do uso, dilua a solução original em 400 μL de meio completo DMEM/F-12 suplementado com mistura de 10% FBS e 1% de antibiótico triplo para obter uma concentração final de MitoTracker de 50 μM.
      ATENÇÃO: Proteja os corantes fluorescentes da exposição direta à luz durante os procedimentos de preparação e incubação.
   6. Adicione a solução de trabalho de coloração mitocondrial aos pratos de cultura.
   7. Incube as células a 37°C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO₂ por 30 minutos sob condições protegidas à luz.
   8. Remova a solução de coloração mitocondrial em condições de proteção à luz.
   9. Lave suavemente as células uma vez com 500 μL de PBS sem íons de cálcio e magnésio (pH 7,3–7,5). Adicione e remova o PBS lentamente ao longo da parede do prato de cultura para evitar perturbar os TNTs intercelulares durante a lavagem.
   10. Remova o PBS com cuidado.
2. Cocultura Astrócito-Neurônio
   1. Semente imortalizou células neuronais do hipocampo de camundongos na passagem 3 (P3) para os pratos de cultura contendo astrócitos com densidade de 3 × 10⁴ células por prato. Adicionar células em um volume total de 2 mL, consistindo em uma mistura 1:1 de DMEM e meio completo DMEM/F-12 suplementada com 10% de FBS e 1% de mistura tripla de antibióticos. Estabeleça a cocultura usando um método de contato direto, sem inserção Transwell. Cultive as células a 37°C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO₂.
      NOTA: Adicione células neuronais suavemente para minimizar a perturbação das estruturas pré-existentes de TNT.
   2. Mantenha a cocultura por 24 horas sob condições padrão de incubadora, protegendo as amostras de exposições desnecessárias à luz durante os procedimentos de manuseio.
3. Fixação e permeabilização
   1. Remova o meio de cultivo em condições de proteção à luz.
   2. Lave as células uma vez com PBS.
   3. Fixe as células com uma solução fixadora comercial de 4% contendo paraformaldeído (pH 7,2–7,4) por 30 minutos em RT sob condições de luz fraca.
      ATENÇÃO: Manuseie soluções fixadoras usando equipamentos de proteção individual adequados e realize todos os procedimentos de acordo com as diretrizes institucionais de segurança química.
   4. Remova a solução fixativa.
   5. Lave as células uma vez com PBS.
   6. Permeabilize as células com 500 μL de solução de permeabilização Triton X-100 pronta para uso por 20 minutos em RT sob condições de luz fraca.
      ATENÇÃO: O Triton X-100 pode perturbar estruturas frágeis de TNT. Minimize a agitação excessiva durante a permeabilização.
   7. Remova a solução de permeabilização.
   8. Lave as células uma vez com PBS.
4. Bloqueio e Coloração por Imunofluorescência
   1. Bloqueie as células com soro de cabra a 5% por 1 hora em RT sob condições de pouca luz. Prepare a solução bloqueante diluindo o soro de cabra 1:20 em PBS.
   2. Remova a solução bloqueadora.
   3. Diluir anticorpo monoclonal anti-Miro1 de coelho em PBS com uma razão de diluição de 1:100. Adicione a solução primária diluída de anticorpos aos recipientes de cultura e incube durante a noite (12–16 h) a 4°C.
      NOTA: Proteja as amostras marcadas com fluorescência da exposição direta à luz durante todo o processo de coloração.
   4. Remova a solução primária de anticorpos.
   5. Lave as células três vezes com PBS usando 500 μL por lavagem por 1 minuto em cada lavagem.
   6. Dilua o anticorpo secundário fluorescente anti-coelho IgG do coelho no PBS com uma razão de diluição de 1:100. Adicione 500 μL de solução secundária diluída de anticorpos a cada recipiente de cultura e incube por 1 hora em condições de proteção à luz.
      NOTA: Um controle sem anticorpos primários não foi incluído no presente estudo. Experimentos futuros devem incorporar controles apropriados de imunofluorescência para validar ainda mais a especificidade da coloração.
   7. Remova a solução secundária fluorescente de anticorpos.
5. Contracoloração e Imagem Fluorescentes
   1. Prepare a solução de mancha imediatamente antes do uso. Dilua o corante de coloração F-actina no PBS até uma concentração final de 1 μM e use DAPI como corante nuclear pronto para uso. Misture bem as soluções de mancha antes de usar.
      NOTA: Reagentes de coloração à base de faloidinas podem ser usados como alternativas para a visualização da F-actina.
   2. Adicione a solução de tingimento aos recipientes de cultura.
   3. Incube as células por 30 minutos a 37°C no escuro.
   4. Remova a solução de mancha.
   5. Lave as células três vezes com PBS usando 500 μL por lavagem por 1 minuto em cada lavagem.
   6. Adicione 1 mL de PBS para evitar que as células sequem durante a preparação por imagem.
   7. Adquira imagens usando um microscópio confocal invertido Nikon equipado com uma lente objetiva ×20. Colete imagens do Z-stack usando um passo de 5 μm em uma faixa total de imagem de 40 μm (8 seções ópticas). Use excitação de 405 nm para DAPI, excitação de 488 nm para coloração com F-actina, excitação de 594 nm para imunocoloração com Miro1 e excitação de 665 nm para coloração com MitoTracker. Capture imagens com resolução de 1024 × 1024 pixels sob condições de proteção à luz em RT.
   8. Realize uma avaliação qualitativa usando pelo menos cinco campos de visão selecionados aleatoriamente por amostra. Avalie estruturas semelhantes a TNT, sinais de fluorescência associados a mitocôndrias e aparente colocalização entre Miro1 e coloração associada a mitocôndrias nas conexões intercelulares da membrana (Figuras 3A–3C).
      NOTA: Adquira imagens imediatamente após a coloração para minimizar a perda de fluorescência e a perturbação estrutural dos TNTs.

Figura 3: Coloração por colocalização de mitocôndrias e Miro1 em TNTs em um sistema de cocultura de astrócitos-neurônios. (A) Imagens representativas de microscopia confocal mostrando coloração nuclear, mitocondrial, Miro1 e F-actina em astrócitos e neurônios cultivados em placas de cultura com fundo de vidro. Setas brancas indicam regiões de aparente colocalização entre sinais associados a mitocôndrias e Miro1 dentro de estruturas semelhantes a TNT. (B) Imagem tridimensional reconstruída em Z-stack mostrando estruturas semelhantes a TNT formadas entre células adjacentes. (C) Reconstrução em vista lateral da mesma imagem do Z-stack mostrando estruturas semelhantes a TNT se estendendo entre células adjacentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Resultados

Em preparações de monocultura de astrócitos, protuberâncias finas de membrana conectando células adjacentes foram observadas após coloração por F-actina e nuclear (Figuras 1A e 1B). Múltiplas estruturas semelhantes a TNT foram detectadas se estendendo entre astrócitos vizinhos, e astrócitos individuais frequentemente formavam conexões com várias células ao redor. A preservação bem-sucedida de estruturas semelhantes a TNT esteve associada a manuseio suave durante os procedimentos de lavagem e fixação. Distúrbios mecânicos excessivos durante a remoção ou lavagem do meio resultaram em menor detecção e perturbação estrutural dessas conexões de membrana, como mostrado em estruturas semelhantes a TNT interrompidas após manuseio inadequado de amostras (Figuras 1C e 1D).

Em preparações de cocultura astrócito-neurônio, sinais de fluorescência associados a mitocôndrias foram observados em estruturas semelhantes a TNT conectando células adjacentes após coloração com MitoTracker e imagens confocais (Figuras 2A e 2B). Essas estruturas foram visualizadas juntamente com F-actina e coloração nuclear para apoiar a avaliação morfológica das conexões semelhantes ao TNT. A proteção adequada da luz e a minimização da intensidade da lavagem melhoraram a preservação do sinal de fluorescência e da morfologia do TNT durante a preparação de imagem.

Em experimentos de colocalização por imunofluorescência, sinais de fluorescência sobrepostos correspondentes à coloração associada a mitocôndrias e à imunocoloração com Miro1 foram observados em estruturas semelhantes a TNT em preparações de cocultura de astrócito-neurônio (Figura 3A). Essas observações sugerem uma possível associação entre Miro1 e mitocôndrias localizadas em estruturas semelhantes a TNT. Imagens tridimensionais reconstruídas com pilha Z reforçaram ainda a presença de estruturas semelhantes a TNT que se estendem entre células adjacentes (Figuras 3B e 3C). A preservação do TNT, a intensidade do sinal de fluorescência e a qualidade da imagem foram influenciadas por fixação, permeabilização e condições de imagem.

Discussão

O primeiro passo crítico no protocolo experimental descrito acima é o pré-tratamento protegido pela luz antes da fixação. Estruturas semelhantes a TNT são altamente frágeis, e manter condições de proteção à luz após a remoção da incubadora é importante para preservar a intensidade do sinal de fluorescência e a integridade estrutural durante a preparação da amostra. A segunda etapa crítica é realizar a lavagem de PBS com manipulação suave para minimizar a perturbação das estruturas semelhantes ao TNT causada pelo fluxo de fluido. A adesão a esses procedimentos chave de manuseio ajuda a preservar a morfologia e a estabilidade das estruturas semelhantes ao TNT e melhora a consistência dos resultados subsequentes de imagem. Aspiração excessiva, lavagem prolongada ou agitação forte do fluido podem levar ao colapso ou fragmentação de estruturas semelhantes a TNT durante o processamento da amostra. Devido à sua natureza altamente dinâmica, os TNTs são sensíveis à luz. A fototoxicidade induzida pela exposição à luz pode causar perturbação do TNT, tornando essas estruturas difíceis de^{visualizar 11}. Portanto, condições protegidas contra a luz devem ser mantidas durante experimentos relacionados ao TNT.

O movimento mitocondrial intracelular contribui para a distribuição de energia celular, especialmente nos neurônios. Estudos mostraram que as mitocôndrias podem se mover ao longo dos filamentos de actina e^{microtúbulos 12}. Estudos recentes também demonstraram que os TNTs podem funcionar como estruturas de comunicação intercelular de longa distância associadas à transferência mitocondrial entre células^{neurais 13}. A abordagem metodológica descrita neste estudo permite a visualização de estruturas semelhantes a TNT e sinais de fluorescência associados a mitocôndrias em sistemas de cultura celular neural. Estudos anteriores mostraram que a transferência intercelular mitocondrial entre células neurais pode contribuir para a reparação de tecidos e processos neuroprotetores em distúrbios neurológicos como a doença de Parkinson e lesão isquêmica^{cerebral 14,15}. Utilizando os métodos descritos neste estudo, estruturas semelhantes a TNT foram observadas entre astrócitos e entre astrócitos e neurônios, juntamente com sinais de fluorescência associados a mitocôndrias localizados dentro dessas estruturas.

Como observado em estudos^{anteriores 10}, a coloração por MitoTracker está sujeita a vazamento de corante e transferência de sinal não mitocondrial, o que pode reduzir a confiabilidade dos dados. Para enfrentar essa limitação, futuras investigações devem empregar métodos mais robustos, como a marcação mitocondrial geneticamente codificada, para obter resultados mais conclusivos. Nas condições experimentais atuais, os dois tipos celulares foram distinguidos com base na morfologia celular, uma abordagem que pode reduzir a especificidade de identificação do tipo celular. Estudos futuros devem incorporar marcação fluorescente específica de tipo celular para melhorar a precisão da análise de cocultura. Miro1 é uma proteína adaptadora localizada na membrana mitocondrial externa e tem sido implicada nos processos de transporte mitocondrial nos^{neurônios 16,17}. Utilizando o protocolo de colocalização por imunofluorescência descrito neste estudo, sinais de fluorescência sobrepostos correspondentes à coloração associada a mitocôndrias e à imunocoloração com Miro1 foram observados em estruturas semelhantes a TNT. Essas observações sugerem uma possível associação entre Miro1 e mitocôndrias localizadas em estruturas semelhantes a TNT. No entanto, a resolução espacial da microscopia confocal convencional pode limitar a avaliação definitiva da colocalização molecular em protuberâncias finas de membrana.

Realizamos imagens com pilha Z para confirmar a presença de estruturas semelhantes a TNT entre células, apoiando assim a validação estrutural dessas conexões de membrana. Embora o protocolo atual seja adequado para a maioria dos ambientes experimentais, a imagem confocal de células fixas pode resultar na perda de estruturas frágeis semelhantes a TNT durante o processamento da amostra em comparação com a imagem de células vivas, limitando assim a quantificação precisa do^{TNT 18}. Além disso, a imagem de células fixas não permite a determinação inequívoca da direcionalidade de transferência mitocondrial, o que justifica investigações adicionais em estudos futuros. Esse protocolo oferece um fluxo de trabalho experimental padronizado para colorir estruturas semelhantes a TNT, sinais associados a mitocôndrias e proteínas relacionadas em sistemas de cultura celular neural. Comparado aos procedimentos de lavagem e fixação descontroladas, o protocolo enfatiza o manuseio suave da amostra e a preservação da fluorescência durante a preparação da imagem. Esses métodos podem ajudar a melhorar a consistência experimental e a reprodutibilidade em estudos de imagem relacionados a TNT.

Em resumo, este estudo fornece um protocolo de laboratório prático e amplamente aplicável para a avaliação qualitativa dos TNTs e a investigação do transporte mitocondrial por meio de estruturas semelhantes a TNTs. No entanto, etapas de processamento da amostra, como fixação e lavagem, podem introduzir variabilidade de quantificação em comparação com abordagens de imagem de células vivas. Além disso, a microscopia confocal oferece menor resolução espacial do que a microscopia de superresolução, o que limita a caracterização estrutural detalhada dos TNTs. Além disso, a coloração mitocondrial baseada em MitoTracker é afetada por vazamento de corante e transferência de sinal inespecífica, o que deve ser abordado em estudos futuros para melhorar a precisão experimental.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1% triple antibiotic mixture	Biosharp	BL142A	Previne a contaminação bacteriana e fúngica durante a cultura celular
4% Tissue Cell Fixative	Solarbio	P1110	Reagente de fixação celular
Anti-Miro1 antibody	Abcam	AB319154	Anticorpo primário contra Miro1
Astrocytes	Primary cells isolated in laboratory	NA	Astrocitos foram isolados do córtex cerebral de filhotes de ratos SD neonatais com 1–3 dias de idade. A pureza das células isoladas foi confirmada como >95% por coloração GFAP, e células de passagem 3 (P3) foram usadas para todos os experimentos
Astrocyte cell culture medium medium (DMEM/F-12)	Gibco	6125011	DMEM e F-12 foram misturados em uma proporção de 1:1 (v/v), suplementados com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de antibióticos triplos
Confocal microscope	Nikon AX	ECLIPSE TI2-E	As imagens foram adquiridas usando um microscópio confocal Nikon AX (Nikon Corporation, Japão) controlado por NIS-Elements (versão 5.4)
DAPI	Servicebio	G1012-100ML	Corante de coloração nuclear
DMSO	BioFroxx	1084ML100	Solvente usado para a preparação de soluções estoque de corantes fluorescentes
F-actin staining dye	Thermo Fisher Scientific	A57243	Reagente de coloração F-actin para visualização de estruturas do citoesqueleto e nanotúbulos tunelizados
Fetal bovine serum	ExCell Bio	FSD500	Fornece nutrientes essenciais para a cultura celular
Fluorescent secondary antibody (Goat Anti-Rabbit IgG)	ABclonal	AS039	Anticorpo secundário para coloração por imunofluorescência
Glass-bottom cell culture dish	NEST	801001	Prato de imagem para microscopia confocal
Goat serum	Solarbio	210C051	Reagente de bloqueio para coloração por imunofluorescência
MitoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	M22426	Corante de coloração mitocondrial
Neurons	Cell Bank of CAS	HT22-GNM47	Células neuronais hipocampais de camundongo imortalizadas foram mantidas em meio completo DMEM. Células na passagem 3 (P3) foram coletadas e usadas para experimentos subsequentes.
Neuron cell culture medium (DMEM)	Servicebio	G4511-500ML	DMEM suplementado com GlutaPlus e piruvato de sódio, sem HEPES, suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de antibióticos triplos
Phosphate-buffered saline (PBS)	Servicebio	G4203-500ML	Tampão de lavagem usado durante fixação e coloração
Triton X-100	Solarbio	P1080	Reagente de permeabilização celular