Imagem por Espectrometria de Massa de Célula Única usando Ionização por Eletrospray por Dessorção Acoplada a Espectrômetros de Massa Orbitrap

Resumo

Este protocolo descreve a imagem por espectrometria de massa de célula única de células OVCAR-8 usando ionização por eletrospray por dessorção acoplada a espectrômetros de massa Orbitrap para análise metabolômica de alta resolução espacial.

Resumo

Imagem-espectrometria de massa por ionização por eletrospray por dessorção (DESI–MSI) permite imagens moleculares ambientes, sem matrizes, com preparação mínima da amostra. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho para MSI de célula única de células OVCAR-8 usando DESI acoplado a espectrômetros de massa Orbitrap. O sistema integra um pulverizador DESI, uma interface modificada de espectrômetro de massa, um estágio XYZ motorizado e uma placa de teste óptica para imagens de alta resolução espacial. As células são cultivadas em lâminas de vidro gradeadas, lavadas com solução de formiato de amônio para reduzir a interferência do sal, secas e analisadas em condições ambientes. O solvente é administrado continuamente usando um sistema de cromatografia nanolíquida, e a nebulização do gás nitrogênio é regulada para manter a estabilidade do spray. O protocolo também descreve imagens rasterizadas, controle de pixels e registro de imagens de espectrometria óptica para massa para localização de célula única. Alta resolução de massa e precisão de massa fornecidas pela detecção Orbitrap permitem a diferenciação de espécies moleculares intimamente relacionadas e apoiam a análise metabolômica de célula única. Esse protocolo oferece uma estratégia adaptável para implementar MSI de célula única de alta resolução espacial usando múltiplas plataformas de espectrômetro de massa Orbitrap.

Introdução

A metabolômica busca caracterizar de forma abrangente metabólitos de pequenas moléculas que refletem o estado funcional dos sistemas^biológicos 1,2,3,4,5. Como os metabólitos são produtos diretos da atividade enzimática, eles fornecem uma leitura dinâmica do fenótipo celular e da regulação bioquímica. No entanto, fluxos de trabalho metabolômicos convencionais normalmente dependem de métodos de extração em massa que fazem a média dos sinais entre milhares e milhões de células, obscurecendo assim a heterogeneidade celular ^6,7,8.

A metabolômica de célula única aborda essa limitação ao permitir o perfilamento molecular no nível das células individuais, revelando diversidade metabólica dentro de populações complexas e melhorando a compreensão mecanicista da progressão da doença, resposta a fármacos e diferenciação celular. A espectrometria de massa (EM) é uma ferramenta indispensável para a análise molecular de amostras biológicas. Avanços recentes nas técnicas de EM, incluindo preparação de amostras, instrumentação e análise de dados, permitem que estudos metabolômicos de EM sejam realizados no nível de célula^única 9,10,11,12.

A imagem MS (MSI), que permite a análise molecular espacialmente resolvida de amostras biológicas, integra movimento preciso da amostra, amostragem minimizada, ionização eficiente e visualização de dados ao adquirir um espectro de massa completo em cada coordenada espacial definida em uma superfície^{amostral 12, 13 e 14}. Imagens da MS são reconstruídas ao plotar a intensidade dos valores selecionados da razão massa-carga (m/z) entre coordenadas x–y, preservando assim informações espaciais químicas dentro de sistemas biológicos^complexos 12,13,15,16,17,18. Alcançar metabolômica de célula única espacialmente resolvida requer plataformas analíticas capazes de preservar a localização molecular enquanto mantêm sensibilidade e resolução de massa suficientes para detectar espécies^de baixa abundância 9,12,19,20.

A MSI de célula única apresenta desafios adicionais porque células individuais normalmente variam de 5 a 20 μm de^{diâmetro 8,21}. Nessa escala espacial, a abundância de analitos por evento de amostragem é extremamente limitada. Portanto, múltiplos fatores, incluindo controle preciso do movimento da amostra, amostragem minimizada, alta eficiência de ionização e transmissão eficiente de íons, são igualmente essenciais para obter informações moleculares interpretáveis de células^{individuais 14,22}. A dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI)–MSI, uma técnica baseada em vácuo rotineiramente usada para estudos MSI de alta resolução espacial, requer deposição matricial e operação a vácuo; no entanto, a cristalização matricial no MALDI pode introduzir deslocalização e variabilidade do analito na escala de célula^única 23,24,25,26,27. Em contraste, as abordagens MSI ambientais operam sob condições ambientes, e as amostras mantêm estados químicos próximos dos nativos porque é necessária pouca ou nenhuma preparação da amostra. Entre os métodos de MSI ambiente,^{DESI 28}, nano-DESI²¹, nano-DESI²⁹ assistido pneumaticamente e sonda única ^{8,30,31,32,33,34,35}, já foram usados anteriormente em estudos MSI de célula única. Embora técnicas baseadas em extração microlíquida, incluindo nano-DESI, nano-DESI assistida pneumaticamente e sonda única, proporcionem alta eficiência de amostragem e ionização, elas dependem da manutenção de uma ponte líquida estável na ponta da sonda de amostragem, enquanto perturbações da ponte líquida, como mudanças na morfologia da superfície ou obstrução da sonda, podem afetar a qualidade dos experimentos^{MSI 5,8, 21, 30, 35}.

DESI é uma técnica de ionização ambiente na qual gotículas de solvente carregado impactam uma superfície, extraem analitos e geram gotículas secundárias contendo a espécie^{ionizada 36}. O DESI oferece amostragem sem contato, sem entupimentos, com compatibilidade para fluxos de trabalho de imagem baseados em raster, tornando-o bem adequado para mapeamento molecular multi-íon de alta resolução de células individuais identificadas opticamente quando acopladas a plataformas Orbitrap de alta resolução 20,37,38,39,40. O DESI é amplamente utilizado para imagem de tecidos, mas raramente foi aplicado a MSI unicelulares, principalmente devido a desafios^{técnicos 20,28}. Estudos recentes realizados com um sistema comercial consistindo em um Waters DESI XS acoplado a um espectrômetro de massa IMS cíclico SÉRIE SELECT demonstraram que a resolução de célula única pode ser alcançada para múltiplas linhas celulares. Alcançar alta resolução espacial em DESI–MSI requer controle coordenado da eficiência de ionização, transmissão de íons, taxa de aquisição e alinhamento do^{pulverizador 12, 20, 28}. Em particular, avanços no design de novas gerações de pulverizadores DESI, incluindo DESI XS e ionização de foco por dessorção por fluxo eletro-fluido (DEFFI), reduziram significativamente a área de^{amostragem em 41,42}. Além disso, reduzir as taxas de fluxo de solventes, como as vazões de nanolitros por minuto fornecidas por bombas de cromatografia nanolíquida (LC), pode melhorar substancialmente o confinamento espacial para alcançar a delimitação molecular de célula^{única 28}. Embora essa abordagem tenha alcançado resolução de célula única MSI, ela depende de instrumentação de um fornecedor específico (Waters). A implementação mais ampla do DESI–MSI de célula única, portanto, exige estratégias que possam ser integradas a espectrômetros de massa de alta resolução amplamente disponíveis, como os sistemas Orbitrap, para fornecer alta sensibilidade, precisão de massa e poder de resolução. Combinar DESI com espectrômetros de massa Orbitrap oferece novas oportunidades em estudos de MSI unicelular, incluindo a diferenciação de espécies próximas e isobáricas em extratos celulares^complexos 20,43,44.

Este protocolo descreve uma estratégia modular para integrar um pulverizador Waters DESI XS com espectrômetros de massa Orbitrap para estudos MSI de célula única. O fluxo de trabalho integra coverslips em grade para fixação de células e correlação óptica, um estágio XYZ motorizado para varredura raster controlada, entrega de solventes em nanoescala para formação estável de spray e detecção Orbitrap de alta resolução. Embora um espectrômetro de massa Thermo Orbitrap Tribrid Lumos tenha sido selecionado como plataforma, muitos outros modelos de espectrômetro de massa Orbitrap equipados com geometrias de interface fonte compatíveis podem potencialmente ser acoplados a configurações DESI XS personalizadas semelhantes após adaptação mecânica e otimização adequadas.

Protocolo

As células OVCAR-8 foram obtidas da Coleção de Cultura Americana de Tipo (ATCC). Todos os procedimentos de cultura celular foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança. As células eram rotineiramente testadas para contaminação por micoplasma usando um kit de detecção de micoplasmas, conforme as instruções do fabricante.

NOTA: Realize todos os procedimentos de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança. Use equipamentos de proteção individual adequados. Manuseie solventes orgânicos em uma exaustão química.

1. Cultivar e preparar células OVCAR-8 em capas gradeadas

1. Prepare o meio completo suplementando o meio RPMI-1640 com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina–estreptomicina. Aqueça o médio a 37°C.
2. Mantenha as células OVCAR-8 em placas de cultura celular de 10 cm contendo 10 mL de meio completo. Incube as células a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% de_CO2.
3. Passagem das células quando aproximadamente 80% da superfície da cultura está visualmente ocupada por células aderentes, tipicamente a cada 2 dias sob as condições descritas da cultura.
   1. Aspire o meio do recipiente de cultivo de 10 cm e enxágue as células uma vez com 5 mL de soro salino tamponado com fosfato 1×.
   2. Adicione 2 mL de 0,25% de tripsina–ácido etilendiamina-tetraacético ao prato de cultura. Incube as células a 37°C por aproximadamente 3 minutos, ou até que a maioria das células se desprenda visivelmente da superfície da cultura ao examinar ao microscópio.
   3. Adicione 8 mL de meio completo pré-aquecido ao recipiente para neutralizar a tripsina. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, pipete suavemente a suspensão celular para cima e para baixo aproximadamente 15–20 vezes para dispersar as células.
   4. Transfira 1 mL da suspensão para 9 mL de meio completo e novo.
   5. Conte as células usando um contador automático. Carregue 10 μL da suspensão de células ressuspensas diretamente na lâmina de contagem sem diluição adicional e realize a contagem de células conforme as instruções do fabricante.
      NOTA: Corantes de viabilidade celular, como o azul de tripano, não foram usados neste protocolo. Avalie visualmente a condição celular monitorando a morfologia e a fixação celular antes da tripsinização.
4. Seme as células nas coberturas.
   1. Dilua as células até uma concentração final de ~1 × 10⁶ células/mL usando meio completo. Calcule o volume necessário de suspensão de células usando C₁V₁ = C₂V₂, onde C₁ é a concentração da célula contada, V₁ é o volume de suspensão da célula necessário, C₂ é a concentração alvo e V₂ é o volume final desejado.
   2. Coloque coberturas individuais de vidro gradeado de 28 mm com espaçamento de grade de 50 μm em poços de uma placa de 6 poços.
      NOTA: Autoclave as coberturas de vidro antes do uso para cultura celular. Coloque o lado da grade voltado para baixo para minimizar a interferência no crescimento celular.
   3. Adicione 2 mL de meio completo e 200 μL da suspensão da célula (~2 × 10^{células de 5} células/poço) a cada poço. Balance suavemente a placa de 6 poços em padrão de "X" para distribuir uniformemente as células pela superfície do revestimento.
   4. Incube as células por aproximadamente 15–20 horas para permitir a ligação celular.
      NOTA: Monitore rotineiramente a morfologia celular usando um microscópio para garantir o crescimento celular normal. Examine a possível contaminação por micoplasma usando um kit de detecção de micoplasma caso as células crescam mal.

2. Lavagem celular com solução de formiato de amônio (AF)

NOTA: Prepare uma solução nova para AF antes de cada uso.

1. Prepare o buffer de lavagem AF isotônica imediatamente antes do uso. Pesar 0,45 g de FA e dissolvê-lo em 50 mL de água de grau LC/MS para preparar uma concentração final de AF de 0,14 M (0,9% p/w). Não ajuste o pH ^5,45.
   NOTA: Use a solução de AF recém-preparada no mesmo dia de preparação. Mantenha a solução gelada (0°C–4°C) até o uso.
2. Aspire o meio de cultura de cada poço da placa de 6 poços. Adicione imediatamente 2 mL de solução de AF fria em cada poço.
3. Usando pinças estéreis, levante suavemente cada capa contendo células aderentes do poço, mantendo a superfície revestida de células voltada para cima. Coloque brevemente o revestimento por 2–3 segundos em um poço separado, pré-preenchido com 2 mL de solução fria de 0,9% de AF.
4. Repita o processo de enxágue por um total de dois enxágues usando solução fresca de AF para cada enxágue. Após o enxágue final, remova o revestimento da solução AF e deixe-o secar ao ar em temperatura ambiente em uma exaustão química por aproximadamente 20–30 minutos antes da análise DESI–MSI.
   NOTA: Enxágue as células suavemente para evitar perturbá-las durante a etapa de lavagem.

3. Fabricação de interface MS baseada em FAIMS modificada

1. Desmonte o adaptador da caixa da fonte de íons do FAIMS Pro para acessar a região interna do eletrodo. Confirme se o adaptador é compatível com espectrômetros de massa Thermo Orbitrap equipados com a configuração de interface FAIMS Pro.
2. Remova os componentes do eletrodo FIMS, incluindo os fios internos, conjuntos de eletrodos, anéis de O e estruturas internas de suporte. Mantenha a carcaça externa, as flanges de montagem e o pino de detecção de interface necessário para o reconhecimento do adaptador com espectrômetro de massas.
3. Modificar a abertura circular usando procedimentos padrão de usinagem em oficina. Amplie a abertura até que haja espaço suficiente ao redor do conjunto saliente de entrada/funil de íons Orbitrap.
4. Alise e desrebarba a borda usinada após o corte. Confirme que a abertura modificada permite posicionamento desobstruído do adaptador da carcaça no espectrômetro de massa.
5. Modifique o comprimento de duas pernas do adaptador da carcaça usando uma serra. Corte as pernas até um comprimento final de aproximadamente 2 1/4 pol para permitir a conexão com a placa de teste óptica.
   NOTA: Use ferramentas de usinagem adequadas e evite danificar a integridade estrutural do revestimento restante.
6. Prepare uma placa de teste óptica de alumínio (10 pol × 12 pol × furos roscados de 0,5 pol, 1/4"-20). Posicione a placa de ensaio horizontalmente abaixo do adaptador FAIMS modificado.
7. Use dois suportes de montagem para conectar o adaptador FAIMS modificado à placa de teste óptica. Corte os suportes conforme necessário para reduzir peso e permitir o posicionamento correto da placa de teste em relação à entrada Orbitrap.
8. Fixe a interface FAIMS modificada na placa de teste óptica usando um hardware de montagem mecanicamente compatível, alinhado com o padrão de furos com rosca de 1/4"-20 da placa de prove. Garantir uma posição estável durante os experimentos de imagem.
   NOTA: Certifique-se de que a interface esteja rigidamente fixa para minimizar a vibração durante o movimento do estágio e a aquisição de dados.
9. Usinar ou cortar um sulco raso na placa de teste óptica diretamente abaixo da região de contato do FAIMS que abriga. Tamanho e posicionamento do sulco para fornecer folga suficiente para assentos estáveis e alinhamento do alojamento modificado do FAIMS em relação à entrada Orbitrap.
   NOTA: Dimensione o sulco para acomodar a base do adaptador de carcaça FAIMS e melhorar a reprodutibilidade posicional.
10. Alinhe a interface montada com a entrada do espectrômetro de massas. Confirme que as flanges de montagem mantidas assentam corretamente no instrumento e que a placa de teste óptica permanece nivelada abaixo da interface.
11. Verifique se a abertura circular modificada oferece folga desobstruída ao redor da entrada Orbitrap/conjunto do funil de íons antes de instalar o pulverizador DESI.

4. Montar o pulverizador DESI e a interface Orbitrap

1. Monte o pulverizador DESI no sistema integrado que consiste na estrutura FAIMS personalizada, estágio motorizado XYZ, regulador de gás e placa de teste óptica. Use um estágio motorizado controlado por um controlador CONEX-MFACC.
2. Defina o eixo x como a direção de varredura raster da esquerda para a direita e defina o eixo y como a direção do passo de linha de cima para baixo. Defina a posição do eixo z antes da aquisição e mantenha-a fixa durante a imagem.
3. Use um intervalo de curso de estágio de aproximadamente 1 mm na direção x e 1 mm na direção y. Não aplique movimento no eixo z durante a aquisição.
4. Posicione o pulverizador DESI em um ângulo de aproximadamente 70° em relação à superfície da amostra. Coloque a amostra diretamente abaixo do pulverizador e posicione a ponta do pulverizador o mais próximo possível da entrada do Orbitrap, sem contato físico.
5. Conecte o metal de aterramento DESI a uma fonte terrestre sob o espectrômetro de massa. Controle o movimento raster usando o software de controle de palco (Figura 1).
   NOTA: O pulverizador DESI usado neste estudo está disponível apenas para usuários com instrumentos DESI–MSI.
6. Use um controlador de estágio motorizado XYZ para movimento e posicionamento do palco. Conecte a linha de tensão, linha de gás nitrogênio, linha de solvente e linha de aterramento antes da operação.
7. Instale um tubo de transferência de íons em aço inoxidável fabricado sob medida (1/16 pol de dia-divisão × 0,033 pol de dia-divisão), projetado para combinar com a entrada da fonte de íons Orbitrap. Posicione o tubo de transferência de íons de modo que ele se alinhe diretamente com a entrada do Orbitrap, estendendo-se o suficiente para fora para permitir acesso desobstruído à pluma DESI.
   NOTA: Personalize o tubo de transferência de íons de acordo com a configuração do espectrômetro de massas. Fabrice o tubo de transferência de íons usando procedimentos de usinagem apropriados.
8. Use um tubo de transferência de íons com geometria curvada para melhorar o posicionamento do pulverizador DESI em relação à superfície da amostra e à entrada Orbitrap.
9. Alinhe o pulverizador em um ângulo de aproximadamente 70° em relação à superfície da amostra para que a pluma de pulverização DESI intersecte a região de entrada do Orbitrap sem entrar em contato com a superfície da amostra.
10. Defina uma pluma de spray estável pela presença de espectros de massa estáveis e valores consistentes de nível normalizado (NL) durante a aquisição. Ajuste a posição do pulverizador até que um sinal de íon seja observado.
11. Defina a distância entre pulverizador e superfície para aproximadamente 1,0–1,5 mm como condição inicial. Ajuste manualmente a posição do pulverizador enquanto monitora os valores de NL para alcançar o sinal de íons mais estável.

Figura 1. Configuração integrada de ionização por eletrospray por dessorção (DESI) – imagem por espectrometria de massas (MSI) acoplada a um espectrômetro de massa Orbitrap. O pulverizador DESI é montado em uma plataforma integrada composta por um adaptador modificado para espectrometria de mobilidade de íons assimétricos de alto campo (FAIMS ), um estágio XYZ motorizado, um regulador de gás e uma placa de teste óptica. O solvente é administrado usando um sistema de cromatografia nanolíquida, e gás nitrogênio é fornecido a aproximadamente 12 psi para estabilização por pulverização. A figura também mostra a conexão da tensão de ionização, a linha do solvente e o posicionamento do pulverizador em relação à entrada Orbitrap. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

5. Configurar as condições de entrega de solventes e pulverização

1. Prepare solvente em spray fresco composto por metanol/água/ácido fórmico (98:2:0.1, v/v/v) antes da análise DESI–MSI.
   NOTA: Outros sistemas de solventes compatíveis com DESI, incluindo solventes à base de acetonitrilo e diferentes proporções metanol/água, podem ser usados após a otimização. Metanol/água/ácido fórmico (98:2:0.1, v/v/v) foi usado como condição inicial padrão neste protocolo porque proporcionava formação estável de plumas, redução da dispersão do solvente e sinais lipídicos reprodutíveis em modo iônico positivo durante experimentos DESI–MSI de célula única.
   ATENÇÃO: O metanol é inflamável e tóxico. Ácido fórmico é corrosivo. Manuseie os solventes em uma exaustão química.
2. Administre o solvente usando um sistema nano-LC Ultimate 3000 operado como uma bomba isocrática de solvente a 750 nL/min para os experimentos relatados. Conecte a tomada nano-LC ao pulverizador DESI usando tubo PEEK (1/16 pol de dia-dia-orde × 0,005 de dia-divisão).
3. Instale uma coluna de C18 (por exemplo, nanoEase M/Z Peptide BEH; 130 Å, 1,7 μm, 300 μm × 150 mm) em linha para fornecer pressão de retorno suficiente para formação estável de spray em baixas vazões.
4. Ajuste o método do espectrômetro de massa para modo iônico positivo com detecção Orbitrap, tensão de spray de 0,85 kV, resolução Orbitrap de 120.000 a m/z 200 e faixa m/z de 150–1200.
5. Defina o alvo normalizado do AGC para 100%, o tempo máximo de injeção para 100 ms, a lente RF para 45% e as microscans para 1. Desative o isolamento de quadrupolos e a fragmentação da fonte.
6. Forneça gás de bainha de nitrogênio de um gerador de nitrogênio ou fonte de nitrogênio líquido a aproximadamente 12 psi para estabilizar a pluma de pulverização DESI. Use 12 psi como pressão inicial de operação e faça ajustes manuais menores apenas se necessário para melhorar os valores de NL e manter um espectro de massa estável.

6. Realizar imagem raster e controle de pixels

1. Identifique uma região de interesse contendo células individuais visíveis opticamente usando os coverslips em grade como referência. Selecione células isoladas com clara separação visual das células vizinhas, morfologia aderente intacta e sem sobreposição óbvia com detritos ou agrupamentos celulares.
2. Defina a região raster usando o software Fance Stage^{Controller 46}. Defina o tamanho do passo raster para 0,01 mm, a velocidade do estágio para 0,01 mm/s e o tempo de permanência para 20 s.
3. Use varredura raster da esquerda para a direita em cada linha seguida de movimento para a próxima linha na direção y. Defina o tamanho ortogonal do passo entre as linhas raster para 10 μm.
4. Ajuste a velocidade do estágio de acordo com a taxa de aquisição do Orbitrap para alcançar a dimensão desejada do pixel na direção de varredura (por exemplo, aproximadamente 2,5–6,5 μm). Calcule a dimensão do pixel na direção da varredura usando a seguinte relação: dimensão do pixel da direção da varredura = velocidade do estágio × tempo de aquisição por varredura.
5. Usando uma velocidade de estágio de 0,01 mm/s (10 μm/s), adquira 376 varreduras ao longo de 102 s para produzir um tempo de aquisição de 0,271 s por varredura e uma dimensão correspondente de pixels na direção da varredura de aproximadamente 2,7 μm. Sincronize o movimento do estágio e a aquisição espectral de massa ajustando o tempo de aquisição do Orbitrap um pouco mais curto do que os parâmetros combinados de movimento do estágio e tempo de permanência.
   NOTA: A dimensão do pixel ortogonal é determinada pelo tamanho do passo programado e pelas limitações físicas e mecânicas do estágio, enquanto a dimensão da direção de varredura é governada pela velocidade do estágio e taxa de aquisição espectral.
6. Adquirir dados de imagem sobre a faixa de massa selecionada até a conclusão da região raster pré-definida. Para uma região de imagem de 1 mm × 1 mm adquirida usando um passo de linha de 0,01 mm e velocidade de estágio de 0,01 mm/s, o tempo total de aquisição é de aproximadamente 4–5 h.
7. Gerar arquivos de dados RAW durante a aquisição e parar a aquisição após a conclusão das coordenadas raster x–y especificadas e da duração correspondente do método do instrumento. Sob as condições de modo íon positivo descritas aqui, cada linha raster normalmente gera um arquivo RAW de aproximadamente 50 MB, resultando em aproximadamente 5 GB de dados totais para 101 linhas raster.

7. Registro de imagem de óptica para MS

1. Capture imagens em campo claro das células na região selecionada após lavagem e secagem AF e antes da aquisição do DESI usando um microscópio de campo claro equipado com objetivo de 10×.
2. Converta arquivos RAW em arquivos mzML usando msConvert do ProteoWizard⁴⁸. Converta os arquivos mzML para o formato imzML usando o imzML Converter⁴⁹.
3. Use configurações de conversão de centroide/perfil consistentes com o formato de dados adquirido. Envie os arquivos imzML diretamente para o METASPACE (https://metaspace2020.eu)⁵⁰ para visualização de imagens.
4. Não aplique normalização, remoção de hotspots ou correções adicionais de processamento de imagem antes da visualização. Alinhe manualmente as imagens ópticas e MS usando os pontos de referência da grade como referências posicionais.
5. Escale a imagem óptica usando as dimensões conhecidas da imagem e o espaçamento da grade. Sobrepor manualmente a imagem MS para avaliar a correspondência entre as posições das células visíveis opticamente e os sinais de íons localizados.
6. Confirme a localização de célula única por concordância visual entre células isoladas na imagem do campo claro e as correspondentes distribuições de íons MS.

Resultados

A execução bem-sucedida desse protocolo produz conjuntos de dados DESI–MSI nos quais células individuais identificadas opticamente correspondem espacialmente a sinais moleculares localizados de íons (Figura 2). Imagens de microscopia de campo claro adquiridas antes da análise DESI–MSI permitem a identificação visual de células individuais do OVCAR-8 e facilitam o registro de imagem óptica para MS usando o revestimento gradeado como referência posicional. Imagens representativas de íons DESI–MSI demonstram distribuições iônicas localizadas que se correlacionam espacialmente com células individuais identificadas na imagem correspondente de campo claro (Figura 2A–2D).

Figura 2. Comparação entre microscopia de campo claro e MSI de células OVCAR-8. (A) Imagem de microscopia de campo claro das células OVCAR-8 adquiridas com ampliação de 10×. (B–D) Imagens MS adquiridas usando DESI–MSI com tamanho de pixel de 5,5 μm × 10 μm. Distribuições representativas de íons são apresentadas para (B) m/z 317.111, (C) m/z 808.562 e (D) m/z 788.616. Barra da escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Células individuais geram espectros de massa completos contendo múltiplos íons relacionados a lipídios e pequenas moléculas. Em vez de depender de um único marcador molecular, cada célula apresenta um perfil molecular multi-íon que funciona como uma impressão digital química. Imagens iônicas representativas em m/z 317.111, m/z 808.562 e m/z 788.616 demonstram distribuições moleculares heterogêneas entre células vizinhas, indicando heterogeneidade metabólica mensurável no nível de célula única (Figuras 2B–2D). Anotações baseadas no METASPACE sugeriram que íons detectados em m/z 808.562 e m/z 788.616 estavam principalmente associados a espécies de lipídidos fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina, enquanto m/z 317.111 correspondia a várias moléculas pequenas candidatas e espécies relacionadas a dipeptídeos. Esses resultados demonstram que a plataforma permite a detecção de características moleculares espacialmente localizadas de células individuais identificadas opticamente sob condições ambientes. Resultados adicionais, incluindo espécies provisoriamente anotadas, espécies identificadas como EM/EM, imagens representativas da EM e espectros de massa, são fornecidos em estudos^{anteriores 20}.

A plataforma integrada DESI–MSI consiste em um pulverizador DESI, um adaptador FAIMS modificado, um estágio XYZ motorizado e uma placa de ensaio óptica montada adjacente à entrada Orbitrap (Figura 1). A configuração permite entrega estável de solventes, movimento controlado do estágio e alinhamento da pluma de spray DESI com a entrada do espectrômetro de massa para experimentos de imagem de célula única ambiente. O tubo de transferência de íons personalizado mostrado na Figura 3 permite a transmissão de íons entre a região de origem DESI e a entrada Orbitrap. A geometria capilar curvada facilita o posicionamento do pulverizador DESI em relação à superfície da amostra e à região de entrada, mantendo a transferência de íons desobstruída.

Figura 3. Tubo de transferência de íons personalizado para o Orbitrap MSI. Fotografia do tubo de transferência de íons fabricado sob medida usado para acoplar o pulverizador DESI ao espectrômetro de massa Orbitrap Fusion Lumos. A figura mostra a geometria capilar de transferência curvada e o conjunto de montagem usado para transmissão de íons durante experimentos de MSI de célula única em ambiente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

A Figura 4 mostra o adaptador FAIMS modificado integrado à placa de ensaio óptica e ao estágio motorizado XYZ. A vista superior (Figura 4A) ilustra o posicionamento do estágio de amostra e do adaptador modificado em relação à entrada Orbitrap, enquanto a vista inferior (Figura 4B) mostra os suportes de montagem e o conjunto do estágio usados para suportar a plataforma de imagem. A estabilidade mecânica do conjunto integrado é importante para manter um movimento raster consistente e minimizar o desvio posicional durante a aquisição de imagem.

Figura 4. Adaptador modificado de espectrometria de mobilidade iônica assimétrica de alto campo (FAIMS) integrado à placa de teste óptica e ao estágio motorizado XYZ. (A) Vista superior do adaptador modificado montado ao lado da entrada de Orbitrap e do estágio de amostra. (B) Vista inferior mostrando os suportes modificados, placa de teste óptica e conjunto motorizado de estágio XYZ usado para suportar e alinhar a plataforma de imagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

A alta resolução de massa proporcionada pela detecção Orbitrap permite a diferenciação de espécies lipídicas próximas e isobáricas, melhorando assim a especificidade molecular e o contraste da imagem em comparação com sistemas de menor resolução de massa. Pequenas dimensões de pixels podem ser alcançadas por meio da sincronização da velocidade do estágio com a taxa de aquisição espectral. Por exemplo, dimensões de pixels tão pequenas quanto 2,7 μm × 10 μm foram alcançadas usando plataformas Orbitrap de aquisição rápida e parâmetros raster^{otimizados 42}. Imagens de alta resolução espacial permitem a delimitação molecular de células próximas enquanto minimizam a sobreposição de sinais entre regiões celulares vizinhas.

Experimentos bem-sucedidos com DESI–MSI são caracterizados por condições de pulverização estáveis, intensidade iônica consistente entre linhas raster e localização espacial de sinais moleculares que correspondem a células individuais na imagem óptica. Experimentos subótimos podem produzir distribuições difusas de íons, baixa intensidade de sinal, padrões raster inconsistentes ou perda de localização celular devido à formação instável de pulverização, alinhamento inadequado do pulverizador, disseminação excessiva do solvente ou movimento da amostra durante a aquisição. A otimização cuidadosa do alinhamento do spray, taxa de fluxo do solvente, velocidade do estágio e posicionamento da amostra melhora a fidelidade espacial e a estabilidade do sinal iônico durante experimentos de imagem de célula única.

Discussão

Esse protocolo possibilita DESI–MSI de célula única ambiente usando espectrômetros de massa Orbitrap de alta resolução de massa, por meio da integração de controle preciso de estágio, entrega de solvente em nanoescala, direcionamento óptico e análise de massa de alta resolução espacial. A combinação desses elementos aborda múltiplas barreiras técnicas que historicamente limitaram a aplicação do DESI–MSI no nível de célula única. Em particular, o controle coordenado da estabilidade do spray, transmissão de íons e tempo de aquisição permite a detecção confiável de sinais moleculares a partir de volumes de amostragem extremamente pequenos, correspondentes a células individuais. Um fator central que governa o desempenho nesse fluxo de trabalho é a estabilidade e o confinamento da pluma de pulverização DESI. Em resoluções espaciais em escala micrométrica, pequenas perturbações na taxa de fluxo do solvente, pressão do gás ou posicionamento do pulverizador podem alterar significativamente a área de amostragem efetiva. O uso de entrega de solvente em nanoescala combinado com a contrapressão adequada melhora a estabilidade do spray e reduz a dispersão do solvente, aumentando assim a fidelidade espacial. Além disso, manter uma distância e um ângulo consistentes entre pulverizador e superfície é fundamental para a eficiência de ionização reproduzível. Mesmo pequenas variações na geometria podem levar a variações substanciais na intensidade do sinal, especialmente ao analisar amostras celulares heterogêneas. Na prática, a otimização das condições de pulverização DESI foi realizada empiricamente monitorando a corrente total de íons, estabilidade espectral e valores de NL (tipicamente em torno de 10⁵–10⁶) durante a aquisição. A qualidade do sinal reproduzível foi alcançada por meio do ajuste iterativo da posição do pulverizador, estabilidade do fluxo de solvente, pressão do gás e alinhamento da pluma DESI em relação à entrada Orbitrap.

A eficiência da transmissão de íons representa outra limitação importante na escala de célula única, pois a abundância de analitos é inerentemente baixa dentro de células individuais. Nessas escalas espaciais, a transmissão eficiente de íons pode se tornar uma limitação prática maior do que a eficiência de ionização em algumas implementações, pois apenas uma fração muito pequena dos íons desorviados chega finalmente à entrada do espectrômetro de massa. A transferência eficiente de íons da região de amostragem para a entrada do espectrômetro de massa é, portanto, essencial. O adaptador de alojamento FAIMS modificado usado neste protocolo fornece uma interface entre a fonte de pulverização DESI e um espectrômetro de massa termotérmico, permitindo compatibilidade com múltiplos modelos de instrumentos, incluindo plataformas das séries Orbitrap Tribrid, Exploris e Astral. A integração do adaptador de alojamento FAIMS modificado com uma placa de teste óptica também proporciona estabilidade mecânica, minimizando assim o desalinhamento durante experimentos de imagem prolongados. A sincronização entre o movimento do estágio e a aquisição espectral de massa é igualmente crítica para alcançar alta resolução espacial. No DESI–MSI, a dimensão do pixel na direção da varredura é governada pela relação entre a velocidade do estágio e a taxa de aquisição, enquanto a dimensão ortogonal é definida pelo tamanho do passo programado. O controle preciso desses parâmetros permite amostragem precisa. Como muitas células de mamíferos tipicamente variam de aproximadamente 5 a 20 μm de diâmetro, dimensões de pixels próximas de apenas alguns micrômetros são necessárias para minimizar a sobreposição de sinais entre células adjacentes e melhorar a localização das características moleculares em regiões celulares individuais. No entanto, o tamanho nominal dos pixels não corresponde necessariamente à pegada real da amostragem, pois a interação da pluma de solvente com a superfície da amostra pode introduzir espalhamento lateral e sobreposição parcial do sinal entre pixels adjacentes. As dimensões relatadas dos pixels devem, portanto, ser interpretadas no contexto da resolução espacial efetiva, e não apenas definições estritamente geométricas. O tubo de transferência de íons personalizado usado neste estudo foi projetado de acordo com a geometria do tubo padrão de transferência de íons para preservar as características de transmissão de íons, ao mesmo tempo em que possibilita a integração com a configuração da fonte DESI.

Alto poder de resolução de massa e precisão de massa fornecidos pelos espectrômetros de massa Orbitrap são essenciais para resolver a mistura complexa de metabólitos e lipídios presentes em células individuais. Muitas características moleculares detectadas foram provisoriamente anotadas usando medições de massa precisas e análise METASPACE. Como múltiplas atribuições candidatas podem corresponder a um único valor m/z medido, estratégias adicionais de validação MS/MS e de confirmação molecular ortogonal podem fortalecer ainda mais a identificação molecular em estudos futuros. No modo de íons positivos, os espectros DESI são frequentemente dominados por espécies fosfolipídicas com valores m/z próximos ou isobáricos. A detecção de alta resolução por Orbitrap permite a diferenciação dessas espécies, melhorando assim a especificidade molecular e reduzindo a ambiguidade espectral. Essa capacidade é particularmente importante para análises de células únicas, onde a dependência de um número limitado de íons pode levar a uma má interpretação da heterogeneidade celular. Essa adaptabilidade sugere que estratégias semelhantes podem ser aplicáveis a outras plataformas de espectrometria de massa usando interfaces correspondentes com modificações apropriadas. Apesar dessas vantagens, várias limitações devem ser consideradas. Primeiro, a fonte DESI usada no trabalho atual está disponível apenas para usuários com sistemas DESI–MSI, e a construção de sistemas DESI sprayer/Orbitrap pode, portanto, ser limitada pela disponibilidade da fonte DESI. No entanto, dispositivos DESI alternativos, incluindo o DEFFI, também podem ser implementados para estudos MSI de alta resolução^{espacial 42,47}. Segundo, a implementação dessa plataforma requer personalização significativa, incluindo usinagem das interfaces de instrumentos e fabricação de componentes de montagem. Esses requisitos podem limitar o acesso para laboratórios sem experiência em desenvolvimento de instrumentos ou fabricação mecânica. Na implementação atual, a carcaça da interface FAIMS serviu como uma plataforma mecânica conveniente para posicionar o conjunto do pulverizador DESI em relação à entrada Orbitrap. Consequentemente, a implementação da configuração descrita é mais prática para laboratórios com acesso a sistemas Orbitrap compatíveis com FAIMS e suporte básico de usinagem. No entanto, o conceito mais amplo de acoplar mecanicamente fontes DESI às entradas Orbitrap pode ser alcançado usando projetos alternativos sem modificar o hardware da interface FAIMS. Terceiro, embora baixas taxas de fluxo de solvente melhorem o confinamento espacial, elas também podem reduzir o rendimento total de íons, exigindo otimização cuidadosa para equilibrar sensibilidade e resolução espacial.

Outra consideração importante é o potencial de deslocalização de analitos durante a amostragem. Embora o DESI opere sob condições ambientes e não exija aplicação de matriz, a interação das gotículas do solvente com a superfície da amostra pode levar à redistribuição dos analitos, especialmente para espécies altamente solúveis. Minimizar o volume do solvente e otimizar as condições de pulverização são, portanto, críticos para preservar a integridade espacial no nível de célula única. De forma semelhante, o procedimento de lavagem usando formiado de amônio isotônico pode reduzir a supressão de íons associados ao sal, mantendo a integridade celular e preservando espécies celulares, conforme já relatado nos fluxos de trabalho de EM^{unicelular 5}.

Desenvolvimentos futuros podem melhorar ainda mais o desempenho e a aplicabilidade desta plataforma. Por exemplo, a integração com sistemas de aquisição de dados mais rápidos poderia permitir tamanhos efetivos menores de pixels e experimentos MSI de maior rendimento. A implementação de sistemas automatizados de alinhamento ou controle de feedback em tempo real pode reduzir a variabilidade e melhorar a reprodutibilidade. Além disso, combinar essa abordagem com técnicas complementares, como imagens de fluorescência ou estratégias de marcação direcionada, pode aprimorar a identificação do tipo celular e possibilitar análises multimodais.

Além das considerações técnicas, essa plataforma tem amplas implicações para a pesquisa biológica e biomédica. A capacidade de caracterizar perfis moleculares no nível de células individuais sob condições ambientes permite novas oportunidades para estudar a heterogeneidade celular em sistemas complexos. O DSI–MSI já foi aplicado com sucesso em nível tecidular em estudos de microambientes tumorais, doenças neurológicas, interações hospedeiro-patógeno e populações celulares resistentes^{a medicamentos} 12,15,16,35. Estender o DESI–MSI para o nível de célula única pode melhorar ainda mais a capacidade de delinear heterogeneidade química localizada entre células vizinhas, identificar subpopulações celulares raras e descobrir marcadores moleculares que poderiam estar ocultos em medições de tecido em massa. No entanto, o presente estudo foi realizado usando um modelo simplificado de cultura celular monocamada, e estudos adicionais são necessários para demonstrar compatibilidade com outros sistemas biológicos complexos, incluindo diferentes modelos celulares, tecidos, organoides e culturas 3D. O fluxo de trabalho atual pode fornecer uma base para estender medições DESI de alta resolução espacial para ambientes biológicos cada vez mais heterogêneos, após validação e otimização adicionais. Como esse método preserva o contexto espacial enquanto fornece informações moleculares detalhadas, pode servir como uma ponte entre abordagens de imagem e óticas. Em resumo, este protocolo estabelece uma estrutura flexível e adaptável para alcançar DESI–MSI com resolução de célula única nos espectrômetros de massa Orbitrap. Ao abordar desafios chave relacionados à eficiência de ionização, transmissão de íons, controle espacial e resolução de massa, essa abordagem permite a caracterização molecular detalhada de células individuais. Embora sejam necessárias mais otimizações e validações, a metodologia fornece uma base para expandir o uso do MSI ambiente em estudos de metabolômica unicelular e espacial.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
−80 °C freezer	Eppendorf New Brunswick	U700	Armazenamento de amostras biológicas antes da preparação.
6" vertical bracket for breadboards, 1/4"-20 holes (2 pieces)	Millipore Sigma	VB01A	Suporte mecânico e estabilização da montagem personalizada do sprayer
Acetonitrile	Fisher Chemical	240744	Solvente orgânico para preparação e otimização de solvente compatível com DESI
Ammonium formate	Thermo Fisher Scientific	401152500	Preparação de buffer de lavagem de formiato de amônio isotônico para lavagem de células antes do DESI–MSI
Brightfield microscope	Fisher Scientific	12575252	Imageamento óptico e visualização de células aderentes antes da aquisição DESI–MSI
C18 column	Waters	186009259	Geração de contrapressão em linha para formação estável de spray DESI nano-fluxo
Copper wire	N/A	N/A	Conexão elétrica e aterramento durante a fabricação do suporte do sprayer
DESI XS sprayer	Waters	700014033	Fonte de ionização DESI ambiente para experimentos de DESI–MSI de célula única
Epoxy resin	Devcon	20945	Estabilização mecânica e fixação dos componentes personalizados do suporte do sprayer
FAIMS Pro electrode ion source housing adaptor	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Modificação e fabricação da interface DESI personalizada compatível com Orbitrap
Formic acid	Ward’s Science	470301-120	Modificador de ácido para preparação do solvente do spray DESI
Methanol	Fisher Chemical	A456-4 Optima	Solvente orgânico para preparação do solvente do spray DESI
Gas regulator	Millipore Sigma	23831-U	Regulação da pressão do gás de bainha de nitrogênio durante a operação DESI
Gridded glass coverslip	Ibidi	10817	Substrato de cultura celular e referência posicional para registro de imagem óptico para MS
Grounding wire	N/A	N/A	Conexão de aterramento elétrico para o sprayer DESI e montagem da interface
Incubator	HeraCell	51026282	Manutenção de culturas celulares de mamíferos sob condições controladas de temperatura e CO2
LC/MS-grade water	Thermo Fisher Scientific	W6500	Preparação do buffer de lavagem de formiato de amônio e do solvente do spray DESI
METASPACE platform	METASPACE	https://metaspace2020.eu	Visualização de imagem MS baseada em nuvem e análise de dados de metabolômica espacial
Modified FAIMS interface	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Interface personalizada para acoplamento do sprayer DESI com espectrômetros de massa Orbitrap
Motorized XYZ stage	Newport Corporation	CONEX-MFACC	Movimento controlado do estágio raster durante a aquisição DESI–MSI
MycoAlert PLUS mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-703	Monitoramento de rotina da contaminação por micoplasma em células cultivadas
Nano-liquid chromatography system	Thermo Fisher Scientific	5200.0355	Sistema de entrega de solvente nano-fluxo para geração de spray DESI
Optical breadboard	Thorlabs	MB1012	Plataforma de suporte mecânico para o sprayer DESI e montagem da interface modificada
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	UVPD	Espectrômetro de massa Orbitrap de alta resolução para aquisição de dados DESI–MSI
PEEK tubing	IDEX	1535	Conexão da linha de solvente entre o sistema nano-LC e o sprayer DESI
Penicillin–streptomycin	Gibco	15140-122	Suplemento antibiótico para meio de cultura celular de mamíferos
Phosphate-buffered saline (PBS)	VWR	0780-50L	Solução de lavagem para células cultivadas durante o passaging
RPMI-1640 medium	Gibco	11875093	Meio de cultura celular de mamíferos para manutenção de células OVCAR-8
Stage-control software	Lasken Group	Versão 6	Controle de software do rastreamento raster, movimento do estágio e parâmetros de aquisição de imagem
Stainless steel tubing	MicroGroup	316H16H	Tubulação de transferência de íons fabricada sob medida (1/16" OD, 0,033" ID) para integração da interface Orbitrap
Syringe, 250 µL	Hamilton	1725LTN250UL	Carregamento de solvente e entrega de solvente nano-fluxo
Synthetic fetal bovine serum (FBS)	HyClone	SH3006603	Suplemento sérico para preparação do meio completo de cultura celular de mamíferos
TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad Laboratories	1450102EDU	Contagem automatizada de células cultivadas antes da semeadura em lâminas
Tissue culture dish, 100 mm	Fisher Scientific	FB012924	Expansão e manutenção de culturas celulares OVCAR-8 aderentes
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072	Descolamento enzimático de células aderentes durante o passaging
UV-curing resin	Prime Dental	6.03	Fabricação e estabilização de componentes personalizados do suporte do sprayer DESI
Xcalibur software	Thermo Fisher Scientific	4.7	Controle do instrumento, configuração do método Orbitrap e aquisição de dados espectrais de massa