Artigo de método

Imagem 3D por MicroCT de Nódulos Radiculares de Medicago sativa

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DOI:

10.3791/71686

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28 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Leguminosas associam-se ao solo bactérias, formando nódulos radiculares nos quais as bactérias fixam o nitrogênio atmosférico para uso pela planta. A microtomografia computadorizada (MicroCT) permite a obtenção de imagens tridimensionais não destrutivas da organização tecidual, das zonas de bacteroides e dos feixes vasculares desse tecido opaco e rígido dos nódulos radiculares, oferecendo vantagens sobre as técnicas tradicionais de imagem que exigem o corte dos nódulos.

Resumo

A relação simbiótica entre a leguminosa Medicago sativa e a bactéria do solo Sinorhizobium meliloti resulta na formação de nódulos radiculares fixadores de nitrogênio. Métodos destrutivos tradicionais, incluindo inclusão em parafina, seccionamento com vibrátomo e crioseccionamento, têm sido aplicados para visualizar como as bactérias ocupam o nódulo, dificultando extremamente a obtenção de informações tridimensionais confiáveis. Essas abordagens são frequentemente combinadas com marcação ou coloração fluorescente, o que pode introduzir estresse adicional que afeta o crescimento da planta e a formação de nódulos. A microtomografia computadorizada (microCT) surgiu como uma ferramenta relativamente rápida, simples e robusta para a biologia vegetal, capaz de visualizar não destrutivamente características histológicas de plantas em três dimensões (3D), evitando assim artefatos decorrentes da preparação de amostras e garantindo uma reconstrução 3D de alta fidelidade. Embora a microCT tenha sido aplicada a nódulos radiculares de leguminosas, ainda é inexistente um protocolo detalhado e estabelecido que documente todo o processo, desde a colheita das plantas e preparação das amostras até a aquisição de imagens e visualização por meio de software.

Neste estudo, apresentamos um fluxo de trabalho passo a passo de microTC utilizando Medicago sativa como modelo. O protocolo inclui a excisão de nódulos das raízes, fixação, realce de contraste, montagem, varredura e reconstrução tridimensional. Parâmetros críticos que afetam elementos como qualidade da imagem, preservação do tecido e contraste são destacados. Com esta abordagem, é possível visualizar a organização geral dos tecidos, células infectadas por bacteroides e feixes vasculares em três dimensões, sem seccionar fisicamente os nódulos. O fluxo descrito aqui fornece um método reprodutível para obtenção de imagens não destrutivas e de alta resolução de nódulos radiculares nativos e provavelmente pode ser adaptado a outras espécies de leguminosas, oferecendo aos pesquisadores uma ferramenta prática para o estudo da estrutura dos nódulos e da organização bacteriana no interior dos nódulos em 3D.

Introdução

Plantas da família Leguminosae (ou Fabaceae), como Medicago sativa (alfafa), estabelecem uma relação simbiótica com bactérias do solo fixadoras de nitrogênio da família Rhizobiaceae, como Sinorhizobium meliloti, resultando no desenvolvimento de nódulos radiculares. A planta libera flavonoides para atrair as bactérias em condições de limitação de nitrogênio. Isso ativa a expressão dos fatores Nod nas bactérias simbióticas, desencadeando o encurvamento dos pelos radiculares e a subsequente formação de uma câmara de infecção ao redor das bactérias1,2,3,4. Um filete de infecção se forma a partir de uma região enfraquecida da parede da câmara, criando um tubo alongado que transporta as bactérias através da célula do pelo radicular5. Quando o filete de infecção atinge o córtex interno, uma série de divisões celulares inicia a formação de um órgão radicular especializado chamado nódulo radicular1,2,5. As bactérias então infectam a célula do nódulo e vivem no interior das células, cercadas pela membrana do simbiossomo dentro da célula. Nesse local, a planta fornece carbono e outros nutrientes às bactérias. Em troca, as bactérias fixam nitrogênio para a planta, convertendo o nitrogênio atmosférico não utilizável em amônia, uma forma utilizável pela planta2,3,4. Assim, o nódulo radicular funciona como uma fábrica biológica essencial para a fixação de nitrogênio, sustentando o crescimento da planta mesmo na ausência de fertilizantes nitrogenados sintéticos. Esse processo de fixação biológica de nitrogênio é economicamente e ambientalmente importante porque permite que leguminosas cresçam na ausência de fertilizantes sintéticos6. Além disso, algumas leguminosas formam nódulos indeterminados que apresentam zonas distintas nas quais as bactérias se diferenciam e fixam nitrogênio de forma mais eficiente4. Portanto, é importante visualizar tanto o exterior quanto o interior do nódulo (onde as bactérias ocupam fisicamente as células vegetais dentro do nódulo) para estudar em detalhes a fixação biológica de nitrogênio. No entanto, trata-se de um órgão opaco, preenchido com a proteína vegetal de cor vermelha chamada leghemoglobina, o que torna os métodos tradicionais de imagem desafiadores.

As técnicas de imagem utilizadas no passado foram destrutivas. O corte em parafina, o corte com vibrátomo e o corte criostático têm sido usados para produzir seções de tecido, mas esses métodos perturbam o estado nativo do tecido e introduzem artefatos que complicam a reconstrução tridimensional (3D)6,7,8,9,10. A reconstrução a partir de seções de tecido de nódulos embutidos em parafina já foi realizada com sucesso, mas utiliza amostras desidratadas e exige mais de 200 seções individuais8. Em seções individuais, é possível observar partes do sistema vascular, mas não como os feixes se dividem e envolvem o nódulo. Várias técnicas de marcação e coloração fluorescente foram realizadas em seções de tecido antes da microscopia confocal, mas essas apresentam geralmente os seguintes problemas8,9,10: (i) o tecido de nódulos vegetais é altamente autofluorescente, (ii) muitos métodos exigem a clareza do tecido antes da imagem, (iii) a coloração fluorescente pode danificar o tecido do nódulo, (iv) a inoculação de plantas com bactérias marcadas com proteína verde fluorescente (GFP) introduz estresse que afeta tanto o crescimento da planta quanto a formação de nódulos, e (v) os nódulos nativos são grandes demais para que toda a amostra seja facilmente seccionada5,11.

Comumente empregada em ambientes médicos, a imagem por tomografia computadorizada (TC) é utilizada para fins diagnósticos e terapêuticos12,13. Uma versão menor dessa técnica, a microtomografia de raios X (MicroTC), é um método de imagem que permite a visualização tridimensional (3D) não destrutiva de pequenos espécimes. Enquanto a TC gira o equipamento ao redor de um espécime maior, a microTC gira o espécime menor próximo à fonte de raios X. Isso permite uma resolução muito maior. A microTC tem sido aplicada à biologia do desenvolvimento animal, mas também surgiu como uma ferramenta promissora na biologia vegetal6,10,14,15,16,17,18,19. Importante ressaltar que a microTC e a tomografia de raios X baseada em sincrotrão têm sido amplamente utilizadas na fisiologia vegetal para investigar embolias no xilema e para validar cruzadamente estimativas baseadas em imagens com medições hidráulicas convencionais20,21,22. Por permitir a imagem de órgãos intactos em escalas sem seccionamento físico, a microTC preserva as relações espaciais em todo o nódulo. Com agentes de contraste apropriados, ela resolve estruturas em nível tecidual, como feixes vasculares e zonas de infecção, e pode penetrar além do limite imposto pelo espalhamento da luz em abordagens ópticas convencionais, o que é particularmente valioso para nódulos opacos e autofluorescentes. As amostras também podem ser reescaneadas, incorporadas em fluxos de trabalho corretivos subsequentes após processamento para microscopia óptica ou eletrônica, ou arquivadas para análises futuras. Embora alguns estudos tenham utilizado microTC e TC de raios X baseada em sincrotrão para investigar nódulos radiculares de soja, não há nenhum registro detalhado que abranja todo o processo, desde a coleta e coloração dos nódulos até a aquisição de imagens e reconstrução, especialmente para nódulos menores, como os da alfafa6,14. O contraste em raios X depende da densidade tecidual, e a maioria dos tecidos vegetais possui baixa densidade e fraca atenuação aos raios X. Sem um agente de contraste, os nódulos não podem ser diferenciados do fundo em um microtomógrafo convencional de bancada. Utilizamos o ácido fosfotúngstico (PTA), um corante não específico que se liga a proteínas e outras biomoléculas e que já demonstrou produzir alto contraste em tecidos vegetais14.

Este estudo fornece um protocolo detalhado, passo a passo, para a imagem microCT de nódulos radiculares de leguminosas utilizando alfafa como modelo, em um sistema convencional baseado em laboratório que oferece uma alternativa mais acessível à microscopia de raios X (XRM) e plataformas baseadas em sincrotrons6,14. Este fluxo de trabalho inclui instruções específicas para a coleta de nódulos da raiz, fixação, coloração, realce de contraste, montagem, varredura, reconstrução tridimensional e análise (Figura 1). Entre essas etapas, fornecemos parâmetros detalhados para garantir montagem estável, retenção de umidade e bom contraste. Em última instância, este pipeline de microCT é um método reprodutível que permite a visualização não destrutiva e de alta resolução de características histológicas tridimensionais, incluindo a organização geral dos tecidos, ocupação bacteriana das células vegetais, zonas distintas de fixação de nitrogênio e feixes vasculares de nódulos radiculares inteiros de alfafa em seu estado nativo. Acreditamos que este protocolo será adaptável a outras espécies de leguminosas, oferecendo aos pesquisadores um método prático e intacto para visualizar a estrutura e organização tridimensionais deste órgão radicular tão importante.

Protocolo

1. Coleta e fixação de nódulos

  1. Use um bisturi (Veja Tabela de Materiais) para fazer um corte reto através da raiz em ambos os lados do nódulo de interesse, deixando o nódulo preso à raiz (Figura 2).
  2. Transfira oito a doze nódulos para um frasco de vidro de 20 mL contendo 10 mL de etanol a 70% (v/v) (Veja Tabela de Materiais).

2. Coloração de nódulos

  1. Prepare 1% (p/v) de PTA em etanol 70% adicionando 2 g de pó de PTA em 200 mL de etanol 70% em um frasco quadrado de boca larga de 200 mL (veja a Tabela de Materiais). Agite até dissolução completa e, em seguida, armazene a 4 °C. Prepare a coloração um dia antes do uso.
  2. Remova o etanol 70% utilizado durante a fixação e substitua por 10 mL da solução de PTA 1% (veja a Tabela de Materiais).
  3. Coloque o frasco de vidro em um agitador orbital à temperatura ambiente, a 80 rpm, por 4 semanas. Substitua a solução de coloração semanalmente por 10 mL de PTA 1% fresca (veja a Tabela de Materiais, Figura 2).

3. Montagem do nódulo

  1. Derreta a parafina usando uma placa aquecedora a 100 °C em um béquer de vidro aberto de 100 mL (Veja Tabela de Materiais).
  2. Selecione ponteiras de pipeta de 200 µL para inclusão da amostra. Sobre as ponteiras no extremo estreito mergulhando-as levemente (1–2 mm) na parafina derretida (Veja Tabela de Materiais).
  3. Lave a amostra com 2 mL de etanol 70% em uma placa de micropoços de 35 mm por 5 min (Veja Tabela de Materiais).
  4. Adicione 0,2 g de agarose de ponto de fusão baixo em um frasco Erlenmeyer de 25 mL e misture com 20 mL de água desmineralizada para obter agarose a 1% (p/v) de ponto de fusão baixo. Aqueça em uma placa aquecedora a 50 °C, agitando algumas vezes até dissolução completa. Em seguida, coloque o frasco em banho-maria regulado a 40 °C (Veja Tabela de Materiais).
  5. Adicione aproximadamente 25 µL de agarose a 1% de ponto de fusão baixo nas ponteiras seladas invertidas e aguarde 1 min para esfriar (Veja Tabela de Materiais).
  6. Pegue um nódulo e transfira-o para dentro da ponteira usando pinça fina para imobilizá-lo na agarose a 1% de ponto de fusão baixo. Use uma ponteira para carregamento de géis para mover o nódulo o mais próximo possível do lado da ponteira selado com parafina, sem danificar o nódulo radicular (Veja Tabela de Materiais).
  7. Coloque as ponteiras com os nódulos radiculares em um suporte para permitir a solidificação da agarose de ponto de fusão baixo. Após a solidificação, feche o lado aberto das ponteiras com Parafilm para manter a umidade (Veja Tabela de Materiais). Armazene a amostra na geladeira a 4 °C e realize a análise por tomografia das amostras incluídas dentro de uma semana.

4. Imagem por microTC

  1. Monte as ponteiras de pipeta de cabeça para baixo em um suporte de amostra de tamanho apropriado para permitir o posicionamento mais próximo possível da fonte de raios X e garantir o alinhamento preciso da amostra (Veja a Tabela de Materiais).
  2. Abra o software de tomografia computadorizada. Parafuse firmemente a amostra no suporte sobre o estágio de rotação do microTC (Veja a Tabela de Materiais, Figura 3, Figura Suplementar 1).
  3. Ligue a visualização da câmera e a fonte de raios X, em seguida, ative a tela de visualização contínua de raios X (Figura Suplementar 1).
  4. Ajuste verticalmente a altura da amostra para posicionar a região de interesse no centro da tela contínua de raios X. Anote essa altura para uso posterior na etapa 4.10 (Figura Suplementar 1).
  5. Com o binning em 512 × 512, ajuste o tamanho do pixel (veja a Tabela Suplementar 1) para que a amostra ocupe a maior parte do campo de visão da tela contínua de raios X, com algum espaço vazio em cada lado (Figura Suplementar 1).
  6. Centralize a amostra na tela de visualização contínua de raios X, girando-a a cada 45° e ajustando para o centro (Figura Suplementar 1).
  7. Altere o binning para 2048 × 2048 (veja a Tabela Suplementar 1, Figura Suplementar 1).
  8. Escolha sem filtro e defina a tensão em 50 kV e a corrente em 40 µA no menu Modos de Varredura (veja a Tabela Suplementar 1, Figura Suplementar 1).
  9. Realize uma correção de campo plano movendo a amostra para baixo até 68 mm, de modo que ela saia do campo de visão da tela contínua de raios X. Desligue a Correção de Campo Plano e ajuste o Tempo de Exposição para que a transmissão média de raios X seja de 55%. Em seguida, ligue a Correção de Campo Plano (veja a Tabela Suplementar 1, Figura Suplementar 1).
  10. Retorne a amostra à altura determinada na etapa 4.4 (Figura Suplementar 1).
  11. Em Opções de Varredura, defina o nome do arquivo e o local da pasta (Figura Suplementar 1).
  12. Defina o passo de rotação em 0,200°. Defina a Média de Quadros em 3 e o Movimento Aleatório em 30. Escolha a varredura de 360° (veja a Tabela Suplementar 1, Figura Suplementar 1).
  13. Se desejar, ajuste a Largura Parcial para excluir espaços vazios excessivos e reduzir o tamanho dos dados (Figura Suplementar 1).
  14. Clique em Varredura para iniciar o processo de escaneamento (Figura Suplementar 1).

5. Reconstrução da imagem

  1. Abra o software de reconstrução de imagens e carregue todas as projeções 2D provenientes do exame (consulte a Tabela de Materiais, Fig. 4).
  2. Clique em Visualizar para observar os resultados do reconstrução na localização da linha verde (Figura Suplementar 2).
  3. Ajuste o histograma na aba Saída. Elimine a área plana à direita e mantenha o valor em 0 ou ligeiramente abaixo de 0 à esquerda (Figura Suplementar 2).
  4. Na aba Início, clique em Ajuste Fino para o pós-alinhamento. Comece com o Parâmetro definido em um e o Número de tentativas em cinco. Clique em Iniciar e em OK. Quando os resultados aparecerem na aba Saída, clique na janela prv e navegue pelos resultados para escolher o melhor alinhamento. Mantenha a imagem com o melhor alinhamento (Figura Suplementar 2).
  5. Ative a ROI na aba Saída marcando a caixa ao lado de Usar ROI. Escolha círculo como forma da ROI. Ajuste o tamanho da ROI ao tamanho da amostra ao longo do volume de dados retornando à aba Início e movendo a linha verde para visualizar diferentes localizações. Deixe um espaço vazio ao redor da amostra (Figura Suplementar 2).
  6. Voltar à aba Início. Mova as linhas vermelhas na parte superior e inferior para eliminar as áreas não necessárias nos dados de reconstrução. Verifique se dados importantes foram excluídos movendo a linha verde próximo às linhas vermelhas e visualizando os reconstruções na aba Saída (Figura Suplementar 2).
  7. Na aba Saída, salve o reconstrução como imagens TIFF (16 bits) no local desejado (Figura Suplementar 2).
  8. Volte à aba Início e clique em Iniciar (Figura Suplementar 2).

6. Visualização 3D

  1. Abra o Software Dragonfly (Veja Tabela de Materiais).
    NOTA: Para obter mais informações sobre o Dragonfly e suas funcionalidades, consulte https://dragonfly.comet.tech/
  2. Importe as imagens TIFF reconstruídas.
  3. Selecione todas as imagens e confirme que o espaçamento das imagens é o mesmo que o Tamanho do Pixel da Imagem Dimensionada no arquivo de texto da varredura (Figura Suplementar 3).
  4. Ajuste o nivelamento da janela para obter uma visualização 3D com bom contraste (Figura Suplementar 3).
  5. Percore os diferentes planos de corte 2D (XY, transversal; XZ, coronal; YZ, sagital) (Figura Suplementar 3).
  6. Clique com o botão direito na imagem e exporte uma captura de tela da visualização para salvar as vistas dos cortes conforme necessário (Figura 4).

Resultados

Coletamos dois nódulos radiculares de cada uma de três plantas de M. sativa. Dois nódulos foram utilizados para comparações de duração da coloração, e quatro foram imageados após a coloração completa de 28 dias com PTA 1% em etanol 70% para realce de contraste. Utilizando agarose de ponto de fusão baixo a 1% como meio de montagem em ponteiras de pipeta, obtivemos um ambiente de montagem com baixa densidade de raios X ao redor da amostra. A solução de coloração aumentou com sucesso o contraste do tecido vegetal (Figura 5A,B, Figura Suplementar 4). O sinal proveniente da amostra foi facilmente separado do fundo e da ponteira da pipeta pelo histograma de dados, permitindo uma visualização tridimensional desobstruída da estrutura externa e interna de todo o nódulo radicular (Figura 5A,B).

A epiderme externa é visível, mas apresenta menor contraste em comparação com os outros tecidos (Figura 5C–E). Por outro lado, os feixes vasculares são nítidos e bem conectados desde a base até o topo da amostra (Figura 5A,B). Em cortes transversais, é possível observar claramente o número e a ramificação desses feixes (Figura 5C). Além disso, o tecido interno apresenta bom contraste, permitindo a identificação do córtex e das vacúolos vegetais (Figura 5C–E). O alto contraste também facilita a identificação de células infectadas e não infectadas (Figura 5C–E). Cortes coronal e sagital revelam a distribuição das zonas meristemática, de infecção e de diferenciação (Figura 5D). Vídeo Suplementar 1 mostra uma vista de 360° de um nódulo reconstruído em 3D.

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Figura 1: Fluxo do protocolo. Visão geral do fluxo de trabalho para o uso de microTC na obtenção de imagens de nódulos radiculares de leguminosas e o tempo necessário para cada etapa. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Nódulos radiculares de M. sativa para este protocolo. (A) Planta de M. sativa 28 dias após inoculação com bactérias S. meliloti (28 dpi). Linhas pontilhadas pretas representam as linhas de corte sugeridas para a remoção dos nódulos ilustrados. Dois nódulos foram removidos por planta, a partir de três plantas, e quatro amostras foram escaneadas. (B) Nódulo de M. sativa 28 dpi após 4 semanas de coloração com PTA. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Visão geral da preparação da amostra para microTC. O nódulo radicular corado com um agente de contraste é estabilizado em agarose de baixo ponto de fusão dentro da ponteira de uma micropipeta. A ponteira da micropipeta é selada em uma extremidade com cera de parafina e fixada no estágio de rotação dentro da máquina de microTC. A fonte de raios X (sem filtro) está localizada em um lado da máquina, e os raios atravessam a amostra até atingir o detector de raios X no lado oposto. A varredura resulta em uma projeção 2D com base na densidade tecidual. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Exemplo de reconstrução de imagem e visualização 3D. (Esquerda) Projeção 2D. (Meio) Seção reconstruída. A1, B1 e C1 mostram seções transversais reconstruídas nas posições A, B e C da projeção 2D de microTC. (Direita) Uma visualização 3D do nódulo radicular produzida a partir das imagens reconstruídas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Imagens representativas anotadas. (A) Anotado Visualização 3D de M. sativa nódulo radicular.B) Contornos vermelho, azul e verde em uma imagem 3D mostrando o plano transverso (C), coronal (D) e sagital (E) planos, respectivamente. Transversais anotadas (C), coronal (D) e sagital (E) seções de M. sativa nódulo radicular. Abreviações: c – córtex; e – epiderme; ic – célula infectada; r – raiz; uc – célula não infectada; v – vacúolo; vb – feixe vascular; ZI – Zona I (meristemática); ZII – Zona II (infecção); ZIII – Zona III (diferenciação). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar 1. Capturas de tela do software para imagem microTC. (A1) Abrir e fechar a porta do estágio. (A2) Ativar a visualização da câmera. (A3) Ligar a fonte de raios X. (A4) Ativar a visualização contínua de raios X. (A5) Ajustar a altura da amostra. (A6) Ajustar o tamanho do pixel. (A7) Girar a amostra. (A8) Alterar o binning. (A9) Trocar o filtro. (A10) Opções para acessar os Modos de Varredura. (A11) Definir a tensão e a corrente da fonte de raios X. (A12) Clique duas vezes para desativar a correção de campo plano. (A13) Opções de varredura. (B1) Correção de campo plano desativada. (B2) Opções para acessar os Modos de Varredura. (B3) Transmissão média de raios X. (B4) Ajustar o tempo de exposição. (B5) Atualizar os campos planos. (C1) Nomear o arquivo e escolher onde salvar os dados. (C2) Definir o passo de rotação, média de quadros, movimento aleatório e varredura de 360 graus. (C3) Ajustar a largura parcial. (C4) Iniciar a varredura.Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2. Capturas de tela do software para reconstrução de imagem. (A1) Escolha onde visualizar a amostra. (A2) Visualização da amostra. (A3) Ajuste fino de parâmetros. (A4) Defina o número de tentativas e o passo do parâmetro para o pós-alinhamento. (A5-6) Parte superior e inferior da área de reconstrução. (A7) Iniciar reconstrução. (B1) Ajustar contraste. (B2) Visualizar e navegar pelos resultados do pós-alinhamento. (B3) Criar ROI circular. (B4) Escolha o formato do arquivo e onde salvar os dados.Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3. Capturas de tela do software para visualização 3D. (A) Informações de espaçamento da imagem. (B) Ferramentas de seleção, rotação e zoom (superior). Ajuste de nível da janela para contraste (inferior). (C) Exibição da barra de escala (superior). Alteração da cor de fundo (inferior). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 4. Reconstrução por microTC após coloração com PTA por 14, 17 e 28 dias. (A) Secção reconstruída de M. sativa após 14 d de coloração com PTA mostra ruído na camada externa (n = 1). (B) Secção reconstruída de M. sativa após 17 d de coloração com PTA mostra maior contraste na camada externa, mas menor nitidez no interior comparado a (A) (n = 1). (C) Secção reconstruída de M. sativa após 28 d de coloração com PTA mostra maior contraste tanto nas camadas externa quanto interna comparado a (A) e (B) (n = 4).Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Parâmetros para imagem de microTC.Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 1: Vídeo tridimensional do nódulo.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A seguir estão algumas recomendações sobre o preparo e coloração de amostras. Durante o preparo da amostra para a tomografia computadorizada microCT, a excisão cuidadosa dos nódulos é essencial para preservar a integridade estrutural. Recomendamos manter um pequeno segmento da raiz em ambos os lados do ponto de fixação do nódulo para preservar o contexto espacial e minimizar danos teciduais. O uso de um agente de contraste é fundamental para aumentar a atenuação dos raios X e visualizar características anatômicas internas14. Um estudo anterior utilizando coloração com ácido fosfotúngstico (PTA) demonstrou que um período mínimo de coloração de 14 dias é necessário para obter contraste suficiente entre diferentes espécies vegetais e tipos de tecidos, sem evidência de supercoloração14. Nesse estudo, nódulos radiculares de soja induzidos por Bradyrhizobium (fixados aos 14 dpi) foram corados por 35 dias14. Utilizando esse intervalo (14–35 dias) como referência, realizamos ensaios preliminares de coloração em nossas próprias amostras de nódulos em diversos pontos temporais (14, 17 e 28 dias) e comparamos o contraste das imagens resultantes. Um período de coloração de 28 dias foi selecionado para este protocolo, pois proporcionou melhor contraste, limites celulares mais nítidos e coloração mais uniforme em comparação com tempos mais curtos (Figura Suplementar 4). Observamos que as reconstruções de 14 e 17 dias provêm de um único nódulo, e não de um estudo com réplicas sistemáticas, enquanto a condição de 28 dias inclui os quatro nódulos escaneados, e a duração da coloração deve ser ajustada com base na resolução necessária para o estudo. Um período de 28 dias também não é breve. Conforme sugerido em estudos anteriores, a coloração assistida por micro-ondas pode ajudar a acelerar a penetração do PTA e, assim, reduzir a duração necessária da coloração14. Agentes à base de iodo, como a solução de Lugol, também são utilizados para aumentar o contraste em tecidos vegetais23,24. Optamos pelo PTA com base em seu desempenho comprovado em tecidos de nódulos, sem comparar diferentes agentes de coloração, já que o objetivo principal deste estudo foi estabelecer um único protocolo reprodutível14. Estudos futuros devem testar outros corantes em diferentes espécies vegetais e tipos de tecidos.

A inclusão adequada é igualmente importante. A amostra deve permanecer completamente coberta com agarose de ponto de fusão baixo para evitar desidratação e manter sua morfologia natural. Após a inclusão, as amostras devem ser armazenadas durante a noite a 4 °C para garantir a solidificação da agarose e manter a estabilidade durante a varredura. A amostra montada deve ser fixada firmemente à platina de varredura para evitar desvios ou artefatos por vibração durante a aquisição de dados.

A microTC permite a visualização tridimensional não destrutiva de tecidos inteiros de nódulos com uma resolução mais grossa do que a microscopia óptica e eletrônica. Tanto a RMX quanto a tomografia computadorizada de raios X baseada em sincrotrão geralmente fornecem imagens de maior qualidade e resolução do que a microTC convencional. A tomografia computadorizada de raios X baseada em sincrotrão também pode permitir que amostras frescas e não coradas sejam escaneadas diretamente, já que o alto fluxo de fótons e a coerência do feixe permitem aquisição rápida e contraste suficiente sem agentes de realce de contraste6. A comparação direta com Duncan et al. (2022)14 e Nakhforoosh et al. (2024)6 é limitada pelas diferenças no delineamento do estudo: espécie (soja versus Medicago sativa), tipo de nódulo (determinado versus indeterminado) e modalidade de imagem (RMX e tomografia computadorizada de raios X baseada em sincrotrão versus microTC convencional). Apesar disso, o tamanho nominal do pixel das nossas reconstruções de nódulos é de aproximadamente 1,75 µm, mais fino do que a varredura de nódulos em Duncan et al. (2022)14 (2,2 µm, Figura 4A), ainda assim suas reconstruções mostram maior clareza do que as nossas. Isso provavelmente reflete que a resolução efetiva depende de mais do que o tamanho nominal do pixel; a ampliação óptica das lentes objetivas da RMX, sensibilidade do detector, estabilidade da fonte, qualidade da câmera e métodos de reconstrução contribuem todos. Embora características grandes e de baixa densidade, como vacúolos, sejam facilmente distinguíveis, como mostrado aqui, a ocupação individual de células por bacteroides e organelas menores ou menos densas não é, e os processos biológicos dinâmicos não podem ser capturados em tempo real. Agentes de contraste à base de PTA e iodo são não específicos e não podem indicar identidade molecular. Questões subcelulares ainda exigirão microscopia de fluorescência ou microscopia eletrônica. Essas abordagens de imagem são complementares, sendo a microTC particularmente adequada para a morfologia de órgãos inteiros e arquitetura tecidual tridimensional, fornecendo contexto para a microscopia óptica e eletrônica, que abordam detalhes estruturais e moleculares mais finos.

Replicamos com sucesso este fluxo de trabalho com nódulos em pontos temporais e estágios de desenvolvimento semelhantes de M. sativa inoculada com outras cepas de S. meliloti, e de M. truncatula e Trigonella foenum-graecum inoculadas com diversas cepas diferentes de S. meliloti (dados não publicados). Não testamos nódulos em diferentes estágios de desenvolvimento, pois nosso objetivo foi caracterizar e fornecer um protocolo reprodutível para nódulos maduros com fixação de nitrogênio. Mesmo assim, o fluxo de trabalho deve ser aplicável a nódulos em diversos estágios de desenvolvimento, já que a limitação mais relevante é o tamanho do nódulo. Os nódulos que escaneamos tinham aproximadamente 2,5 mm de comprimento (Tabela Suplementar 1). No microTC utilizado neste estudo, o tamanho mínimo recomendado é de 1 mm de comprimento. O tamanho que pode ser imageado será afetado pelo equipamento utilizado, pois as ampliações podem variar.

Evidências recentes sugerem que a ocupação dentro do nódulo é um parâmetro importante que se correlaciona diretamente com a eficiência da fixação de nitrogênio. Nódulos com uma proporção maior de células infectadas demonstraram fixar nitrogênio melhor do que aqueles em que menos células são ocupadas por bactérias25. Além disso, a saúde do nódulo depende do grau de vascularização, e uma vascularização interrompida ou limitada indica nódulos defeituosos e redução na saúde da planta26. Dado o potencial de visualizar a ocupação e a arquitetura vascular, a microTC preenche uma lacuna importante no campo da fixação de nitrogênio. Este fluxo de trabalho torna acessível de forma rotineira a visualização não destrutiva das estruturas internas e externas dos nódulos radiculares, e essas estruturas são determinantes diretos da eficiência de fixação que impulsiona o suprimento simbiótico de nitrogênio para as culturas.

Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Stephanie Sage pela ajuda com a preparação das plantas. Xia Zhao auxiliou no embutimento das amostras. Somos gratos a Madi Mitchell pela discussão inicial do projeto. Gostaríamos de agradecer a Tom Kleist e Kexi Yi pelo conselho na interpretação dos dados. Agradecemos também a Keith Duncan (Centro de Ciências Vegetais Donald Danforth) pelo seu conselho sobre o protocolo. Este projeto é financiado pelo Instituto de Pesquisa Médica Stowers.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Frasco de vidro de 20 mLSigma-AldrichZ190527Utilizado para acondicionar nódulos para fixação e coloração.
Pontas de pipeta de 200 µLFisherbrand02-717-144Utilizado para acondicionar nódulos para imagem.
Placa de fundo microporoso de 35 mmFisher Scientific507532924Utilizado para lavar nódulos após a coloração.
Software DragonflyComet Technologies Canada Inc.V2022.2Utilizado para visualizar e manipular reconstruções 2D em uma visão 3D.
EtanolDecon LabsV1001Utilizado para fixar e lavar nódulos.
Pinça finaDumontAA-Inox-EUtilizado para ajustar nódulos na ponta da pipeta.
Ponta para carregamento de gelCorning (Costar)4853Utilizado para manipular o nódulo dentro do agarose dentro da ponta da pipeta.
Placa aquecedoraMirakSP72725Utilizado para derreter parafina e dissolver agarose de baixo ponto de fusão.
Agarose de baixo ponto de fusãoGeneMate490001-602Utilizado para inclusão de nódulos radiculares para manter a orientação e umidade.
MicroTCBrukerBruker SkyScan 1272Utilizado para escanear o nódulo.
Software NReconBrukerV2.2.0.6Utilizado para a reconstrução de projeções 2D.
Agitador orbitalVWR77591-858Utilizado para agitar o nódulo radicular para acelerar a penetração da coloração.
ParafinaMcCormick Scientific39503002Utilizado para selar a extremidade estreita da ponta da pipeta.
ParafilmAlkali ScientificPM996Utilizado para selar pontas de pipeta para evitar a secagem da amostra.
Ácido fosfotúngsticoElectron Microscopy Science (EMS)19500Utilizado para coloração do nódulo.
Suporte para amostra - L 3,4 cm D 0,63 mmBrukerConjunto da Bruker com o equipamentoUtilizado para segurar a ponta da pipeta e a amostra durante a aquisição de imagens.
EscalpeloFisher ScientificS07890Utilizado para colher nódulos radiculares.
Software SkyscanBrukerv1.5.1.0Utilizado para manipular o MicroTC.
Banho-mariaBoekel Grant640013001Utilizado para manter o agarose líquido durante a inclusão dos nódulos.

Referências

  1. Oldroyd GED, Murray JD, Poole PS, Downie JA. The rules of engagement in the legume-rhizobial symbiosis. Annu Rev Genet. 2011;45:119-44.
  2. Gibson KE, Kobayashi H, Walker GC. Molecular determinants of a symbiotic chronic infection. Annu Rev Genet. 2008;42:413-41.
  3. Porter SS, et al. Host-imposed control mechanisms in legume-rhizobia symbiosis. Nat Microbiol. 2024;9:1929-39.
  4. Guerra-García FJ, Sankari S. NCR peptides in plant-bacterial symbiosis: applications and importance. Trends Microbiol. 2025;33(2):147-50.
  5. Rae AE, Rolland V, White RG, Mathesius U. New methods for confocal imaging of infection threads in crop and model legumes. Plant Methods. 2021;17:24.
  6. Nakhforoosh A, et al. Visualization and quantitative evaluation of functional structures of soybean root nodules via synchrotron X-ray imaging. Plant Phenomics. 2024;6.
  7. Nierenberger M, Rémond Y, Ahzi S, Choquet P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. C R Biol. 2015;338(7):425-33.
  8. Livingston D, Tuong T, Nogueira M, Sinclair T. Three-dimensional reconstruction of soybean nodules provides an update on vascular structure. Am J Bot. 2019;106(3):507-13.
  9. Warner CA, et al. An optical clearing technique for plant tissues, allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy. Plant Physiol. 2014;166(4):1684-7.
  10. Indore NS, Karunakaran C, Jayas DS. Synchrotron tomography applications in agriculture and food sciences research: a review. Plant Methods. 2022;18:101.
  11. Novák K. Determination of symbiotic nodule occupancy in the model Vicia tetrasperma using a fluorescence scanner. Ann Bot. 2011;107(4):709-15.
  12. Martin L, et al. Cancer cachexia in the age of obesity: Skeletal muscle depletion is a powerful prognostic factor, independent of body mass index. J Clin Oncol. 2013;31(12):1539-47.
  13. Liguori C, et al. Emerging clinical applications of computed tomography. Med Devices (Auckl). 2015;8:265-78.
  14. Duncan KE, et al. X-ray microscopy enables multiscale high-resolution 3D imaging of plant cells, tissues, and organs. Plant Physiol. 2022;188(2):831-45.
  15. Wang J, et al. A deep learning-based micro-CT image analysis pipeline for nondestructive quantification of the maize kernel internal structure. Plant Phenomics. 2025;7(1).
  16. Brackin R, Atkinson BS, Sturrock CJ, Rasmussen A. Roots-eye view: Using microdialysis and microCT to non-destructively map root nutrient depletion and accumulation zones. Plant Cell Environ. 2017;40(12):3135-42.
  17. Brodersen CR, Roddy AB. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. Am J Bot. 2016;103(2):184-8.
  18. Schoborg TA, et al. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 2019;146(23).
  19. Wang M, et al. Nanoplastics causes extensive congenital malformations during embryonic development by passively targeting neural crest cells. Environ Int. 2023;173.
  20. Brodersen CR, et al. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiol. 2010;154(3):1088-95.
  21. Brodersen CR, et al. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiol. 2013;161(4):1820-9.
  22. Nolf M, et al. Visualization of xylem embolism by X-ray microtomography: a direct test against hydraulic measurements. New Phytol. 2017;214(2):890-8.
  23. Karahara I, Yamauchi D, Uesugi K, Mineyuki Y. Three-dimensional visualization of plant tissues and organs by X-ray micro-computed tomography. Microscopy (Oxf). 2023;72(4):310-25.
  24. Staedler YM, Masson D, Schönenberger J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 2013;8(9).
  25. Sánchez-Cañizares C, et al. Developmental fates and N2-fixing efficiency of terminally-differentiated versus undifferentiated bacteroids from legume nodules. Plant Physiol. 2026;200(3).
  26. Pepper AN, Morse AP, Guinel FC. Abnormal root and nodule vasculature in R50 (sym16), a pea nodulation mutant which accumulates cytokinins. Ann Bot. 2007;99(4):765-76.

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