Artigo de método

FISH de reação em cadeia de hibridização no lobo óptico em desenvolvimento de Drosophila

DOI:

10.3791/71681

⸱

17 de julho de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, New York University, 2Department of Biological Sciences, Columbia University, 3Department of Biology, The City College of New York

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve as etapas necessárias para realizar hibridização fluorescente in situ por reação em cadeia (HCR-FISH) nos lobos ópticos larvais de Drosophila melanogaster . Procedimentos para o projeto da sonda, hibridização, amplificação e montagem de tecidos são detalhados para facilitar a visualização do lobo óptico em desenvolvimento.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Compreender o desenvolvimento neural requer caracterização precisa de quando e onde os genes são expressos. Técnicas como a hibridização in situ há muito tempo permitem a visualização da expressão gênica em tecidos em desenvolvimento. Embora a hibridização in situ seja amplamente utilizada em embriões de Drosophila melanogaster , sua aplicação no desenvolvimento do sistema visual tem sido limitada por vários desafios técnicos. Por exemplo, sondas longas frequentemente penetram mal no lobo óptico, e protocolos que dependem de repórteres catalíticos difusíveis, como a peroxidase de raiz-forte, frequentemente produzem baixas relações sinal-ruído em preparações de montagem completa. A hibridização fluorescente fluorescente in situ (HCR-FISH) supera muitas dessas limitações e permite uma detecção de sinais mais robusta. Assim como no FISH convencional, os monômeros de sonda de DNA hibridizam com sequências de RNA dentro dos tecidos. No HCR-FISH, entretanto, sondas amplificadoras conjugadas fluorescentes formam estruturas estáveis em forma de grampo que desencadeiam a polimerização de monômeros adicionais, amplificando assim a intensidade do sinal. O uso de conjuntos de sondas multiplexadas também permite o uso de oligonucleotídeos mais curtos (~45 nt, comparado a até 1.000 nt no FISH convencional), melhorando a penetração da sonda e produzindo uma coloração mais uniforme em amostras de montagem inteira. Este artigo descreve um protocolo HCR-FISH otimizado para o lobo óptico larval de Drosophila . O protocolo adapta as abordagens HCR-FISH existentes otimizando as condições de fixação e aumentando as concentrações de sonda e hairpin para melhorar a intensidade do sinal e a penetração dos tecidos. Listas de reagentes e procedimentos passo a passo são fornecidos. Aplicações potenciais na neurobiologia do desenvolvimento também são apresentadas, incluindo visualização de neurônios recém-nascidos e caracterização de padrões de expressão gênica em casos em que métodos convencionais, como proteínas marcadas endógenamente ou coloração de anticorpos, não fornecem informações suficientes.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Compreender como o cérebro é montado exige identificar tanto a diversidade dos tipos celulares presentes quanto os repertórios gênicos expressos em cada tipo celular1. Avanços recentes no sequenciamento de RNA unicelular permitiram que pesquisadores abordassem essas questões com altaresolução 2. No entanto, muitas abordagens de célula única não preservam informações espaciais, exigindo experimentos adicionais para mapear aglomerados celulares transcricionais para suas localizações dentro do cérebro em desenvolvimento.

Sistemas binários de expressão gênica como o GAL4-UAS podem fornecer informações posicionais, mas não sãoquantitativos 3. Além disso, atrasos entre a expressão gênica e a detecção de repórteres podem obscurecer padrões de expressão fisiologicamente relevantes durante os estágios iniciais do desenvolvimento. A imunocoloração é outra abordagem amplamente utilizada para determinar padrões de expressão específicos dotecido 4. No entanto, proteínas secretadas são frequentemente difusas e difíceis de localizar com precisão.

Abordagens de marcação de nucleótidos, como a hibridização in situ (ISH), também têm sido amplamente utilizadas para obter informações espaciais sobre a expressãogênica 5. Na ISH, oligonucleotídeos de DNA marcados se ligam a sequências de RNA complementares reversas de interesse. Os primeiros métodos ISH usavam sondas de DNAradiomarcadas 6, enquanto protocolos posteriores incorporaram marcadores mais seguros como digoxigenina, fluoresceína erodamina 7,8,9. Cientistas adaptaram rapidamente o ISH para uso em Drosophila melanogaster, onde foi aplicado para caracterizar a organização do cromossomo politeno e mapear os padrões de expressão de genes de gapo, como o corcunda, em embriões de montagemintegral 10,11.

Apesar de sua utilidade ampla, várias limitações técnicas dificultaram a adoção do ISH em preparações mais espessas de montagem completa, como o lobo óptico larval. Muitos protocolos in situ dependiam de repórteres catalíticos difusíveis, como a peroxidase de raiz-forte, que frequentemente resultavam em baixas relaçõessinal-ruído 12. Além disso, muitas abordagens usaram sondas longas direcionadas a sequências individuais para melhorar a especificidade. Embora eficazes em embriões de Drosophila e cromossomos politenos, sondas longas penetram mal no cérebro larval e frequentemente produzem marcação desigual 10,11,13.

O desenvolvimento da ISH fluorescente de molécula única (smFISH) e da hibridização fluorescente in situ por reação em cadeia (HCR-FISH) abordaram muitas dessaslimitações 14,15. Ao usar conjuntos de sondas curtas espalhadas por uma única região gene, o smFISH reduz o comprimento médio da sonda de aproximadamente 1.000 nt para aproximadamente 40 nt16. Isso melhora substancialmente a penetração da sonda, mantendo a intensidade do sinal forte. O HCR-FISH melhora ainda mais as relações sinal-ruído usando sondas amplificadoras conjugadas fluorescente, que aumentam a precisão posicional e amplificam a saída do sinal. Importante, essa etapa de amplificação parece escalar linearmente com a concentração de transcritos, permitindo a medição quantitativa dos níveis17 de expressão gênica.

O HCR-FISH começa com sondas iniciadoras complementares à sequência alvo. Esses oligonucleotídeos de DNA não marcados contêm uma sequência iniciadora de fita simples que se liga ao domínio de entrada de uma sonda amplificadora H1 marcada fluorescente. Amplificadores H1 adotam uma estrutura em grampo que mantém a inatividade catalítica até se ligar à sequência iniciadora. Ao se conectar, o amplificador H1 se abre e expõe uma sequência que se liga a uma sonda parceira, H2. Essa interação abre o hairclip H2, permitindo que ele se ligue a outra sonda H1 (Figura 1)15. Ciclos repetidos de ligação H1/H2 geram um polímero estável que amplifica o sinal de fluorescência enquanto reduz o ruído de fundo. Como cada sequência iniciadora é específica para um par correspondente H1/H2, múltiplas sondas com sequências iniciadoras distintas e fluoróforos podem ser usados simultaneamente para marcar vários genes dentro da mesma amostra.

figure-introduction-1
Figura 1: Representação gráfica do fluxo de trabalho HCR-FISH. Sondas de DNA contendo sequências iniciadoras hibridizam em um transcrito de RNA-alvo. Grampos amplificadores de DNA marcados fluorescentemente se ligam à sequência iniciadora e passam por polimerização sequencial para formar cadeias de amplificação estáveis de fita dupla. A conjugação direta do fluoróforo melhora a amplificação do sinal e a relação sinal-ruído. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Melhorias recentes no HCR-FISH aumentaram ainda mais sua utilidade. O design da sonda iniciadora dividida melhora a especificidade do amplificador, e anticorpos secundários conjugados aos iniciadores de HCR possibilitam imunohistoquímica simultânea eHCR-FISH 18. Além disso, opções expandidas de fluoróforos agora permitem a imagem multiplexada de até 10 genessimultaneamente 19,20.

Embora experimentos iniciais de prova de conceito para HCR-FISH tenham sido realizados em peixe-zebra (Danio rerio), o método ganhou amplo uso em muitos sistemas, especialmente em organismos não modelo, onde os anticorpos são caros ou indisponíveis15. A síntese de sonda também oferece uma alternativa mais rápida à geração de anticorpos, que pode levar meses de desenvolvimento. Consequentemente, o HCR-FISH oferece uma abordagem rápida para validar genes candidatos identificados por meio dos conjuntos de dados de sequenciamento de RNA de célulaúnica 21. Mesmo em organismos modelo genéticos estabelecidos, o HCR-FISH fornece um método valioso para mapear espacialmente neurônios recém-nascidos quando repórteres GAL4 ou imunohistoquímica falham em marcar adequadamente populações celulares específicas.

Este artigo descreve um protocolo HCR-FISH otimizado para o lobo óptico larval de Drosophila em terceiro estádio. O protocolo adapta métodos previamente publicados em outros organismos para uso no sistema visual 22 de Drosophila. Condições de fixação comumente usadas para imunohistoquímica da Drosophila foram otimizadas para aplicações FISH. As concentrações de sonda e grampo de cabelo foram aumentadas para melhorar a intensidade do sinal e a penetração dos tecidos. Tubos de PCR foram usados em vez de placas pontuais, para reduzir o consumo de reagentes e simplificar o manuseio de pequenas amostras de tecido. Além disso, os tempos de lavagem e hibridização foram reduzidos para acomodar o tamanho menor do cérebro de Drosophila em relação a outros sistemas de insetos comumente usados para HCR-FISH.

Aplicações representativas demonstram como essa abordagem pode fornecer informações posicionais para populações neuronais específicas durante o desenvolvimento. Esses experimentos indicam que certos transcritos, como abruptos, podem ser detectados mais cedo com HCR-FISH do que com coloração por anticorpos ou linhas repórteres. Desafios potenciais, estratégias de solução de problemas e aplicações do HCR-FISH para estudar o desenvolvimento de sistemas visuais em Drosophila também são discutidos.

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Protocolo

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Todos os experimentos com Drosophila melanogaster foram realizados de acordo com as diretrizes do City College of New York, Columbia University e New York University para o cuidado e uso de organismos de pesquisa. As ferramentas de pesquisa usadas neste protocolo estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Preparar os tampões

NOTA: Prepare todos os reagentes em tubos livres de nuclease usando pontas de filtro.
NOTA: Use luvas durante todo o procedimento. Limpe as superfícies de trabalho com solução de descontaminação RNase antes de começar.

  1. Prepare soluções sem nuclease
    1. Prepare 1x PBS-T diluindo 20x PBS, Triton X-100 e glicina em água sem nuclease até as concentrações finais de 1x PBS, 1% (v/v) Triton X-100 e 1 mM de glicina.
    2. Prepare 5x SSCT diluindo 20x SSC e Tween-20 em água livre de nuclease para preparar 5x SSC contendo 0,1% (v/v) Tween-20.
    3. Dilua 20x PBS em água sem nuclease para preparar 1x PBS.

2. Sondas de projeto

  1. Para projetar sondas comercialmente, selecione a isoforma de interesse para a espécie de interesse e ordene sondas correspondendo ao amplificador desejado usando a interface web do fornecedor.
    NOTA: As químicas comerciais de sondas HCR e sequências iniciadoras são proprietárias e patenteadas pela Molecular Instruments.
    1. Modificar a região alvo na interface web se a detecção específica de transcrito ou pré-mRNA for desejada.
    2. Peça aproximadamente 20 sondas para transcrições altamente expressas. Use até 40 sondas para transcritos de baixa abundância em preparações de Drosophila de montagem inteira.
      NOTA: Solicite oligos especializados para transcritos mais curtos que acomodam menos sítios de ligação de sonda.
  2. Para projetar sondas manualmente, baixe a sequência FASTA para a transcrição alvo. Determine se deve direcionar uma única isoforma ou todas as isoformas do gene.
    NOTA: Priorize éxons constitutivos ou isoformas altamente expressas identificadas em conjuntos de dados de sequenciamento de RNA para melhorar o sinal.
    1. Ao projetar sondas para detecção pré-mRNA, projete sondas que atravessam junções intrônio-éxon. Projete sondas que atravessem junções de emenda para detectar transcritos maduros. Use sondas intrônicas para detectar transcritos nascentes dentro dos núcleos.
      NOTA: Sondas intrônicas podem não colocalizar com transcritos citoplasmáticos maduros e podem exigir marcadores adicionais para identificação celular.
    2. Determine o tamanho do conjunto da sonda. Use no mínimo aproximadamente 5 sondas para transcrições curtas quando conjuntos maiores de sondas não podem ser projetados. Use 20 sondas para aplicações padrão e aproximadamente 40 sondas para sensibilidade ideal em amostras de montageminteira 18,23.
    3. Se estiver projetando suas próprias sondas, use sequências de 25nt separadas por um espaçador de 2bp e adicione sequências de iniciadores divididas na extremidade de 5' de cada oligo.
      NOTA: Embora sequências de iniciadores divididos de primeira geração estejam disponíveis publicamente, as sequências comerciais de iniciadores de próxima geração sãoproprietárias 18.
    4. Se estiver projetando suas próprias sondas, valide as sequências da sonda. Certifique-se de que as sondas dentro de cada conjunto tenham temperaturas de fusão semelhantes. Confirme 100% de identidade entre as sondas.
      NOTA: Evite regiões fortes de G e mantenha um conteúdo de GC semelhante entre assondas 24. Minimize sequências repetitivas e avalie a ligação fora do alvo usando BLAST25.
    5. Use software de projeto de sondas disponível publicamente quandoapropriado 26,27.
      NOTA: Ferramentas de design de código aberto podem não reproduzir o desempenho otimizado dos pipelines comerciais de projeto de sondas.

3. Dissecar, fixar e pré-hibridizar cérebros

  1. Pré-aquecer o buffer de hibridização da sonda a 37 °C.
    ATENÇÃO: O Buffer de Hibridização da Sonda contém formamida. Manuse-se sob uma exaustão química enquanto usa o equipamento de proteção individual adequado.
  2. Dilua cada sonda ajustada a uma concentração final de 1 μM usando água destilada livre de nuclease.
  3. Aliquota aproximadamente 250 μL de PBS livre de nuclease em um prato dissecante.
  4. Transfira uma larva errante do terceiro instar para o PBS usando pinças. Segure o abdômen com um par de pinças e segure os ganchos da boca com um segundo par. Puxe os ganchos da boca para longe do corpo para isolar o cérebro e o cordão nervoso ventral (VNC).
  5. Remova corpos de gordura e glândulas salivares mantendo o VNC. Transfira cérebros dissecados para um tubo contendo 600 μL de PBS sem nuclease gelada.
    NOTA: Mantenha os lobos ópticos submersos durante toda a dissecação para evitar o ressecamento do tecido.
  6. Repetir a dissecação até que aproximadamente seis lobos ópticos sejam coletados. Complete as dissecações em até 20 minutos para minimizar a degradação do tecido.
  7. Adicione 200 μL de 16% de paraformaldeído (PFA) para alcançar uma concentração final de 4% de PFA. Inverta o tubo suavemente para misturar e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
    ATENÇÃO: O PFA é tóxico e mutagenênico. Manuse-se sob uma capela de fumaça química enquanto usa luvas.
  8. Remova o fixador das amostras e deposite como resíduo químico designado. Lave amostras três vezes com 600 μL de PBS frio sem nuclease, usando um recipiente de dissecação para capturar as soluções de lavagem.
    NOTA: Inspecionar soluções de lavagem para perda de tecido e recuperar cérebros deslocados sob um microscópio dissecante.
  9. Transfira cérebros para um tubo de PCR contendo 100 μL de Tampão de Hibridização da Sonda pré-aquecido.
    Misture suavemente com um estalo no tubo e incube por 10 minutos em temperatura ambiente.
    NOTA: Certifique-se de que o cérebro permaneça submerso e não adera às paredes dos tubos.

4. Hibridizar sondas

  1. Prepare uma solução de sonda de 4 nM adicionando 0,4 pmol de cada sonda ajustada ao Buffer de Hibridização da Prova para um volume final de 100 μL.
    NOTA: Aumente a concentração da sonda até 16 nM se a intensidade do sinal for baixa nas colorações iniciais.
  2. Remova o tampão de pré-hibridização sem perturbar o tecido. Adicione solução de sonda diluída a cada amostra.
  3. Incube amostras a 37 °C em um nutator por 16–24 horas.

5. Amplificar o sinal da sonda

  1. Leve o Amplification Buffer para a temperatura ambiente. Prepare aproximadamente 200 μL de Buffer de Amplificação por amostra.
  2. Equilibre o buffer de lavagem. Lave a sonda quente a 37 °C usando banho-maria.
    ATENÇÃO: O Probe Wash Buffer contém formamida. Controle sob uma exaustão química.
  3. Remova a solução da sonda e armazene a -20 °C para reutilização.
    NOTA: Reutilize as soluções da sonda até que a intensidade da coloração diminua.
  4. Lave as amostras quatro vezes por 10 minutos cada em um tampão de lavagem de sonda pré-aquecido a 37 °C. Lave as amostras duas vezes por 5 minutos cada em temperatura ambiente 5x SSCT.
  5. Adicione 100 μL de Amplification Buffer sem hairpins. Incube por 30 minutos em temperatura ambiente.
  6. Aqueça um termociclador a 95 °C. Adicione 2 μL de cada grampo de 3 μM em tubos de PCR separados. Prepare um tubo para cada espécie de hairpin.
    NOTA: Aumente a concentração do amplificador se a coloração produzir pontos esparsos ou uma baixa relação sinal-ruído.
  7. Incube os grampos de cabelo a 95 °C por 90 segundos. Proteja os tubos da luz e incube em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos.
  8. Prepare a solução de amplificação. Combine os hairpins no Amplification Buffer para um volume final de 100 μL por amostra.
  9. Remova o buffer de amplificação dos samples. Adicione um Buffer de Amplificação contendo grampo de cabelo.
    Incube durante a noite em temperatura ambiente em um nutator protegido da luz (envolto em papel alumínio).
  10. Remova a solução de amplificação. Lave as amostras duas vezes por 5 minutos em 150 μL de 5x SSCT. Lave as amostras três vezes por 10 minutos em 150 μL de 5x SSCT em um nutator. Realize duas lavagens rápidas em PBS sem nuclease para remover o detergente.

6. Montar cérebros para imagem

  1. Anexe um adesivo de espaçador de imagem em uma lâmina de vidro. Pressione suavemente com a extremidade inferior de uma pinça para remover as bolhas de ar presas.
  2. Corte o cérebro pelo cordão nervoso ventral usando uma pinça.
  3. Coloque o cérebro no centro do poço espaçador. Oriente o tecido lateralmente com o lobo óptico voltado para cima.
  4. Adicione meio de montagem antidescolorante suficiente (cerca de 25 μL) para preencher o poço sem introduzir bolhas de ar. Distribua o meio de montagem de forma uniforme usando pinças.
  5. Coloque uma capa sobre a amostra e fele com esmalte.

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Resultados

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Para os cientistas que estudam neurobiologia do desenvolvimento, o HCR-FISH oferece um método robusto para visualizar padrões de expressão gênica e determinar as posições espaciais dos neurônios em desenvolvimento dentro do lobo óptico de Drosophila .

No lobo óptico de Drosophila (Figura 2A), neurônios dentro do neuropilo da medula surgem de células-tronco neurais (neuroblastos) derivadas de um neuroepitélio espa...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo descreve uma adaptação do HCR-FISH para uso no lobo óptico larvar de Drosophila melanogaster . Abordagens convencionais de hibridização in situ frequentemente têm desempenho ruim no tecido cerebral larval inteiro devido à penetração limitada da sonda e baixa intensidade de sinal. O protocolo apresentado aqui otimiza várias etapas críticas para melhorar a qualidade da coloração no lobo óptico em desenvolvimento. Condições de fixação comumente usadas para imun...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem a Claude Desplan por fornecer acesso às sondas HCR-FISH da Molecular Instruments e ao dpp-GAL4; Linha de mosca UAS-Stinger. Os autores também agradecem a Aneesh Acharya e Harry Choi, da Molecular Instruments, pelo feedback técnico e discussões sobre a implementação do HCR-FISH. Este protocolo foi adaptado a partir de metodologias HCR-FISH previamente publicadas e não publicadas desenvolvidas por MegYounger 22, Hunter Whitbeck, Bogdan Sieriebriennikov, Amanda Araujo Gomes Ferreira, Yen-Chung Chen e Yanqiqi Zeng. Bogdan Sieriebriennikov foi apoiado pelo Programa de Ciência da Fronteira Humana (LT000010/2020-L). Jennifer Malin foi apoiada pela bolsa R00 do National Institutes of Health EY032269.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10% Tween-20Bio-Rad Laboratories1662404NA
20x PBS, pH7.4Growcells.comMRGF-63962,74M NaCl, 53,7 mM KCl, 20,3 mM Na2HPO4, 29,4 mM KH2PO4 
20x SSCQuality Biological351-003-1313M NaCl, 0,3M Sodium Citrate
37 °C incubatorFisher Scientific (Isotemp)15-015-2633NA
37 °C water bathFisher ScientificFSGPD15DNA
Aluminum foilReynolds Wrap/Fisher Brand15-078-291NA
Antibody: Mouse-anti-AbruptDSHBAbrupt; RRID: AB_528344 Dilution: 1:20
Antibody: Chicken anti-GFPMillipore SigmaCatalog# 06-896; RRID: AB-619712Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-GFPLife Technologies#11122; RRID: AB_221569Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-DllGenscript/Desplan lab-Dilution: 1:200
Antibody: Rat anti-NCadherinDSHBDN-Ex #8, RRID: AB_528121Dilution: 1:50
Antibody: Rabbit anti-SoxNGenscript/Desplan lab-Dilution: 1:200
Antibody: Guinea Pig anti-Traffic jamGift from D. Godt-Dilution: 1:2.000
Antibody: Donkey anti-Rat 405Jackson ImmunoResearchCode # 712-475-150; RRID: AB_2340680Dilution: 1:100
Antibody: Donkey anti-Chicken 488Jackson ImmunoResearchCode #703-545-155; RRID: AB_2340375Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Mouse 488Jackson ImmunoResearchCode #715-545-151; RRID: AB_2341099Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit 488Jackson ImmunoResearchCode #711-545-152; RRID: AB_2313584Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit A555Thermo ScientificCatalog #A-31572; RRID: AB_162543Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat Cy3Jackson ImmunoResearchCode #712-165-153; RRID: AB_2340667Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Guinea Pig 647Jackson ImmunoResearchCode #706-605-148; RRID: AB_2340476Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat 647Jackson ImmunoResearchCode #712-605-153; RRID: AB_2340694Dilution: 1:200
Antifade mountantThermo Fisher ScientificS36940 (SlowFade Gold Antifade Mountant)Other slowfades will work as well, including ones with DAPI (S36936)
Confocal MicroscopeZeissLSM-880NA
Cover slips (22 x 30)VWR16004-332NA
Fly: D. melanogaster: ab-GFP-FLAGBDSC38626; RRID: BDSC_38626NA
Fly: D. melanogaster: Canton SBDSC64349; RRID: BDSC_64349NA
Fly: D. melanogaster: dpp-Gal4BDSC1553; RRID: BDSC_1553NA
Fly: D. melanogaster: ham-GFP.FPTBBDSC83660; RRID: BDSC_83660NA
Fly: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP;BDSC32198; RRID: BDSC_32198NA
Fly: D. melanogaster: UAS-StingerBDSC84277; RRID: BDSC_84277NA
Fly: D. melanogaster:  wit-KO-Gal4BDSC600136; RRID: BDSC_600136NA
ForcepsDumont#5 or #55sNA
Glass slidesVWR16005-106NA
GlycineMillipore SigmaG7126-10MGNA
HCR Amplification bufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR-Gold AmplifiersMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR HiFi ProbesMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR Probe Hybridization BufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitContains formamide
HCR Probe Wash BufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitContains formamide
Nail polish (clear)Electron Microscopy Sciences72180NA
Nuclease-free water (not DEPC-treated)Thermo Fisher ScientificAM9937NA
Nutating mixerCorning/Fisher Scientific10-320-100NA
Paraformaldehyde, 16% (w/v)Electron Microscopy Sciences15710Toxic
PCR Machine/Thermal CyclerBio-Rad1851148 (C1000 Touch Thermal Cycler)NA
PCR pull-apart tube strips with dome cap strips (0.2 mL) USA Scientific#1402-2400NA
Petri dishes (150 x 15 mm; for making dissecting dishes)Fisher ScientificFB0875714NA
RNase ZAPThermoFisher ScientificAM9780NA
Slide spacer stickersSUNJinIS016 (iSpacer stickers (0,2 mm deep))NA
Sylgard elastomer kit (for making dissecting dishes)Fisher ScientificNC9285739NA
Triton X-100Merck Millipore SigmaX100NA

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