Um procedimento repetitivo de queda de peso para estabelecer um modelo de camundongo de lesão cerebral traumática crônica

Resumo

Um protocolo é apresentado para estabelecer um modelo de camundongos com lesão cerebral leve e repetitiva com lesão cerebral traumática leve, para estudar os mecanismos subjacentes ao comportamento depressivo crônico na ausência de lesões estruturais cerebrais grossas.

Resumo

A lesão cerebral traumática (LCT) pode levar a mudanças neuropatológicas persistentes e sequelas neuropsiquiátricas de longo prazo. Durante a recuperação, uma proporção substancial dos pacientes desenvolve distúrbios afetivos, incluindo sintomas depressivos e queixas relacionadas ao sono, mesmo quando tomografia computadorizada de rotina ou imagem por ressonância magnética não revelam anomalias estruturais óbvias. Modelos experimentais que reproduzam essas características são necessários para investigar os mecanismos subjacentes aos sintomas neuropsiquiátricos pós-traumáticos crônicos. Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de camundongos com lesão cerebral leve e trauma cerebral leve e repetitivo, para estudar os mecanismos subjacentes ao comportamento depressivo crônico na ausência de lesões estruturais cerebrais grossas evidentes detectáveis por exame macroscópico e ressonância magnética ponderada em T2. Neste método, o crânio intacto é exposto e submetido a impactos repetidos usando parâmetros definidos de queda de peso por cinco dias consecutivos. Nas condições descritas aqui, o procedimento produz uma lesão na cabeça fechada, sem fratura grave do crânio ou contusão focal macroscópica. Após um intervalo pós-lesão, os camundongos apresentam comportamentos semelhantes a depressivos, sem apresentar anomalias estruturais focais óbvias no exame macroscópico ou na imagem por ressonância magnética ponderada em T2 sob as condições utilizadas neste estudo. Esse protocolo oferece uma abordagem experimental para estudar comportamentos semelhantes à depressão crônica após lesão cerebral traumática leve repetitiva e para avaliar possíveis intervenções terapêuticas.

Introdução

No entanto, como o paradigma atual fornece principalmente impacto linear em um rato com a cabeça fixa, ele deve ser interpretado como um modelo de rmTBI de cabeça fechada otimizado para estudar resultados afetivos crônicos, em vez de uma imitação biomecânica direta de concussão esportiva ou lesão leve no trânsito." A lesão cerebral traumática (LCT) é atualmente uma das principais causas de morbidade e mortalidade relacionadas ao trauma, impondo um ônus médico e econômico substancial às famílias e à sociedade ^1,2. Notavelmente, danos ao sistema nervoso central após TCE não são transitórios; Normalmente, ela evolui de maneira crônica e progressiva. Um estudo sobre TCE revelou que, mesmo 18 anos após a lesão, a ativação microglial persiste, e a neuroinflamação crônica prolongada continua causando deterioração neural^{severa 3}. Dados epidemiológicos indicam que até 28%–32% dos pacientes desenvolvem transtornos afetivos graves durante a fase⁴ prolongada de recuperação. Neste artigo, rmTBI refere-se ao paradigma de indução de lesão cerebral traumática leve e repetitiva, enquanto o estágio crônico pós-lesão, caracterizado por alterações comportamentais persistentes, é referido aqui como lesão cerebral traumática crônica (TCE-C). O termo c-TBI é usado aqui para descrever o estado crônico pós-lesão caracterizado por alterações comportamentais persistentes após o rmTBI, em vez de um paradigma de lesão distinto. Esse uso é conceitualmente consistente com nossos trabalhos anteriores que demonstraram que o TCE experimental pode evoluir como um processo crônico progressivo associado a anomalias histopatológicas e comportamentais de longo prazo.

Essas sequelas neuropsiquiátricas crônicas comprometem severamente a qualidade de vida e os resultados funcionais dos^{pacientes 5}. No entanto, a patogênese exata subjacente a esses transtornos afetivos secundários permanece inexplorável, e as opções de tratamento clínico são severamente limitadas. Portanto, investigar os mecanismos dos comportamentos depressivos induzidos por LCT e identificar alvos terapêuticos precisos é uma necessidade clínica urgente e de grande importância prática.

Para elucidar os mecanismos patológicos do TCE, pesquisadores desenvolveram vários modelos animais, entre os quais o modelo de impacto cortical controlado (CCI) é atualmente um dos mais^{amplamente utilizados 6,7}. A CCI permite o controle preciso dos parâmetros de impacto para gerar lesões focais altamente reprodutíveis. No entanto, tanto o CCI quanto o modelo tradicional de lesão fluida-percussão (FPI) normalmente exigem uma craniotomia. Essas abordagens são particularmente úteis para estudar contusão focal, perda de tecido e respostas neuroinflamatórias graves relacionadas a lesões, mas tendem a simular LCT aberto grave, que difere significativamente das apresentações clínicas mais comuns de lesões ligeiras na cabeça fechada, como concussões relacionadas a^{esportes 8,9}. Crucialmente, a necrose do tecido cerebral, cicatrizes gliais e cavitação em estágio avançado causadas por craniotomia e impacto apresentam duas limitações principais. Primeiro, déficits estruturais graves frequentemente induzem disfunção motora, o que confunde diretamente a avaliação precisa dos resultados comportamentais. Segundo, a perda física de tecido corta projeções neurais de longo alcance. Como demonstrado em estudos anteriores usando o modelo de TCE induzido por CCI, camundongos apresentaram contusões cerebrais focais^{significativas 4}. Essa perturbação estrutural dificulta severamente a aplicação de técnicas neuroanatômicas avançadas, como o rastreamento viral, tornando em grande parte inviável investigar sintomas psiquiátricos e seus circuitos neurais associados. Assim, embora esses modelos continuem sendo valiosos para estudos de LCT grave ou focal, podem ser menos adequados quando o objetivo é investigar anormalidades afetivas crônicas após lesão leve repetitiva em cabeça fechada, especialmente quando a preservação da integridade estrutural é importante para análises comportamentais e em nível de circuito.

Para superar as limitações dos modelos de LCT grave aberto mencionados, este estudo detalha um protocolo para estabelecer um modelo murino de lesão cerebral leve e leve repetitiva (RMTL) usando um método de queda de peso no crânio exposto e intacto, sem craniotomia. Este protocolo emprega parâmetros de impacto precisamente definidos: altura de queda de 25 cm e peso de 20 g. O local do impacto foi direcionado a 2 mm à esquerda da sutura sagital e 2 mm atrás da sutura coronal, utilizando uma ponta metálica curva de impactador com diâmetro de 4 mm para garantir a precisão e uniformidade da força do impacto. Além disso, a frequência específica de impactos repetitivos ao longo de cinco dias consecutivos garante a estabilidade das alterações patológicas crônicas. Avaliações abrangentes que incorporam ressonância magnética, histopatologia e ensaios comportamentais demonstram que esse modelo murino apresenta comportamentos significativos semelhantes a depressivos, preservando a integridade estrutural grossa do cérebro, sem contusões focais óbvias ou déficits motores. Esse perfil fenotípico captura características comportamentais selecionadas de lesão leve na cabeça repetitiva, incluindo mudanças semelhantes às neuropsiquiátricas, apesar de não haver anomalias estruturais óbvias em neuroimagem^rotineira 10,11,12,13. No entanto, como o paradigma atual fornece principalmente impacto linear em um rato com a cabeça fixa, ele deve ser interpretado como um modelo de rmTBI de cabeça fechada, otimizado para estudar resultados afetivos crônicos, em vez de uma imitação biomecânica direta de concussão esportiva ou lesão leve no trânsito.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal do Instituto de Inteligência Artificial, Centro Nacional de Ciências Abrangentes de Hefei (Aprovação nº IAI2024071004). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório. Um diagrama esquemático do protocolo experimental é mostrado na Figura 1. Equipamentos equivalentes de outros fornecedores podem ser utilizados, desde que as características críticas de desempenho sejam mantidas, como peso de impacto de 20 g, altura de queda de 25 cm, diâmetro de 4 mm na ponta do impactador, entrega confiável de isoflurano e configurações de ressonância magnética comparáveis às usadas aqui. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação animal

1. Prepare os animais.
   1. Use camundongos machos C57BL/6N com idades entre 8 e 10 semanas e pesando entre 20 e 25 g.
   2. Alojar os camundongos em gaiolas ventiladas individualmente (IVCs) em uma instalação específica para animais livres de patógenos (FPS). Forneça comida e água à vontade e mantenha um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridade sob temperatura e umidade controladas.
   3. Aclimate os camundongos à sala de alojamento antes do experimento e realize uma triagem de saúde rotineira de acordo com os procedimentos institucionais de cuidado animal.
2. Atribua os grupos.
   1. Atribua aleatoriamente os camundongos ao grupo Naive, ao grupo Sham e ao grupo c-TBI. Os pesquisadores responsáveis pela interpretação de ressonância magnética, avaliação patológica macroscópica e pontuação comportamental/análise de dados foram cegos para a atribuição em grupo.
   2. Registre o número de identificação do animal e a atribuição em grupo antes da primeira sessão de lesão.

2. Preparação para cirurgia e anestesia

1. Prepare os instrumentos cirúrgicos e o sistema de anestesia.
   1. Prepare um bisturi estéril equipado com lâmina nº 11, cotonetes estéreis, soro fisiológico estéril, solução de povidona-iodo 10%, sutura monofilamento de polipropileno 5-0 não absorvível, fita adesiva e pomada oftálmica com clortetraciclina.
   2. Esterilize os instrumentos cirúrgicos antes do uso, coloque-os em um campo cirúrgico limpo e mantenha a técnica asséptica durante todo o procedimento. Use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas, jaleco e proteção ocular.
   3. Prepare uma almofada térmica termostática e ajuste para 37 °C ± 0,5 °C.
   4. Conecte a câmara de indução e o cone do nariz ao sistema de anestesia gasosa de laboratório animal.
   5. Ajuste a taxa de fluxo de oxigênio para 0,5 a 1,0 L/min e prepare o vaporizador de isoflurano para indução e manutenção. Realize anestesia em uma área bem ventilada ou utilize um sistema aprovado de recaptação de gases residuais.
2. Prepare o rato para a cirurgia.
   1. Administrar buprenorfina HCl (0,1 mg/kg, intraperitonealmente) 30 minutos antes da anestesia e cirurgia, de acordo com o protocolo animal aprovado.
   2. Coloque o camundongo na câmara de indução e induza anestesia com isoflurano. Ajuste o vaporizador para 3%–5% para indução e monitore o rato continuamente até que o reflexo de endireitamento se perca e o movimento espontâneo dos membros cesse. Não exceda 5% de isoflurano durante a indução.
   3. Transfira o rato para uma estrutura estereotáxica em posição deitada e mantenha a anestesia através de um cone nasal. Reduza a configuração do vaporizador para 1%–2% para manutenção, mantendo a taxa de fluxo de oxigênio entre 0,5–1,0 L/min.
      1. Durante o procedimento, mantenha uma frequência respiratória estável de aproximadamente 60–100 respirações/min. Se a frequência respiratória cair abaixo de 60 respirações/minuto ou a respiração se tornar superficial ou irregular, reduza imediatamente a concentração de isoflurano, proporcione aquecimento de suporte e atrase o impacto até que a respiração estável retome. Não exceda 2% de isoflurano durante a manutenção.
   4. Confirme anestesia adequada pela ausência de reflexo de retirada do pedal, prenda a cabeça com as barras auriculares do corpo estereotáxico sem danificar as membranas timpânicas (Figura 2A) e mantenha o camundongo em posição deitada. Se não houver anestesia adequada dentro dos intervalos de indução e manutenção estabelecidos, ou se ocorrer depressão respiratória excessiva, exclua o animal dessa sessão de lesão.
   5. Aplique pomada oftálmica com clortetraciclina em ambos os olhos, raspe o couro cabeludo e desinfete o local cirúrgico com solução 10% de povidona-iodo.

3. Estabelecimento do modelo de lesão cerebral traumática leve repetitiva

1. Expõe o crânio.
   1. Faça uma incisão longitudinal na linha média, aproximadamente de 0,5 cm a 1 cm de comprimento, no couro cabeludo usando um bisturi estéril equipado com uma lâmina nº 11.
   2. Dissecar de forma direta o tecido subcutâneo e o periósteo com pinças estéreis ou cotonetes para expor totalmente o crânio sem arranhar a superfície óssea.
   3. Limpe a superfície do crânio com um cotonete estéril umedecido com soro fisiológico para visualizar os pontos de referência cranianos, incluindo bregma e a sutura coronal.
2. Prepare o dispositivo de impacto.
   1. Instale uma ponta metálica curva de impactador de 4 mm de diâmetro no dispositivo de queda livre de queda de peso.
   2. Ajuste a altura da queda para 25 cm e use um peso de impacto de 20 g (Figura 2B).
3. Causar o impacto.
   1. Identifique o local do impacto em um ponto 2 mm à esquerda da sutura sagital e 2 mm posterior à sutura coronal na superfície do crânio (Figura 2C).
   2. Alinhe a ponta do impactador verticalmente sobre o local alvo, abaixe-a suavemente até que toque a superfície do crânio e certifique-se de que a ponta permaneça centrada e perpendicular ao crânio antes de liberar o peso.
   3. Libere o peso de 20 g de uma altura de 25 cm para causar um único impacto.
   4. Para o grupo Naive, não realize anestesia ou cirurgia. Para o grupo simulado, administre anestesia e faça uma incisão no couro cabeludo, mas não realize o impacto.
4. Suture a incisão e preste cuidados pós-operatórios.
   1. Remova a ponta do impactador imediatamente após o impacto e inspecione o local cirúrgico.
   2. Feche a incisão no couro cabeludo com o ponto interrupto de monofilamento de polipropileno não absorvível 5-0 e desinfete o local da incisão com solução 10% de povidona-iodo.
   3. Coloque o rato em uma almofada térmica termostática mantida entre 37 °C ± 0,5 °C, monitore a respiração até a recuperação total da consciência e a caminhada livre, e então o rato retorne à sua gaiola de origem.
      NOTA: A recuperação é definida pelo retorno da respiração espontânea regular, recuperação do reflexo de endireitamento e marcha espontânea. Apneia aguda e hemorragia visível devem ser monitoradas imediatamente após cada impacto e durante a recuperação inicial. Animais que apresentam apneia prolongada, hemorragia visível, não recuperam o reflexo de endireitamento em até 10 minutos após a descontinuação do isoflurano, ou não se deslocam espontaneamente em até 15 minutos, devem ser excluídos de procedimentos adicionais e gerenciados de acordo com o protocolo animal aprovado.
   4. Descarte as lâminas e agulhas usadas em um recipiente aprovado para objetos cortantes. Descartar resíduos animais e materiais contaminados de acordo com as regulamentações institucionais de biossegurança.
5. Repita a lesão.
   1. Repita os passos 3.1–3.4 a cada 24 horas por 5 dias consecutivos para entregar um total de 5 impactos.
   2. Monitore o peso e a atividade do corpo continuamente durante todo o período de recuperação pós-operatória. Exclua animais de análises subsequentes se desenvolverem fratura no crânio, hemorragia visível, convulsão, círculos persistentes ou incapacidade de se alimentar ou beber de forma independente.

4. Aquisição de imagens por ressonância magnética

NOTA: Neste estudo, a ressonância magnética foi realizada no sétimo dia após a lesão final. Os camundongos foram escaneados sob anestesia isoflurana e não foram sacrificados antes da imagem. A coleta de tecidos foi realizada após imagens de acordo com o cronograma experimental.

1. Prepare o animal para a ressonância magnética.
   1. Anestesie o camundongo com isoflurano e coloque-o em uma cama compatível com ressonância magnética, equipada com um cone nasal.
   2. Monitore a respiração durante todo o exame e mantenha a temperatura corporal entre 37 °C ± 0,5 °C.
2. Adquirir imagens ponderadas T2
   1. Adquira imagens em um ímã supercondutor de 9,4 T com diâmetro de 30 cm e sistema de gradiente com intensidade máxima de gradiente de 1000 mT/m e taxa máxima de desvio de 10000 T/m/s.
   2. Use uma bobina de volume de 86 mm para transmissão por radiofrequência e uma bobina de superfície plana de 15 mm para recepção de sinal.
   3. Adquira imagens de spin-echo rápido multi-fatiadas ponderadas em T2 usando os seguintes parâmetros: tempo de repetição = 3000 ms, tempo de eco = 46,34 ms, comprimento do trem de eco = 13, largura de banda do receptor = 220 Hz/pixel, campo de visão = 20 × 20^{mm 2}, matriz de aquisição = 208 × 208, espessura do corte = 0,5 mm, lacuna de corte = 0 mm e número de excitações = 2.
   4. Adquira 30 fatias para cobrir todo o cérebro. Use um tempo total de aquisição de 1 min 33 s. No presente estudo, a ressonância magnética ponderada em T2 foi usada apenas para avaliação qualitativa. Nenhuma análise quantitativa de ressonância magnética foi realizada.
      NOTA: As imagens de ressonância magnética foram revisadas qualitativamente por um pesquisador cego para a atribuição em grupo.

5. Avaliação da neuropatologia macroscópica

1. Realize a coleta de tecidos.
   1. Anestesie profundamente o rato de acordo com o protocolo animal aprovado.
   2. Abra a cavidade torácica, exponha o coração, insira uma agulha de perfusão no ventrículo esquerdo e incisa o átrio direito.
   3. Perfunda com soro fisiológico normal, depois perfunde com paraformaldeído (PFA) a 4%. Realize todo o procedimento de perfusão em uma exaustão química certificada e evite contato direto com pele ou olhos com a PFA. Descarte tecidos e resíduos líquidos em conformidade com as normas de resíduos perigosos e biossegurança.
   4. Colete o crânio e o cérebro intacto e capture imagens grosseiras usando uma câmera de alta resolução.
      NOTA: A avaliação patológica macroscópica foi realizada por um investigador cego para a atribuição em grupo.

6. Monitorar o peso corporal

1. Registre o peso do corpo.
   1. Pese cada camundongo antes da primeira sessão de lesão e nos dias 1, 3, 7, 14, 21 e 30 após a lesão, e registre os valores para avaliar o estado geral de saúde ao longo do tempo.

7. Realizar o teste de caminhada por feixe

1. Prepare o aparelho.
   1. Use uma viga horizontal de madeira de 1 m de comprimento por 1 cm de largura e suspenda-a a 30 cm acima do chão.
2. Coordenação motora de teste.
   1. Coloque o mouse na extremidade inicial do feixe, permita que ele percorra até o ponto final e registre o tempo necessário para atravessar o feixe.
   2. Realize o teste antes da lesão e nos dias 1, 3, 7, 14, 21 e 30 após a lesão.
      NOTA: Os ensaios comportamentais foram programados para minimizar os efeitos transferidos entre os testes. Como o teste de suspensão da cauda (TST) e o teste de natação forçada (FST) são mais estressantes do que o teste em campo aberto (OFT), eles foram realizados primeiro, seguidos pelo OFT e pelo labirinto Barnes em momentos posteriores. Essa sequência foi selecionada para reduzir possíveis confundimentos causados por habituação prévia ou exposição exploratória repetida durante avaliações comportamentais subsequentes.

8. Realização do teste de suspensão na cauda

1. Prepare o aparelho.
   1. Realize o teste no dia 7 após a lesão e coloque um cilindro de Plexiglas sobre a cauda para evitar escalar a cauda. Use um cilindro de 4 cm de comprimento com diâmetro externo de 1,6 cm, diâmetro interno de 1,2 cm e peso de 1,6 g.
2. Registre o comportamento.
   1. Fixe a cauda à caixa de suspensão com fita adesiva, certifique-se de que o mouse não alcance o fundo da caixa e suspenda o mouse por 3 minutos.
   2. Grave toda a sessão com uma câmera de alta resolução e analise manualmente o tempo de mobilidade e o tempo de imobilidade a partir do vídeo gravado por um observador cego.

9. Realização do teste de natação forçada

1. Prepare o aparelho.
   1. Realize o teste no 10º dia após a lesão e encha um cilindro transparente de 25 cm de altura e 15 cm de diâmetro com água mantida entre 23 e 25 °C. Use uma profundidade de água que impeça a cauda e os membros posteriores de tocarem o fundo.
2. Registre o comportamento.
   1. Coloque o mouse na água por 6 minutos e grave toda a sessão com uma câmera de alta resolução.
   2. Analise manualmente os últimos 4 minutos da gravação por um observador cego e quantifique o tempo de mobilidade e o tempo de imobilidade.
   3. Defina imobilidade apenas como os movimentos mínimos necessários para manter a cabeça acima da água.

10. Realização do teste em campo aberto

1. Prepare o aparelho.
   1. Realize o teste no dia 14 após a lesão, em um cômodo silencioso sob iluminação constante. Esse último momento foi escolhido para proporcionar separação das sessões anteriores de TST e FST e, assim, reduzir a transferência relacionada ao estresse agudo para a OFT.
   2. Use uma caixa de campo aberto medindo 40 cm × 40 cm × 40 cm.
2. Registre e analise comportamentos exploratórios.
   1. Coloque o mouse no centro da arena e deixe ele explorar livremente por 6 minutos.
   2. Acompanhe o comportamento por 6 minutos usando um software de rastreamento e análise comportamental. Calibre as dimensões da arena no software para corresponder aos aparelhos de 40 cm × 40 cm e divida virtualmente a arena em uma grade de 5 × 5.
   3. Defina os 16 quadrados externos como a zona periférica e os 9 quadrados internos como a zona central. Defina a cor do animal mais escura que a cor do fundo. Rastreie apenas o corpo do animal; Não rastreie a cabeça ou o rabo. Capture manualmente o fundo.
   4. Use o software para medir a velocidade média, o tempo passado na zona central, o tempo na zona periférica e a distância total percorrida durante todo o período de teste.
   5. Limpe e desodorize o aparelho antes e depois de cada teste para remover sinais olfativos.

11. Apresentando o labirinto de Barnes

1. Prepare o aparelho.
   1. Comece a avaliação do labirinto Barnes no dia 30 após a lesão.
   2. Use uma plataforma circular de aço inoxidável com 1 m de diâmetro e 20 furos espaçados uniformemente.
   3. Coloque a caixa de escape sob um buraco designado, posicione pistas visuais ao redor do labirinto e mantenha a localização do buraco de alvo constante em todos os testes.
2. Conduzindo a fase de treinamento
   1. Ative ruído branco de 90 dB como estímulo aversivo durante o treinamento.
   2. Coloque o mouse sob um cilindro transparente no centro da plataforma por 120 s.
   3. Remova o cilindro e deixe o mouse explorar por até 180 segundos.
   4. Grave um teste bem-sucedido quando as quatro patas entrarem na caixa de escape.
   5. Guie o mouse para dentro da escape box se ele não localizar o alvo dentro de 180 s e registre a latência como 180 s.
   6. Deixe o mouse permanecer na escape box por 60 segundos.
   7. Repita a prova de treinamento uma vez após um intervalo de 4–5 horas em cada dia de treinamento e continue treinando por 4 dias consecutivos.
3. Conduzindo o dia de descanso e a fase de teste
   1. Suspenda o treinamento por 1 dia após a fase de treinamento.
   2. Coloque o mouse no centro da plataforma no dia do teste e permita a exploração por até 180 s.
   3. Ajuste o diâmetro do labirinto para 100 cm para calibração em escala e certifique-se de que a arena de rastreamento esteja centralizada no quadro do vídeo. Deixe a cor do animal mais escura que o fundo. Rastreie apenas o corpo do animal; Não rastreie a cabeça ou o rabo. Capture manualmente o fundo.
   4. Registre a latência para entrar na escape box, a velocidade média e a distância total percorrida durante a sessão de teste de 180 s usando um software de rastreamento e análise comportamental. Defina a zona de escape no software de acordo com a localização do furo alvo designado antes da análise.

12. Análise de dados

1. Prepare o conjunto de dados.
   1. Compile os dados comportamentais, de imagem e de peso corporal em um software estatístico e gráfico.
   2. Expresse os dados como a média ± erro padrão da média (SEM).
2. Realize uma análise estatística.
   1. Analise os dados longitudinais de peso corporal e caminhada em feixe neste estudo usando um modelo linear de efeitos mistos com grupo, tempo e sua interação como efeitos fixos e animal como efeito aleatório, seguido por testes de comparação múltipla post hoc quando aplicável.
   2. Analisar os resultados do TST, FST, OFT e Barnes do labirinto usando ANOVA unidirecional comum para dados normalmente distribuídos com variâncias homogêneas, seguido pelo teste post hoc de Tukey quando a ANOVA geral foi significativa. Para dados não paramétricos, use o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste post hoc de Dunn.
   3. Informe valores exatos de p. sempre que disponíveis, juntamente com a estatística do teste, graus de liberdade e uma medida de tamanho do efeito (R² para ANOVA unidirecional). Derive todos os valores-p reportados dos testes estatísticos especificados acima e realize todas as análises no software estatístico e de gráficos.
   4. Defina significância estatística na p. < 0,05.

Resultados

Imagem e avaliação neuropatológica de camundongos com TCE

Para avaliar o estado geral de saúde e a função motora basal dos animais, o peso corporal e o desempenho na caminhada com trave foram monitorados de acordo com a linha do tempo mostrada na Figura 1. As diferenças longitudinais dos grupos foram analisadas usando um modelo linear de efeitos mistos com o animal como efeito aleatório. Antes da modelagem, não ha...

Discussão

Este estudo detalha um protocolo experimental padronizado para estabelecer um modelo de camundongo de lesão cerebral leve e leve repetitiva (rmTBI) usando um método repetido de queda livre e queda de peso. Ao prender o camundongo exposto ao crânio em um aparelho estereotáxico e aplicar impactos repetidos em coordenadas definidas usando um peso de 20 g reduzido de uma altura de 25 cm por cinco dias consecutivos, foi induzido um fenótipo comportamental caracterizado por comportamento depre...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5-0 nonabsorbable polypropylene monofilament suture	Jinhuan Medical	I303	fechamento de feridas
Máquina de anestesia	RWD Life Science	R550	construção de modelos animais
Software de rastreamento comportamental ANY-maze	Stoelting	Versão 7	software comportamental
Labirinto Barnes	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XB108	software comportamental
Biorender	BioRender	https://biorender.com	software de desenho para pesquisa científica
Buprenorfina	Sigma-Aldrich	Y0001108	analgesia pós-operatória
Navalha elétrica	AUX	AUX-C5-1	remoção de pêlos pré-operatória
Teste de natação forçada	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	software comportamental
GraphPad Prism 9.5	La Jolla	9.5	software estatístico
Isofluorano	RWD Life Science	R510-22-10	construção de modelos animais
Camundongos	Charles river	C57/6N	animal experimental
Teste de campo aberto	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XZ301	software comportamental
Pomada oftálmica	BEIJING TWINLUCK PHARMACEUTICAL	H11021342	prevenir a secagem da córnea durante a anestesia
Paraformaldeído (PFA), 4%	Biosharp	BL539A	perfusão e fixação de tecidos
Soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS)	Biosharp	BL1425A	perfusão e lavagem de tecidos
Solução de povidona-iodina, 10%	Beyotime	27883-25g	desinfecção da pele antes da cirurgia
Sistema de Ressonância Magnética Pré-clínica	United Imaging Life Science Instrument	uMR9.4T	software de imagem
Lâmina de bisturi Nº 11	Jinhuan Medical	K3-11	incisão da pele durante a cirurgia
Maçaneta de bisturi	Jinhuan Medical	K6-10	usado com lâmina de bisturi Nº 11
Instrumento de estereotaxia	RWD Life Science	68025	construção de modelos animais
Gaze estéril	HYNAUT	BK05	controle de sangramento e limpeza cirúrgica
Teste de suspensão de cauda	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	software comportamental
Impactor de queda de peso	RWD Life Science	68093	construção de modelos animais