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Um Ensaio de Cocultura Baseado em Imagens em Tempo Real para Quantificar a Morte Apoptótica de Organoides Tumorais Derivados de Pacientes Mediada por Linfócitos Infiltrantes de Tumor

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DOI:

10.3791/71688

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3 de setembro de 2026

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1Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell Medicine, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medicine, 4Department of Systems and Computational Biomedicine, Weill Cornell Medicine

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece um método baseado em imagens, com microscopia em tempo real de células vivas, para quantificar a citotoxicidade mediada por linfócitos tumorais infiltrantes (TIL) contra organoides tumorais derivados de pacientes, permitindo a análise cinética em tempo real da apoptose para caracterização funcional do sistema imunológico e avaliação de terapias imunomoduladoras.

Resumo

Compreender a capacidade funcional dos linfócitos infiltrantes no tumor (TILs) de reconhecer e eliminar células tumorais autólogas é fundamental para o avanço da imunoterapia personalizada. O objetivo deste método é fornecer um protocolo baseado em imagens, com imagem em tempo real de células vivas, que mensure a eliminação apoptótica mediada por TILs e dependente da caspase-3 contra organoides tumorais derivados de pacientes (PDTOs) em tempo real. Este método integra procedimentos estabelecidos de isolamento e expansão de PDTOs e TILs com um sistema padronizado de co-cultivo tridimensional e detecção automatizada de apoptose baseada em fluorescência.

Organoides tumorais são semeados em placas de 96 poços compatíveis com imagem e marcados com um marcador tumoral vermelho, enquanto linfócitos infiltrantes tumorais expandidos são adicionados em razões definidas de efetor por alvo na presença de um substrato fluorescente verde ativado pela caspase-3. Os cultivos mistos são monitorados a cada 4 h por meio de um sistema de análise de células vivas para capturar canais de contraste de fase e de dupla fluorescência. A análise quantitativa de imagens identifica estruturas tumorais positivas para o sinal vermelho e calcula a proporção de objetos tumorais apoptóticos duplo-positivos (vermelho/verde) ao longo do tempo. Réplicas técnicas e biológicas apropriadas são incluídas, juntamente com controles de linha de base, de apoptose espontânea, negativos e positivos de lise, para garantir a rigorosidade do ensaio.

Ao preservar a heterogeneidade tumoral dentro da arquitetura tridimensional dos PDTOs, ao mesmo tempo que permite a quantificação longitudinal, este protocolo fornece um sistema fisiologicamente relevante para o perfil funcional das interações específicas entre tumor e LIT do paciente e para investigar agentes imunomoduladores que potencializam a imunidade antitumoral.

Introdução

A imunoterapia contra o câncer foi transformada pelo desenvolvimento de inibidores de pontos de controle imunológico (ICIs) que visam as vias da proteína de morte celular programada 1/ligante de morte programada 1 (PD-1/PD-L1) e da proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4), que reativam respostas antitumorais mediadas por linfócitos T endógenos em diversos tipos de tumores sólidos1,2,3. Apesar das respostas duradouras em um subconjunto de pacientes, a maioria não alcança benefício clínico significativo, e biomarcadores preditivos validados para identificar prospectivamente os respondedores ainda representam uma necessidade não atendida. Assim sendo, ensaios funcionais que meçam diretamente a destruição tumoral mediada por linfócitos T são ferramentas essenciais para a descoberta de biomarcadores e para a avaliação pré-clínica de combinações terapêuticas projetadas para potencializar respostas imunes citotóxicas.

Ensaios convencionais de citotoxicidade, incluindo a liberação de cromo-51, quantificação de lactato desidrogenase (LDH) e ensaios de viabilidade baseados em luminescência de ATP, como o CellTiter-Glo, têm sido amplamente utilizados para quantificar a morte celular mediada pelo sistema imunológico, mas geram medições pontuais em massa que carecem de resolução espacial e temporal4,5,6. Da mesma forma, ensaios de morte celular baseados em citometria de fluxo em ponto final quantificam a morte celular em um tempo fixo e são pouco adequados para formatos de cultivo tridimensionais. Além disso, linhagens celulares tumorais bidimensionais, amplamente utilizadas nesses ensaios, não recapitulam completamente a heterogeneidade intrínseca dos tumores primários de pacientes.

Organoides tumorais derivados de pacientes (PDTOs) surgiram como uma plataforma ex vivo clinicamente relevante que preserva de maneira mais fiel as alterações genômicas, a heterogeneidade celular e os fenótipos de resposta a fármacos do tumor original em comparação com modelos convencionais de linhagens celulares7,8,9,10,11,12Estudos recentes demonstraram que PDTOs podem ser cultivados em co-cultura com células imunes autólogas para modelar respostas imunes antitumorais ex vivo; no entanto, a maioria dos métodos publicados depende de medidas de viabilidade em ponto final ou de análises de imagem confocal que exigem intensa mão de obra, o que limita a capacidade experimental e impede o monitoramento dinâmico da resposta citotóxica13,14,15,16.

Aqui, descrevemos um ensaio de cocultura baseado em imagens, em tempo real, para leitura quantitativa derivada de imagens da citotoxicidade mediada por linfócitos T contra PDOs fluorescentemente marcados. O método utiliza microscopia de fluorescência com registro de tempo combinado a um substrato fluorescente ativado por caspase-3 para gerar curvas cinéticas de apoptose com resolução em nível de organoide individual ao longo de uma janela de observação de 12 a 36 horas. Em comparação com ensaios convencionais de citotoxicidade, esta plataforma oferece diversas vantagens técnicas: preserva a arquitetura tridimensional do tumor durante todo o ensaio, resolve a dinâmica temporal da indução apoptótica, permite proporções definidas de efetores para alvos e possui potencial aplicação futura em formatos de triagem de fármacos com média produtividade, incluindo inibidores de pontos de controle imunológico e agentes direcionados testados isoladamente ou em combinação. Este protocolo destina-se a pesquisadores que atuam em imuno-oncologia, medicina funcional de precisão e biologia de linfócitos T, podendo ser implementado em laboratórios equipados com infraestrutura padrão de cultura de tecidos e sistema de imagem de células vivas com fluorescência.

O isolamento e cultivo de organoides tumorais derivados de pacientes (PDTOs) e de linfócitos infiltrantes do tumor (TILs) correspondentes a partir de espécimes tumorais humanos são metodologias bem estabelecidas e amplamente publicadas. Protocolos robustos que descrevem a dissociação mecânica e enzimática de tumores, o encapsulamento tridimensional em matriz da membrana basal, a expansão de organoides a longo prazo e o isolamento paralelo e expansão ex vivo de TILs foram validados extensivamente em múltiplos tipos de tumores. Esses métodos preservam de forma confiável a heterogeneidade celular tumoral, a arquitetura e a especificidade imunológica, e foram adaptados em sistemas de co-cultivo para avaliar as interações tumor-imunidade. Assim, neste estudo, o isolamento e a expansão de organoides e TILs foram realizados de acordo com protocolos previamente publicados e validados, sem modificações substanciais, salvo indicação em contrário.

Protocolo

Realizamos todos os procedimentos envolvendo tecido tumoral humano e linfócitos infiltrantes de tumor (LITs), conforme aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (IRB#1305013903) e regulamentos institucionais de biossegurança, e obtivemos consentimento informado por escrito antes da aquisição dos tecidos. O órgão aprovador foi o Comitê de Ética em Pesquisa da Weill Cornell Medicine (listado como Institutional Review Board (IRB), Weill Cornell Medicine, Nova York, NY), sob o protocolo #1305013903. Os espécimes abrangidos por este protocolo incluem tecido tumoral remanescente obtido de cirurgias de rotina ou procedimentos de pesquisa após avaliação patológica de rotina; tecido congelado existente ou em parafina fixado em formalina (FFPE) proveniente da Weill Cornell Medical College ou de outras instituições; sangue, do qual são isolados e armazenados os mononucleares do sangue periférico (PBMCs), soro e plasma; swabs bucais, saliva, urina ou tecido benigno utilizados como controles em alguns casos; e, para participantes inscritos no Programa de Autópsia Rápida, tecidos coletados em autópsia realizada dentro de 6 h (até 24 h) após a morte. Os LITs utilizados neste estudo foram expandidos a partir dos espécimes de tecido tumoral descritos acima. Identificadores pessoais foram removidos de todas as biosamostras, que foram vinculadas à identidade do participante apenas por meio de um número de identificação único do paciente, conforme as normas do HIPAA e institucionais; os dados foram reidentificados somente no momento da geração do relatório. Todos os experimentos foram conduzidos sob condições de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2) em uma cabine de segurança biológica certificada Classe II. Materiais biologicamente perigosos foram descartados de acordo com a política institucional. Consulte a Tabela de Materiais e o Arquivo Suplementar 1 para obter informações sobre os materiais e a preparação de tampões e meios utilizados neste trabalho.

1. Rotulagem fluorescente e reconstituição de organoides tumorais derivados de pacientes (PDTOs) (Figura 1)

  1. Remova o Matrigel antigo e inicie a dissociação celular.
    1. Coloque a placa de cultura na cabine de segurança biológica. Aspire cuidadosamente o meio dos poços sem perturbar as gotas de Matrigel.
    2. Adicione 1–2 mL de enzima de dissociação celular à temperatura ambiente por poço. Pipete para cima e para baixo repetidamente com uma pipeta P1000 e um espátula estéril para quebrar completamente as gotas de Matrigel.
    3. Transfira a mistura celular para um tubo cônico de 15 mL rotulado. Adicione 1 mL adicional da enzima de dissociação celular a cada poço para lavar as células residuais e transfira para o mesmo tubo. Ajuste o volume para garantir que pelo menos 5 mL de enzima por poço sejam coletados. Tampe o tubo e agite manualmente para homogeneizar completamente.
  2. Dissociação enzimática
    1. Coloque o tubo em banho-maria a 37 °C. Incube por 10 min e agite o tubo manualmente a cada 2–3 min para promover a dissociação. Monitore visualmente a completa desagregação.
    2. Após a dissociação, centrifugue a 300 × g por 3 min a 4 °C. Inspecione o tubo após a centrifugação.
    3. Se não se formar pellet e a turvação do Matrigel persistir, adicione enzima adicional de dissociação celular. Agite e retorne ao banho-maria por 3–5 min. Se o pellet ainda não se formar, coloque o tubo no gelo por 3 min para permitir a sedimentação da matriz.
  3. Contagem celular e avaliação de viabilidade
    1. Aspire o sobrenadante sem perturbar o pellet. Adicione 10 mL do meio de lavagem +++.
    2. Centrifugue a 300 × g por 3 min a 4 °C. Re-suspenda o pellet em 1 mL de PBS. Triture suavemente para obter uma suspensão de células únicas.
    3. Misture 15 µL da suspensão celular com 15 µL de Azul de Tripano 0,4%. Carregue 10 µL por câmara de contagem. Conte as células viáveis usando um contador automatizado ou hemocitômetro.
    4. Mantenha as células no gelo durante a contagem. Adicione uma placa de 6 poços não tratada para tecidos, já aquecida a 37 °C, para semeadura posterior.
  4. Marcação fluorescente de células tumorais
    1. Ajuste a concentração celular para 1 × 106 células viáveis/mL em PBS.
    2. Reconstitua o corante CellTrace Far Red com 20 µL de DMSO para preparar uma solução estoque de 1 mM. Vortexe e centrifugue brevemente.
    3. Adicione 1 µL da solução estoque de 1 mM por 1 mL de suspensão celular (1 × 106 células/mL), obtendo uma concentração final de marcação de 1 µM. Inverta suavemente para misturar. Incube por 30 min a 37 °C protegido da luz.
    4. Adicione 5 volumes de PBS para lavar o corante. Centrifugue a 300 × g por 5 min. Lave duas vezes com PBS.
    5. Avalie a eficiência da marcação. Um pellet celular visivelmente colorido serve como critério qualitativo de aceitação.
    6. Determine a viabilidade pós-marcação pelo método de exclusão do Azul de Tripano e registre a viabilidade observada (80%).
      ​NOTA: Prossiga com as células para inclusão somente se o pellet celular demonstrar coloração uniforme e a viabilidade pós-marcação for ≥80%.
  5. Criação da suspensão celular tridimensional em matriz
    1. Re-suspenda o pellet em um volume apropriado de meio específico de cultura com base no tamanho do pellet (por exemplo, para 900.000 células, adicione 500 µL de meio; para 1,8 milhão de células, adicione 1.000 µL de meio).
    2. Adicione Matrigel gelado na proporção de 1:2 (meio:matriz), resultando em 67% de Matrigel. Misture completamente, mas com cuidado, para evitar a formação de bolhas (alvo típico: 300.000 células por poço de uma placa de 6 poços).
  6. Plaqueamento de gotas de matriz 3D
    1. Usando uma pipeta de 200 µL, plaque gotas de 100 µL: 5 gotas por poço em placas de 6 poços. Coloque as placas em um incubador a 37 °C por 5 min.
    2. Coloque as placas de cabeça para baixo e incube por mais 40 min para polimerização completa. Confirme a presença de células incluídas por microscopia.
    3. Adicione 4 mL de meio por poço (placa de 6 poços) e retorne as placas ao incubador. Incube por 72 h para permitir a formação de organoides de 100–300 µm.

2. Preparação de organoides para ensaio de morte celular

  1. Dissolver a matriz da membrana basal preservando a estrutura tridimensional dos organoides.
    1. Remova as placas de organoides do incubador e transfira para uma cabine de segurança biológica. Aspire cuidadosamente o meio de cultura de cada poço sem perturbar as cúpulas de Matrigel.
      NOTA: Designe e mantenha um poço intacto para dissociação completa e contagem de células tumorais (ver seção 2.2).
    2. Adicione 1 mL de Solução de Recuperação Celular gelada diretamente em cada poço para dissolver a matriz da membrana basal. Disperse mecanicamente as cúpulas usando uma pipeta P1000 e um raspador celular estéril até que a matriz esteja totalmente destacada da superfície da placa.
    3. Transfira a suspensão de até três poços para um tubo cônico de 15 mL previamente rotulado e mantido no gelo. Adicione mais 8 mL de Solução de Recuperação Celular gelada ao tubo. Coloque o tubo horizontalmente em um agitador a 4 °C por 30 min para garantir a dissolução completa da matriz.
      NOTA: Proteja as amostras da luz, caso tenha sido realizada marcação fluorescente.
    4. Após a incubação, centrifugue a 300 × g por 3 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente o sobrenadante completamente, sem perturbar o pellet de organoides.
    5. Resuspenda suavemente o pellet em meio PDTO completo usando pipetagem lenta com ponteiras de grande diâmetro para manter a arquitetura tridimensional intacta dos organoides.
      CRÍTICO: Evite pipetagem excessiva ou vortex, o que pode romper a estrutura tridimensional.
      Se a matriz residual for visível após a centrifugação, repita a incubação em Solução de Recuperação Celular gelada por mais 10–15 min. Re-centrifugue e reavalie.
  2. Determinar o número de células tumorais viáveis e ajustar a concentração da suspensão de organoides.
    1. Dissocie completamente o poço reservado usando a enzima de dissociação celular conforme descrito na Seção 1. Incube a 37 °C por 5–7 min com trituração intermitente.
    2. Neutralize com meio PDTO completo. Centrifugue a 300 × g por 5 min. Resuspenda em 1 mL de meio.
    3. Misture 15 µL de suspensão celular com 15 µL de Azul de Tripano a 0,4%. Conte as células viáveis usando um hemocitômetro ou contador automatizado.
    4. Com base na contagem de células viáveis, calcule a diluição necessária para atingir 200.000 células viáveis/mL em meio PDTO completo
      NOTA: Exemplo de cálculo: Para um alvo de 20.000 células tumorais por poço em 100 µL, é necessária uma concentração de trabalho de 200.000 células/mL. Se for semear uma placa de imagem de 96 poços completa (60 poços internos), o volume total do ensaio será de 6 mL (100 µL × 60 poços), mas com 20% de volume morto, prepare 7,2 mL. Assim, o número necessário de células é 6 mL × 200.000 células/mL = 1,2 × 106 células e 7,2 mL × 200.000 células/mL = 1,44 × 106 células.
  3. Plaque os organoides para o ensaio de morte celular
    ​NOTA: Use placas de imagem de 96 poços com paredes pretas e fundo transparente. Plaque cada condição em pelo menos três réplicas técnicas.
    1. Usando uma pipeta multicanal, dispense 100 µL de suspensão de organoides por poço para atingir 20.000 células tumorais viáveis por poço.
    2. Preencha os poços externos da placa com 200 µL de PBS estéril para minimizar a evaporação e os efeitos de borda.
    3. Confirme visualmente a distribuição uniforme ao microscópio.
    4. Permita que os organoides sedimentem a 37 °C por 10–30 min antes da adição de linfócitos T.
  4. Manter a expansão contínua dos organoides.
    1. Utilize a suspensão unicelular gerada durante a contagem. Resuspenda as células em meio específico para o cultivo. Adicione Matrigel gelado até uma concentração final de 67%.
    2. Plaque em placas de suspensão de 6 poços pré-aquecidas com 100.000 células por poço. Polimerize e cubra com meio conforme descrito na Seção 1. Retorne ao incubador para expansão contínua.

3. Preparação de linfócitos T reativos a tumores

  1. Expansão e coleta de linfócitos infiltrantes em tumores (TILs)
    1. Isole e expanda TILs a partir de espécimes tumorais utilizando protocolos previamente estabelecidos13,14.
    2. Registre as seguintes características para cada preparação de TIL: viabilidade pós-expansão: ≥80% (exclusão com Azul de Tripano); pureza de CD3⁺: ≥85%; distribuição de CD4⁺/CD8⁺: ≥30% de células T CD8⁺, com a razão CD4:CD8 documentada; duração da expansão e condições de cultivo: 10–14 dias em RPMI-1640 completo suplementado com 10% de soro humano AB e IL-2 recombinante humana (600 UI/mL) em condições sem células alimentadoras; fenótipo de ativação/esgotamento: PD-1 ≤ 50%, TIM-3 ≤ 30% e LAG-3 ≤ 20% das células CD3⁺ no momento do ensaio; marcadores de ativação (por exemplo, CD69 ou CD25) detectáveis após estimulação; evidência de reatividade tumoral: atividade antígeno-específica mensurável por pelo menos um ensaio funcional (por exemplo, aumento na produção de IFN-γ, superexpressão de CD137/4-1BB, desgranulação de CD107a ou citotoxicidade contra células tumorais autólogas).
    3. Confirme que cada PDTO foi co-cultivado exclusivamente com sua própria preparação autóloga de TIL.
      NOTA: Prefira estratégias de expansão sem células alimentadoras para preservar populações citotóxicas de CD8+. Protocolos que utilizam PBMCs alimentadores irradiados podem desviar a expansão para células T CD4+. Sistemas sem células alimentadoras preservam melhor as células T CD8+.
      Limite a expansão de TILs a um máximo de 14 dias para evitar fenótipos de esgotamento e perda de função citotóxica.
    4. No dia do ensaio, colete as células T dos frascos de cultivo. Transfira as células para tubos cónicos de 15 mL. Centrifugue a 300 × g durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aspire completamente o sobrenadante.
  2. Prepare as células T para o ensaio funcional.
    1. Re-suspenda o pellet do passo 3.1.4 em 1 mL de meio básico para células T (RPMI 1640 + 10% FBS + 1% Pen/Strep).
      NOTA: Assegure que o meio não contenha IL-2, IL-15, citocinas, microesferas anti-CD3/CD28 ou células alimentadoras.
      ​CRÍTICO: Citocinas residuais ou microesferas de ativação aumentarão artificialmente a citotoxicidade e comprometerão a interpretação do ensaio.
    2. Determine a concentração celular e a viabilidade utilizando Azul de Tripano. Prossiga apenas se a viabilidade for ≥ 80%.
  3. Prepare as razões efetor-alvo (E:A).
    1. Defina a razão E:A como células T:células tumorais.
      NOTA: O número de células tumorais usado para calcular a razão E:A é estimado a partir de um poço de referência totalmente dissociado processado em paralelo (Seção 2.2). Como os organoides são semeados como estruturas tridimensionais intactas, o número de células tumorais não pode ser determinado diretamente nos poços individuais de co-cultivo sem interromper o ensaio. A concentração estimada de células tumorais obtida do poço de referência é aplicada uniformemente a todos os poços preparados a partir da mesma suspensão de organoides agrupados.
      1. Para uma razão E:A de 2:1 com 20.000 células tumorais por poço, adicione 40.000 células T por poço. Prepare as células T a 400.000 células/mL para entregar 100 µL por poço; portanto, 400.000 células/mL × 0,1 mL = 40.000 células.
      2. Se for semear uma placa de imagem completa de 96 poços (60 poços internos), o volume necessário de células T será de 6 mL, e com 20% de volume morto, o volume de células T será de 7,2 mL.
        Células T necessárias: 6 mL × 400.000 células/mL = 2,4 × 106 células
        7,2 mL × 400.000 células/mL = 2,88 × 106 células
        NOTA: A razão E:A estimada está sujeita a variabilidade inerente associada ao cultivo de organoides tridimensionais, incluindo variação no tamanho dos organoides (normalmente 100–300 µm de diâmetro), perda celular durante a dissolução e lavagem do Matrigel (Seção 2.1) e pequenas variações no pipetamento e sedimentação celular durante a preparação da placa.
        ​Para minimizar a variabilidade, plaque no mínimo três réplicas técnicas por condição, utilize ponteiras de pipeta de grande diâmetro e ressuspenda suavemente para preservar a integridade dos organoides e confirme visualmente a distribuição uniforme dos organoides entre os poços antes da adição das células T (Seção 2.3).
  4. Prepare o reagente de detecção de caspase-3.
    1. Use o substrato de caspase-3; concentração estoque: 200 µM para preparar uma solução de trabalho adicionando diretamente o substrato à suspensão de células T para atingir uma concentração final de 2 µM na suspensão de células T. Misture suavemente.
      NOTA: Proteja da luz em todos os momentos.
  5. Opcional: Estudos de triagem de fármacos ou modulação imunológica
    ​NOTA: Este ensaio pode ser adaptado para avaliar inibidores de moléculas pequenas (por exemplo, inibidores de quinases, moduladores metabólicos), inibidores de pontos de controle imunológico (por exemplo, anti-PD-1, anti-PD-L1) e terapias combinadas.
    1. Pré-incube os fármacos com os organoides por 24–72 h antes da dissociação da matriz e da adição de células T, ou adicione-os simultaneamente com as células T.
    2. Inclua controles apenas com veículo para cada condição.
    3. Se estiver testando inibidores de pontos de controle imunológico, confirme a expressão do alvo (por exemplo, PD-L1) nos organoides e PD-1 nas células T antes do ensaio.

4. Estabelecer o co-cultivo e os controles experimentais.

  1. Configuração do co-cultivo
    1. Retire a placa de imagem de 96 poços com organoides cultivados do incubador e transfira-a para a cabine de segurança biológica. Resuspenda suavemente a suspensão de linfócitos T preparada (Seção 3) imediatamente antes do cultivo para garantir distribuição homogênea (Figura 2A).
    2. Utilizando uma pipeta multicanal, adicione 100 µL da suspensão de linfócitos T (contendo o substrato de caspase a 2 µM) a cada poço que contenha 100 µL de organoides. Após a adição, bata suavemente na placa 2–3 vezes para assegurar distribuição uniforme das células.
      NOTA: Evite tocar o fundo do poço para prevenir a desorganização dos organoides. Não pipete para cima e para baixo dentro dos poços. Agitação excessiva compromete a integridade dos organoides e altera a cinética de infiltração dos linfócitos T.
    3. Transfira imediatamente a placa para um sistema de imagem de células vivas para minimizar flutuações de temperatura.
      ​NOTA: Concentrações finais no poço após mistura 1:1: combinar 100 µL de suspensão de organoides (em meio completo para organoides) com 100 µL de suspensão de linfócitos T (em meio básico para linfócitos T) reduz à metade a concentração de cada componente. As concentrações finais são: Suplemento B27 0,5X; Nicotinamida 5 mM; substituto da glutamina 0,5X; Penicilina/Estreptomicina 50 U/mL / 50 µg/mL; HEPES 5 mM; N-Acetilcisteína 0,625 mM; Primocin 50 µg/mL; FGF-Básico (FGF-2) 0,5 ng/mL; FGF-10 10 ng/mL; PGE2 0,5 µM; SB202190 5 µM; EGF 25 ng/mL; Y-27632 5 µM; A-83-01 250 nM; NRG1 5 ng/mL; Noggin e R-Spondina 5% v/v cada; FBS (do meio de linfócitos T) 5%; substrato de caspase-3 1 µM final no poço.
      1. Configure a aquisição cinética no software de imagem de células vivas selecionando Varredura programada para permitir imagens repetidas durante toda a duração do ensaio (Figura 3B), escolha o tipo de varredura Padrão para compatibilidade entre contraste de fase e fluorescência (Figura 3C) e especifique os canais de Fase, Verde e Vermelho em 10× com tempos de aquisição otimizados por canal (Figura 3D).
      2. Defina o tempo de aquisição (exposição) de fluorescência por canal em aproximadamente 300–400 ms para os canais Verde e Vermelho, e confirme que o objetivo de 10× está selecionado (calibração da imagem 1,24 µm/px em 10×).
        NOTA: O conjunto de dados representativo foi adquirido no sistema de análise de células vivas referenciado (ver a Tabela de Materiais). A análise de imagem foi realizada utilizando o Analisador Básico com uma Definição de Análise salva (nomeada red-green-overlap-Bladder).
      3. Defina que os poços adquiram quatro imagens por poço interno da placa de 96 poços, com varreduras repetidas a cada 2 h por até 36 h (Figura 3A,E).
      4. Inicie a análise de imagem criando uma nova Definição de Análise e habilitando os canais Fase, Verde e Vermelho (Figura 4A,B).
      5. Otimize os parâmetros de segmentação do canal vermelho, incluindo limites de área e filtros de exclusão de borda, para isolar objetos tumorais de detritos e duplos (Figura 4C).
      6. Para o canal Vermelho (tumor, CellTrace Far Red), defina o Tipo de Segmentação como Ajuste de Superfície com Limiar de 2,0 RCU; habilite Divisão de Borda com Sensibilidade de Borda = 0; defina Preenchimento de Buraco = 0 µm2 e Ajuste de Tamanho = 0 pixels; e aplique um filtro de Área mínima do objeto de 50 µm2 (sem filtro de área máxima, excentricidade ou intensidade).
      7. Para o canal Verde (NucView 488 caspase-3/7), crie a segmentação verde com o Tipo de Segmentação definido como Ajuste de Superfície e um Limiar de 2,0 GCU; habilite Divisão de Borda com Sensibilidade de Borda = 0; defina Preenchimento de Buraco = 0 µm2 e Ajuste de Tamanho = 0 pixels; e não aplique filtros de área ou intensidade.
      8. Defina a leitura de tumor apoptótico como objetos duplo-positivos Verde + Vermelho. Não aplique filtros adicionais de área ou intensidade à sobreposição. Valide os critérios de sobreposição com os poços controle de apoptose espontânea e de morte celular positiva, e então aplique a definição de análise uniformemente a todos os poços.
      9. Configure métricas de análise para ambos os canais para quantificar a proporção de objetos apoptóticos duplo-positivos em vermelho/verde; revise as sobreposições de segmentação para verificar a identificação precisa dos objetos tumorais (Figura 4D).
      10. Selecione os horários de varredura e os poços para cobrir todos os pontos temporais experimentais (Figura 4E), e confirme que as análises concluídas estejam acessíveis para revisão e exportação de dados em formato tabular ou gráfico (Figura 4F,G).
      11. Exporte os dados de análise por objeto e por poço (por ponto temporal) para quantificação posterior.

Resultados

Os cultivos de organoides tumorais utilizados para os resultados apresentados aqui foram estabelecidos e expandidos além da passagem 5 e armazenados em mais de 6 crioviis a 1 × 106 células por vial, com os cultivos sendo reexpandidos após descongelamento para cada ensaio. A identidade epitelial maligna e a ausência de supercrescimento epitelial normal ou estromal foram confirmadas por sequenciamento direcionado, que demonstrou a manutenção das mutações somáticas presentes no tumor original, e por inclusão histológica, que revelou morfologia de organoides concordante com a patologia do tumor original; todas as linhagens foram confirmadas como negativas para micoplasma antes do uso. Cultivos que exibiam morfologia epitelial normal ou que não mantinham as características moleculares do tumor original foram identificados e excluídos, minimizando assim a contaminação por células não tumorais no ensaio.

Todos os resultados apresentados (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5) foram gerados a partir de um único par de organoides e LIT combinados, derivados de um paciente com adenocarcinoma pulmonar. A amostra tumoral foi obtida a partir de uma ressecção cirúrgica realizada sem tratamento neoadjuvante prévio, e os organoides foram utilizados na passagem 21. Os organoides foram mantidos em cultura por aproximadamente 12 semanas, desde o isolamento inicial até o ensaio apresentado (passagem 21). A data da ressecção tumoral é considerada informação de saúde protegida e, portanto, não é informada.

Após a reexpansão, os PDTOs são recuperados, contados e semeados em placas de imagem de 96 poços. Os LITs são preparados em paralelo numa razão efetora-alvo de 2:1, com o substrato de caspase-3 NucView 488 adicionado imediatamente antes da montagem do cultivo em co-cultura (Figura 2A). Imagens representativas de um único poço num ponto temporal intermediário demonstram a saída esperada em quatro canais: o contraste de fase confirma a presença de organoides e células imunes (Figura 2B); a fluorescência verde identifica o sinal apoptótico ativado pela caspase-3 (Figura 2C); a fluorescência vermelha marca seletivamente os organoides tumorais marcados com CellTrace Far Red (Figura 2D); e a sobreposição mesclada revela estruturas tumorais duplo-positivas em vermelho/verde, a leitura principal do ensaio (Figura 2E). É esperado um sinal verde espontâneo mínimo dentro das estruturas positivas para vermelho na ausência de morte mediada por LITs. Para quantificação, os organoides duplo-positivos em vermelho/verde (apoptóticos) são expressos como porcentagem de PDTOs apoptóticos e plotados ao longo do tempo como média ± erro padrão da média (SEM), com sobreposições de segmentação confirmando a identificação precisa das estruturas tumorais (Figura 4D).

Em um experimento representativo testando seis moléculas pequenas a 1 µM, o Fármaco 4 e o Fármaco 5 apresentam apoptose elevada em relação ao veículo a partir de aproximadamente 24 h (Figura 5A; ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001); comparação dentro de um único experimento representativo. Os gráficos de violino no ponto final de 36 h fornecem uma visão complementar da distribuição de resposta entre as réplicas, mostrando que o Fármaco 4 e o Fármaco 5 produzem os maiores aumentos em PDTOs apoptóticos neste experimento representativo, enquanto o Fármaco 3 mostra uma resposta de morte nominalmente reduzida, consistente com possível atividade imunossupressora (Figura 5B).

Para confirmar que a apoptose medida reflete a morte mediada por linfócitos infiltrantes no tumor (TIL) e não a citotoxicidade direta do fármaco ou sinal derivado de células efetoras, um composto representativo (Drug 5) foi avaliado em três braços paralelos: co-cultura (TIL + organoide), apenas organoide (sem TIL) e apenas linfócitos T, ao longo de um período de 36 h (Figura 5C).

O braço de co-cultivo mostrou acúmulo progressivo e dependente do tempo de PDTOs apoptóticos, atingindo 19,2 ± 1,0% após 36 h (média ± erro padrão da média, n = 6 poços), enquanto o braço somente com organoides (sem TIL) permaneceu baixo durante todo o período, aumentando apenas para 4,0 ± 0,3% em 36 h (n = 3 poços), um sinal 4,8 vezes menor. O controle somente com linfócitos T manteve-se no nível basal ao longo de todo o curso temporal (0,0%; n = 3 poços), consistente com o fato de apenas os organoides tumorais estarem marcados fluorescentemente e confirmando que o sinal detectado não se origina das células efetoras. Em conjunto, esses braços isolam a morte apoptótica líquida dependente de TILs acima da linha de base do tumor isolado. Como o braço somente com organoides foi avaliado na presença da droga, ele também serve como controle de droga mais tumor (sem TIL): com a droga presente, mas sem TILs, a apoptose permaneceu baixa (4,0 ± 0,3% em 36 h), indicando que o aumento da morte no braço correspondente de co-cultivo não pode ser explicado por citotoxicidade direta da droga sobre os organoides. Um braço pareado somente com a droga foi gerado apenas para a Droga 5; para os demais compostos, o aumento da apoptose é, portanto, descrito como um efeito combinado que ainda não pode ser atribuído especificamente ao aprimoramento imunológico, sendo identificado um controle específico por composto (somente droga) como etapa necessária de validação.

Todos os dados que apoiam as descobertas deste estudo estão disponíveis sem restrições. As séries de imagens em lapso de tempo brutas, arquivos exportados em nível de objeto, arquivos de definição de análise do Incucyte, configurações de parâmetros de segmentação, metadados e os dados estatísticos brutos que fundamentam a Figura 5 foram depositados em um repositório público e são livremente acessíveis sob uma licença aberta doi: 10.5281/zenodo.21676769. Os dados brutos em nível de objeto, mapas das placas, configurações de segmentação e o arquivo de definição de análise utilizados para gerar a Figura 5 estão fornecidos no Arquivo Suplementar 2.

Processo de reconstituição de organoides: diagrama mostra suspensão de células isoladas, coloração e plaqueamento em cúpulas de Matrigel.
Figura 1: Marcação fluorescente e reconstituição tridimensional de organoides tumorais derivados de pacientes. (A) Visão esquemática do fluxo de trabalho de preparação de PDTO: os organoides são dissociados do Matrigel, dissociados em uma suspensão de células isoladas, marcados com o corante CellTrace Far Red, re-suspensos em matriz de Matrigel e plaqueados como gotas tridimensionais para reexpansão durante 72 h antes do ensaio de co-cultura. (B) Fotografia representativa de pellets celulares marcados em tubos de 15 mL, demonstrando coloração visível indicativa de coloração bem-sucedida com CellTrace Far Red. (C) Imagem de contraste de fase mostrando uma gota de Matrigel contendo organoides tumorais reexpandidos após 72 h de cultivo. (D) Imagem de sobreposição de fluorescência mostrando organoides tumorais marcados em vermelho (CellTrace Far Red), confirmando a morfologia tridimensional intacta dos organoides e marcação fluorescente uniforme antes da montagem do ensaio de co-cultura. As imagens foram obtidas com aumento de 10×. Barras de escala = 800 µm (C) e 400 µm (D). Abreviação: PDTO = organoide tumoral derivado de paciente. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Diagrama do fluxo do ensaio de organoides com LIT; corante NucView 488; medição de apoptose; sistema Incucyte.
Figura 2. Fluxo do ensaio de co-cultivo e imagens representativas de fluorescência da eliminação de organoides tumorais mediada por LIT. (A) Esquema do fluxo completo do ensaio de co-cultivo, mostrando dois processos paralelos de preparação: (caminho superior) recuperação de organoides do Matrigel, contagem e semeadura em placas de imagem de 96 poços; (caminho inferior) expansão de LIT, ressuspendimento e adição com o substrato da caspase-3. Ambos os processos convergem no estabelecimento da co-cultura em uma placa de 96 poços inserida no sistema de imagem em tempo real para aquisição cinética e análise automatizada. Imagens representativas de um poço de co-cultura em um único ponto temporal: (B) contraste de fase, (C) canal de fluorescência verde mostrando o sinal do NucView 488 ativado pela caspase-3 em células apoptóticas, (D) canal de fluorescência vermelha mostrando organoides tumorais marcados com CellTrace Far Red e (E) sobreposição de fluorescência demonstrando estruturas tumorais duplo-positivas em vermelho/verde em processo de apoptose. As imagens foram adquiridas com aumento de 10×. Barra de escala = 400 µm. Abreviação: LIT = linfócito infiltrante de tumor. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Configuração de varredura automatizada; interface de configurações; aquisição de dados; análise de imagens; guia de software.
Figura 3. Configuração do instrumento para varredura e definição dos parâmetros de aquisição para imagem de células vivas. (A) Painel de agendamento do instrumento mostrando uma varredura ativa com mapa da placa e propriedades da varredura, incluindo tipo de recipiente, canais de imagem, objetiva, duração da varredura e cronograma de aquisição. (B) Diálogo Varredura Repetida ou Única? com a opção Varredura no Cronograma selecionada para habilitar a aquisição cinética longitudinal durante toda a duração do ensaio. (C) Painel de seleção do tipo de varredura com o modo Padrão escolhido, compatível com aplicações de análise baseadas em contraste de fase e fluorescência. (D) Painel de configurações de varredura especificando os canais de imagem (Fase, Verde, Vermelho), tempos de aquisição por canal e seleção da objetiva de 10×. (E) Painel de padrão de varredura mostrando a seleção de poços para os poços internos de uma placa de 96 poços configurada para quatro imagens por poço com duração estimada da varredura. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Fluxograma de software de análise de imagem; configuração de imagem de microscopia; varredura/integração de dados; diagrama educacional.
Figura 4. Configuração do instrumento de imagem em tempo real e fluxo de trabalho de análise de imagem utilizando software integrado. (A) Interface de inicialização da análise mostrando a seleção de Criar Nova Definição de Análise para iniciar um novo pipeline de análise. (B) Painel de seleção de canais de imagem com os canais Fase, Verde e Vermelho habilitados para aquisição de dupla fluorescência. (C) Interface de Definição de Análise exibindo os parâmetros de segmentação do canal vermelho, incluindo limiares mínimo e máximo de área, exclusão de bordas e filtros de detritos utilizados para identificar objetos tumorais. (D) Interface de Definição de Análise mostrando as métricas de análise configuradas para os canais verde e vermelho, com uma sobreposição representativa de segmentação confirmando a identificação precisa de estruturas tumorais apoptóticas duplo-positivas em vermelho/verde. (E) Interface de seleção de tempo de varredura e poços utilizada para agendar a aquisição repetida de imagens nos poços internos da placa de imagem de 96 poços. (F) Seleção da definição de análise concluída sob o arquivo de imagem. (G) Visualização resumida da análise concluída exibindo informações do vaso, tipo de análise, métricas disponíveis e opções de exportação de dados, incluindo gráfico de microplaca, gráfico e exportação tabular. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráfico de resposta a fármacos na apoptose: análise de curso temporal, gráfico de violino, teste de fármacos em organoides, eficácia do tratamento.
Figura 5. Análise representativa dos efeitos de fármacos de pequenas moléculas no processo de eliminação de organoides tumorais mediado por LIT. (A) Curvas cinéticas de eliminação mostrando a porcentagem de PDOTs apoptóticos ao longo do tempo, comparadas entre múltiplas condições de tratamento com pequenas moléculas e controle com veículo, apresentadas como média ± erro padrão da média (SEM). (B) Gráficos de violino ilustrando a análise pontual em 36 horas como uma abordagem gráfica alternativa para visualizar a distribuição das respostas apoptóticas entre as condições de tratamento, permitindo comparação descritiva entre culturas em co-cultivo tratadas com fármaco e controles com veículo neste experimento representativo. (C) Controles de dependência de LIT para um composto representativo (Fármaco 5): porcentagem de PDOTs apoptóticos ao longo de um período de 36 h nas condições de co-cultivo (LIT + organoide), apenas organoide (sem LIT) e apenas linfócitos T, confirmando que o sinal apoptótico é dependente de LIT e não decorre das células efetoras (co-cultivo n = 6 poços; apenas organoide e apenas linfócito T n = 3 poços; média ± SEM). Abreviações: PDOT = organoide tumoral derivado de paciente; LIT = linfócito infiltrante tumoral; SEM = erro padrão da média. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Preparação de meios e tampões. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2. Dados brutos e arquivos de análise para a Figura 5. Esta pasta ZIP contém os dados brutos em nível de objeto, mapas de placa, configurações de segmentação e o arquivo de definição de análise utilizados para gerar as análises do Figura 5 de triagem de compostos e controles do Medicamento 5. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este protocolo descreve um método de imagemagem em tempo real baseada em imagem para avaliar interações citotóxicas entre organoides tumorais derivados de pacientes (PDTOs) e linfócitos infiltrantes no tumor (TILs) pareados. Ao integrar a arquitetura tridimensional do tumor, efetores imunológicos autólogos e medidas em tempo real da ativação da caspase-3, este sistema permite a avaliação dinâmica da apoptose de células tumorais em condições fisiologicamente relevantes. O fluxo de trabalho combina métodos estabelecidos de expansão de organoides e TILs com condições de cocultivo controladas e quantificação automatizada baseada em imagem, fornecendo uma abordagem baseada em imagem para estudos funcionais imunológicos. Como as etapas iniciais de isolamento e expansão de PDTOs e TILs são realizadas de acordo com protocolos previamente publicados e não descritos integralmente aqui, a reprodução completa deste fluxo de trabalho exige a consulta dessas referências originais além deste protocolo.

Uma característica fundamental dessa abordagem é a preservação da heterogeneidade intrínseca ao tumor dentro dos organoides. Diferentemente dos sistemas de monocamada bidimensionais, os organoides mantêm a estrutura tridimensional e as interações entre células tumorais. Quando cultivados em co-cultura com LITs correspondentes, isso permite a avaliação da infiltração de linfócitos T, da morte celular dependente de contato e das respostas cinéticas ao longo do tempo. O uso de um substrato fluorescente ativado pela caspase-3 permite a medição direta da apoptose, em vez de depender de marcadores indiretos, como a perda de confluência ou ensaios de viabilidade em ponto final baseados em ATP.

Vários parâmetros críticos determinam o sucesso do experimento. A integridade dos organoides no momento da semeadura é essencial; a superdigestão durante a dissociação inicial do tumor ou a disruptura mecânica excessiva durante a montagem do co-cultivo pode fragmentar os organoides, aumentando artificialmente a contagem de objetos vermelhos e alterando os cálculos de apoptose. Uma distribuição consistente do tamanho dos organoides melhora a precisão da segmentação e reduz a variabilidade entre poços. A manutenção precisa das razões efetoras por alvo (E:T) também deve ser mantida entre as réplicas, pois contagens imprecisas de linfócitos T ou agregação introduzem variabilidade na cinética de morte celular. A ressuspensão suave imediatamente antes da semeadura minimiza esse problema. Apenas uma única razão E:T (2:1) foi avaliada no conjunto de dados representativo mostrado, em conformidade com o parâmetro operacional padrão estabelecido no protocolo do nosso laboratório. Razões E:T mais altas geralmente são esperadas para aumentar a morte tumoral com base na literatura estabelecida sobre citotoxicidade de linfócitos T, e a titulação formal desse parâmetro permanece como uma direção para a validação futura dessa plataforma. A seleção e validação dos parâmetros de segmentação representam outro passo crucial. Os limiares para tamanho mínimo e máximo dos objetos devem excluir detritos, ao mesmo tempo que capturam estruturas tumorais intactas; limiares excessivamente permissivos inflacionam a contagem tumoral, enquanto limiares excessivamente restritivos subestimam a carga tumoral. Os critérios de sobreposição entre os sinais vermelho e verde devem ser validados utilizando tanto controles de apoptose espontânea quanto controles positivos de morte celular, e devem ser aplicados de forma consistente em todos os poços para evitar viés nos cálculos percentuais de apoptose.

A inclusão de controles apropriados fortalece a interpretabilidade. Poços contendo apenas tumor estabelecem a estabilidade da fluorescência vermelha de base, enquanto os controles de tumor mais substrato quantificam a apoptose espontânea independente da atividade imunológica. Os controles contendo apenas linfócitos T determinam o sinal de fundo de caspase proveniente da morte de linfócitos. Os controles positivos de apoptose confirmam a funcionalidade do substrato e validam os limiares de segmentação. Esses controles são particularmente importantes ao comparar pares independentes de tumor-TIL, uma vez que as taxas basais de apoptose podem variar entre linhagens de organoides.

Esta plataforma baseada em imagem oferece diversas vantagens em comparação com ensaios tradicionais de citotoxicidade, como a liberação de cromo ou medições de viabilidade baseadas em ATP no ponto final. O imageamento em tempo real permite o monitoramento contínuo e não destrutivo das interações entre tumor e sistema imunológico, possibilitando uma resolução cinética precisa da morte celular mediada pela resposta imune. Diferentemente dos ensaios em ponto final, que fornecem apenas uma única medição cumulativa e podem ocultar eventos citotóxicos transitórios ou sequenciais, o imageamento longitudinal distingue respostas citotóxicas precoces e rápidas de apoptose tardia ou progressiva. Essa resolução temporal permite a identificação de fases de latência associadas à ativação ou infiltração de linfócitos T, intervalos de pico de citotoxicidade e fases de platô que podem refletir exaustão dos linfócitos T ou resistência das células-alvo. Medições repetidas a partir do mesmo poço reduzem a variabilidade entre amostras e eliminam a necessidade de placas paralelas em múltiplos pontos de tempo. Como a carga tumoral e a conversão apoptótica são quantificadas simultaneamente em cada intervalo, é possível realizar uma normalização dinâmica, melhorando a precisão em comparação com ensaios de lise em massa que não conseguem discriminar a morte celular induzida pela resposta imune da morte celular espontânea. Em conjunto, essa abordagem fornece uma avaliação fisiologicamente mais informativa e mecanisticamente mais interpretável da função citotóxica do que os ensaios tradicionais realizados em um único ponto de tempo.

No entanto, várias limitações devem ser consideradas. Embora os organoides derivados de tumores de pacientes recapitulem a arquitetura tumoral nativa mais fielmente do que as culturas convencionais bidimensionais, eles não modelam completamente os componentes estromais, vasculares ou mieloides do microambiente tumoral. Além disso, a aquisição de imagens em 10× oferece produtividade suficiente para análises longitudinais, mas pode não resolver interações entre células individuais dentro de organoides densamente empacotados. A aquisição de imagens com maior aumento pode melhorar a resolução espacial, mas reduz o campo de visão e a produtividade do ensaio. Este ensaio quantifica especificamente a morte apoptótica dependente da caspase-3 em células tumorais. A citotoxicidade mediada por linfócitos T que ocorre por mecanismos independentes de caspase, incluindo necrose ou necroptose, não é detectada por esta leitura e, portanto, deve ser interpretada dentro do escopo do ensaio. Além disso, a dissociação em células únicas, marcação e reexpansão por 72 h poderiam, em princípio, selecionar subpopulações; as estruturas de 100–300 µm que se reorganizam nesse período retêm, contudo, a arquitetura tridimensional multicelular dos organoides parentais, e nenhuma alteração morfológica evidente foi observada em relação às culturas parentais, embora uma comparação formal da composição clonal antes e após a reexpansão não tenha sido realizada. O presente estudo não inclui um controle positivo farmacológico de referência, como um inibidor de checkpoint imunológico (por exemplo, anti-PD-1) em um par organoide–LIT PD-L1⁺/PD-1⁺, com o aumento esperado da citotoxicidade, para calibrar formalmente a faixa dinâmica do ensaio; a inclusão de um agente imunopotenciador de referência desse tipo é um passo essencial de validação futura, e os resultados comparativos de compostos relatados aqui devem ser interpretados de acordo. Um controle com fármaco isolado (sem LIT) foi realizado apenas para o Fármaco 5 nestes exemplos; o aumento relativo na morte celular não pode ser atribuído aos outros compostos, que não possuem um controle individual com fármaco isolado. Uma validação ortogonal, na mesma amostra, desta leitura baseada em imagens frente a uma medida independente de padrão-ouro de morte celular, como coloração com Anexina V por citometria de fluxo ou confirmação por confocal em nível de célula única, não foi realizada aqui e é considerada um passo fundamental seguinte para consolidar ainda mais a especificidade da leitura dupla positiva em vermelho/verde17.

Uma consideração adicional é que a fluorescência do CellTrace Far Red é progressivamente diluída a cada divisão celular tumoral. Consequentemente, a proliferação durante o período de recuperação de 72 h dos organoides e a janela subsequente de imagem podem reduzir a intensidade da fluorescência em pontos temporais posteriores, potencialmente diminuindo o número de objetos tumorais detectáveis positivos para CellTrace e aumentando moderadamente a porcentagem calculada de apoptose devido a um denominador reduzido. Para monitorar essa possível variável de confusão, o número de objetos positivos para CellTrace Far Red foi acompanhado longitudinalmente ao longo do período de imagem, e as poças foram avaliadas quanto a declínios substanciais no sinal positivo para vermelho, independentemente da ativação da caspase-3/7 associada à apoptose. Não foi observada perda significativa e inexplicada de objetos positivos para CellTrace durante a janela de imagem, sugerindo que a diluição do corante dificilmente foi um fator importante nas alterações observadas nas medidas de apoptose. No entanto, essa limitação permanece inerente ao rastreamento de células tumorais baseado na diluição de fluorescência e deve ser considerada ao interpretar medidas em pontos temporais mais tardios.

A variabilidade biológica entre amostras derivadas de pacientes representa tanto uma vantagem quanto um desafio para esta plataforma de ensaio. Embora essa variabilidade reflita a heterogeneidade tumoral clinicamente relevante, um delineamento experimental adequado deve levar em conta a variação biológica ao definir o tamanho do estudo e os requisitos de replicação. Cada par distinto de tumor–LIT deve ser considerado uma réplica biológica independente, enquanto réplicas técnicas são utilizadas para avaliar a variabilidade do ensaio dentro da amostra. O conjunto de dados representativo mostrado na Figura 5 corresponde a um único par de organoide–LIT analisado em triplicata técnica; portanto, a ANOVA de medidas repetidas a dois fatores apresentada descreve a variabilidade do ensaio dentro dessa amostra individual e não deve ser interpretada como uma avaliação da variabilidade biológica entre pacientes. O número de pares de organoide–LIT independentes necessários para cada estudo deve ser determinado por meio de cálculos prospectivos de poder estatístico, com base no tamanho do efeito esperado, na variabilidade biológica e nos objetivos experimentais. Réplicas técnicas devem ser incluídas para quantificar a precisão do ensaio, mas não devem ser consideradas substitutas de réplicas biológicas independentes.

Modificações futuras deste protocolo podem incorporar bloqueio de checkpoints imunológicos, modulação de citocinas, inibidores de molécula pequena ou perturbações genéticas para dissecar os mecanismos que regulam a citotoxicidade mediada por linfócitos T. A integração com transcritômica de única célula ou imagem espacial poderia aumentar ainda mais o entendimento mecanicista. Além disso, a adaptação para formatos de alto rendimento em placas de 384 poços pode permitir aplicações em triagem de fármacos. Esta plataforma também é facilmente adaptável para avaliar terapias com linfócitos T expressando receptores de antígeno quiméricos (CAR-T) em substituição aos TILs policlonais, exigindo apenas a confirmação da expressão do antígeno-alvo nos PDTOs antes da co-cultura e a inclusão apropriada de controles de organoides negativos para o antígeno, a fim de confirmar a especificidade direcionada18,19,20.

Em resumo, este protocolo fornece um método quantitativo baseado em imagens para medir em tempo real a citotoxicidade mediada por LIT contra organoides tumorais autólogos. A atenção cuidadosa à integridade dos organoides, proporções constantes de células efetoras, limiares de segmentação validados e controles apropriados garante uma quantificação confiável. Este sistema é amplamente aplicável a estudos de imunologia tumoral, modulação de pontos de controle imunológico, otimização da terapia celular adotiva e perfilhamento imunológico funcional personalizado.

Divulgações

B.D.H. é cofundador e consultor da Faeth Therapeutics. O.E. possui participação acionária na Volastra Therapeutics e na Owkin, mas isso não tem relação com este projeto. Nem a Faeth Therapeutics, nem a Volastra Therapeutics, nem a Owkin forneceram financiamento, materiais, equipamentos, software, propriedade intelectual ou contribuição para o desenho do estudo neste trabalho. Os demais autores declaram não haver conflitos de interesses.

DECLARAÇÃO DE USO DE IA:
Durante a elaboração deste trabalho, o(s) autor(es) utilizou(ram) o Claude para edição de linguagem. Após utilizar essa ferramenta/serviço, o(s) autor(es) revisou(ram) e editou(ou) o conteúdo conforme necessário e assume(m) total responsabilidade pelo conteúdo do artigo publicado.

Agradecimentos

Agradecemos sinceramente ao Instituto Englander de Medicina de Precisão da Weill Cornell Medicine pelo apoio generoso e pelo acesso aos recursos institucionais. Este trabalho também foi apoiado pelo Programa de Doações MERIT / The Medical Excellence Foundation, Inc. (prêmio nº 61500857), concedido a Olivier Elemento e Benjamin D. Hopkins. O financiador não teve papel no desenho do estudo, na coleta de dados, na análise ou na preparação do manuscrito. As linhagens produtoras de HEK293T que secretam Noggin e R-Spondina foram um presente gentil do laboratório de Yu Chen (Centro de Câncer Memorial Sloan Kettering) e foram geradas conforme descrito anteriormente21.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos Cônicos de 15 mLCorning430791Coleta de células e centrifugação
Placas de 6 Poços sem Tratamento para Cultura de TecidosGreiner Bio-One657185Plaqueamento e expansão de organoides tridimensionais
A-83-01 (inibidor de TGF-beta)Tocris Bioscience2939Meio Completo para Organoides
DMEM/F12 AvançadoThermo Fisher Scientific12634010Componente do meio
Suplemento B27 (50X), livre de soroThermo Fisher Scientific17504044Meio Completo para Organoides
Microplaca Óptica de Fundo Preto, 96 Poços, superfície preta, com superfície TCNunc165305Placa para imagem em tempo real em células vivas para ensaio de morte celular
Solução de Recuperação de CélulasCorning354253Dissolução a frio da Matrigel mantendo a estrutura tridimensional do organoide
Kit de Proliferação Celular CellTrace Far RedThermo Fisher ScientificC34564Marcação fluorescente de células tumorais (canal vermelho)
Cabinet de Biossegurança Classe IIThermo Fisher Scientific1375 (1300 Series A2, 4 ft)Manuseio asséptico sob BSL-2
Incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2, umidificada)Thermo Fisher Scientific51030400 (Heracell VIOS 160i)Expansão de organoides e incubação em co-cultura
Contador Automatizado de Células Countess 3Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)AMQAX2000Contagem automatizada de células e viabilidade (usado com lâminas Countess, C10312)
Lâminas para Contagem Countess (ou hemocitômetro)Thermo Fisher ScientificC10312Contagem automatizada de células
Dissulfóxido de Dimetila (DMSO), estérilSigma-AldrichD2650Reconstituição do corante CellTrace Far Red
Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (PBS), 1X, sem Ca2+/Mg2+Corning21-040-CVRRessuspendimento celular para contagem e marcação com corante
Soro Bovino Fetal (FBS), inativado pelo calorThermo Fisher Scientific16140071Componente do meio
Suplemento GlutaMAX-I (100X)Thermo Fisher Scientific35050061Componente do meio
GraphPad Prism (v10.6.1)GraphPad Software / DotmaticsVersion 10.6.1Análise estatística (ANOVA de duas vias com medidas repetidas) e geração de gráficos
Linhas Celulares Produtoras HEK293T (secretoras de Noggin e R-Spondin)Yu Chen Lab, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC)Doação (ver Gao et al., Cell 2014)Produção de meio condicionado (Seção 0.2); doação gentil do laboratório Yu Chen (MSKCC); geradas conforme descrito em Gao et al., Cell 2014, DOI: 10.1016/j.cell.2014.08.016
HEPES (solução 1 M)Thermo Fisher Scientific15630080Componente do meio
FGF-10 Recombinante HumanoThermo Fisher ScientificPHG0204Meio Completo para Organoides
FGF-Básico Recombinante Humano (FGF-2)Thermo Fisher ScientificPHG0261Meio Completo para Organoides
Software Base Incucyte (v2024B)SartoriusIntegrated software v2024BProgramação de aquisição de imagens e segmentação/análise automatizadas
Sistema de Análise de Células Vivas Incucyte S3Sartorius4647Instrumento de imagem em tempo real em células vivas (37 °C, 5% CO2); aquisição em contraste de fase e dupla fluorescência
Microscópio Invertido de Contraste de Fase / FluorescênciaNikonEclipse Ts2-FLControle de qualidade de organoides e confirmação visual da segmentação
Congelador de Laboratório (−20 °C / −80 °C)Thermo Fisher ScientificTSX40086A (TSX Series −86 °C)Armazenamento de alíquotas de fatores de crescimento e meio condicionado
Rocker de Laboratório / Plataforma Oscilante (compatível com 4 °C)Benchmark ScientificB3D2300 (BenchRocker 3D)Dissolução da matriz em Solução de Recuperação de Células a frio (Seção 2.1)
Matriz da Membrana Basal Matrigel, com Redução de Fatores de CrescimentoCorning356231Matriz tridimensional para inclusão e expansão de organoides
EGF Recombinante MurinoPeproTech315-09Meio Completo para Organoides
N-AcetilcisteínaSigma-AldrichA9165Meio Completo para Organoides
NicotinamidaSigma-AldrichN0636Meio Completo para Organoides
Noggin (meio condicionado ou recombinante)Alíquota preparada no laboratório—Meio Completo para Organoides
NRG1 (Neuregulina-1 / Heregulina)R&D Systems396-HBMeio Completo para Organoides
Substrato NucView 488 para Caspase-3 (estoque de 200 µM)Biotium30029Detecção em tempo real da ativação da caspase-3 (leitura de apoptose, canal verde)
Solução de Penicilina-Estreptomicina (100X)Thermo Fisher Scientific15140122Componente do meio
PGE2 (Prostaglandina E2)Sigma-AldrichP0409Meio Completo para Organoides
PrimocinInvivoGenant-pm-1Meio Completo para Organoides
Centrífuga Refrigerada (com rotor de balde oscilante, 300 × g, 4 °C)Eppendorf022628187 (Centrifuge 5810 R, rotor A-4-62)Etapas de centrifugação para dissociação e lavagem
Meio RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875093Meio base para ressuspendimento de linfócitos T
R-Spondin (meio condicionado ou recombinante)Alíquota preparada no laboratório—Meio Completo para Organoides
SB202190 (inibidor de p38 MAPK)Sigma-AldrichS7076Meio Completo para Organoides
StaurosporinaSigma-AldrichS4400Controle positivo de morte celular; agente pró-apoptótico para confirmar a funcionalidade do substrato de caspase
Sistema de Filtração a Vácuo Esteril Stericup (0,22 µm)MilliporeSigma (Merck)S2GPU05REFiltração/produção de meios condicionados de Noggin e R-Spondin (Seção 0.2)
Escavador Celular EsterilCorning3008Disrupção mecânica de cúpulas de Matrigel
Solução de Azul de Tripano, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061Avaliação de viabilidade por exclusão de corante
Enzima TrypLE Express (1X)Thermo Fisher Scientific12604021Dissociação enzimática da Matrigel e organoides
Banho-Maria (37 °C)Thermo Fisher ScientificTSGP05 (Precision GP 05)Dissociação enzimática e aquecimento de meios
Y-27632 (Inibidor de ROCK)Sigma-AldrichY0503Meio Completo para Organoides

Referências

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