Este estudo identificou os principais alvos e caminhos da shikonin contra o CCR por meio de análise multimétodo e validação in vitro , fornecendo uma estrutura para estudos mecanicistas adicionais.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de investigação
Este estudo identificou os principais alvos e caminhos da shikonin contra o CCR por meio de análise multimétodo e validação in vitro , fornecendo uma estrutura para estudos mecanicistas adicionais.
O carcinoma de células renais (CCR) é um dos tumores mais comuns no sistema urinário e possui a maior taxa de mortalidade. Investigações anteriores demonstraram que a shikonin pode tratar carcinoma de células renais, mas o mecanismo ainda não está claro. Portanto, nosso estudo teve como objetivo elucidar o mecanismo da shikonina no tratamento do carcinoma de células renais usando farmacologia em rede, acoplamento molecular e ensaios funcionais in vitro, incluindo proliferação celular, migração e apoptose, com validação por western blot (WB). Alvos Shikonin foram avaliados usando PharmMapper, SwissTargetPrediction e outros bancos de dados, e identificados alvos relacionados ao RCC a partir do Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), GeneCards e outros bancos de dados; Os potenciais alvos terapêuticos foram obtidos por análise de interseção. Uma rede de interação proteína-proteína (PPI) foi construída, e o Cytoscape foi usado para rastrear alvos centrais, enquanto acoplamento molecular foi aplicado para analisar a afinidade de ligação entre shikonina e alvos principais. Um total de 374 alvos shikonin e 1.087 alvos relacionados ao RCC foram coletados, e 98 genes alvo sobrepostos foram identificados. Seis alvos centrais (SRC, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, PTPN11 e PIK3R1) foram identificados. As análises da Gene Ontology (GO) e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) mostraram que a shikonin exercia efeitos anti-RCC principalmente ao regular a atividade das proteínas quinases, HIF-1 e vias de sinalização IL-17. O acoplamento molecular confirmou que a shikonin tinha uma forte afinidade de ligação com esses alvos centrais. Estudos in vitro usando células Caki-1 e 786-O RCC humanas demonstraram que a shikonin inibia significativamente a proliferação e migração celular de forma dependente da dose, promovia a apoptose celular e aumentava as atividades da caspase-3 e caspase-8. Experimentos com Western blot também verificaram que a shikonin modulava a expressão das proteínas-alvo centrais e suprimia a via de sinalização do HIF-1. Este estudo elucida sistematicamente o mecanismo farmacológico da shikonina contra o carcinoma de células renais, fornecendo uma base teórica para o desenvolvimento e aplicação da shikonina como um novo agente anti-RCC.
O carcinoma de células renais (CCR) é o tumor maligno mais comum do sistema urinário, representando aproximadamente 90% de todos os tumores malignos renais e 2%–3% dos tumores malignos adultos no mundo. De acordo com os dados do GLOBOCAN 2022, houve cerca de 434.800 novos casos e 155.953 mortes por carcinoma de células renais globalmente em 2022, com a incidência e mortalidade do CCR mostrando uma tendência contínua de alta. A American Cancer Society estimou 80.980 novos casos e 14.510 mortes por carcinoma de células renais apenas nos Estados Unidos em 2025. O carcinoma de células renais apresenta a maior taxa de mortalidade entre os ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Todas as linhagens celulares humanas usadas neste estudo foram adquiridas de bancos celulares comerciais autenticados, e nenhum tecido humano fresco ou amostras de pacientes foi coletado. Portanto, não foi necessária aprovação ética para este estudo baseado em células in vitro .
Obtenção e previsão de alvos shikonin
A palavra-chave "shikonin" foi pesquisada no banco de dados PubChem. A estrutura SDF do shikonin foi baixada, e sua notação simplificada de sistema de entrada molecular de entrada de linha (SMILES) foi obtida. De acordo com os requisitos dos respectivos bancos de dad....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Obtenção e previsão de alvos shikonin
Usando os quatro bancos de dados mencionados, foram previstos potenciais alvos de shikonin, e 426 alvos foram identificados após integração e resumo. Os alvos resumidos foram desduplicados, resultando em 374 alvos, conforme mostrado na Figura 2A.
Obtenção de alvos carcinomas de células renais
Um total de 1.147 alvos foi obtido após a resumida dos dados relacionados aos três bancos de dad.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
PIK3CA é formalmente conhecido como isoforma alfa da subunidade catalítica fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato 3-quinase. O PIK3CA, componente central da via PI3K/AKT/mTOR, desempenha um papel essencial na ocorrência, desenvolvimento e tratamento do carcinoma de células renais (CCR). Estudos mostraram que PIK3CA é um gene mutante de alta frequência desse subtipo (6/57, 11%), e sua mutação está diretamente relacionada à ativação anormal da via PI3K/AKT. Além disso, esses pacientes respondem.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Os autores não têm nada a revelar.
Esta pesquisa foi financiada pela Comissão Provincial de Saúde de Ciência e Tecnologia de Guizhou (gzwkj2024-516); Programa Nacional e Provincial de Desenvolvimento de Talentos em Inovação em Ciência e Tecnologia da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Guizhou, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Guizhou TD Hopes [2023] 005; Fundação Provincial de Ciências Naturais de Guizhou [números de subsídio: ZK [2024] 404]; Complexo proteína-polissacarídeo de Chuanxiong baseado nas características do leite de Pickering de circulação prolongada para promover o tratamento da cefaleia com Chuanxiong (82360779).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 786-O | American Type Culture Collection (ATCC) | RRID: CVCL_1051 (ATCC CRL-1932) | Linha celular de carcinoma de células renais de células claras humanas |
| AlphaFold database | European Molecular Biology Laboratory (EMBL) - EBI | AlphaFold Protein Structure Database | Banco de dados de previsão de estrutura de proteínas (AlphaFold Protein Structure Database) |
| AutoDock Tools software | Scripps Research Institute | 1.5.7 | Software de acoplamento molecular para previsão de ligação ligante-proteína |
| Caki-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | RRID: CVCL_0234 (ATCC HTB-46) | Linha celular de carcinoma de células renais de células claras humanas |
| Caki-1 cells | Mudanjiang Normal University | HTB-46 (RRID: CVCL_0234) | Linha celular de carcinoma de células renais de células claras humanas |
| Caspase 3 and caspase 8 detection kits | Credit Suisse Biotechnology Co Ltd (QUANZHOU, China) | Caspase-3 Activity Assay Kit, Cat. No. RX302848M, Caspase-8 Activity Assay Kit, Cat. No. RX302849M | Usado para detectar atividade de caspase para avaliar apoptose celular |
| Cytoscape software | Cytoscape Consortium | 3.9.1 | Usado para construção e visualização de rede biológica |
| DMEM medium | Hyclone | SH30022.01 | Meio de cultura celular para cultura celular Caki-1 e 786-O |
| Fetal bovine serum | Gbico | 10099-141 | Suplemento de cultura celular para crescimento celular Caki-1 e 786-O |
| GeneCards | Weizmann Institute of Science | https://www.genecards.org/ | Banco de dados genéticos humano abrangente para anotação de genes-alvo |
| GraphPad Prism | GraphPad, San Diego, CA, USA | versão 8.3.0 | Para construção de gráficos estatísticos |
| HERB database | Chinese Academy of Sciences | http://herb.ac.cn | Banco de dados componente-alvo de medicina tradicional chinesa |
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | Fiji | Software de análise de imagem para quantificação de bandas de morfologia celular e Western blot |
| inverted microscope | Olympus, IX73, Japan | 100× magnification. | Usado para observar mudanças na morfologia celular após o tratamento com shikonin |
| KOBAS 3.0 database | Peking University | http://bioinfo.org/kobas/ | Ferramenta de análise de enriquecimento de ontologia gênica e via |
| Metascape database | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | https://metascape.org/gp/index.html) | Ferramenta de análise de enriquecimento de função gênica e rede |
| Microcredit platform | National Center for Bioinformation (China) | http://www.bioinformatics.com.cn/ | Plataforma de análise bioinformática online para processamento de dados |
| MTT assay kit | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (Beijing, China) | Cat. No. M8180 | Usado para detectar viabilidade celular (ensaio antiproliferativo) |
| OMIM | Johns Hopkins University School of Medicine | https://www.omim.org/ | Herança Mendeliana Online no Homem (banco de dados de doenças genéticas humanas) |
| PharmMapper database | East China University of Science and Technology | https://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ | Banco de dados de previsão de alvos de medicamentos de moléculas pequenas |
| PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, and PTPN11 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA) | Anticorpos primários para análise de Western blot de proteínas-alvo |
| PyMol software | Schrödinger, Inc. | 2.2.0 | Software de visualização molecular para análise de estrutura de proteínas |
| RCSB protein database | RCSB Protein Data Bank (Rutgers University) | https://www.rcsb.org/ | Banco de dados de estrutura de proteínas (PDB) para modelagem molecular |
| SEA Search Server database | University of California, San Francisco | https://sea.bkslab.org | Abordagem de Ensemble de Similaridade para previsão de alvos |
| Shikonin (pureza 98% | organismos de folha originários da China | Y0001439 | Composto de molécula pequena usado para tratamento de carcinoma de células renais (RCC) neste estudo |
| SPSS | IBM, Armonk, NY, USA | versão 20.0 | Para análise estatística |
| STRING | European Molecular Biology Laboratory (EMBL) | https://stringdb.org/ | Banco de dados de rede de interação proteína-proteína |
| SwissTargetPrediction database | Swiss Institute of Bioinformatics | https://www.swisstargetprediction.ch/ | Ferramenta de previsão de alvos de moléculas pequenas para descoberta de medicamentos |
| Therapeutic Target Database | Shanghai Institute of Materia Medica | https://ttd.idrbrab.cn | Banco de dados de alvos terapêuticos e medicamentos |
| Venny 2.1 | Spanish National Center for Biotechnology (CNB-CSIC) | https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html) | Ferramenta de diagrama de Venn para análise de interseção de dados |