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Plataforma de Nanoatuadores Magnéticos para Mecanoestimulação Remota e Controlável de Células de Schwann com Imagem Confocal em Tempo Real

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DOI:

10.3791/71685

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8 de setembro de 2026

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1Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, 2Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, 3International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin Universit, 4Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta uma plataforma de nanoativação magnética compatível com microscopia, integrando nanopartículas superparamagnéticas fluorescentes, um eletroímã calibrado e imagem confocal em tempo real para estimular remotamente e de forma controlada as células de Schwann e monitorar dinamicamente suas respostas mecanossensoriais.

Resumo

As forças mecânicas regulam criticamente o comportamento celular, mas muitos métodos existentes de estimulação mecânica dependem de contato físico direto ou ambientes extracelulares artificialmente projetados, limitando assim sua flexibilidade em estudos dinâmicos com células vivas. Aqui, apresentamos uma plataforma de nanoacionamento magnético para mecanostimulação remota, sem contato e controlável de células de Schwann in vitro. Esta configuração integrada permite estimulação magnética remota e imagem sincronizada de células vivas na mesma sessão experimental. Este manuscrito descreve a preparação de nanopartículas superparamagnéticas fluorescentes (SPIONs), opcionalmente SPIONs funcionalizadas direcionadas à actina (f-SPIONs), a construção e calibração de um dispositivo eletromagnético compatível com microscópio, a estimativa de forças magnéticas nos níveis de partícula única e célula única, e a integração do acionamento magnético com imagem confocal em tempo real. Células de Schwann são células gliais altamente mecanossensíveis que desempenham papéis essenciais no desenvolvimento, manutenção e reparo dos nervos periféricos. O monitoramento em tempo real de suas respostas à estimulação mecânica é crucial para compreender como as forças mecânicas influenciam a organização do citoesqueleto e o comportamento celular. Esta plataforma fornece um fluxo de trabalho reprodutível para o estudo da mecanobiologia de células de Schwann e pode ser adaptada a outros tipos celulares mecanicamente responsivos e sistemas multicelulares.

Introdução

Estímulos mecânicos regulam uma ampla gama de processos celulares, incluindo adesão, migração, proliferação, diferenciação e plasticidade fenotípica1,2,3. Estudos em mecanobiologia demonstraram que tanto neurônios quanto células gliais exibem acentuada mecanossensibilidade e resposta ao longo do desenvolvimento4,5,6,7. Para investigar como as células detectam e respondem à força, diversas abordagens experimentais foram desenvolvidas, incluindo microscopia de força atômica (AFM), aspiração por micropipeta, pinças ópticas, sistemas de cultura baseados em estiramento e plataformas microfluídicas8,9,10,11,12. Essas técnicas avançaram significativamente o estudo da mecanotransdução. No entanto, muitas delas exigem contato físico direto com as células ou dependem de ambientes mecânicos artificiais pré-definidos, tornando-as menos adequadas para estímulos remotos, dinamicamente controláveis e compatíveis com imagem.

A entrega de forças mediada por nanopartículas magnéticas oferece uma estratégia alternativa para mecanosestímulo remoto13,14,15,16,17,18. Como a maioria dos tecidos biológicos apresenta baixa suscetibilidade magnética, campos magnéticos aplicados externamente podem penetrar amostras biológicas sem contato direto e atuar seletivamente sobre partículas magneticamente responsivas introduzidas em células ou tecidos. Na presença de um gradiente de campo magnético, essas partículas sofrem forças direcionais que podem ser utilizadas para impor perturbações mecânicas nos níveis subcelular, celular ou tecidual8,9. Essa abordagem é atrativa porque é sem contato, ajustável, compatível com imagem em tempo real e potencialmente extensível a sistemas biológicos mais complexos.

As células de Schwann são células gliais altamente mecanossensíveis19,20 que desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento, manutenção e reparo dos nervos periféricos21,22. A observação dinâmica das respostas das células de Schwann à estimulação física é importante para compreender como a força regula a organização do citoesqueleto e o comportamento celular. No entanto, muitos sistemas convencionais de aplicação de força não são facilmente compatíveis com microscopia de alta resolução em tempo real. Para superar essa limitação, desenvolvemos uma plataforma de nanoativação magnética que combina partículas magnéticas superparamagnéticas fluorescentes direcionadas ao citoesqueleto de actina (f-SPIONs), um dispositivo eletromagnético personalizado compatível com a platina de um microscópio confocal e uma estrutura quantitativa para estimativa de força. Esse sistema integrado permite a estimulação magnética remota e a imagem sincronizada de células vivas na mesma sessão experimental.

O fluxo de trabalho descrito aqui inclui a preparação de superpartículas magnéticas fluorescentes (SPIONs), funcionalização opcional direcionada à actina com base em faloidina para gerar f-SPIONs, caracterização de nanopartículas, construção do dispositivo eletromagnético e calibração do campo, estimativa da força magnética e estimulação magnética combinada com imagem confocal em tempo real. Embora otimizado aqui para células de Schwann, a plataforma pode fornecer um arcabouço prático para estudos relacionados em outros sistemas vivos mecanicamente responsivos.

Protocolo

Os experimentos descritos neste protocolo utilizaram uma linhagem estabelecida de células de Schwann de rato (RSC96) e não envolveram participantes humanos nem animais vivos. Este estudo foi conduzido como parte de um projeto de pesquisa mais amplo que envolvia experimentos com animais, o qual foi aprovado pelo Comitê de Bem-Estar e Ética Animal do Primeiro Hospital da Universidade Jilin (Número de Aprovação: 2022-0045).

1. Preparação de superpartículas magnéticas fluorescentes

  1. Sintetize nanopartículas de Fe₃O₄ revestidas com ácido oleico.
    ​OBSERVAÇÃO: As nanopartículas de Fe₃O₄ revestidas com ácido oleico foram sintetizadas por decomposição térmica conforme descrito anteriormente20,23.
    1. Adicione 2 mmol de Fe(acac)₃, 6 mmol de ácido oleico, 6 mmol de oleylaminas e 5 mmol de 1,2-hexadecanodiol a 20 mL de éter benzílico em um frasco de reação.
    2. Agite a mistura sob atmosfera de nitrogênio por 15 min até obter uma solução precursora homogênea.
    3. Aqueça a mistura até 200 °C a uma taxa de 20 °C/min.
    4. Mantenha a reação a 200 °C por 30 min.
    5. Aumente a temperatura até 265 °C e mantenha a mistura em refluxo por 30 min.
    6. Deixe a mistura de reação esfriar naturalmente até a temperatura ambiente.
    7. Recupere as nanopartículas de Fe₃O₄ por separação magnética.
    8. Lave as nanopartículas três vezes com etanol.
    9. Redispersa as nanopartículas purificadas em tolueno.
  2. Monte superpartículas de Fe₃O₄·Cy3.5.
    ​OBSERVAÇÃO: As superpartículas de Fe₃O₄·Cy3.5 foram preparadas conforme descrito anteriormente20,24,25.
    1. Disperse 28 mg de nanopartículas de Fe₃O₄ revestidas com ácido oleico em 4 mL de tolueno em um balão de fundo redondo com três bocas de 50 mL.
    2. Prepare uma fase aquosa contendo 12,5 mg de dodecilsulfato de sódio e 3 mg de Cianina 3,5 (Cy 3,5) em 12,5 mL de água.
    3. Combine a suspensão de nanopartículas de Fe₃O₄ em tolueno (28 mg em 4 mL; 7 mg/mL) com a solução aquosa de surfactante/ corante para formar uma microemulsão óleo-em-água.
    4. Misture completamente até obter uma emulsão estável.
    5. Aqueça o balão de fundo redondo com três bocas até 60 °C e agite continuamente a 300 rpm por 6 h.
      OBSERVAÇÃO: Não é necessário procedimento de evaporação sob pressão reduzida ou com evaporador rotativo.
    6. Evapore o tolueno sob as condições descritas acima para induzir a agregação das nanopartículas de Fe₃O₄. Usando uma pipeta de transferência descartável, transfira uma pequena alíquota da solução para um tubo de ensaio e deixe repousar. A ausência de separação de fases indica que o tolueno foi completamente removido.
    7. Transfira a suspensão de superpartículas de Fe₃O₄·Cy3.5 para tubos cónicos de 15 mL. Centrifugue a 2.370 × g por 5 min à temperatura ambiente para recolher as superpartículas e descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet.
    8. Redispersa o pellet em água desionizada ultrapura e centrifugue novamente a 2.370 × g por 5 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e repita o procedimento de lavagem três vezes para remover o corante Cy3.5 livre residual e o dodecilsulfato de sódio.
  3. Revestir as superpartículas com polidopamina (PDA).
    ​OBSERVAÇÃO: As superpartículas revestidas com polidopamina foram preparadas conforme descrito anteriormente20,26.
    1. Centrifugue a suspensão de superpartículas de Fe₃O₄·Cy3.5 a 2.370 × g por 5 min à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
    2. Redispersa o pellet em tampão Tris 10 mM (pH 8,5).
    3. Adicione 26 mg de monômero de dopamina à suspensão.
    4. Agite a mistura à temperatura ambiente por 3 h sob condições alcalinas.
    5. Centrifugue a suspensão a 2.370 × g por 5 min à temperatura ambiente.
    6. Remova o sobrenadante e redispersa o pellet em água ultrapura para obter partículas de Fe₃O₄·Cy3.5@PDA (SPIONs).
  4. Funcionalize opcionalmente as partículas com faloídim-Alexa Fluor 350.
    ​OBSERVAÇÃO: As superpartículas foram funcionalizadas na superfície utilizando faloídim-Alexa Fluor 350 disponível comercialmente20.
    1. Prepare 5 mL de solução aquosa contendo 100 unidades de faloídim-Alexa Fluor 350.
    2. Adicione 200 µL da suspensão de Fe₃O₄·Cy3.5@PDA contendo 2 mg de partículas à solução.
    3. Agite suavemente a mistura à temperatura ambiente por 24 h.
    4. Centrifugue a mistura a 2.370 × g por 5 min à temperatura ambiente.
    5. Descarte o sobrenadante e redispersa o pellet em água desionizada.
    6. Armazene a formulação final de Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@faloídim (f-SPIONs) protegida da luz até o uso.

2. Caracterização das nanopartículas

  1. Determine a morfologia e o tamanho.
    1. Prepare amostras de nanopartículas para microscopia eletrônica de transmissão (TEM) ou microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM) de acordo com os requisitos do instrumento.
    2. Adquira imagens para determinar a morfologia geral das partículas, a estrutura núcleo-casca e o diâmetro médio (Figura 1).
    3. Prepare suspensões aquosas de nanopartículas para espalhamento dinâmico de luz (DLS).
    4. Meça o diâmetro hidrodinâmico e o índice de polidispersão (PDI).
    5. Compare os resultados da microscopia eletrônica com os do DLS para avaliar a uniformidade da formulação e o comportamento coloidal.
  2. Determine as propriedades magnéticas.
    1. Prepare amostras de nanopartículas secas ou concentradas adequadas para análise por dispositivo de interferência quântica supercondutor (SQUID).
    2. Registre curvas de histerese magnética a 300 K.
    3. Determine a magnetização de saturação, a remanência e a coercividade.
    4. Confirme que as partículas exibem comportamento superparamagnético com remanência e coercividade desprezíveis.
  3. Determine as propriedades de fluorescência.
    1. Prepare uma suspensão de f-SPION em água desionizada ultrapura e transfira a suspensão para uma cubeta de quartzo.
    2. Registre espectros de fotoluminescência usando um espectrofotômetro de fluorescência.
    3. Confirme que o sinal fluorescente permanece detectável após lavagem e ressuspendimento.
  4. Valide a localização associada à actina ao usar a formulação direcionada.
    1. Obtenha células RSC96.
      ​OBSERVAÇÃO: As células RSC96 utilizadas neste estudo, uma linhagem de células de Schwann de rato transformada espontaneamente obtida por meio de cultura prolongada de células de Schwann primárias de rato, foram adquiridas do Banco de Células da Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China (CSTR: 19375.09.3101RATGNR6) e testadas negativas para contaminação por micoplasma e fungos. Foram utilizadas células entre as passagens 3–10.
    2. Cultive as células em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de solução de penicilina–estreptomicina (100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina).
    3. Semente as células RSC96 numa densidade de 1 × 105 células por placa de microscopia de cultura celular de 35 mm e cultive-as por 24 h a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂ para permitir a adesão celular.
    4. Aspire o meio de cultura existente, lave as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adicione meio de cultura completo contendo 15 µg/mL de f-SPIONs. Incube as células com os f-SPIONs por 12 h.
    5. Aspire o meio de cultura e lave as células duas vezes com PBS gelado contendo 1 mM de deferoxamina para remover completamente as partículas não internalizadas.
    6. Adquira imagens confocais para avaliar a distribuição intracelular das partículas. Defina os parâmetros de imagem com um pinhole de 1 unidade Airy (AU) e um passo z de 0,43 µm para obter seções ópticas de alta resolução das estruturas intracelulares.
    7. Verifique se as partículas apresentam enriquecimento em regiões celulares associadas à actina.

3. Construção e calibração do dispositivo de estimulação eletromagnética (Figura 2)

  1. Monte o dispositivo eletromagnético.
    1. Construa um sistema compacto de bobinas eletromagnéticas dimensionado para se ajustar à platina do microscópio confocal e à câmara para células vivas (Figura 2A,B).
    2. Conecte a bobina a uma fonte de alimentação controlável ou a uma fonte de corrente externa.
    3. Simular numericamente o ambiente de campo magnético gradiente utilizando o COMSOL Multiphysics 4.3b (Figura 2C,D).
    4. Confirme que o eletroímã gera o campo magnético gradiente (CMG) correspondente sob diferentes correntes de entradaFigura 2G).
  2. Meça a densidade de fluxo magnético e calibre o campo magnético gradiente.
    1. Posicione o eletroímã ao lado da placa de cultura, com a ponta do polo voltada para o centro da placa e localizada a 1 mm da parede externa da placa (Figura 2E,F).
    2. Mantenha essa configuração geométrica relativa entre o eletroímã e a placa de cultura durante todos os experimentos subsequentes de estimulação magnética em tempo real e de imageamento celular.
    3. Utilize um gaussímetro digital para medir a densidade de fluxo magnético em posições predeterminadas dentro da região de estimulação, usando a grade de posicionamento na parte inferior da placa de cultura como referência espacial.
    4. Calcule o gradiente do campo local a partir da variação espacial da densidade de fluxo magnético.
    5. Calibre e valide o gradiente de campo magnético simulado numericamente utilizando os valores de gradiente de campo magnético medidos e calculados experimentalmente.

4. Estimativa das forças magnéticas fornecidas pela plataforma.

  1. Defina o modelo de estimativa de força.
    1. Utilize a equação de força para nanopartículas magnéticas em um campo magnético não uniforme27,28:
      Equação de equilíbrio estático, F=(m·∇)B, sobre interação de campo magnético, para uso educacional.
    2. Sob a suposição de alinhamento superparamagnético com o campo aplicado, simplifique a equação para
      Equação de força magnética \(F_{\text{f-SPION}}=m\frac{dB}{dr}\); fórmula para estudo de campo magnético.
      em que:
      F é a força nanomagnética
      m é o momento de dipolo magnético
      Equação Nabla B, símbolo de cálculo vetorial, ilustrando fluxo magnético em diagrama de física. é o gradiente do campo magnético
      dB/dr é o gradiente do campo magnético (T/m) gerado pelo dispositivo correspondente de geração de campo magnético.
    3. Utilize o gradiente de campo medido a partir do dispositivo calibrado em todos os cálculos.
  2. Estime a força atuando sobre uma única nanopartícula.
    1. Determine as dimensões médias das partículas a partir de imagens de MEAT de alta resolução.
    2. Calcule o volume do núcleo magnético assumindo geometria esférica.
    3. Estime o volume magnético específico do Fe₃O₄ com base na fração magnética do núcleo.
    4. Calcule o momento de dipolo magnético de acordo com Fórmula de cálculo de massa química \(m=\rho \cdot V \cdot M_m\), equação para estequiometria.
      em que:
      Mm representa a magnetização mássica dos f-SPIONs (16 A·m2/kg) sob a intensidade do campo fornecida;
      ρ é a densidade do Fe₃O₄ (5,24 g/cm3).
      V é o volume do núcleo magnético de Fe₃O₄ em cada f-SPION (5,89 × 10⁻17 cm3).
    5. Multiplique o momento de dipolo pelo gradiente de campo medido para estimar a força atuando sobre uma única nanopartícula (Equação de força de equilíbrio estático Ff-SPION; símbolo; uso educacional.).
  3. Estime a captação de nanopartículas por célula de Schwann.
    1. Semente células de Schwann RSC96 a 5 × 105 células por poço em placas de microscopia de cultura celular de 35 mm.
    2. Incube as células por 24 h sob condições padrão de cultura.
    3. Substitua o meio por meio fresco contendo 15 µg/mL de f-SPIONs.
    4. Incube as células por mais 12 h.
    5. Lave as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato gelada contendo 1 mM de deferoxamina.
    6. Colete e conte as células.
    7. Meça o conteúdo intracelular de ferro utilizando espectroscopia de emissão atômica com plasma acoplado indutivamente (ICP-AES).
    8. Calcule o número de partículas internalizadas por célula dividindo a massa média de ferro por célula pela massa de ferro por partícula Equação para captação celular de SPIONs (n_cell^f-SPIONs) em pesquisa de imagem médica..
  4. Estime a força entregue a uma única célula de Schwann.
    1. Calcule a força no nível celular de acordo com
      Equação de equilíbrio estático, F_cell=n^f-SPIONs_cell·F_f-SPION, fórmula; análise de equilíbrio de força.
      em que:
      Equação de força de equilíbrio estático Ff-SPION; símbolo; uso educacional. é a força magnética exercida sobre um único f-SPION.
      Equação de concentração de SPION, \( n^\text{f-SPIONs}_\text{cell} \), notação científica, diagrama. é o número de f-SPIONs internalizados por célula.
      Fcell é a força magnética exercida sobre uma única célula.
    2. Relate o valor resultante como a força magnética estimada entregue a uma única célula de Schwann (Fcell).
    3. Declare claramente que o valor é uma estimativa baseada em modelo e não uma medição direta da força intracelular.

5. Combinando estimulação magnética com imagem em tempo real por microscopia confocal a laser (CLSM)

  1. Carregar células de Schwann com nanopartículas magnéticas.
    1. Plaque células de Schwann em placas de cultura ibidi compatíveis com imagem ou câmaras de cultura microfluídicas.
    2. Permita que as células adiram e se recuperem.
    3. Substitua o meio existente por meio de cultura fresco contendo 15 µg/mL de f-SPIONs.
    4. Incube as células por 12 h para permitir o carregamento com f-SPIONs.
    5. Verifique a morfologia celular antes de prosseguir.
  2. Remover partículas não internalizadas.
    1. Remova o meio contendo nanopartículas.
    2. Lave as células duas vezes com PBS contendo 1 mM de deferoxamina.
    3. Substitua a solução de lavagem por meio para células vivas compatível com imagem.
    4. Confirme um baixo fundo de partículas extracelulares antes da aquisição de imagens.
  3. Integrar o dispositivo eletromagnético ao sistema de imagem por CLSM.
    1. Monte o eletromagneto com a câmara de cultura para células vivas, posicionando o eletromagneto em sua localização pré-calibrada.
    2. Coloque a câmara de cultura para células vivas montada sobre a platina do microscópio confocal (Figura 3). Confirme que a placa de cultura está localizada dentro da região efetiva de estimulação (Figura 3A).
    3. Ative o eletromagneto de acordo com os parâmetros predefinidos e confirme a exposição a um campo magnético gradiente efetivo na área da placa de cultura (Figura 3B).
    4. Confirme que a lente objetiva pode alcançar o plano focal sem interferência.
    5. Confirme que o dispositivo não obstrui o posicionamento do objetivo ou o movimento da platina.
    6. Considerando o calor gerado durante a operação do eletromagneto, ajuste as configurações de temperatura dos componentes da câmara para células vivas de acordo com as condições ótimas de cultura previamente determinadas, garantindo um ambiente interno de 37 °C e 5% CO₂ (Figura 3C).
    7. Confirme que todo o sistema opera normal e estavelmente.
  4. Imageamento funcional de Ca2⁺ em células vivas.
    1. Incube as células com solução de Krebs–Ringer (pH 7,4) contendo 3 µM de Fluo-4 AM e 0,1% de Pluronic F-127 a 37 °C por 30 min.
    2. Após a incubação, lave os cultivos duas vezes com PBS e transfira-os para a plataforma de imageamento de células vivas do sistema CLSM para aquisição de imagens (Figura 4A).
    3. Utilizando a grade de posicionamento no fundo da placa de cultura ibidi, capture imagens de cinco locais pré-definidos.
    4. Divida igualmente cada campo de imagem em 25 regiões e selecione 0–3 células de cada região para quantificação da fluorescência, dependendo da densidade celular real naquela região.
    5. Defina o contorno completo de uma célula individual como região de interesse (ROI) e monitore a resposta de cálcio induzida magneticamente analisando as variações na intensidade de fluorescência (ΔF) dentro da ROI.
    6. Calcule a variação na intensidade de fluorescência como ΔF = (Fstim - F0). Considere um aumento na intensidade de fluorescência antes e após a estimulação (ΔF/F0) superior a 10% como um evento de resposta de cálcio.
      ​OBSERVAÇÃO: Funstim representa a intensidade de fluorescência antes da estimulação por força magnética, F0 representa a intensidade de fluorescência basal e Fstim representa a intensidade de fluorescência evocada após a estimulação por força magnética.
    7. Para correção de fundo, subtraia a intensidade média de fluorescência de fundo medida em uma região sem células do valor de intensidade de fluorescência de cada ROI.
    8. Realize três experimentos independentes, incluindo uma placa de cultura em cada experimento.
  5. Realize imageamento com lapso de tempo e aplique estimulação magnética durante a aquisição.
    1. Defina os parâmetros de imageamento com lapso de tempo da seguinte forma: intervalo de aquisição de 2,1 s por quadro, duração total de aquisição de 650 s e imageamento óptico de seção com resolução padrão alta usando 1 AU.
    2. Durante o imageamento celular, adquira imagens continuamente por 50 s sem entrada de corrente para registrar a intensidade de fluorescência intracelular de cálcio na ausência de estimulação por força magnética (Funstim) (Figura 2H e Figura 4B).
    3. Normalize a intensidade de fluorescência registrada durante os primeiros 50 s e defina-a como intensidade de fluorescência basal (F0).
    4. Posteriormente, aplique uma corrente constante de 3,0 A ao eletromagneto, expondo as células de Schwann carregadas com nanopartículas magnéticas a um campo magnético gradiente de 3,25 T/m e, assim, submetendo-as à estimulação por força magnética. Continue o imageamento com lapso de tempo por 10 min para registrar a intensidade de fluorescência intracelular de cálcio durante a estimulação por força magnética (Fstim) (Figura 2H e Figura 4C).
    5. Calcule quantitativamente a variação na intensidade de fluorescência como ΔF/F0 (Figura 4D,E).
  6. Realize análise estatística e analise os dados de fluorescência de Ca2⁺.
    1. Para cada célula, calcule o valor mediano de ΔF/F₀ ao longo da série temporal analisada e utilize esse valor como métrica da resposta de Ca2⁺ ao nível celular.
    2. Realize três experimentos independentes para cada condição experimental, com uma placa de cultura por condição em cada experimento. Agrupe as células analisadas nos três experimentos independentes para apresentação descritiva e informe n como o número total de células analisadas em cada grupo.
    3. Avalie a normalidade dos dados de ΔF/F₀ ao nível celular utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov.
    4. Como os dados de resposta de fluorescência de Ca2⁺ não apresentam distribuição normal, apresente os dados como mediana e intervalo interquartil (IQR).
    5. Analise as diferenças entre os grupos utilizando o teste não paramétrico de Friedman, seguido por testes de Wilcoxon de postos com sinal para comparações pareadas, conforme relatado anteriormente.
    6. Considere P < 0,05 como indicativo de significância estatística.

Resultados

A microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM) mostrou que a formulação final de nanopartículas possuía um núcleo magnético agregado e uma camada externa após a modificação da superfície (Figura 1). Os f-SPIONs finais tinham um diâmetro médio total de 63,36 ± 16,65 nm, com um núcleo magnético rico em Fe₃O₄ de aproximadamente 56,60 ± 6,19 nm e uma camada externa composta por polidopamina e faloidina-Alexa Fluor 350 com espessura média de aproximadamente 5,79 ± 1,36 nm. Esses resultados confirmaram a construção bem-sucedida de uma arquitetura de superpartícula adequada para atuação magnética e visualização baseada em fluorescência.

A análise de histerese magnética mostrou que as partículas exibiram comportamento superparamagnético acentuado, com remanescência e coercividade desprezíveis. Sob um campo magnético aplicado de 10.000 Oe (1,0 T), sua magnetização de saturação atingiu aproximadamente 35 A·m2/kg (Figura 5). Na ausência de um gradiente de campo magnético, os f-SPIONs exibiram boa dispersibilidade em meio aquoso (Figura 6A). Ao serem expostos a um campo magnético com gradiente, os f-SPIONs demonstraram resposta magnética sensível (Figura 6B). A análise de fluorescência confirmou ainda que as partículas mantiveram a detectabilidade óptica após a síntese e modificação da superfície (Figura 7).

O dispositivo de estimulação eletromagnética foi integrado com sucesso ao sistema de imagem em tempo real de células vivas (Figura 3). A calibração do campo magnético mostrou que o dispositivo gerou um campo magnético com gradiente estável ao longo da região de cultura celular (Figura 2E, F), com um campo magnético gradiente in vitro de aproximadamente 3,25 T/m sob a configuração experimental atual (Figura 2G).

A imagem confocal demonstrou uma carga eficiente das nanopartículas magnéticas fluorescentes nas células de Schwann (Figura 7). Após a lavagem, o sinal de fluorescência permaneceu principalmente associado às células, em vez de partículas livres no meio. Para a formulação direcionada à actina, a imagem confocal mostrou ainda um enriquecimento das partículas em regiões celulares associadas à actina.

A imagem confocal com lapso de tempo demonstrou que a estimulação magnética e a imagem de células vivas podem ser realizadas dentro do mesmo fluxo experimental, mantendo um acesso óptico estável às células durante todo o período de estimulação. (Figura 2H e Figura 4A).

Um resumo quantitativo vinculou ainda mais o design da nanopartícula, a calibração do dispositivo e a carga celular. Sob o campo magnético gradiente in vitro de 3,25 T/m, estimou-se que a força magnética atuando sobre um único f-SPION fosse aproximadamente 1,59 × 10-5 pN. Com base na quantificação intracelular de ferro, cada célula de Schwann RSC96 internalizou aproximadamente 9,30 ± 2,88 × 103 partículas, correspondendo a uma força magnética total estimada de aproximadamente 0,15 ± 0,05 pN por célula.

Em comparação com a fluorescência basal, sob a estimulação magnética mediada por f-SPIONs, as células RSC96 exibiram dinâmica ativa de Ca2+ e sinais de fluorescência de Ca2+ significativamente aumentados (Figura 4D). A análise quantitativa dos sinais de fluorescência de Ca2+ revelou que a alteração na intensidade da fluorescência de Ca2+ (ΔF/F0) nas células RSC96 no grupo de estimulação magnética (62,96 [35,07–91,67]) foi significativamente maior do que no grupo controle normal (-5,74 [-15,66–1,20]), no grupo controle com f-SPIONs (-16,70 [-22,02–-12,00]) e no grupo controle com campo magnético em gradiente (-12,90 [-21,24–-6,97]) (Figura 4E).

Estrutura de nanopartículas em imagens de microscopia eletrônica; análise por microscopia eletrônica mostrando detalhes de nanopartículas agrupadas.
Figura 1: Morfologia e estrutura núcleo-casca de f-SPIONs por MEHR. (A) Os f-SPIONs são esféricos e exibem uma estrutura típica de núcleo-casca, com um núcleo magnético interno composto por nanopartículas de Fe₃O₄ e Cy3.5. (B) A camada externa é composta por PDA e faloidina-Alexa Fluor 350. As imagens no painel B mostram vistas ampliadas representativas das regiões destacadas com caixa vermelha no painel A, sendo as linhas brancas e setas indicativas da espessura medida da camada. A barra de escala no painel B representa 10 nm. Três medições independentes foram realizadas, com um total de 680 nanopartículas analisadas. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Diagrama do dispositivo eletromagnético com fio de cobre e núcleo de ferro; simulações de campo magnético; gráfico do campo.
Figura 2: Construção, calibração e operação do eletroímã personalizado para estimulação magnética em células vivas. (A,B) A bobina do eletroímã foi enrolada ao redor de um núcleo de ferro utilizando fio de cobre esmaltado de 1,1 mm, com um total de 410 voltas. A bobina tinha um diâmetro externo de 60 mm, um diâmetro interno de 20 mm, um comprimento de 110 mm e uma resistência em corrente contínua de aproximadamente 1,2 Ω. A ponta do polo media 13,0 mm × 12,0 mm × 3,0 mm (comprimento × largura × altura) e foi fabricada em permalloy 1J50. (C,D) A corrente de entrada máxima do eletroímã não excedeu 3 A. Com uma corrente de entrada de 3 A, um gradiente de campo magnético de aproximadamente 6,7 T/m foi gerado próximo à ponta do polo. (E,F) Distribuição do gradiente de campo magnético dentro da placa de cultura próximo à ponta do polo com uma corrente de entrada de 3 A. Um gradiente médio de campo magnético estático de aproximadamente 3,25 T/m foi gerado na região de imagem celular. (G) Gradientes de campo magnético gerados pelo eletroímã em diferentes correntes de entrada: 1 A, 2 A e 3 A. (H) Protocolo para aquisição de imagens com lapso de tempo em células vivas, aplicação de corrente e exposição ao gradiente de campo magnético neste estudo. Imagens com lapso de tempo foram adquiridas continuamente durante 50 s sem entrada de corrente. Em seguida, uma corrente contínua constante de 3,0 A foi aplicada, e a aquisição de imagens com lapso de tempo continuou por 10 min. DC: Corrente contínua. GMF: Gradiente de campo magnético. Os painéis E, F e G foram adaptados com permissão de Liu et al.20. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Câmara de cultura de células vivas com imagem por CLSM, eletroímã, aquecedores e configuração de corrente contínua.
Figura 3: Integração do eletroímã na câmara de cultura de células vivas. (A) Um eletroímã compacto personalizado posicionado em local calibrado dentro da câmara de cultura de células vivas para exposição da área da placa de cultura celular a um campo magnético gradiente. (B) Configuração integrada do sistema de imagem por CLSM, da plataforma de nanoacionamento magnético e da fonte externa de corrente contínua. (C) A otimização das configurações de temperatura para os componentes individuais da câmara de cultura celular garante uma temperatura estável dentro da placa de cultura durante a operação do eletroímã. (D) Parâmetros de configuração de temperatura para os componentes individuais da câmara de cultura celular. CLSM: microscopia confocal a laser de varredura. PV: Valor Medido. SV: Valor Definido. Top Heater: Temperatura do aquecedor da tampa superior. Stage heater: Temperatura de aquecimento da platina do microscópio e da base da câmara de cultura. Bath heater: Temperatura do banho de água. Lens heater: Temperatura do aquecedor da objetiva. Temp sensor: Temperatura real medida pelo sensor de temperatura. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Diagrama de nanoativação magnética; f-SPIONs, íons de cálcio, microscopia DIC, resultados de fluorescência.
Figura 4: Imagens representativas das respostas de cálcio em células de Schwann sob estimulação por força magnética. (A) Fluxo de trabalho integrado para estimulação magnética e imagem de Ca2+ em tempo real em células vivas na plataforma de nanoativação magnética. (B) Imagem de fluorescência de Ca2+ no estado basal adquirida antes da estimulação magnética (Funstim). (C) Imagem de fluorescência de Ca2+ adquirida após a estimulação magnética (Fstim), mostrando a alteração na intensidade de fluorescência (ΔF). (D) Traços do sinal de Ca2+ resolvidos no tempo monitorados antes e após a estimulação magnética. (E) Análise quantitativa e comparação das alterações na fluorescência de Ca2+ (ΔF/F₀) entre os diferentes grupos experimentais. DIC: Contraste de Interferência Diferencial. Funstim: intensidade de fluorescência antes da estimulação por força magnética. F0: intensidade de fluorescência basal. Fstim: intensidade de fluorescência induzida após a estimulação por força magnética. ΔF: alteração na intensidade de fluorescência. “Normal” representa o grupo controle normal, “f-SPIONs+GMF” representa o grupo de nanoativação magnética, “f-SPIONs” representa o grupo controle de f-SPIONs e “GMF” representa o grupo controle de campo magnético gradiente. Três experimentos independentes foram realizados, com uma placa de cultura por condição experimental em cada experimento. Para cada célula, o valor mediano de ΔF/F₀ ao longo da série temporal analisada foi utilizado como métrica de resposta em nível celular. Os dados são apresentados como mediana e intervalo interquartil (IQR), e n indica o número total de células analisadas nos três experimentos independentes. A análise estatística foi realizada utilizando o teste de Friedman seguido pelo teste de Wilcoxon de postos com sinal, conforme relatado anteriormente por Liu et al. Os dados quantitativos no painel E foram adaptados com permissão de Liu et al.20. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráficos de magnetização versus campo, curva de histerese a 300 K, análise de propriedades magnéticas, gráfico.
Figura 5: Propriedades superparamagnéticas de f-SPIONs. (A) Curva de histerese magnética de f-SPIONs, mostrando comportamento superparamagnético típico. (B) Visualização ampliada da curva de histerese próxima ao campo magnético zero. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Experimento de campo magnético: bobina com frasco. Efeito da ativação/desativação do GMF na dispersão (PDI: 0,16).
Figura 6: Dispersibilidade aquosa e resposta a campo magnético gradiente de f-SPIONs. (ANa ausência de um campo magnético gradiente, os f-SPIONs permanecem bem dispersos no meio aquoso.B) Quando o campo magnético gradiente é aplicado, os f-SPIONs migram e se acumulam rapidamente ao longo da direção do gradiente do campo. GMF: Campo magnético gradiente. PDI: Índice de politropicidade. A seta indica a direção do campo magnético gradiente. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Imagem celular com nanopartículas de Fe3O4; microscopia de fluorescência mostrando fusão de DIC, Cy3.5 e faloídimina.
Figura 7: Imagens de fluorescência por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) da internalização de f-SPIONs em células de Schwann. (A) Imagens CLSM de células de Schwann após coincubação com f-SPIONs (15 µg/mL) por 12 h e subsequente lavagem (pinhole = 1 AU; z-step = 0,43 µm), mostrando morfologia celular preservada e fundo mínimo de partículas extracelulares. (B) Fluorescência vermelha detectada no canal Cy3.5 (Ex/Em: 561–568/607 nm), indicando a presença de f-SPIONs marcados com Cy3.5 dentro das células de Schwann. (C) Fluorescência azul detectada no canal Alexa Fluor 350 (Ex/Em: 350–360 nm/440–460 nm), confirmando a incorporação bem-sucedida do módulo de funcionalização com faloídimina-Alexa Fluor 350. (D) Imagem fundida mostrando sobreposição espacial substancial entre os sinais de fluorescência vermelha e azul, compatível com a construção bem-sucedida das superpartículas magnéticas-fluorescentes. DIC: Contraste de interferência diferencial. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Discussão

As nanopartículas de óxido de ferro são amplamente reconhecidas como nanomateriais magnéticos com biocompatibilidade favorável. Como agentes de contraste amplamente utilizados em imagens por ressonância magnética, as nanopartículas superparamagnéticas de Fe₃O₄ têm sido extensivamente aplicadas no diagnóstico clínico por imagem29,30. Em um estudo recente do nosso grupo20, demonstrou-se que as f-SPIONs exibem citotoxicidade extremamente baixa e excelente biossegurança. A plataforma de atuação nanomagnética, construída utilizando f-SPIONs como atuadores mecânicos em combinação com um eletroímã controlável, ativou efetivamente a dinâmica do citoesqueleto em células de Schwann, induziu a abertura do canal iônico mecanossensível Piezo1, desencadeou a entrada transmembranar de Ca2⁺ e subsequentemente promoveu a "reprogramação" da expressão gênica e alterações fenotípicas nas células20.

Várias etapas são particularmente importantes para a implementação bem-sucedida desta plataforma. A primeira etapa crítica é a preparação das nanopartículas. As partículas devem permanecer bem dispersas, magneticamente responsivas e opticamente detectáveis após a síntese e modificação da superfície. A agregação em qualquer estágio pode reduzir a consistência da captação celular, alterar as propriedades magnéticas efetivas e comprometer a qualidade da imagem em células vivas.

O segundo passo crítico é o procedimento de carregamento celular e lavagem. A concentração de nanopartículas e o tempo de incubação devem ser suficientes para produzir um carregamento intracelular detectável, sem causar acúmulo extracelular excessivo ou comprometer a morfologia celular. A remoção completa das partículas não internalizadas e associadas à membrana é essencial, especialmente quando a imagem de fluorescência é usada para avaliar a localização intracelular. Uma lavagem inadequada pode levar à interpretação equivocada dos padrões de localização e também pode distorcer as estimativas de força em nível celular.

O terceiro passo crítico é o alinhamento geométrico do dispositivo de estimulação magnética em relação à amostra. Como a força magnética depende diretamente do gradiente local do campo, a posição relativa entre a bobina eletromagnética e o plano da amostra deve permanecer consistente com a configuração de calibração. Mesmo pequenas alterações na distância ou no alinhamento entre a bobina e a amostra podem modificar as condições efetivas de estimulação.

A plataforma pode ser modificada de acordo com a questão biológica em estudo. Quando a carga magnética geral e a aplicação de força forem suficientes, as superpartículas fluorescentes revestidas com PDA (SPIONs) podem ser utilizadas sem funcionalização direcionada à actina. Quando for desejada a localização subcelular próxima a regiões ricas em actina, pode-se utilizar em vez disso a formulação funcionalizada com faloidina (f-SPIONs). Essa modularidade representa uma vantagem prática da plataforma.

A técnica atual apresenta várias limitações. Primeiro, o número calculado de partículas magnéticas incorporadas por célula representa um valor médio da população, enquanto a carga de partículas no nível de célula única inevitavelmente exibe heterogeneidade. Segundo, os valores de força magnética relatados neste estudo são estimativas baseadas em modelos, e não medições diretas de cargas mecânicas intracelulares. Terceiro, este protocolo foi projetado e desenvolvido principalmente para células de Schwann cultivadas em condições de imagem in vitro. Em sistemas de cultivo celular tridimensionais densos e em tecidos, pode ser necessária uma otimização substancial, pois a incorporação de nanopartículas, a distribuição intracelular, a acessibilidade óptica e o acoplamento mecânico podem diferir daqueles observados em cultivos bidimensionais. Por fim, a estratégia opcional de direcionamento à actina aumenta a probabilidade de localização das partículas em regiões associadas à actina, mas não garante um direcionamento uniforme ou específico de todas as estruturas ricas em actina dentro de células vivas.

Apesar dessas limitações, a atual plataforma de nanoacionamento magnético oferece diversas vantagens metodológicas distintas em comparação com técnicas existentes de aplicação de força. Por exemplo, a microscopia de força atômica (AFM) permite aplicação precisa de força localizada, mas exige contato mecânico direto com o alvo e nem sempre é facilmente integrada com imagens de células vivas de longo prazo8. Sistemas baseados em estiramento e substratos projetados podem fornecer estímulos mecânicos no nível da população celular, mas dependem de interfaces materiais pré-definidas e não são adequados para aplicação remota de forças intracelulares10. Pinças ópticas proporcionam alta resolução espacial na aplicação de força, mas apresentam riscos de danos teciduais induzidos por laser8. Métodos baseados em micropipetas são relativamente simples de operar, mas possuem baixa produtividade e resolução de força12. Sistemas microfluídicos são vantajosos para gerar microambientes mecânicos específicos, como tensão de cisalhamento e pressão de fluido, mas enfrentam desafios técnicos na reprodução de ambientes celulares complexos e na integração de múltiplos modos de estímulo mecânico11. Em contraste, a plataforma atual integra estimulação remota e sem contato, atuação magnética controlável, rastreamento de partículas baseado em fluorescência e compatibilidade direta com imagens confocais em tempo real em um único fluxo de trabalho.

A mesma estratégia geral pode ser adaptada a outros tipos celulares mecanicamente responsivos e a modelos biológicos mais complexos. Também pode ser estendida a sistemas multicelulares mais densos, como organoides neurais, cistos epiteliais ou epitélios semelhantes aos de rins de cães Madin-Darby (MDCK). Nessas condições, seria necessária uma otimização adicional para a penetração de partículas, distribuição das partículas e estimativa de forças em amostras tridimensionais mecanicamente acopladas. Mesmo diante desses desafios, o fluxo de trabalho atual fornece uma base prática para o desenvolvimento mais amplo de estratégias de estimulação magnetomecânica em sistemas vivos.

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (números de concessão 82571677 e 82001304 para Y.W.), pelo Programa Especial para Talentos em Saúde e Medicina da Província de Jilin (número de concessão JLSRCZX2025-134 para Y.W.) e pelo Projeto Programa Bethune da Universidade de Jilin (número de concessão 2024B19 para Y.W.). Os autores agradecem ao Colegiado de Química da Universidade de Jilin (Laboratório Chave Nacional de Estrutura Supramolecular e Materiais) e ao Instituto de Química Aplicada de Changchun, Academia Chinesa de Ciências, pela assistência no projeto, síntese e caracterização de nanomateriais. Os autores também agradecem ao Instituto de Medicina Translacional do Primeiro Hospital da Universidade de Jilin pela assistência nas imagens de microscopia confocal de varredura a laser (CLSM).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1,2-HexadecanodiolSigma-Aldrich213748Grau técnico, 90%; utilizado na síntese por decomposição térmica
35 mm ibidi µ-pratosibidi80156Utilizado para cultura e imagem de células de Schwann
Éter benzílicoSigma-Aldrich10801498%; solvente para Fe3O4 síntese de nanopartículas
Microscópio confocal a laser de varreduraNikonAXR (Ti2-E)Utilizado para imagem de células vivas e fluorescência 
Eletroímã personalizadoConstruído sob medidaN/AÍmã eletromagnético unipolar compacto para geração de campo magnético gradiente in vitro 
Ácido carboxílico de cianina3.5Duofluor Inc.D10128Corante fluorescente utilizado para Fe3O4·Montagem de superpartícula Cy3.5; MM 593,20; armazenar a -20 °C, protegido da luz 
Sal de mesilato de deferoxaminaSigma-AldrichD9533Agente quelante de ferro utilizado para remover ferro não internalizado e associado à membrana
Gaussímetro digitalCAMPO MAGNÉTICO AMPLOWT103Utilizado para medir a densidade de fluxo magnético e calibrar o campo magnético gradiente gerado pelo eletroímã personalizado
Cloreto de dopaminaSigma-AldrichH8502≥98% (CCT); utilizado para revestimento de polidopamina
Instrumento de dispersão dinâmica da luzMalvern InstrumentsZetasizer Nano-ZSUtilizado para a medição do diâmetro hidrodinâmico e do PDI 
Fluo-4 AM Invitrogen, Thermo Fisher ScientificF14201Indicador de cálcio utilizado para Ca²⁺ em células vivas2+ imagem
Espectrofotômetro de fluorescênciaShimadzuRF-6000Utilizado para caracterização por fotoluminescência 
Microscópio eletrônico de transmissão de alta resoluçãoJEOLJEM-F200Utilizado para a microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM) da morfologia e núcleo de nanopartículas–estrutura da concha 
Espectrômetro de emissão atômica com plasma acoplado indutivamentePerkinElmerOptima 3300 DVUtilizado para a quantificação de ferro intracelular
Acetilacetonato de ferro(III), Fe(acac)3Sigma-AldrichF30097%; precursor de Fe3O4 síntese de nanopartículas
Incubadora de estágio para células vivasTOKAI HITTENP&CO2Utilizado para imagem confocal de células vivas durante estimulação magnética 
Ácido oleicoSigma-AldrichO1008≥99% (CG); ligante de superfície para Fe3O4 síntese de nanopartículas
OleilaminaSigma-AldrichO7805Grau técnico, 70%; ligante para síntese de nanopartículas
Faloídicina–Alexa Fluor 350Invitrogen, Thermo Fisher ScientificA22281Reagente opcional de funcionalização direcionado à actina 
Pluronic F-127 Invitrogen, Thermo Fisher ScientificP3000MPUsado para facilitar o carregamento de Fluo-4 AM para Ca²⁺ em células vivas2+ imagem
Fonte de alimentação regulada CC programávelTongmeneTM-L605SPL (60 V, 5 A)Usado para alimentar o eletroímã personalizado para a geração de campo magnético gradiente in vitro
Células de Schwann RSC96Banco de Células da Academia Chinesa de CiênciasN/ALinhagem de células de Schwann derivadas de rato 
Dodecil sulfato de sódio (SDS)Sigma-Aldrich436143reagente ACS, ≥99,0%; surfactante para microemulsão de óleo em água
magnetômetro SQUIDQuantum Design Inc.MPMS-XLUtilizado para a medição de histerese magnética a 300 K 
ToluenoSigma-Aldrich244511Anidro, 99,8%; solvente para montagem de superpartículas
Microscópio eletrônico de transmissãoFEIEP 5018/40, Tecnai Spirit BiotwinUtilizado para a observação da ultraestrutura de tecidos celulares e neurais 

Referências

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