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Estabelecimento de um Ensaio de Repórter STAT6 para a Triagem de Toxicantes Ambientais que Afetam a Inflamação Alérgica das Vias Aéreas

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DOI:

10.3791/71694

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25 de agosto de 2026

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1Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a geração e validação de um ensaio repórter de luciferase estável para STAT6 em células epiteliais das vias aéreas humanas. O método permite a triagem eficiente de toxicantes ambientais e componentes da poluição do ar que modulam a atividade de STAT6 sob condições in vitro controladas.

Resumo

A inflamação das vias aéreas alérgica associada à poluição do ar é uma preocupação crescente para a saúde pública. A interleucina-4 (IL-4) e a interleucina-13 (IL-13), que ativam a via de sinalização do Fator de Transcrição e Transdutor de Sinais 6 (STAT6), mediador central da inflamação alérgica das vias aéreas, podem modular as toxicidades respiratórias de poluentes. O presente estudo descreve a geração e validação de um ensaio estável de repórter luciferase para STAT6 em células epiteliais das vias aéreas humanas, com o objetivo de avaliar toxicantes ambientais que modulam a sinalização de STAT6. Células epiteliais brônquicas humanas 16HBE14o− foram transduzidas com um repórter luciferase responsivo a STAT6 utilizando um vetor lentiviral, seguido da otimização da seleção com puromicina e da multiplicidade de infecção, e isolamento monoclonal por diluição limitante. Um clone estável com indução forte e reprodutível ao longo de passagens seriadas foi selecionado. A resposta do repórter foi validada mediante estimulação com IL-4/IL-13, e a dependência de STAT6 foi confirmada utilizando inibidores seletivos de STAT6, STAT5 e STAT3. O desempenho do ensaio foi quantificado por análise do fator Z′, que indicou separação reprodutível do sinal. Além disso, o ensaio foi aplicado a constituintes individuais da poluição do ar, e o benzo[b]fluoranteno e a matéria particulada aumentaram significativamente a atividade do repórter STAT6. Este método fornece uma abordagem escalonável para medir a atividade de STAT6 em células epiteliais das vias aéreas e para priorizar toxicantes ambientais que modulam a sinalização alérgica das vias aéreas.

Introdução

A poluição do ar representa um dos desafios mais urgentes para a saúde pública global, com profundos efeitos sobre a saúde e impactos socioeconômicos. Atualmente, é classificada como o segundo fator de risco mais importante para mortalidade, sendo responsável por 8,1 milhões de mortes anualmente1,2,3. Entre os poluentes atmosféricos, a matéria particulada fina com diâmetros inferiores a 2,5 micrômetros (PM2,5) apresenta o maior risco à saúde devido à sua capacidade de penetrar profundamente no trato respiratório4,5. A exposição elevada à PM2,5 tem sido consistentemente associada à função pulmonar prejudicada e a taxas aumentadas de hospitalização por doenças respiratórias6. A prevalência de doenças inflamatórias alérgicas, incluindo asma, rinite alérgica e dermatite atópica, tem aumentado em todo o mundo e é desproporcionalmente mais elevada nas megacidades altamente poluídas4.

As doenças alérgicas das vias aéreas, como a asma atópica, são mediadas principalmente por uma resposta inflamatória do tipo 2, caracterizada por níveis elevados das citocinas interleucina-4 (IL-4) e interleucina-13 (IL-13) e pela ativação da via de sinalização do transdutor de sinal e ativador da transcrição 6 (STAT6)7. Em células epiteliais das vias aéreas, a fosforilação do STAT6 induzida por IL-4 e IL-13 promove a hipersecreção de muco e a ruptura da barreira epitelial, identificando o STAT6 como um mediador central da patologia alérgica das vias aéreas e um alvo terapêutico relevante8,9. Evidências experimentais provenientes de modelos murinos indicam que a exposição à PM2,5 e ao dióxido de enxofre potencializa a sinalização do STAT6 e agrava a inflamação alérgica das vias aéreas10,11. No entanto, se constituintes individuais da poluição do ar modulam diretamente a atividade transcripcional do STAT6 em células epiteliais humanas das vias aéreas ainda não foi avaliado sistematicamente.

A poluição do ar compreende uma mistura quimicamente complexa de constituintes, incluindo material particulado, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs), metais pesados e sais inorgânicos, cujas contribuições individuais para a ativação da STAT6 nas vias aéreas permanecem pouco definidas12,13. As metodologias atuais para medir a atividade da STAT6 em células epiteliais das vias aéreas, como ensaios terminais de fosforilação ou sistemas repórter baseados em transfeção transitória, não são adequadas para triagem química em larga escala. Uma plataforma repórter estável e baseada em células para a STAT6 em células epiteliais humanas das vias aéreas, portanto, forneceria uma ferramenta escalável para identificar compostos derivados da poluição que modulam a sinalização alérgica nas vias aéreas. Este protocolo descreve o desenvolvimento e a validação de um ensaio repórter estável de luciferase para a STAT6 em células epiteliais das vias aéreas 16HBE14o−, permitindo a avaliação quantitativa da ativação da STAT6 para triagem sistemática de amostras ambientais e de toxicantes químicos individuais.

Protocolo

A aprovação ética em seres humanos não é aplicável porque este estudo utilizou a linhagem estabelecida de células epiteliais brônquicas humanas 16HBE14o−.

1. Geração de células 16HBE14o− estavelmente expressando um repórter de atividade STAT6

OBSERVAÇÃO: Figura 1 fornece uma visão geral do fluxo de trabalho.

  1. Cultura celular
    NOTA: Realize todos os procedimentos utilizando técnica asséptica em uma cabine de segurança biológica Classe II. Confirme que as células estão livres de contaminação por micoplasma antes do uso.
    1. Mantenha as células 16HBE14o− em meio mínimo essencial suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-estreptomicina. Incube as células a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2, e substitua o meio de cultura a cada dois dias.
    2. Deixe as células atingirem aproximadamente 80% de confluência. Aspire o meio de cultura e lave a monocamada celular uma vez com solução salina tamponada com fosfato.
    3. Adicione quantidade suficiente de solução salina tamponada com fosfato para cobrir a monocamada celular e incube as células por 20 min a 37 °C. Aspire completamente a solução salina tamponada com fosfato.
      NOTA: Utilize a incubação de 20 min com solução salina tamponada com fosfato para facilitar a ruptura das junções intercelulares firmes formadas por esta linhagem celular. Essa duração representa uma modificação otimizada internamente.
    4. Adicione quantidade suficiente de solução de tripsina a 0,25%–ácido etilenodiaminotetraacético para cobrir a monocamada celular. Incube as células por 10 min a 37 °C.
      NOTA: Monitore a dessanexação celular utilizando um microscópio invertido. Bata suavemente no vaso de cultura quando necessário para facilitar a dessanexação.
    5. Adicione aproximadamente cinco volumes de meio de cultura completo em relação ao volume da solução de tripsina–ácido etilenodiaminotetraacético para encerrar a atividade enzimática. Pipete suavemente a suspensão para obter uma suspensão de células isoladas.
    6. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugue a suspensão a 300 × g durante 5 min a 25 °C.
    7. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular em meio de cultura fresco. Triture suavemente a suspensão e confirme a presença de uma suspensão de células isoladas sob microscópio invertido.
    8. Conte as células utilizando um hemocitômetro e ajuste a concentração celular à densidade necessária para o experimento subsequente. Utilize uma razão de divisão rotineira de 1:8.
      NOTA: Consulte a Tabela Suplementar 1 e a Tabela Suplementar 2 para as áreas de crescimento dos vasos de cultura e os volumes correspondentes de solução salina tamponada com fosfato e solução de tripsina–ácido etilenodiaminotetraacético.
  2. Determinação da citotoxicidade induzida por puromicina
    ​NOTA: Selecione o antibiótico de acordo com o gene de resistência codificado pelo construto lentiviral.
    1. Semente as células 16HBE14o− com densidade de 2 × 104 células por poço em uma placa de cultura de 96 poços contendo 100 µL de meio de cultura completo por poço. Incube as células durante a noite.
    2. Substitua o meio de cultura por meio fresco contendo puromicina nas concentrações finais de 0,5, 1, 2 ou 4 µg/mL. Prepare placas separadas para os pontos temporais de 24, 48 e 72 h.
    3. Adicione 5 µL de reagente para contagem celular a cada poço. Incube a placa por 1 h a 37 °C.
      NOTA: Evite introduzir bolhas de ar nos poços, pois elas podem interferir nas medições de absorbância.
    4. Meça a absorbância a 450 nm utilizando 650 nm como comprimento de onda de referência. Agite a placa por 15 s imediatamente antes de registrar a absorbância no modo de ponto final.
    5. Calcule a viabilidade celular14 utilizando a Equação 1.
      Equação de viabilidade celular, OD450-650 para amostras, controle, branco; fórmula para análise de bioensaio.
      em que:
      Equação de absorbância OD450-650, método de subtração, utilizado em espectrofotometria, fórmula.
      Fórmula de densidade óptica (OD450-650) para análise de absorção em experimentos de espectroscopia.
      Equação de densidade óptica, OD450-650branco=OD450branco-OD650branco, para análise de dados espectroscópicos.
      NOTA: Defina o controle como células não tratadas e o branco como meio sem células contendo o reagente do ensaio. Selecione a menor concentração de puromicina que elimine completamente as células não transduzidas em 48–72 h.
  3. Determinação da multiplicidade de infecção ótima
    CAUTELA: Manipule partículas lentivirais sob condições de Nível de Segurança Biológica 2, em instalação registrada para Nível de Segurança Biológica 2 e conforme as regulamentações institucionais de segurança biológica. Realize todas as manipulações com o vírus em uma cabine de segurança biológica Classe II. Cubra materiais descartáveis contaminados com vírus e derramamentos com água sanitária a 10% por pelo menos 1 h antes de descartar como resíduo biológico perigoso.
    ​NOTA: Otimize a multiplicidade de infecção, pois ela afeta diretamente a eficiência de transdução.
    1. Calcule o volume necessário do estoque lentiviral15 utilizando a Equação 2.
      Fórmula de cálculo de MOI, razão entre partículas virais e células-alvo, equação de biologia molecular.
      em que:
      Fórmula de título funcional do vírus, T_vírus = UF/mL, equação para análise de dados em pesquisa virológica.
      Equação de volume de vírus, V_vírus=volume de vírus em mL, fórmula, estudo virológico, método de cálculo
      Equilíbrio estático, equação: N_células = número de células-alvo, diagrama para uso educacional em pesquisa.
      NOTA: O título funcional do estoque lentiviral do repórter de luciferase STAT6 utilizado neste protocolo foi de 5 × 107 unidades transduzentes/mL. Para 2 × 104 células-alvo, um MOI de 20 corresponde a 8 µL de estoque lentiviral por poço. O volume do vírus deve ser recalculado para preparações virais com títulos diferentes.
    2. Semente as células 16HBE14o− com densidade de 2 × 104 células por poço em uma placa de 96 poços branca com fundo transparente contendo 100 µL de meio de cultura completo por poço. Incube as células durante a noite até atingirem aproximadamente 80% de confluência.
    3. Substitua o meio de cultura por meio fresco contendo 5 µg/mL de polibreno e lentivírus repórter de luciferase STAT6 com MOIs de 1, 5, 10 e 20. Inclua um poço controle mock não transduzido sem lentivírus.
      NOTA: Calcule o volume de lentivírus necessário para cada MOI a partir do título funcional do estoque.
    4. Incube as células com as partículas lentivirais por 48 h. Substitua o meio de transdução por meio de cultura fresco e incube as células por mais 24 h.
    5. Substitua o meio de cultura por meio fresco contendo interleucina-4 e interleucina-13 a 10 ng/mL cada. Incube as células por 24 h.
    6. Adicione 25 µL de reagente para ensaio de luciferase a cada poço16. Proteja a placa da luz e incube-a por 20 min em temperatura ambiente.
    7. Agite a placa linearmente por 20 s. Meça a luminiscência no modo de ponto final utilizando leitura de toda a placa e ajuste de ganho de 120.
      CAUTELA: Registre a luminiscência dentro de 1 h após a adição do reagente de ensaio de luciferase para capturar o sinal máximo. Siga as instruções do fabricante sobre segurança e manipulação do reagente.
      NOTA: Utilize o mesmo leitor multifuncional de microplacas e configurações de aquisição para todas as medições de absorbância e luminiscência.
  4. Seleção de células transduzidas
    1. Semente as células 16HBE14o− com densidade de 2 × 105 células/mL em uma placa de cultura de 24 poços. Incube as células durante a noite.
    2. Substitua o meio de cultura por meio fresco contendo lentivírus repórter de luciferase STAT6 com MOI de 20 e 5 µg/mL de polibreno. Incube as células por 48 h.
    3. Substitua o meio de transdução por meio de cultura fresco. Incube as células por mais 24 h.
    4. Aspire o meio de cultura e adicione meio fresco contendo 1 µg/mL de puromicina. Incube as células por 5 dias, substituindo o meio de seleção a cada 2 dias.
    5. Continue a seleção com puromicina até que todas as células no poço controle mock não transduzido sejam eliminadas.
      ​NOTA: Aguarde pelo menos 24 h após a transdução antes de aplicar a seleção com antibiótico, para permitir a expressão do gene de resistência.
  5. Isolamento de clones monoclonais por diluição limitante
    1. Desanexe e conte as células repórter STAT6 selecionadas com puromicina. Prepare uma suspensão de células isoladas com densidade de 5 células/mL por diluição seriada.
      ​NOTA: Evite agregação celular durante a diluição. Passe a suspensão por um filtro celular quando necessário.
    2. Dispense 200 µL da suspensão celular em cada poço de uma placa de cultura de 96 poços para obter uma densidade média de aproximadamente uma célula por poço.
    3. Examine cada poço utilizando um microscópio invertido nas primeiras 24 h e identifique os poços contendo uma única célula. Exclua poços com mais de uma célula ou com múltiplos focos celulares espacialmente separados.
    4. Monitore os poços selecionados durante a primeira semana para confirmar o crescimento clonal. Substitua o meio de cultura a cada 3 dias.
    5. Expanda cada clone na placa de 96 poços original por aproximadamente 20 dias ou até que as células atinjam confluência. Transfira cada clone sequencialmente para uma placa de 6 poços e depois para um frasco de cultura T-25.
      NOTA: Cultive as células na placa de 6 poços por aproximadamente 6 dias antes de transferi-las para o frasco T-25, ou transfira-as quando atingirem a confluência adequada.
      ​PONTO DE PAUSA: Continue expandindo os clones ou congele-os a 1 × 106 células por ampola em 1 mL de meio de criopreservação contendo 90% de soro bovino fetal e 10% de dimetil sulfóxido.
    6. Semente cada clone expandido com densidade de 2 × 105 células/mL em uma placa de 96 poços branca com fundo transparente. Incube as células durante a noite.
    7. Substitua o meio de cultura por meio fresco contendo IL-4 e IL-13 a 10 ng/mL cada. Incube as células por 24 h.
    8. Meça a atividade de luciferase conforme descrito nas etapas 1.3.6–1.3.7. Compare a atividade do repórter induzida entre os clones individuais.
    9. Repita o ensaio de luciferase com números crescentes de passagens celulares. Selecione clones que mantenham atividade consistente do repórter induzida por citocinas ao longo das passagens.
      NOTA: O clone 3 foi selecionado por sua baixa luminiscência basal e capacidade de manter um sinal consistente de ativação induzida por citocinas ao longo de passagens seriadas.

2. Estabelecimento e validação do ensaio repórter de atividade de STAT6

OBSERVAÇÃO: Figura 2 fornece uma visão geral do fluxo de trabalho.

  1. Validação do ensaio repórter de atividade de STAT6
    1. Plaque as células repórteres de STAT6 a 2 × 105 células/mL em uma placa branca com fundo transparente de 96 poços, utilizando 100 µL de meio de cultura completo por poço. Incube as células durante a noite.
    2. Substitua o meio de cultura por meio fresco contendo IL-4 e IL-13 nas concentrações finais de 10 ng/mL cada. Adicione simultaneamente os inibidores seletivos da seguinte forma: 100 nM de AS1517499 (inibidor de STAT6), 2,5 µM de AC-4-130 (inibidor de STAT5) ou 2,5 µM de Stattic (inibidor de STAT3).
    3. Inclua um controle de veículo contendo 0,1% de dimetilsulfóxido (DMSO). Incube as células por 24 h.
    4. Determine a viabilidade celular utilizando o ensaio de contagem de células conforme descrito nas etapas 1.2.3–1.2.5.
    5. Meça a atividade de luciferase conforme descrito nas etapas 1.3.6–1.3.7.
    6. Normalize o sinal de luminiscência de cada poço em relação à sua viabilidade celular correspondente. Expresse os valores normalizados em relação ao grupo controle tratado com citocinas.
      NOTA: A redução da viabilidade celular pode diminuir o sinal de luciferase independentemente da atividade de STAT6. Interprete a atividade do repórter apenas após confirmar viabilidade celular aceitável.
  2. Avaliação da robustez do ensaio
    1. Avalie a robustez do ensaio calculando o fator Z′ utilizando 21 poços replicados para os grupos controle positivo e negativo.
    2. Calcule o fator Z′ utilizando a Equação 3.
      Equação de equilíbrio estático, fórmula do fator Z, expressão matemática para controle de qualidade de ensaio.
      em que:
      Equação de equilíbrio estático, σₚ denota o desvio padrão no controle, ilustração educacional da fórmula.
      Equação de desvio padrão, σn, utilizada na análise estatística para precisão do controle negativo.
      Equação μ<sub>p</sub>=sinal médio do controle positivo; conceito de análise de dados estatísticos.
      Equilíbrio estático, equação μn= sinal médio do controle negativo, análise educacional.
      NOTA: Um fator Z′ entre 0,5 e 1,0 indica que o ensaio é adequado para triagem de alto rendimento.

3. Aplicação do ensaio de repórter STAT6 para triagem de toxicantes ambientais

ATENÇÃO: Manipule hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e sais de metais pesados como materiais tóxicos e potencialmente carcinogênicos. Utilize equipamentos de proteção individual apropriados, realize todas as manipulações em capela química certificada e descarte materiais contaminados de acordo com os procedimentos institucionais de resíduos perigosos.

  1. Triagem de toxicantes ambientais
    1. Plaque as células repórter STAT6 a 2 × 105 células/mL em uma placa branca com fundo transparente de 96 poços, utilizando 100 µL de meio de cultura completo por poço. Incube as células durante a noite.
    2. Substitua o meio de cultura por meio fresco contendo cada composto em teste na concentração final desejada, que é de 10 µM para este protocolo, e trate as células na ausência de IL-4 e IL-13.
    3. Inclua um grupo controle negativo contendo 0,1% de dimetil sulfóxido e um grupo controle positivo contendo IL-4 e IL-13 a 10 ng/mL cada. Incube as células por 24 h.
    4. Determine a viabilidade celular utilizando o ensaio de contagem de células conforme descrito nas etapas 1.2.3–1.2.5.
    5. Meça a atividade da luciferase conforme descrito nas etapas 1.3.6–1.3.7.
    6. Normalize o sinal de luminiscência de cada poço em relação ao valor correspondente de viabilidade celular. Expresse o resultado normalizado em relação ao grupo controle negativo.
    7. Exclua compostos que reduzam a viabilidade celular abaixo de 80% da interpretação da atividade do repórter STAT6.
      NOTA: Trate os sinais do repórter obtidos sob condições citotóxicas como não confiáveis, pois a redução da viabilidade celular pode alterar a luminiscência independentemente da atividade da via STAT6.

Resultados

Para determinar a concentração ideal de puromicina para seleção estável, as células parentais 16HBE14o− foram tratadas com concentrações crescentes de puromicina (0,5–4 µg/mL) e a viabilidade celular foi avaliada após 24, 48 e 72 h utilizando um ensaio de viabilidade celular. A puromicina reduziu a viabilidade celular de maneira dependente da dose e do tempo, com todas as concentrações diminuindo a viabilidade para abaixo de 20% após 48–72 h (Figura 3). Uma concentração de 1 µg/mL foi a menor concentração que eliminou completamente as células não transduzidas, reduzindo o sinal de viabilidade residual a aproximadamente 4,5% dentro de 48 h (p < 0,0001). O aumento da concentração de puromicina não produziu nenhuma redução adicional na viabilidade celular. Portanto, a concentração de 1 µg/mL de puromicina foi selecionada para a subsequente seleção de células transduzidas.

Para otimizar a eficiência de transdução lentiviral, células 16HBE14o− foram transduzidas com o lentivírus do repórter de luciferase STAT6 em multiplicidades de infecção (MOIs) de 1, 5, 10 e 20 por 48 h, seguido por estimulação com IL-4 e IL-13 (10 ng/mL cada) por 24 h para ativar a sinalização STAT6. Conforme mostrado na Figura 4, as unidades de luminiscência relativa (RLUs) aumentaram de maneira dependente da MOI. Uma MOI de 20 produziu a maior indução do repórter, resultando em um aumento de aproximadamente 50 vezes na luminiscência em comparação com o controle não estimulado (p < 0,0001). Com base nesses resultados, uma MOI de 20 foi selecionada para experimentos subsequentes.

Após a transdução e seleção com puromicina sob condições otimizadas, as células não transduzidas sofreram morte celular extensiva, enquanto as células transduzidas mantiveram morfologia e viabilidade normais (Figura 5). As células sobreviventes foram posteriormente submetidas à diluição limitante para estabelecer linhagens celulares monoclonais com repórter de STAT6.

Três linhagens celulares repórteres monoclonais derivadas de células individuais foram avaliadas quanto à atividade repórter STAT6. Todos os clones exibiram luminescência basal baixa (<1.000 RLU). A estimulação com IL-4 e IL-13 induziu atividade repórter robusta nos clones 2 e 3, com luminescência excedendo 20.000 RLU e correspondendo a uma indução superior a 20 vezes (Figura 6A). O clone 3 apresentou a luminescência basal mais baixa e, portanto, foi selecionado para caracterização adicional. A atividade repórter no clone 3 foi avaliada ao longo de passagens seriadas (P9–P21) para verificar a estabilidade a longo prazo. Conforme mostrado na Figura 6B, a indução repórter dependente de STAT6 manteve-se estável ao longo do intervalo de passagens avaliado. Considerou-se que um clone era adequado para experimentos subsequentes quando exibia taxa de crescimento normal, luminescência basal abaixo de aproximadamente 1.000 RLU e indução superior a 20 vezes após estimulação com citocinas.

Como a IL-4 e a IL-13 podem ativar outros membros da família STAT, incluindo STAT3 e STAT5, a especificidade do ensaio com repórter foi avaliada mais a fundo17,18. Células repórter STAT6 foram estimuladas com IL-4 e IL-13 na presença ou ausência de inibidores seletivos direcionados ao STAT6, STAT5 ou STAT3 por 24 h19,20,21. A viabilidade celular permaneceu acima de 90% sob todas as condições de tratamento (inibidor de STAT6 AS1517499, 100 nM: 98,4%; inibidor de STAT5 AC-4-130, 2,5 µM: 97,4%; inibidor de STAT3 Stattic, 2,5 µM: 96,2%; Figura 7A). A inibição de STAT6 reduziu acentuadamente a atividade da luciferase (p < 0,0001), enquanto a inibição de STAT5 ou STAT3 não produziu efeito significativo sobre a atividade do repórter (p = 0,2593 e p = 0,8857, respectivamente; Figura 7B). Esses resultados confirmaram que a ativação do repórter foi predominantemente dependente de STAT6.

A robustez do ensaio foi avaliada mediante o cálculo do fator Z′ utilizando células estimuladas com IL-4 e IL-13 como controle de sinal alto e células tratadas com inibidor de STAT6 como controle de sinal baixo. O ensaio apresentou um fator Z′ de 0,703 ± 0,097, indicando excelente desempenho do ensaio, uma ampla janela de sinal e adequação para triagem de alto rendimento.

Por fim, o ensaio de repórter STAT6 foi aplicado para triar constituintes ambientais selecionados de material particulado quanto à sua capacidade de modular a sinalização STAT6. Após 24 h de tratamento, o benzo[b]fluoranteno (10 µM) aumentou significativamente a atividade do repórter STAT6 em aproximadamente 1,75 vez (p = 0,0006), enquanto o material particulado (100 µg/mL) aumentou a atividade do repórter em aproximadamente 1,5 vez (p = 0,0398; Figura 8). Em contraste, os demais hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e compostos de metais pesados, incluindo CdCl2, HgCl2 e NiSO4 (10 µM cada), não alteraram significativamente a atividade do repórter. Em conjunto, esses resultados demonstram que o ensaio de repórter STAT6 é estável, específico, robusto e adequado para triagem em alto rendimento de compostos ambientais que modulam a sinalização STAT6.

Diagrama de transdução celular; repórter de luciferase STAT6; seleção com antibiótico; otimização de MOI.
Figura 1: Fluxo de trabalho para a geração de células repórter STAT6 em 16HBE14o− . Visão esquemática do protocolo para gerar células 16HBE14o− que expressam estavelmente um repórter de luciferase STAT6. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Diagrama do processo do ensaio com células repórter STAT6; estimulação com IL4/13, CCK8, adição de luciferase, resultados.
Figura 2: Fluxo de trabalho para o estabelecimento e aplicação do ensaio repórter STAT6. Visão esquemática do ensaio repórter STAT6 para validação do ensaio e triagem de toxicantes ambientais. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráfico de barras da viabilidade celular mostrando os efeitos da puromicina em 0,5-4 µg/mL ao longo de 24-72 h; análise estatística.
Figura 3: Determinação da concentração ótima de puromicina para seleção estável de células. Células parentais 16HBE14o− foram tratadas com puromicina (0,5, 1, 2 ou 4 µg/mL) por 24, 48 ou 72 h. Células controle do veículo receberam 0,1% de dimetil sulfoxido (DMSO). A viabilidade celular foi determinada utilizando um ensaio de viabilidade celular. A viabilidade celular foi calculada a partir da diferença de absorbância entre 450 e 650 nm após subtração do branco e normalização ao controle do veículo. Os dados são apresentados como média ± DP de três réplicas biológicas independentes com duplicatas técnicas (n = 3). A significância estatística foi determinada utilizando ANOVA unidirecional seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett. Valores de p para comparações com o controle do veículo estão indicados. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráficos de barras de luminescência versus MOI; análise de dados de mudança no índice de RLU e valores estatísticos de p.
Figura 4Otimização da eficiência de transdução lentiviral. 16HBE14o− células foram transduzidas com um lentivírus reporter de luciferase para STAT6 em multiplicidades de infecção (MOIs) de 1, 5, 10 ou 20 por 48 h. Após um período de recuperação de 24 h, as células foram estimuladas com IL-4 e IL-13 (10 ng/mL cada) por 24 h. (AUnidades relativas de luminiscência (RLUs) em células transduzidas com controle e células transduzidas com o repórter nos MOIs indicados. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de um fator, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett.BIndução de dobramento após estimulação com citocina em relação ao controle não estimulado com MOI 20. A análise estatística foi realizada utilizando o teste t de Student não pareado t-test. Os dados são apresentados como média ± DP de três réplicas biológicas independentes (n = 3). p-valores são indicados. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Morfologia celular sob exposição à puromicina; imagem de microscopia mostrando variações na escala de 50 μm.
Figura 5: Imagens representativas de células após seleção com puromicina. Células 16HBE14o− foram transduzidas ou não com o lentivírus repórter de luciferase STAT6 (MOI = 20) e posteriormente tratadas com puromicina 1 µg/mL por 5 dias. As imagens foram obtidas usando um microscópio invertido de contraste de fase com aumento de 100×, em condições idênticas de aquisição. Células parentais não tratadas formaram uma monocamada epitelial normal (esquerda). Células não transduzidas tratadas com puromicina exibiram morte celular extensiva e desprendimento (centro), enquanto células transduzidas submetidas à seleção com puromicina permaneceram viáveis e mantiveram morfologia normal (direita). Barra de escala = 50 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Resultados do ensaio de luminiscência; gráfico de barras comparando as condições controle e IL em clones e passagens celulares.
Figura 6: Identificação de clones repórteres de STAT6 e avaliação da estabilidade do repórter. Após diluição limitante, três linhagens celulares monoclonais repórteres de STAT6 foram expandidas e estimuladas com IL-4 e IL-13 (10 ng/mL cada) por 24 h. (A) Atividade de luciferase de clones repórteres individuais após estimulação com citocinas, comparada aos controles não estimulados. (B) Estabilidade da atividade repórter de STAT6 no clone 3 ao longo de passagens sucessivas (P9–P21). Os dados são apresentados como média ± DP de duplicatas técnicas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráficos de barras comparando a % de viabilidade celular e a luminiscência normalizada em ensaios de células tratadas com fármacos.
Figura 7: Inibição seletiva da atividade do repórter STAT6 sem afetar a viabilidade celular. Células repórter STAT6 foram estimuladas com IL-4 e IL-13 (10 ng/mL cada) por 24 h na presença do inibidor STAT6 AS1517499 (100 nM), do inibidor STAT5 AC-4-130 (2,5 µM) ou do inibidor STAT3 Stattic (2,5 µM). O grupo controle com veículo estimulado por citocinas recebeu 0,1% de DMSO. (A) A viabilidade celular foi determinada utilizando um ensaio de viabilidade celular. (B) Atividade de luciferase dependente de STAT6 normalizada em relação ao controle estimulado por citocinas. Os dados são apresentados como média ± DP de três réplicas biológicas independentes (n = 3). Valores de p são indicados. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráfico de barras dos resultados do ensaio de luminescência normalizados, comparando tratamentos químicos com amostras controle.
Figura 8: Avaliação dos efeitos moduladores de tóxicos ambientais sobre a STAT6. Células repórter da STAT6 foram tratadas por 24 h com material particulado (100 µg/mL) ou com os tóxicos ambientais indicados, incluindo hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs) e metais pesados (10 µM cada). A atividade de luciferase dependente de STAT6 foi normalizada em relação ao controle do veículo (0,1% DMSO). Os dados são apresentados como média ± DP de três réplicas biológicas independentes (n = 3). A significância estatística foi determinada pela comparação com o controle do veículo, e os valores de p são indicados. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar 1: Especificações do vaso de cultura e parâmetros de repicagem para 16HBE14o− cultura celularClique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Comparação de métodos para medir a atividade de STAT6.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A sinalização IL-4/IL-13–JAK–STAT6 não é apenas um alvo terapêutico importante, mas também um fator chave na patogênese de doenças alérgicas, incluindo asma e rinite alérgica22. Este protocolo descreve um ensaio repórter simples, baseado em linhagem celular estável, para identificar moduladores da atividade de STAT6. O ensaio pode ser aplicado para avaliar os efeitos moduladores de STAT6 de uma ampla gama de compostos ambientais e é facilmente adaptável para triagem de alto rendimento, conforme demonstrado no estudo de prova de conceito (Figura 8). Ao combinar um repórter de luciferase com um ensaio paralelo de viabilidade celular, o método permite a avaliação quantitativa da modulação da via STAT6, minimizando ao mesmo tempo os efeitos interferentes decorrentes da citotoxicidade induzida por compostos.

Uma característica distintiva deste método é o uso de células epiteliais brônquicas humanas 16HBE14o− estavelmente transduzidas, um tipo celular fisiologicamente relevante no qual a sinalização induzida por poluentes de IL-4/IL-13 contribui para a inflamação alérgica das vias aéreas. As abordagens existentes para medir a atividade de STAT6 apresentam limitações práticas importantes. A detecção da fosforilação de STAT6 ou de proteínas-alvo downstream por meio de Western blot ou ensaio imunoenzimático (ELISA) é trabalhosa e possui throughput relativamente baixo. Os ensaios de repórter de luciferase com transfeção transitente medem diretamente a atividade transcripcional de STAT6, mas são afetados pela eficiência variável de transfeção, variabilidade entre lotes e pela necessidade de repetir a transfeção em cada experimento, reduzindo assim a reprodutibilidade e o throughput.

A linhagem celular repórter estável descrita no estudo supera muitas dessas limitações. Como o construto repórter é integrado ao genoma e selecionado de forma clonal, a expressão do repórter permanece uniforme em toda a população celular e reprodutível entre passagens, eliminando a variabilidade associada à transfeção transitória. O sinal de luminiscência é medido em células vivas e pode ser normalizado com base em uma medição paralela de viabilidade celular para excluir artefatos citotóxicos. Além disso, o ensaio é facilmente compatível com um formato de 96 poços para aplicações de média a alta produtividade. O ensaio apresentou um fator Z′ de 0,703, indicando excelente separação entre os controles de sinal alto e baixo e confirmando sua adequação para triagem em alta escala. Uma comparação das abordagens comumente utilizadas para medir a atividade de STAT6 é fornecida na Tabela Suplementar 2. No entanto, como o ensaio relata a ativação de um promotor responsivo ao STAT6 e não a expressão gênica endógena, a validação ortogonal utilizando alvos downstream do STAT6, como MUC5AC e CCL26, permanece importante.

Várias etapas são fundamentais para o estabelecimento bem-sucedido e a aplicação do ensaio com repórter STAT6. A otimização da multiplicidade de infecção lentiviral (MOI) é essencial, pois uma quantidade insuficiente de vírus reduz a eficiência de transdução, enquanto uma exposição excessiva ao vírus pode induzir estresse celular e comprometer a viabilidade celular. Da mesma forma, é necessário otimizar a concentração de puromicina para eliminar células não transduzidas, ao mesmo tempo que preserva a viabilidade das células repórter resistentes. Como a suscetibilidade à transdução lentiviral e à seleção com antibióticos varia entre os tipos celulares, ambos os parâmetros devem ser otimizados empiricamente antes do estabelecimento de linhagens celulares repórter estáveis. A linhagem celular 16HBE14o− é uma linhagem imortalizada de células epiteliais brônquicas humanas amplamente utilizada para investigar inflamação das vias aéreas, pois forma junções apertadas funcionais e produz muco8,23. As células selecionadas para a geração do repórter devem expressar receptores funcionais para IL-4 e IL-13 e manter a sinalização JAK–STAT downstream intacta24. Antes de estabelecer linhagens repórter estáveis, o construto repórter deve ser validado mediante a confirmação de sua resposta à estimulação com citocinas, supressão por inibidores específicos da via e ausência de efeitos citotóxicos nas condições escolhidas para o ensaio. Essas etapas de validação ajudam a garantir que as alterações na atividade do repórter reflitam com precisão a sinalização dependente de STAT6, e não estresse celular inespecífico.

Várias limitações deste método também devem ser consideradas. Os vetores lentivirais se integram aleatoriamente ao genoma do hospedeiro, o que pode resultar em variação entre clones na atividade basal do repórter, na inducibilidade e na estabilidade da expressão a longo prazo. Além disso, como o ensaio mede a ativação de um promotor responsivo ao STAT6, ele não avalia diretamente a ativação do receptor upstream ou eventos de sinalização endógenos downstream. O cultivo prolongado de células repórter estáveis também pode levar ao silenciamento epigenético ou à redução da expressão do transgene. Para minimizar esses efeitos, devem ser estabelecidos bancos mestres de células em passagens iniciais, e a resposta do repórter deve ser verificada periodicamente dentro de uma faixa definida de passagens. Além disso, o ensaio ainda não foi validado em células epiteliais brônquicas humanas primárias nem em uma plataforma automatizada completa de triagem de alto rendimento. Por fim, os toxicantes ambientais avaliados neste estudo representam um painel de prova de conceito, e não uma biblioteca abrangente de compostos químicos.

A poluição do ar, particularmente as partículas finas (MP2,5), compreende uma mistura complexa de constituintes química e fisicamente diversos, incluindo carbono negro, sais inorgânicos, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e metais pesados12,13. As variações nas fontes de emissão e no processamento atmosférico geram diferenças substanciais na composição das partículas, o que pode contribuir para efeitos adversos distintos à saúde. Consequentemente, identificar os componentes específicos responsáveis pelas respostas alérgicas permanece um desafio em estudos epidemiológicos e in vivo. O ensaio com repórter STAT6 descrito no estudo fornece uma plataforma in vitro prática para triagem da atividade moduladora do STAT6 por agentes tóxicos atmosféricos individuais, extratos de material particulado associados a fontes específicas ou frações particuladas quimicamente definidas. Este protocolo pode facilitar a priorização de agentes tóxicos candidatos para estudos mecanicistas e apoiar a avaliação orientada ao risco de misturas complexas de poluição do ar.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Pesquisa da Tailândia (NRCT) (Concessão nº N42A680388), e este projeto de pesquisa é financiado pela Universidade Mahidol (Fundo Estratégico de Pesquisa: 2025) (Concessão nº 35). As Figuras 1 e 2 foram criadas usando o BioRender.com (Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tripsina-EDTA 0,25%Gibco25200072Reagente de dissociação celular
Tubo cônico estéril de centrífuga de 15 mLCorningCLS430791Tubo de centrífuga de polipropileno estéril
Linhagem celular epitelial brônquica humana 16HBE14o-Doação do Dr. Nawiya Huipao (Universidade Príncipe de Songkla, Tailândia) e do Prof. Dr. Dieter C. Gruenert (Universidade da Califórnia em São Francisco, EUA)RRID:CVCL_0112Linhagem celular epitelial brônquica humana (passagens 35–40); confirmada livre de micoplasma e mantém morfologia epitelial viável diferenciada e propriedades de barreira. Referência: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
Placa de cultura tecidual de fundo plano transparente com 24 poçosCorning3527Placa de cultura celular
Placa de cultura tecidual de fundo plano transparente com 6 poçosCorning3516Placa de cultura celular
Microplaca de poliestireno de fundo plano transparente com 96 poçosCorning3599Placa para ensaio de viabilidade celular
Microplaca de poliestireno de fundo transparente e poços brancos com 96 poçosCorning3610Placa para ensaio de luminiscência
AC-4-130 (inibidor de STAT5)MedChemExpressHY-124500Inibidor seletivo de STAT5
AS1517499 (inibidor de STAT6)MedChemExpressHY-100614Inibidor seletivo de STAT6
Benzo[b]fluorantenoAccuStandardH-128NHidrocarboneto aromático policíclico
Capa de segurança biológica, Classe IINuaireNU-543-400EPara procedimentos de cultura celular assépticos
Cloreto de cádmio (CdCl2)Sigma202908Composto de metal pesado
Kit de contagem celular-8 (CCK-8)MedChemExpressHY-K0301Ensaio de viabilidade celular
Frasco de cultura celular, 25 cm² (T-25)Corning430639Frasco de cultura tecidual
Incubadora de CO2NuaireNU-5710EMantida a 37 °C, 5% CO2, atmosfera umidificada
Dissulfóxido de dimetila (DMSO)SigmaD2650Solvente (concentração final de 0,1%) e crioprotetor (10%)
Soro bovino fetal (FBS)SigmaF7524Suplemento do meio (10%) e meio de criopreservação (10%)
HemocitômetroBOECOBOE14Contagem manual de células
Microscópio invertido de contraste de faseZEISSPrimovertObservação da morfologia celular
Sistema de ensaio de luciferase (ONE-Step)BPS Bioscience60690Ensaio de repórter luciferase
Cloreto de mercúrio (HgCl2)Sigma215465Composto de metal pesado
Leitor de microplacasBioTekSynergy Neo2Leitor multimodal de microplacas/luminômetro controlado pelo software Gen5 (v3.08.01). Absorbância medida a 450 nm com referência a 650 nm após agitação linear de 15–20 s. Luminiscência medida em modo final com ganho do detector de 120 após agitação linear de 20 s.
Mínimo Meio Essencial de Eagle (MEM)Gibco11095-080Meio basal de cultura
Sulfato de níquel (NiSO4)Tokyo Chemical IndustryN1203Composto de metal pesado
Material particulado (PM)Instituto Nacional de Padrões e TecnologiaSRM 2975Material de referência padrão para material particulado
Penicilina-estreptomicina (100×)Gibco15140122Suplemento antibiótico (concentração final de 1%)
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco18912014Tampão de lavagem
PolybreneSigmaTR-1003-GPotencializador da transdução lentiviral
PuromicinaMedChemExpressHY-B1743AAntibiótico para seleção estável de células
IL-13 humana recombinanteThermo Fisher ScientificA42526Citocina para estimulação
IL-4 humana recombinanteThermo Fisher ScientificA42602Citocina para estimulação
Lentivírus repórter de luciferase para STAT6BPS Bioscience78799Construto repórter lentiviral; título do estoque 5 × 107 TU/mL
Stattic (inibidor de STAT3)MedChemExpressHY-13818Inibidor seletivo de STAT3

Referências

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