Dissecação e isolamento dos gânglios dorsais da raiz do camundongo

Resumo

Os gânglios da raiz dorsal (DRG) contêm corpos celulares primários de neurônios sensoriais e transmitem sinais sensoriais periféricos para a medula espinhal. Este protocolo descreve um método para dissecação por DRG de camundongos que suporta o isolamento padronizado de gânglios estruturalmente intactos, identificação segmentar anatômica, orientação intuitiva para usuários iniciantes e redução de lesão processual no tecido.

Resumo

Os gânglios da raiz dorsal (DRG), que contêm os corpos celulares dos neurônios sensoriais primários, servem como estruturas de retransmissão críticas para a transmissão de sinais sensoriais dos tecidos periféricos para a medula espinhal. Eles desempenham papéis essenciais em estudos sobre dor, lesões nervosas e doenças neurodegenerativas. A aquisição de tecido DRG intacto é crucial para investigar as propriedades funcionais, a expressão molecular e as alterações patológicas dos neurônios sensoriais. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho e localização profunda dentro do canal vertebral, a identificação precisa e o isolamento da DRG apresentam desafios técnicos significativos. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo padronizado para o isolamento da DRG de camundongos. Este método fornece uma descrição detalhada da localização anatômica da DRG, exposição do canal vertebral e as etapas principais envolvidas no isolamento dos gânglios. Todo o procedimento é ilustrado com imagens representativas e gravações de vídeo. Essa abordagem apoia a aquisição de DRG estruturalmente intacta com orientação anatômica para identificação segmentária e é adequada para coloração H&E e análise de imunofluorescência. Comparado aos métodos anteriores de dissecação com DRG, este método permite a recuperação padronizada dos gânglios identificados segmentalmente, fornece orientação anatômica intuitiva para usuários iniciantes e reduz lesões processuais de tecido.

Introdução

Os gânglios da raiz dorsal (DRG), que contêm os corpos celulares dos neurônios sensoriais primários, são estruturas essenciais para transmitir sinais sensoriais periféricos — incluindo estímulos mecânicos, térmicos e nociceptivos — para a medula^{espinhal 1,2,3}. Embora recursos de alta qualidade que descrevam a DRG estejam atualmente disponíveis, ainda é necessário um guia procedimental detalhada para apoiar a identificação precisa e o isolamento da DRG do segmento torácico ao sacro dentro de um único espaçom, minimizando o risco de dano da DRG durante a coleta de tecido.

Os neurônios DRG são componentes-chave da via sensorial periférica. Seus axônios se bifurcam, com um ramo estendendo-se para os tecidos periféricos e o outro projetando-se para o corno dorsal da medula espinhal, desempenhando papéis críticos na transmissão da dor, lesão nervosa, respostas inflamatórias e patogênese de vários distúrbios^{neurológicos 4}. Além disso, a DRG atraiu considerável atenção em áreas de pesquisa como reparação de lesões nervosas, mecanismos de dor crônica, plasticidade dos neurônios sensoriais e regulação^{neuroimune 5,6}. Uma ampla gama de estudos experimentais requer tecido DRG intacto para aplicações que incluem coloração imunohistoquímica, análise de sequenciamento de RNA, cultura neuronal primária e estudos^{eletrofisiológicos.} Portanto, a aquisição de tecido DRG estruturalmente intacto e identificado com precisão por segmentos é fundamental para estudos de circuitos neurais sensoriais, características moleculares neuronais e alterações patológicas.

Os DRG estão localizados próximos aos forames intervertebrais e estão conectados à medula espinhal pelas raízes dorsais. Devido ao seu pequeno tamanho, ao encerramento dentro de estruturas ósseas e à complexidade da anatomia ao redor, o isolamento intacto apresenta consideráveis desafios técnicos. Além disso, a falta de marcos anatômicos claros e procedimentos padronizados aumenta o risco de danos estruturais ou identificação segmentar errada durante a coleta de tecidos.

Comparado aos métodos existentes de dissecação com DRG em camundongos, o método estabelecido neste estudo apresenta várias vantagens. Primeiro, os métodos de isolamento de DRG em camundongos já relatados geralmente exigem a remoção da coluna vertebral do animal, seguida pela segmentação e abertura da linha média da coluna isolada, após o que os DRG são dissecados dos foramines intervertebrais. Durante esse processo, a transeção da coluna vertebral e cortes repetidos podem facilmente causar danos mecânicos à DRG e também podem resultar na omissão de certos segmentos ou identificação segmentar^{pouco clara 8}. Em contraste, nosso método é realizado diretamente in situ no camundongo, sem isolamento prévio ou transeção da coluna vertebral, reduzindo assim o risco de perda de DRG durante a coleta de tecido. Durante todo o procedimento, os instrumentos são aplicados principalmente às estruturas ósseas e tecidos conectivos ao redor da DRG, em vez de agarrar ou puxar diretamente o gânglio, preservando assim sua integridade.

Segundo, métodos existentes frequentemente carecem de marcos anatômicos claros e estáveis para identificar diferentes segmentos DRG. Como os nervos conectados à DRG são frequentemente intersectados durante a remoção da coluna vertebral, torna-se difícil determinar com precisão a origem segmentar de cada DRG com base no trajeto nervoso e nos padrões de ramificação. Em contraste, nosso método é realizado diretamente in situ no camundongo e, portanto, preserva as relações anatômicas naturais entre a DRG, os nervos conectados e as estruturas ao redor, permitindo a identificação de diferentes segmentos da DRG de acordo com conexões nervosas e marcos anatômicos locais. Propomos o uso das características morfológicas de L2 e L3 como pontos de referência anatômicos-chave, juntamente com a relação anatômica entre L3–L5 e o nervo ciático, seguido pela identificação sequencial dos segmentos adjacentes tanto nas direções rostral quanto caudal.

Além disso, esse método fornece uma descrição relativamente sistemática dos passos principais, incluindo exposição da coluna vertebral e do canal vertebral, abertura do canal vertebral com exposição subsequente da medula espinhal, exposição da DRG e localização e dissecação guiadas por estereomicroscópio. O fluxo de trabalho é claro e os marcos anatômicos são bem definidos, o que pode melhorar a padronização e a reprodutibilidade dos procedimentos, especialmente para iniciantes. Os DRG obtidos com esse método mantêm boa integridade tecidual e, portanto, são bem adequados para análises a jusante, incluindo imunofluorescência e coloração H&E.

Neste estudo, estabelecemos um método padronizado de dissecação e isolamento para DRG de camundongos e fornecemos ilustrações esquemáticas para localização anatômica, juntamente com imagens representativas e documentação em vídeo do procedimento de amostragem. Este método apoia o isolamento da DRG do nível torácico ao sacral em uma única amostra, ao mesmo tempo em que reduz o risco de danos por DRG durante a coleta de tecido.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos em estrita conformidade com o protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal do Hospital Leste de Xangai. Os procedimentos de dissecação descritos neste estudo foram realizados com camundongos adultos C57BL/6 (macho ou fêmea, 12 semanas de idade, 25–30 g). A Figura 1 mostra os instrumentos de dissecação usados neste protocolo.

1. Preparação

NOTA: Para amostras fixadas em perfusão, adote medidas protetoras adequadas para evitar exposição ao fixador. Realize a dissecação em uma exaustão ou em um banco bem ventilado, e use equipamentos de proteção individual adequados durante todo o procedimento, incluindo luvas, roupas de proteção e óculos de proteção.

1. Mantenha os camundongos sob um ciclo de 12 horas de luz/12 horas de escuridão a uma temperatura ambiente de aproximadamente 24 °C e umidade relativa de 55%, com acesso ad libitum a comida e água.
2. Antes de iniciar a dissecação, eutanasie o camundongo em uma câmara de dióxido de carbono até que a respiração tenha cessado completamente. Confirme a morte e coloque o animal em posição deitada sobre uma tábua de dissecação e prenda os membros com alfinetes para manter uma postura estável.
3. Borrife o pelo sobre a região toracoabdominal com etanol 70% para reduzir a contaminação dos pelos e manter o campo operatório limpo.
4. Use tesoura para abrir a pele ao longo da linha média do tórax e do abdômen. Estenda a incisão de forma craniana ao longo da linha média ventral para expor totalmente a gaiola torácica. Eleve a extremidade inferior do esterno e corte a parede torácica ao longo de ambos os lados do arco costal para abrir a cavidade torácica e expor o coração. Remova parte do esterno e das costelas, se necessário, para obter uma visão clara do coração.
5. Faça uma pequena incisão no átrio direito com tesoura para estabelecer uma saída para o sangue e perfusar. Encha uma seringa de 20 mL com PBS pré-resfriado (4 °C) e insira lentamente a agulha no ventrículo esquerdo, próximo ao ápice do coração. Estabilize a agulha e evite perfurar a parede ventricular.
6. Perfunda PBS pré-resfriado lenta e uniformemente até que o fígado fique pálido, o fluxo de saída seja transparente e a maior parte do sangue tenha sido lavada para fora. Depois, substitua o PBS por 20 mL de paraformaldeído pré-resfriado a 4% (4 °C) e continue a perfusão em ritmo lento e constante até que os membros fiquem rígidos, a cauda se enrole e os tecidos mudem de vermelho para claro, indicando que a fixação está praticamente completa.
7. Após a perfusão, retire a agulha, remova qualquer líquido residual da cavidade torácica e proceda imediatamente à coleta do tecido. Se for necessário tecido não fixado para análises posteriores, perfunda apenas com PBS pré-resfriado e omite a etapa de fixação de paraformaldeído a 4%.
   NOTA: Mantenha uma taxa de perfusão lenta, constante e uniforme durante todo o procedimento para evitar ruptura cardíaca ou inchaço dos tecidos causada por pressão excessiva. Realize todos os procedimentos acima em temperatura ambiente.

2. DRG e nervos adjacentes (Figura 2)

1. Exposição da coluna vertebral e do canal vertebral (3–5 min)
   1. Coloque o rato na posição deitado e prenda-o na tábua de dissecação. Faça uma incisão longitudinal ao longo da linha média da pele dorsal com tesoura, estendendo a incisão da cauda em direção ao pescoço.
   2. Use tesoura para separar a pele dorsal do tecido conjuntivo subjacente e refleta a pele lateralmente de ambos os lados para expor totalmente a musculatura dorsal. Limpe os cabelos aderidos à superfície do tecido conjuntivo com papel absorvente ou enxágue o campo cirúrgico com soro fisiológico para manter a área de operação limpa.
   3. Incenda os músculos dorsais e o tecido conjuntivo longitudinalmente ao longo de ambos os lados da coluna vertebral para expor totalmente as estruturas vertebrais.
      NOTA: Evite que as tesouras penetrem profundamente na cavidade torácica ou abdominal durante a incisão dos tecidos dorsais, pois isso pode afetar procedimentos subsequentes de dissecação.
   4. Limpe cuidadosamente o tecido conjuntivo e o músculo residual que cobre a coluna vertebral com um ronger ósseo. Se o tecido residual interferir na visualização, apare-o com tesoura conforme necessário para alcançar a exposição total da coluna vertebral. Em seguida, corte as vértebras cervicais a partir da face dorsal com tesoura para destacar a extremidade craniana da coluna vertebral da cabeça e facilitar os passos seguintes.
2. Abra o canal vertebral e exponha a medula espinhal (Figura 3; 8–10 min).
   1. Insira tesouras micro curvas no canal vertebral no nível cervical e corte ao longo dos dois lados das lâminas para abrir o canal.
      NOTA: Tome cuidado para evitar lesões na medula espinhal durante o procedimento.
   2. Remova as lâminas dorsais para expor gradualmente a parte dorsal da medula espinhal.
   3. Continue cortando as lâminas dorsais ao longo do eixo longitudinal da coluna com uma micro tesoura curva, estendendo-se progressivamente da região torácica até a região sacra para expor totalmente a parte dorsal da medula espinhal.
3. Exposição da DRG (Figura 4; 8–10 min)
   1. Após expor totalmente a superfície dorsal da medula espinhal, use um rongeur ósseo para abrir suavemente as estruturas do canal vertebral lateralmente em ambos os lados e alternar a manipulação entre os lados esquerdo e direito.
   2. Depois que o canal vertebral está completamente separado de ambos os lados, observe a DRG localizada dentro dos forames intervertebrais sob um estereoscópio.
4. Identificação da DRG (Figura 5; 8–10 min)
   1. Uma vez que o canal vertebral tenha sido completamente refletido bilateralmente e a medula espinhal totalmente exposta, examine-se os feixes nervosos da raiz dorsal originados na superfície dorsal da medula espinhal sob um estereoscópio. Siga as raízes dorsais lateralmente e identifique a DRG próxima aos forames intervertebrais como estruturas ovais ou ovoides.
   2. Confirme durante a identificação que a DRG está na interface entre a raiz dorsal do nervo espinhal e o forame intervertebral, e observe que está disposta como um par bilateral em cada segmento da coluna vertebral. Identifique a DRG como um gânglio formado pelos corpos celulares dos neurônios sensoriais, com um lado entrando no chifre dorsal da medula espinhal e o lado oposto estendendo-se para os tecidos periféricos.
   3. Use um estereoscópio para identificar a DRG como uma estrutura amarela ou cinza-branca levemente inchada, com formato mais cheio e limites comparativamente distintos.
5. Realizar identificação segmentária e dissecação da DRG (Figura 6; 8–10 min)
   1. Use pinças microcirúrgicas sob um estereomicroscópio para elevar suavemente o feixe nervoso da raiz dorsal e, assim, alcançar a exposição total do DRG fixado.
   2. Use as seguintes características para determinar a identidade segmentar da DRG: designar DRG conectadas a fibras nervosas múltiplas ramificadas (>2 ramos) como DRGs L2 e mais crânianos, e designar DRGs conectadas a fibras nervosas bifurcadas (apenas dois ramos) como DRGs L3 e mais caudais. Em seguida, identifique sequencialmente os segmentos restantes da DRG acima e abaixo, de acordo com a localização dos forames intervertebrais.
      NOTA: As fibras nervosas que surgem do DRG L3–L5 se fundem para formar o nervo ciático.
   3. Use tesouras curvas microcirúrgicas ou pinças microcirúrgicas para separar cuidadosamente o tecido conjuntivo e as fibras nervosas ao redor do DRG, libertando progressivamente o gânglio de suas fixações aos tecidos ao redor do forame intervertebral.
   4. Transecte as fibras nervosas da raiz dorsal que conectam a DRG à medula espinhal e, simultaneamente, corte o feixe nervoso que se estende em direção à periferia para isolar o gânglio.
   5. Isole cuidadosamente a DRG usando pinças microcirúrgicas. Se forem necessárias preservações a longo prazo e subsequentes análises de imunofluorescência, coloque imediatamente o DRG isolado em um tubo centrífuga de 0,5 mL contendo 4% de paraformaldeído e fixe o tecido por 3 horas. Após a fixação, lave o tecido por 3 × 5 minutos com 0,1 M PBS (componentes principais: NaCl, KCl, Na2HPO4 e KH2PO4) e transfira o tecido para uma solução de sacarose a 30% para desidratação até que ele afunde até o fundo. Por fim, incorpore o tecido em OCT e armazene-o a −80 °C para preservação a longo prazo.

3. Confirme os componentes do gânglio.

1. Resultados da coloração H&E (Figura 7)
   1. Fixe imediatamente a DRG isolada em um fixador histológico convencional, por exemplo, 4% de paraformaldeído. Após a fixação, enxágue o tecido em tampão fosfato de 0,1 M, realize desidratação, limpeza e incorporação de parafina conforme procedimentos histológicos padrão, e prepare seções de tecido de 4 a 6 μm para análise de coloração posterior.
   2. Realize coloração por hematoxilina e eosina (H&E) nas seções para avaliar a estrutura geral e a morfologia celular da DRG. Use as seções coradas para identificar os componentes celulares e a organização dos tecidos do gânglio e para determinar a qualidade do DRG colhido.
   3. Examine as seções coloridas com H&E ao microscópio e confirme que a DRG é composta predominantemente por numerosos corpos celulares neuronais sensoriais. Identifique neurônios com somatas grandes, arredondadas a ovoides, e observe seus núcleos claramente visíveis, bem como os nucleólos proeminentes presentes em alguns neurônios. Também confirme a presença de células gliais satélite muito próximas ao redor dos neurônios em uma característica disposição em forma de anel.
   4. Examine o interior do gânglio e identifique os feixes de fibras nervosas e septos do tecido conjuntivo para confirmar que a arquitetura geral do tecido está intacta e claramente organizada. Verifique se os limites celulares estão bem definidos e que não há perturbação tecidular óbvia ou desorganização estrutural.
   5. Confirme o isolamento bem-sucedido da DRG na coloração H&E pela presença de estrutura geral preservada, morfologia celular bem definida e ausência de lesão mecânica evidente. Detecte danos na amostra observando a arquitetura celular perturbada, margens de tecido indistintas ou destruição localizada de tecidos ocorrendo durante a dissecação ou processamento. Use esses achados de H&E como base prática para avaliar a qualidade da coleta de DRG e a integridade do tecido.
2. Resultados da coloração por imunofluorescência do TUBB3 (Figura 8)
   1. Fixe o DRG isolado imediatamente em paraformaldeído a 4% por 3 horas. Quando a fixação estiver completa, enxágue o tecido três vezes em 0,1 M PBS, deixando 5 minutos para cada lavagem. Em seguida, coloque o tecido em solução de sacarose a 30% até que ele se assente no fundo, infundi-lo em OCT e corte seções congeladas a 8–12 μm para coloração imunofluorescente a jusante.
   2. Aqueça as seções até a temperatura ambiente, enxágue por 3 × 5 minutos em PBS e realize a coleta de antígenos com solução de coleta de antígeno Tris-EDTA. Deixe as seções esfriarem naturalmente até a temperatura ambiente, lave novamente 3 × 5 minutos com PBS e bloqueie com 5% de BSA por 30–60 minutos em temperatura ambiente. Após a etapa de bloqueio, aplique o anticorpo primário TUBB3 marcado com fluoróforo e incube as seções durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, lave as seções três vezes com PBS, tinga os núcleos com DAPI, monte as seções e capture imagens usando um microscópio de fluorescência.
   3. Inspecione as seções da DRG e verifique se os espigões bem preservados apresentam um contorno distinto do gânglio, estrutura tecidular intacta e arranjo celular ordenado. Observe a imunofluorescência do TUBB3 principalmente nos corpos das células neuronais sensoriais e nas fibras nervosas para definir a distribuição neuronal geral dentro do gânglio. Use contracoloração DAPI para identificar as células maiores TUBB3-positivas como neurônios sensoriais, e observe que os pequenos núcleos DAPI-positivos distribuídos ao redor dessas células apresentam um padrão morfológico consistente com núcleos satélites das células gliais. Identifique danos relacionados à dissecção ou processamento por continuidade tecidular interrompida, localização irregular do sinal TUBB3, morfologia neuronal mal definida ou aumento focal do sinal de fundo.
   4. Aplique a coloração por imunofluorescência TUBB3 como indicador suplementar da integridade do tecido DRG. Reconheça o isolamento bem-sucedido da DRG pela presença de um contorno do gânglio preservado, sinais de fluorescência distintos nos corpos das células neuronais sensoriais e fibras nervosas, morfologia celular clara e coloração mínima de fundo.

Resultados

O sucesso do isolamento da DRG requer a preservação da integridade do gânglio, sem compressão, esmagamento ou rasgão óbvios. Levante suavemente as fibras nervosas conectadas lateralmente, libere progressivamente o gânglio dos tecidos ao redor e transecte as fibras nervosas conectadas somente após o gânglio estar totalmente mobilizado, para que ele possa ser removido intacto. Evite a tração direta do corpo ganglionar com instrumentos durante o procedimento. Após o isolamento, preservar a ...

Discussão

A DRG, como componentes-chave do sistema nervoso sensorial periférico, desempenha um papel fundamental na transmissão de informações sensoriais mecânicas, térmicas e nociceptivas ao sistema nervoso^{central 9,10,11}. Os neurônios DRG apresentam uma morfologia pseudounipolar característica, com um processo se estendendo aos tecidos periféricos e o outro projetando para o chifre dorsal da medula espi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.5 mL centrifuge tube	Not specified	Not specified	Used for fixed DRG storage
20 mL syringe	Not specified	Not specified	Used for cardiac perfusion
30% sucrose solution	Not specified	Not specified	Used for tissue dehydration before OCT embedding
4% paraformaldehyde	Servicebio	G1101
5% BSA	Solarbio	SW3015
70% ethanol	Not specified	Not specified	Used to reduce hair contamination before dissection
Absorbent paper	Not specified	Not specified	Used to remove hair from connective tissue
Adult C57BL/6 mice	Vital River	Not specified	male or female; 12 weeks of age; 25–30 g
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG	Servicebio	GB25303
Anti-TUBB3 antibody	Proteintech	CL488-66375	Used for TUBB3 immunofluorescence
Carbon dioxide chamber	Not specified	Not specified	Used for euthanasia
DAPI	Servicebio	G1012
Dissection board	Not specified	Not specified	Used to secure the mouse during dissection
Fluorescence microscope	Not specified	Not specified	Used for imaging immunofluorescence-stained sections
Friedman-Pearson bone rongeurs	RWD	S21022-14	Extracted from manuscript: bone rongeur (RWD, S21022-14)
H&E staining solution kit	Servicebio	G1005
Microsurgical curved scissors	ASSI	SDCT16R8	Extracted from manuscript: micro curved scissors (ASSI, SDCT16R8)
Microsurgical forceps	Fine Science Tools	11254-20	Extracted from manuscript: microsurgical forceps (FST, 11254-20)
OCT compound	Sakura Finetek	No. 4583
PBS	Servicebio	G2156
Pins	Not specified	Not specified	Used to secure limbs on the dissection board
Saline	Not specified	Not specified	Used to rinse the surgical field
Scissors	Fine Science Tools	14060-09	Extracted from manuscript: scissors (FST, 14060-09)
Stereomicroscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	10447197	Extracted from manuscript: stereomicroscope (Leica, 10447197)
Tris-EDTA antigen retrieval solution	Solarbio	C1038