FTY720 aumenta a sensibilidade à doxorrubicina em células resistentes à leucemia mieloide aguda

Resumo

Este protocolo avalia como o FTY720 aumenta a sensibilidade à doxorrubicina em células resistentes à leucemia mieloide aguda, avaliando a viabilidade celular, apoptose, acúmulo intracelular de doxorubicina, expressão do transportador de efluxo de fármacos e o alvo da sinalização da rapamicina da proteína quinase B/mecanicista.

Resumo

A quimiorresistência continua sendo uma grande barreira para o tratamento eficaz da leucemia mieloide aguda, em parte porque as células leucêmicas resistentes reduzem a exposição intracelular a medicamentos e evitam a apoptose. FTY720, um modulador do receptor de esfingosina-1-fosfato, relatou atividade antiproliferativa e quimiosensibilizante em vários modelos tumorais. No entanto, se a FTY720 aumenta a sensibilidade à doxorrubicina em células de leucemia mieloide aguda resistentes à doxorubicina, e se esse efeito está associado a alterações nos transportadores de efluxo de fármacos e no alvo proteico quinase B/mecanicista da sinalização da rapamicina, permanece insuficientemente definido. Este estudo avaliou os efeitos do FTY720 isoladamente e em combinação com doxorrubicina em linhas celulares parentais de leucemia mieloide aguda (HL60 e K562) e seus derivados resistentes à doxorrubicina (HL60/A e K562/A). A viabilidade celular foi avaliada usando ensaios Kit de Contagem Celular-8, a apoptose foi medida por citometria de fluxo de Annexin V/iodeto propidiano, o acúmulo intracelular de doxorrubicina foi quantificado por citometria de fluxo, e a glicoproteína P, proteína associada à resistência multirfármaco 1, proteína quinase B/alvo mecanicista das proteínas da via rapamicina e proteínas relacionadas à apoptose foram examinadas por citometria de fluxo e Western bloting. O FTY720 apresentou citotoxicidade dependente de dose e aumento da sensibilidade à doxorrubicina em células de leucemia resistente. O tratamento combinado reduziu a viabilidade celular, aumentou as frações celulares apoptóticas, aumentou o acúmulo intracelular de doxorrubicina e diminuiu a expressão da proteína 1 associada à resistência a múltiplos fármacos. O tratamento com FTY720 também esteve associado à redução da fosforilação da proteína quinase B e do alvo mecanicista da rapamicina, enquanto o ativador da proteína quinase B SC79 reverteu parcialmente as mudanças observadas na sinalização, expressão do transportador e apoptose. Esses achados indicam que a FTY720 aumenta a sensibilidade à doxorrubicina em células HL60/A e K562/A, e que esse efeito está associado à redução da sinalização da rapamicina na proteína quinase B/mecanicista, diminuição da expressão do transportador de efluxo de fármacos, aumento do acúmulo intracelular de doxorrubicina e aumento da apoptose. Como este estudo foi limitado a modelos de linha celular in vitro , é necessária uma validação adicional em amostras primárias de leucemia e sistemas in vivo antes que conclusões terapêuticas possam ser tiradas.

Introdução

A leucemia mieloide aguda é uma malignidade hematológica heterogênea que surge da transformação maligna das células-tronco e progenitoras hematopoiéticas. É a forma mais comum de leucemia aguda em adultos e continua associada à baixa sobrevivência a longo prazo. Embora as estratégias de tratamento tenham melhorado, a quimioterapia indutiva baseada em citarabina combinada com uma antracacilina continua sendo uma pedra angular do tratamento. No entanto, muitos pacientes desenvolvem resistência primária ou adquirida, levando a recaídas, doenças refratárias e desfechos clínicos ^ruins

Protocolo

Este estudo foi realizado utilizando linhagens celulares de leucemia mieloide aguda humana estabelecidas e seus derivados resistentes à doxorubicina. Não houve participantes humanos, animais ou amostras primárias derivadas do paciente. Portanto, não era necessária aprovação do conselho de revisão institucional para pesquisa com sujeitos humanos e aprovação de ética animal. As linhas celulares foram obtidas do Instituto de Hematologia da Academia Chinesa de Ciências Médicas, em Tianjin, China, e mantidas no Instituto de Hematologia de Fujian, Hospital da União da Universidade Médica de Fujian. A identidade celular foi confirmada por av....

Resultados

O FTY720 reduziu a viabilidade das células parentais e das células de leucemia mieloide aguda resistentes a doxorubicina

Células HL60, K562, HL60/A e K562/A foram expostas a concentrações crescentes de FTY720 (0, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 e 100 μM) por 48 horas, e a viabilidade celular foi medida usando o ensaio Kit de Contagem Celular-8. O FTY720 reduziu a viabilidade celular em todas as quatro linhagens celulares de forma dependente da conce.......

Discussão

A quimiorresistência continua sendo uma das principais barreiras para o tratamento eficaz da leucemia mieloide aguda. Em pacientes que não respondem à terapia de indução ou desenvolvem recaída após a resposta inicial, células de leucemia resistentes podem persistir apesar da exposição a regimes baseados em citarabina e antraciclina, tornando a identificação de abordagens que aumentem a sensibilidade a medicamentos uma questão experimental e clínica^importante. A do.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
6-well tissue culture plates	Corning / Costar	3516 ou equivalente verificado em laboratório	Usado para tratamento, apoptose, acúmulo de doxorrubicina e experimentos de expressão de proteínas.
96-well tissue culture plates	Corning / Costar	3599 ou equivalente verificado em laboratório	Usado para ensaios de Cell Counting Kit-8.
Alexa Fluor 647 mouse immunoglobulin G1 isotype control	BioLegend	400130 ou equivalente verificado em laboratório	Controle de isótipo para coloração de anticorpos conjugados com Alexa Fluor 647. Use o número de catálogo exato do frasco reagente.
Alexa Fluor 647-conjugated anti-human multidrug resistance-associated protein 1 / ABCC1 antibody	BioLegend	370103	Usado para detecção por citometria de fluxo da proteína associada à resistência a múltiplos medicamentos 1. A disponibilidade do produto deve ser confirmada porque alguns formatos MRP1 da BioLegend foram descontinuados ou substituídos.
Annexin V apoptosis detection kit with propidium iodide	BioLegend	640914 ou equivalente verificado em laboratório	Usado para análise de apoptose por citometria de fluxo com Annexin V e propídio iodeto. Se o Annexin V-aloficocianina foi usado em vez do Annexin V-fluoresceína isotiocianato, substitua por este com o número de catálogo exato do kit.
Bicinchoninic acid protein assay kit	Thermo Fisher Scientific / Beyotime / fornecedor verificado em laboratório	Usar o número de catálogo real	Usado para medição da concentração de proteínas.
Carbon dioxide cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific / Eppendorf / instrumento verificado em laboratório	Modelo a ser inserido a partir do registro do laboratório	Células mantidas a 37 °C e 5% de dióxido de carbono.
Caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	9662; RRID:AB_331439	Detecta caspase-3 completa e clivada por Western blot. Se um anticorpo específico para caspase-3 clivada foi usado, substitua pelo número de catálogo exato.
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies	CK04	Usado para ensaios de viabilidade celular e concentração inibitória média.
Cell staining buffer	BioLegend	420201	Usado para diluição de anticorpos e lavagem durante a coloração citometria de fluxo.
Cleaved poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase antibody	Cell Signaling Technology	94885; RRID:AB_2800237	Anticorpo para Western blot para polimerase clivada de poli(adenosina difosfato-ribose).
CompuSyn	ComboSyn, Inc.	Versão 1.0 ou versão verificada em laboratório	Usado para análise de índice de combinação Chou-Talalay se dados completos de dose de combinação estiverem disponíveis.
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich / Merck	D2650 ou equivalente verificado em laboratório	Veículo para soluções estoque de FTY720 e SC79; a concentração final não excedeu 0,1%.
Doxorubicin hydrochloride	Use o fornecedor real do registro de compra do laboratório	Use o número de catálogo e lote reais	Antraciclina usada para manutenção da resistência e ensaios de tratamento. Esta entrada deve corresponder ao reagente realmente usado nos experimentos.
Enhanced chemiluminescence substrate	Thermo Fisher Scientific / MilliporeSigma / fornecedor verificado em laboratório	Use o número de catálogo real	Usado para detecção de sinal por Western blot.
Fetal bovine serum	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10099-141 ou equivalente verificado em laboratório	Adicionado ao meio de cultura em 10%. Use soro inativado por calor ou não inativado por calor consistentemente em todos os experimentos.
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACScan ou modelo real do instrumento	Usado para apoptose, acúmulo intracelular de doxorrubicina e ensaios de expressão de transportadores. Registre a configuração do laser/filtro nos métodos suplementares, se disponível.
Flow cytometry analysis software	BD Biosciences / FlowJo / software verificado em laboratório	Versão a ser inserida a partir do registro do laboratório	Usado para compensação, gating e análise de intensidade de fluorescência mediana.
FTY720 / fingolimod hydrochloride	Use o fornecedor real do registro de compra do laboratório	Use o número de catálogo e lote reais	Reagente de tratamento medicamentoso. Esta entrada deve corresponder ao reagente realmente usado nos experimentos. Não substitua por um fornecedor diferente, a menos que o experimento tenha sido realizado com esse produto.
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase antibody	Abcam	ab181602	Controle de carga para Western blot. Confirme o RRID do folheto do produto antes da submissão.
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versão 9.5	Usado para ajuste de curva dose-resposta, cálculo de concentração inibitória média e análise estatística.
HL60 human acute myeloid leukemia cells	Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China	Não catalogado comercialmente neste estudo	Linhagem celular parental de leucemia mielóide aguda humana; autenticada por cariótipo e morfologia antes do uso. Se for necessário um referenciamento público, HL60 corresponde a RRID:CVCL_0002.
HL60/A doxorubicin-resistant cells	Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China	Não catalogado comercialmente	Derivado resistente à doxorrubicina das células HL60; mantido no Fujian Institute of Hematology. A resistência foi mantida com 1 µg/mL de doxorrubicina antes da cultura sem o fármaco.
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit immunoglobulin G secondary antibody	Cell Signaling Technology / Abcam / fornecedor verificado em laboratório	Use o número de catálogo real	Anticorpo secundário para Western blot. Insira o fornecedor exato e o número de catálogo dos registros do laboratório.
IBM SPSS Statistics	IBM	Versão 23.0	Usado para análise estatística.
ImageJ	National Institutes of Health	Versão 1.53t	Usado para quantificação densitométrica de Western blot.
K562 human leukemia cells	Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China	Não catalogado comercialmente neste estudo	Linhagem celular parental de leucemia humana; autenticada por cariótipo e morfologia antes do uso. Se for necessário um referenciamento público, K562 corresponde a RRID:CVCL_0004.
K562/A doxorubicin-resistant cells	Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China	Não catalogado comercialmente	Derivado resistente à doxorrubicina das células K562; mantido no Fujian Institute of Hematology. A resistência foi mantida com 5 µg/mL de doxorrubicina antes da cultura sem o fármaco.
Microplate reader	BioTek / Thermo Fisher Scientific / Molecular Devices / instrumento verificado em laboratório	Modelo a ser inserido a partir do registro do laboratório	Usado para medir a absorbância a 450 nm para ensaios de Cell Counting Kit-8.
Multidrug resistance-associated protein 1 antibody for Western blot	Cell Signaling Technology	72202	Usado para detecção por Western blot da proteína associada à resistência a múltiplos