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Este estudo foi realizado utilizando linhagens celulares de leucemia mieloide aguda humana estabelecidas e seus derivados resistentes à doxorubicina. Não houve participantes humanos, animais ou amostras primárias derivadas do paciente. Portanto, não era necessária aprovação do conselho de revisão institucional para pesquisa com sujeitos humanos e aprovação de ética animal. As linhas celulares foram obtidas do Instituto de Hematologia da Academia Chinesa de Ciências Médicas, em Tianjin, China, e mantidas no Instituto de Hematologia de Fujian, Hospital da União da Universidade Médica de Fujian. A identidade celular foi confirmada por avaliação de cariótipo e morfológica antes da experimentação, e todas as culturas celulares foram testadas para contaminação por micoplasmas. Os produtos químicos, equipamentos e softwares usados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Cultura celular e confirmação do fenótipo resistente
Células humanas de leucemia mieloide aguda HL60 e K562 e seus derivados resistentes à doxorubicina, HL60/A e K562/A, foram obtidos do Instituto de Hematologia da Academia Chinesa de Ciências Médicas, em Tianjin, China. As células foram cultivadas em meio Roswell Park Memorial Institute 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C em uma incubadora umidificada contendo 5% de dióxido de carbono.
As células HL60/A foram mantidas em meio completo contendo 1 μg/mL de doxorubicina, e as células K562/A foram mantidas em meio completo contendo 5 μg/mL de doxorrubicina para preservar o fenótipo resistente. A doxorrubicina foi removida do meio de cultivo 1 mês antes dos testes experimentais para evitar efeitos agudos de seleção de medicamentos durante os ensaios de tratamento.
Antes dos experimentos, o fenótipo resistente foi reconfirmado comparando os valores de concentração inibitória metade do máximo de doxorrubicina entre células parentais e resistentes. A estabilidade da resistência após 1 mês de cultura sem medicamentos foi avaliada repetindo o ensaio de sensibilidade à doxorubicina e examinando a expressão basal da P-glicoproteína e da proteína 1 associada à resistência a múltiplos fármacos. Culturas foram usadas em experimentos apenas quando os derivados resistentes mantiveram valores mais altos de concentração inibitória de metade máxima e maior expressão do transportador do que seus equivalentes parentais.
2. Preparação de medicamentos e desenho de tratamento
FTY720, doxorubicina e SC79 foram preparados como soluções padrão conforme as instruções dos fabricantes. FTY720 e SC79 foram dissolvidos em dimetil sulfóxido, e doxorrubicina foi preparada no solvente recomendado e protegida da luz durante o manuseio. As soluções funcionais eram diluídas em meio de cultura completo antes do tratamento. A concentração final de dimetil sulfóxido foi mantida idêntica entre os grupos de tratamento e não excedeu 0,1%.
Os grupos de controle do veículo receberam a mesma concentração final de dimetil sulfóxido que os grupos de tratamento correspondentes. Para experimentos de tratamento combinado, 5 μM FTY720 foi usado como concentração sensibilizante. Doxorrubicina foi usada em 4 μM para células HL60/A e 8 μM para células K562/A em ensaios de apoptose e acumulação intracelular de doxorubicina, salvo indicação em contrário.
3. Ensaio de viabilidade celular e cálculo de concentração inibitória de metade máxima
As células foram semeadas em placas de 96 poços a 1 × 104 células por poço em meio completo de 100 μL. Para testes de fármaco único FTY720, células HL60, K562, HL60/A e K562/A foram tratadas com 0, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 e 100 μM FTY720 por 48 horas. Para testes de sensibilidade à doxorubicina, células HL60/A e K562/A foram tratadas com concentrações seriadas de doxorrubicina na presença ou ausência de 5 μM FTY720 por 48 horas.
A viabilidade celular foi medida usando o ensaio Kit de Contagem de Células-8, conforme as instruções do fabricante. Após o tratamento, o reagente Kit de Contagem Celular 8 foi adicionado a cada poço, e a placa foi incubada a 37 °C por 2 horas. A absorvância foi medida em 450 nm usando um leitor de microplaca.
A viabilidade relativa da célula foi calculada da seguinte forma: viabilidade relativa da célula = [(absorção de poços tratados - absorção de poços em branco) / (absorção de poços de controle de veículo - absorção de poços em branco)] × 100%
Valores de concentração inibitória metade do máximo foram calculados usando regressão não linear com um modelo logístico dose-resposta de quatro parâmetros no GraphPad Prism, versão 9.5. Cada experimento incluiu três réplicas biológicas independentes, com três poços técnicos por condição de tratamento.
4. Análise de combinação de medicamentos
Os efeitos da FTY720 na sensibilidade à doxorrubicina foram avaliados comparando as relações dose-resposta entre doxorrubicina na presença ou ausência da FTY720. As células HL60/A e K562/A foram tratadas com concentrações seriadas de doxorrubicina sozinha ou doxorrubicina combinadas com FTY720 por 48 horas.
A viabilidade celular foi avaliada usando o ensaio Kit de Contagem Celular-8, e os valores de concentração inibitória metade do máximo foram calculados usando regressão não linear com um modelo logístico dose-resposta de quatro parâmetros. As mudanças na sensibilidade à doxorrubicina foram interpretadas com base em mudanças nas curvas dose-resposta e diferenças nos valores de concentração inibitória metade do máximo entre os grupos de tratamento.
Como os experimentos não foram projetados como um estudo completo de matriz de dose de razão fixa, a análise formal de índice de combinação não foi realizada. Portanto, os resultados foram interpretados como evidências de sensibilidade alterada à doxorrubicina, e não como sinergia farmacológica definitiva.
5. Análise de apoptose por citometria de fluxo de Anxetina V e iodeto propidiano
As células HL60/A e K562/A foram semeadas em placas de 6 poços a 4 × 10 célulasde 5 mL e tratadas por 48 horas com veículo, FTY720 sozinho, doxorrubicina sozinha ou doxorrubicina combinada com FTY720. Para tratamento combinado, 5 μM de FTY720 foi combinado com 4 μM doxorubicina em células HL60/A ou 8 μM doxorubina em células K562/A.
Após o tratamento, as células foram coletadas, incluindo as suspensas no meio de cultura, e lavadas duas vezes com soro salino tamponado com fosfato frio. As células foram ressuspensas no tampão de ligação Annexin V na concentração recomendada pelo fabricante do kit de detecção de apoptose. Cada amostra foi corada com 5 μL de isotiocianato de Anexina V-fluoresceína ou Anexina V-aloficocianina e 5 μL iodeto de propidio, seguida de incubação por 15 minutos em temperatura ambiente, no escuro.
As amostras foram analisadas imediatamente por citometria de fluxo. Controles não corados, controles de coloração única e controles de fluorescência menos um foram usados para definir as portas de compensação e quadrante. Detritos foram excluídos usando barreiras de dispersão frontal e lateral. Células apoptóticas iniciais foram definidas como células V-positivas para Anexina e iodeto de propidio, e células apoptóticas tardias ou mortas foram definidas como células positivas para Anexina V e positivas para iodeto propidiano. A apoptose total foi calculada como a soma das frações celulares da apoptose inicial e tardia. Pelo menos 10.000 eventos viáveis de célula única foram adquiridos para cada amostra.
6. Ensaio intracelular de acúmulo de doxorrubicina
As células HL60/A e K562/A foram semeadas em placas de 6 poços a 4 × 10 célulasde 5 mL e cultivadas durante a noite. As células foram então tratadas com controle veicular, doxorubicina isoladamente ou doxorrubicina combinada com 5 μM FTY720. Células HL60/A foram tratadas com doxorubicina de 4 μM, e células K562/A foram tratadas com doxorubicina de 8 μM. As células foram incubadas por 4 horas a 37 °C e protegidas da luz.
Após o tratamento, as células foram colhidas e lavadas duas vezes com soro fisiológico tamponado com fosfato frio para remover a doxorubicina extracelular. As células foram ressuspensas em soro salino tamponado com fosfato e analisadas por citometria de fluxo usando a fluorescência intrínseca da doxorubicina. Células não tratadas foram usadas para definir a autofluorescência de fundo, e células tratadas com doxorubicina foram usadas como referência positiva para fluorescência. O acúmulo intracelular de doxorubicina foi quantificado como intensidade mediana de fluorescência após a exclusão de detritos e agregados. Os valores medianos de intensidade de fluorescência foram normalizados para o grupo doxorubicina isolada em cada experimento independente.
7. Análise citométrica de fluxo da expressão de proteína 1 associada à P-glicoproteína e à resistência multirfármaco
As células HL60/A e K562/A foram semeadas em placas de 6 poços a 2 × 10células de 6 mL e tratadas com 5 μM FTY720 ou controle de veículo por 24 horas. Após o tratamento, as células foram lavadas duas vezes com soro tampão fosfatado gelado e ressuspensas em tampão de coloração de células de 100 μL.
As células foram coloridas com anticorpo anti-P-glicoproteína conjugado com ficoeritrina e com proteína 1 associada à resistência multirrogativa conjugada com Alexa Fluor 647 na diluição recomendada pelo fabricante. Controles de isotipo combinados, controles não corados, controles de uma única coloração e controles fluorescente menos um foram incluídos para configuração e compensação de portas. As amostras foram incubadas por 30 minutos a 4 °C no escuro, lavadas duas vezes com tampão de coloração celular e ressuspensas em tampão de coloração celular de 500 μL antes da aquisição.
A citometria de fluxo foi realizada usando um citômetro de fluxo BD FACScan. Pelo menos 10.000 eventos viáveis de célula única foram adquiridos para cada amostra. Os níveis de expressão da P-glicoproteína e da proteína 1 associada à resistência a múltiplos fármacos foram quantificados como intensidade mediana de fluorescência após subtração do sinal isotipo-controle correspondente. Os valores normalizados foram expressos em relação ao grupo de controle do veículo dentro de cada experimento independente.
8. Western blot e quantificação densitométrica
Após os tratamentos indicados, as células foram coletadas e lavadas duas vezes com soro salino tamponado com fosfato frio. A proteína total foi extraída usando tampão de ensaio de imunoprecipitação por radioimunoprecipitação suplementado com inibidores de protease e fosfatase. A concentração de proteína foi medida usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico.
Um total de 30 μg de proteína por via foi separado por eletroforese em gel de dodecila-poliacrilamida de sódio e transferido para membranas de polivinilideno difluoreto. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado ou 5% de albumina sérica bovina em soro três-buffer contendo Tween 20 por 1 hora em temperatura ambiente.
As membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra a proteína quinase total B, proteína quinase B fosforilada, alvo mecanicista total da rapamicina, alvo mecanicista fosforilado da rapamicina, caspase-3 clivada, poli(adenosina difosfato-ribose) polimerase clivada, P-glicoproteína, proteína 1 associada à resistência multirrogativa e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. Após a lavagem, as membranas foram incubadas com os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte apropriados por 1 hora em temperatura ambiente. As bandas proteicas foram visualizadas usando detecção aprimorada de quimioluminescência.
As intensidades das bandas foram quantificadas usando o software ImageJ, versão 1.53t. A proteína quinase B fosforilada foi normalizada para a proteína quinase B total, e o alvo mecanicista fosforilado da rapamicina foi normalizado para o alvo mecanicista total da rapamicina. P-glicoproteína, proteína 1 associada à resistência a múltiplos fármacos, caspase-3 clivada e poli(adenosina difosfato-ribose) polimerase clivada foram normalizadas para gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. Os valores normalizados foram expressos como variações de dobra em relação ao grupo controle do veículo ou doxorubicina isoladamente, dependendo da comparação. Análises de western blot foram realizadas usando três réplicas biológicas independentes. Imagens de manchas ocidentais não recortadas foram depositadas no repositório público de dados ou carregadas como arquivos suplementares.
9. Experimento de resgate SC79
Para examinar se a sinalização da quinase da proteína B estava associada aos efeitos observados das células FTY720, HL60/A e K562/A foram tratadas com FTY720 na presença ou ausência de SC79, um ativador da proteína quinase B. As células foram pré-tratadas com 5 μM FTY720 por 12 horas e depois tratadas com 30 μM SC79 ou controle do veículo por mais 12 horas.
Após o tratamento, foram avaliados por Western blotting a proteína quinase B fosforilada, o alvo mecanicista fosforilado da rapamicina, a P-glicoproteína e os níveis de proteína 1 associada à resistência a múltiplos fármacos. Paralelamente, a apoptose foi avaliada por coloração com Annexin V e iodeto de propidium após o tratamento com doxorubicina, FTY720 e SC79. Os efeitos do resgate foram interpretados como evidências associadas às vias. Como nenhum experimento de superexpressão genética ou knockdown foi realizado, as conclusões causais foram apresentadas com cautela.
10. Análise estatística e reporte de dados
Análises estatísticas foram realizadas usando GraphPad Prism, versão 9.5, e IBM SPSS Statistics, versão 23.0. Réplicas biológicas foram definidas como experimentos independentes realizados em dias diferentes usando células cultivadas de forma independente. Réplicas técnicas foram definidas como poços repetidos ou medições repetidas dentro do mesmo experimento biológico.
Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média, a menos que especificado de outra forma. Comparações em dois grupos foram analisadas usando um teste t de Student bi-cauda, sem pareamento, quando os dados estavam aproximadamente distribuídos normalmente. Comparações entre três ou mais grupos foram analisadas usando análise unidirecional da variância, seguida pelo teste post hoc de Tukey. Experimentos envolvendo dois fatores independentes, como concentração de medicamentos e condição de tratamento, foram analisados usando análise bidirecional da variância seguida de uma correção apropriada por múltiplas comparações.
Quando as suposições de normalidade não eram suportadas, testes não paramétricos eram usados. Valores p exatos foram reportados sempre que possível. A significância estatística foi definida como p < 0,05 após correção para comparações múltiplas. Todas as legendas das figuras especificavam o número de réplicas biológicas, o teste estatístico utilizado, o significado das barras de erro e o limite de significância. Os valores individuais de replicação biológica foram mostrados em gráficos de dispersão ou sobrepostos a gráficos de barras sempre que possível.