Preparação de vesículas unilamelares grandes e gigantes híbridas de polímero e polímero de membrana, proteína e lipídio

Resumo

Este protocolo demonstra a reconstituição mediada por detergente de uma proteína de membrana, citocromo bo3 ubiquinol oxidase, em grandes vesículas unilamelares feitas de PDMS-g-PEO e sua conversão em vesículas gigantes por meio de fusão-eletroformação. Os compartimentos funcionais resultantes baseados em polímeros são adequados para estudos bioquímicos e biofísicos avançados.

Resumo

Vesículas formadas a partir de copolímeros anfifílicos, isoladas ou misturadas com fosfolipídios, oferecem estabilidade mecânica e química superior em comparação com as vesículas lipídicas convencionais. Isso os torna um chassi atraente, que pode ser desenvolvido e expandido para permitir aplicações específicas, como administração de medicamentos, biossensação diagnóstica, construção de células artificiais e micro e nanorreatores bioinspirados. Em particular, a funcionalização por meio da incorporação de proteínas membranares é essencial para muitas dessas aplicações. Aqui, apresentamos um protocolo para preparar vesículas unilamelares (LUVs) funcionalizadas por proteínas de membrana a partir do copolímero de enxerto PDMS-g-PEO por meio de reconstituição mediada por detergente. Além disso, descrevemos como essas grandes vesículas podem ser convertidas em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) usando uma abordagem de fusão–eletroformação. O protocolo abrange a marcação por fluorescência de proteínas de membrana, preparação de LUVs de polímero e híbridos, reconstituição de proteínas de membrana, análise da distribuição de tamanho via espalhamento dinâmico da luz (DLS), avaliação da atividade proteica por meio de medições de consumo de oxigênio, preparação de GUVs funcionalizados por proteína e análise da inserção de proteínas e da atividade de bombeamento de prótons em GUVs por meio de microscopia confocal. Resultados representativos demonstram a formação de proteo-LUVs monodispersos com índice de polidispersidade (PDI) abaixo de 0,2, e a geração bem-sucedida de proteo-GUVs com diâmetro de 5 a 35 μm. A atividade proteica é confirmada por medições de consumo de oxigênio tanto em LUVs poliméricos (18,2 nmol/min/mL) quanto em LUVs híbridos (26,9 nmol/min/mL). A inserção de proteínas nos GUVs é quantificada por intensidade de fluorescência, resultando em 20,6 ± 3,7 u.a. para GUVs poliméricos e 26,2 ± 5,0 u.a. para GUVs híbridos. A atividade de bombeamento de prótons em GUVs, monitorada por meio de um corante encapsulado sensível ao pH, é consistente com a funcionalidade proteica, sendo predominante o bombeamento de prótons para dentro. A suavidade mecânica do copolímero e a espessura das duas camadas semelhantes a lipídios (~5,3 nm) apoiam a inserção eficiente de proteínas e a preservação da funcionalidade.

Introdução

Copolímeros de bloco anfifílicos podem se auto-montar em solução aquosa formando membranas, que espontaneamente se curvam e fecham sobre si mesmas para formar compartimentos esféricos fechados por membrana, conhecidos como polimersomas (vesículas poliméricas). Comparados às membranas lipídicas, compartimentos à base de polímeros oferecem maior versatilidade química e maior estabilidade química¹ e^{mecânica 2}, tornando-os altamente atraentes para aplicações como administração de fármacos, nano e microrreatores, e a construção de células artificiais duráveis. Tanto nosso grupo quanto outros funcionalizaram membranas poliméricas inserindo proteínas membranas para criar organelas e células^artificiais 1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Polímeros contendo núcleo hidrofóbico poli(dimetilsiloxano) (PDMS) são particularmente adequados para incorporação de proteínas de membrana devido à alta flexibilidade da cadeia e à possibilidade de ajustar a espessura hidrofóbica da membrana para melhor corresponder ao domínio^{transmembrana 5} da proteína. Enquanto nosso laboratório se concentrou principalmente no copolímero de enxerto poli(dimetilsiloxano)-enxerto-poli(óxido de etileno) (PDMS-g-PEO), que forma membranas altamente dinâmicas ^4,16,17, mais macias que as bicamadas lipídicas convencionais e com espessura de aproximadamente 5,3^nm1, outros grupos já utilizaram com sucesso copolímeros tribloco baseados em PDMS, como PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA ^5,6,7,8,9,10,11 e PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz¹² para reconstituição proteica de membrana. Mesmo copolímeros dibloco relativamente rígidos, como PBD-b-PEO, especialmente em sistemas híbridos misturados com lipídios, têm sido utilizados para incorporação bem-sucedida de^{proteínas 13}. Esses exemplos destacam a versatilidade das membranas à base de polímeros como plataformas de reconstituição, que também podem proporcionar maior estabilidade química¹ e vida útil^{prolongada 14} para proteínas de membrana incorporadas. Embora as membranas híbridas polímero/lipídico nem sempre igualem a estabilidade química dos sistemas puros^{de polímeros,} elas oferecem um compromisso atraente ao combinar a robustez mecânica dos polímeros com a relevância biológica dos lipídios. Isso resulta em um ambiente de membrana que imita mais de perto as membranas biológicas nativas, preservando as principais vantagens dos materiais sintéticos. Tais arquiteturas híbridas podem oferecer vantagens adicionais, incluindo a redução da permeabilidade dos prótons decorrente do rearranjo^{em nanoescala 1} e a formação de domínios dentro da^{membrana 15}.

Existem várias técnicas para reconstituir proteínas de membrana em vesículas de tamanho nanométrico (LUVs), incluindo reconstituição mediada por solvente orgânico (por exemplo, evaporação em fase reversa, reidratação de filmes de proteínas lipídicas), abordagens mecânicas (por exemplo, sonicação, prensa francesa, congelamento-descongelamento) e reconstituição mediada por detergente (via remoção de detergente, diluição ou incorporação direta)¹⁸, além de estratégias mais recentes como a transferência direta de nanodiscos de copolímero de estireno-ácido^maleico19. Enquanto as porinas foram incorporadas com sucesso em LUVs poliméricos por inserção direta, por exemplo, adicionando a proteína ao filme polimérico durante a^{reidratação 8}. Essa abordagem geralmente resulta em baixa eficiência de inserção para proteínas de membrana maiores ou mais complexas e frequentemente leva a uma orientação aleatória das proteínas. Consequentemente, a reconstituição mediada por detergente, que envolve a adição controlada do detergente seguida de sua remoção, continua sendo o método mais amplamente utilizado. Também é a estratégia preferida para incorporar proteínas de membrana maiores em LUVs baseados em polímeros, especialmente para proteínas assimétricas onde a orientação controlada é crucial para a função. Nessa abordagem, membranas de vesículas são primeiro saturadas com o detergente escolhido (a concentração de detergente saturante é denotada como_{R saturado}), parcialmente solubilizadas (coexistência de vesículas e micelas) ou totalmente solubilizadas, ou seja, quebradas em micelas (a concentração do detergente é denotada como R_sol). Esse tratamento inicial com membrana é seguido pela adição de proteína, incubação e remoção do^{detergente 18}. Esta última pode ser alcançada por diálise, cromatografia de exclusão de tamanho ou adsorção em esferas de poliestireno hidrofóbicas (por exemplo, Bio-Esferas). A escolha do detergente, sua concentração e o método de remoção são otimizados para cada tipo de membrana e proteína, maximizando a eficiência de incorporação e controle da orientação^{da proteína 20}.

Embora os LUVs sejam bem adequados para medições de atividade em massa, estudos de vesícula única e análises baseadas em microscopia óptica exigem que proteínas de membrana sejam reconstituídas em vesículas unilamelares gigantes (GUVs). Cinco abordagens principais são usadas para a incorporação de proteínas nos GUVs: coformação na presença de proteína e solvente^{orgânico 21}, coformação na presença de^{detergente 22}, inserção em GUVs pré-formados via diluição^{de detergente 23}, inserção por fusão de membrana com proteo-LUVs^16,24 e fusão-eletroformação²⁵. Embora essas abordagens tenham sido aplicadas com sucesso a GUVs lipídicos, sua transferência para GUVs híbridos de polímero ou polímero/lipídico é frequentemente desafiadora. Em particular, métodos de coformação e diluição de detergente frequentemente resultam em baixas eficiências de inserção em membranas poliméricas ou são incompatíveis com certas composições^{poliméricas 15}. Estratégias baseadas em fusão 4,16,24,26,27 que dependem de agentes fusogênicos adicionais também podem ser problemáticas, pois lipídios/polímeros catiônicos sintéticos ou peptídeos fusogênicos podem comprometer a estabilidade das proteínas de membrana, alterar suas propriedades ou reduzir a eficiência de incorporação da proteína alvo. A eletroformação por fusão supera muitas dessas limitações e provou ser um método robusto e eficiente para incorporar proteínas de membrana em polímeros e híbridos polímero/lipídico^{GUVs 1,5,15}. Essa abordagem permite a incorporação controlada de proteínas enquanto preserva a integridade e a funcionalidade da proteína, tornando-a particularmente adequada para a geração de GUVs poliméricos funcionalizados por proteínas.

Reconstituir bombas de prótons em vesículas baseadas em polímeros é essencial para construir células artificiais duráveis, pois possibilita a geração de gradientes de prótons transmembrana — a moeda energética fundamental dos sistemas vivos. Ao recriar a conversão de energia quimiosmótica em um ambiente controlado de membrana^{mínima 28}, essas vesículas podem impulsionar a síntese de ATP, o transporte ativo e as reações metabólicas, estabelecendo a base energética necessária para uma funcionalidade autônoma e realista. Uma bomba de prótons representativa usada nesses sistemas é a citocromo bo₃ oxidase de E. coli, uma enzima respiratória terminal que acopla a redução de oxigênio à translocação de prótons através da membrana. Como a transferência de elétrons e o bombeamento de prótons são fortemente acoplados, sua atividade em vesículas sintéticas pode ser monitorada quantitativamente, seja pelo consumo^{de oxigênio 1,20} ou pelo acompanhamento da formação do gradiente de^{prótons 1}.

Neste protocolo, apresentamos um fluxo de trabalho detalhado para a preparação de LUVs baseados em PDMS-g-PEO, incluindo membranas puras de polímero e híbridos polímero/lipídico, sua funcionalização com proteínas de membrana, escalabilidade para GUVs e medições de atividade da bomba de prótons reconstituída citocromo bo₃ oxidase por meio de ensaios de consumo de oxigênio a granel e medições de bombeamento de prótons com vesícula única.

Protocolo

NOTA: Todo lixo químico perigoso gerado durante este protocolo deve ser descartado de acordo com as regulamentações institucionais e locais.

1. Preparação para Bio-Esferas SM-2

NOTA: Bio-Esferas SM-2 são pré-lavadas com metanol para remover conservantes e contaminantes orgânicos antes da adsorção do detergente.

1. Coloque papel filtro em um funil de vidro sobre um béquer ou frasco de vidro limpo.
2. Adicione pelo menos 600 mg de Bio-Beads SM-2 ao funil (suficiente para 3 repetições de reconstituição tanto para LUVs híbridos quanto de polímero).
   NOTA: É necessário um mínimo de 90 mg de Bio-Beads SM-2 por reconstituição, conforme especificado no passo 4.4.1. Uma quantidade maior pode ser preparada se mais reconstituições forem planejadas.
3. Lave as esferas três vezes com metanol puro, usando volume suficiente para imergir completamente as esferas a cada vez.
   ATENÇÃO: Realize todas as etapas de manuseio de metanol em uma exaustão química.
4. Lave imediatamente as esferas três vezes com água Milli-Q para remover o metanol residual.
   NOTA: Não deixe as esferas secarem durante o procedimento de lavagem. Ao remover as soluções de lavagem, certifique-se de que as gotas permaneçam úmidas e não fiquem completamente secas.
5. Transfira as esferas lavadas para um recipiente adequado para armazenamento (por exemplo, um tubo de centrífuga de polipropileno estéril de 50 mL ou garrafa de vidro com tampa bem vedada), adicione água Milli-Q até que as esferas fiquem completamente submersas e armazene a 4 °C por até 3 meses.

2. Marcagem por fluorescência de proteínas de membrana

1. Diluição de proteínas
   1. Dissolva citocromo bo₃ oxidase em 2,2 mg/mL em um tampão HEPES de 20 mM contendo 0,05% de n-dodecil β-D-maltosídeo (DDM) (p/v), pH 8,3. Esse pH garante uma fração suficiente de aminas primárias não protonada (reativas) para uma marcação eficiente.
      NOTA: Para uma marcação ideal com corantes ATTO N-hidroxisuccinimidil (NHS), mantenha o pH do tampão entre 8,3 e 8,5. Para outros corantes, siga as instruções do fabricante para conjugação de proteínas, incluindo as condições recomendadas de rotulagem.
2. Adição de corante
   1. Adicione um excesso de oito molares de éster ATTO 643 N-hidroxisuccinimidil (NHS) reativo à amina, dissolvido a 2 mg/mL em DMSO anidro, à solução proteica.
      NOTA: Para outros corantes, siga as instruções do fabricante para conjugação de proteínas, incluindo o excesso molar recomendado de corante para proteína.
   2. Misture suavemente batendo três vezes no tubo da microcentrífuga para garantir uma distribuição homogênea do corante.
3. Incubação
   1. Incube a mistura de reação em temperatura ambiente (20–25 °C) por 1,5 h sob agitação suave (250 rpm) em um termomisturador, no escuro, para evitar o fotobranqueamento.
4. Remoção do corante não ligado
   1. Equilibre a coluna Superdex 200 10/300 GL (CV: 23,562 mL) com pelo menos 2 volumes de coluna (aproximadamente 48 mL) de tampão de elução proteica de membrana (20 mM HEPES, pH 7,5, 200 mM KCl, 0,05% DDM (p/v)) a uma vazão de 0,3 mL/min usando um sistema de purificação ÄKTA.
      NOTA: Para a remoção do excesso de corante fluorescente, colunas de filtração em gel mais curtas (10–20 cm de comprimento de leito) geralmente são suficientes, especialmente para corantes menos hidrofílicos. O fabricante do corante recomenda a dessalinização usando uma matriz Sephadex G-25. Uma coluna Superdex 200 10/300 GL foi usada neste estudo devido à disponibilidade do instrumento.
   2. Coloque até 500 μL da proteína marcada usando um loop capilar de 1 mL e elute com o mesmo tampão a 0,3 mL/min.
   3. Monitore a elução medindo absorção em 280 nm para proteína e 643 nm para corante ATTO 643.
   4. Colete frações de 0,5 mL em volumes de 1,5 coluna. Identifique frações que contenham tanto proteína quanto corante. Use diretamente se estiver suficientemente concentrado, ou concentre usando unidades de filtro centrífugo Amicon. Para concentração usando filtros Amicon, utilize um filtro centrífugo com corte molecular de 30 kDa e centrifuge a 14.000 × g por 30 minutos a 4 °C.
5. Determinação da concentração de proteínas e do grau de marcação (DOL)
   1. Meça os espectros de absorção do conjugado purificado.
   2. Calcule a concentração de proteínas e o número médio de moléculas de corante por enzima usando:
      
      onde A_max representa a absorção do conjugado no máximo de absorção do corante (λ_abs; ATTO 643, λ = 643 nm), A₂₈₀ é a absorção a 280 nm (máximo de absorção das proteínas), ε_prot é o coeficiente de extinção molar da citocromo _bo3 oxidase desnaturada (184.720 M⁻¹cm⁻¹), ε_corante é o coeficiente molar de extinção do corante (150.000 M⁻¹cm⁻¹), e CF₂₈₀ é o fator de correção para a absorvância ATTO 643 em 280 nm (0,04).

3. Preparação de grandes vesículas unilamelares (LUVs)

1. Preparação de polímero fino ou filme polimérico/lipídico
   1. Use pipetas de deslocamento positivo com pontas resistentes a solventes ou seringas de vidro herméticas para transferir soluções de polímero, lipídio e corante fluorescente dissolvidas em clorofórmio:metanol (2:1, v/v) para um frasco de vidro limpo, conforme as composições listadas na Tabela 1.
      CUIDADO: Realize toda a manipulação de solventes sob uma capela de exaustão enquanto usa luvas de proteção e óculos de proteção.
   2. Misture a solução cuidadosamente com um vórtice suave enquanto mantém o frasco na vertical para garantir a homogeneidade.
      ATENÇÃO: Ajuste cuidadosamente a velocidade do vórtice para evitar que o líquido respinge ou espirre do frasco em suas mãos.
   3. Evapore os solventes orgânicos sob um fluxo suave de nitrogênio na exaustão por aproximadamente 1 hora, até que uma película fina uniforme se forme na parede do frasco (Figura 1).
      NOTA: Ajuste o fluxo de nitrogênio para que o líquido se mova suavemente sem respingar; Um fluxo muito alto pode causar formação desigual de filmes. Após 5–10 minutos, o fluxo pode ser levemente aumentado para garantir a secagem completa e a espalhação uniforme da mistura da vesícula ao longo do fundo do frasco.
2. Reidratação de filme
   1. Reidrate o filme seco com 1 mL de tampão de reidratação (1 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM de sacarose) para obter uma concentração final de anfifílicos de 5 mg/mL (correspondente a 1,67 mM para polimerssomos e 2,14 mM para vesículas híbridas). Se polimersomas forem usados para reconstitução, suplemente o tampão de reidratação com 0,1% de colato de sódio.
      ATENÇÃO: O colato de sódio é um irritante leve. Evite contato prolongado com a pele e inalação de pó. Manuseio de acordo com a ficha de dados de segurança (SDS) do fabricante.
   2. Vórtice vigorosamente até que o filme seja completamente destacado e suspenso, formando vesículas multilamelares (MLVs).
3. Ciclos de congelamento-descongelamento (apenas vesículas híbridas)
   1. Submeta suspensões híbridas de MLV a cinco ciclos de congelamento-descongelamento da seguinte forma: congele as amostras em nitrogênio líquido por 1 minuto, descongele-as em banho-maria a 35 °C até que estejam completamente derretidas, e faça vórtice entre 2500 e 3000 rpm por 30 segundos usando um agitador de tubo. Repita esse procedimento por um total de cinco ciclos.
      NOTA: Pule essa etapa para polimersomas puros.
      ATENÇÃO: Nitrogênio líquido (−196 °C) pode causar queimaduras criogênicas graves. Manuseie em um local bem ventilado usando EPI apropriado (luvas criogênicas, óculos de proteção e jaleco). Evite contato com pele e olhos.
4. Extrusão
   1. Transfira a suspensão da vesícula para um mini-extrusor equipado com uma membrana de policarbonato de 100 nm com tamanho de poros.
   2. Extruda a suspensão 21 vezes para obter LUVs homogêneos em tamanho.
      NOTA: Certifique-se de que a etapa final de extrusão deixe a suspensão LUV na seringa oposta à seringa de carregamento inicial. Isso minimiza a contaminação da amostra final com vesículas maiores ou material residual que pode não ter passado completamente pela membrana.
5. Armazenamento
   1. Armazene a suspensão de LUV a 4 °C e utilize-a dentro de uma semana para manter a distribuição do tamanho das vesículas e evitar agregação ou crescimento microbiano no tampão contendo sacarose.
   2. Antes do uso, homogeneize suavemente a suspensão do LUV por meio de vórtice.

4. Reconstituição da proteína de membrana em LUVs

1. Pré-tratamento das vesículas com detergente
   1. Transfira 200 μL de LUVs para um tubo microcentrífuga de 2 mL (Figura 1). Se usar LUVs híbridos, adicione 1 μL de 20% (p/v) de colato de sódio para obter uma concentração final de detergente de 0,1% (p/v). Se for usado LUVs poliméricos, não é necessário detergente adicional, pois o colato de sódio já está presente.
      NOTA: Prepare o estoque de detergente no mesmo tampão usado nos experimentos para garantir a compatibilidade com as vesículas.
   2. Misture suavemente batendo levemente no tubo da microcentrífuga três vezes. Evite agitação vigorosa ou vórtice, que podem criar espuma e introduzir bolhas de ar.
2. Introdução de proteína em vesículas tratadas com detergente
   1. Adicionar citocromo bo₃ oxidase (para medições de atividade) ou citocromo bo₃ oxidase–ATTO 643 (para imagem de fluorescência) às vesículas desestabilizadas pelo detergente para alcançar as seguintes concentrações finais de proteínas: para polimersomos, 0,556 μM para experimentos LUV e 1,112 μM para experimentos GUV; para vesículas híbridas, 0,714 μM para experimentos LUV e 1,428 μM para experimentos GUV.
      NOTA: Essas concentrações correspondem a uma proporção molar proteína-polímero de 1:3.000 para LUVs e 1:1.500 para GUVs.
   2. Adicione a proteína lentamente enquanto mistura suavemente, com o objetivo de distribuí-la uniformemente pela solução e evitar a concentração local excessiva.
      NOTA: O volume de proteína adicionada pode variar entre frações devido a diferenças na concentração de estoque proteico.
3. Montagem de complexos proteína–detergente–polímero
   1. Incube a mistura a 4 °C por 30 minutos com agitação leve (400 rpm) em um termomisturador para permitir a formação de conjuntos mistos de proteína, detergente e polímero antes da remoção do detergente.
4. Remoção de detergente
   1. Remova o detergente por meio da adição sequencial de Bio-Esferas SM-2 (Bio-Rad). Retire 30 mg de Bio-Esferas da solução de armazenamento, garantindo que permaneçam úmidos (úmidos, mas sem excesso de líquido). Adicione as esferas à amostra e incube por 30 minutos a 4 °C com agitação suave a 600 rpm em um termomisturador. Repita essa etapa mais duas vezes, totalizando 90 mg de Bio-Esferas e um tempo total de incubação de 1,5 h.
      NOTA: Use apenas bio-esferas totalmente hidratadas. Não transfira esferas secas, esferas aderindo às paredes do tubo de origem Bio-Beads ou contas flutuando na superfície. Se as esferas aderirem à parede do tubo de reação de reconstituição acima do nível líquido após a adição, centrifuge brevemente o tubo (por exemplo, 3–5 s em uma minicentrífuga de bancada) para coletar as esferas na parte inferior antes da incubação.
   2. Faça pellets nas Bio-Esferas por centrifugação a 2.000 × g por 2 minutos usando uma mini centrífuga de bancada. Colete cuidadosamente o sobrenadante sem mexer na bola de contas.
      NOTA: Como alternativa à centrifugação, deixe as esferas se depositarem por gravidade por aproximadamente 5 minutos e depois remova cuidadosamente o sobrenadante.
5. Armazenamento
   1. Armazene bo-3-LUVs reconstituídos a 4 °C e utilize-os no mesmo dia para medições de atividade proteica.

5. Tamanho e dispersão dos LUVs por espalhamento dinâmico da luz (DLS)

1. Carregando LUVs para medições DLS
   1. Transfira 45 μL de suspensão de LUV ou proteo-LUV não diluído para um cuvette de quartzo limpo. Certifique-se de que a cuveta esteja livre de poeira, impressões digitais ou outros resíduos para minimizar artefatos de dispersão de luz.
      NOTA: Evite introduzir bolhas de ar, pois elas podem interferir nas medições do DLS. Para evitar bolhas, pipete lentamente a amostra ao longo da parede da cuveta e não expeite a última gota com força. Se pequenas bolhas se formarem, deixe-as subir e se dissipar antes da medição.
2. Determinação do tamanho e dispersão do LUV por DLS
   1. Meça o diâmetro hidrodinâmico e o índice de polidispersidade (PDI) usando um instrumento DLS equipado com um laser hélio-néon de 633 nm e detecção de retroespalhamento em um ângulo fixo de 173°.
   2. Realize pelo menos três medições independentes por amostra para garantir a reprodutibilidade.
   3. Analise os dados usando o modelo de uso geral (distribuição normal) para obter o tamanho médio e o PDI.

6. Análise do consumo de oxigênio dos LUVs

1. Configuração de temperatura
   1. Ajuste a câmara de medição de um sistema de eletrodos de oxigênio do tipo Clark para 22 °C e permita que o sistema se equilibre.
2. Adição de buffer
   1. Adicione 1 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM de tampão de sacarose à câmara de medição, para um volume total de 1.000 μL. Ajuste o volume do tampão de acordo com o tipo de amostra: 942,9 μL para polímeros bo 3-LUVs e 953,7 μL para híbridos bo 3-LUVs.
      NOTA: O volume restante será ocupado por LUVs e pela mistura DTT/Q₁ para alcançar o volume final de medição.
3. Adição de LUVs
   1. Adicione _bo-3-LUVs à câmara de medição e comece a mexer suavemente usando o agitador magnético a 100 rpm e 22 °C. Ajuste o volume dos bo 3-LUVs para alcançar uma concentração teórica de oxidase bo₃ de aproximadamente 27 nM: 48,6 μL para polímeros bo 3-LUVs e 37,8 μL para híbridos bo 3-LUVs.
      NOTA: Para o controle negativo, substitua os_BO-3-LUVs por um volume equivalente de LUVs livres de proteína com a mesma composição e concentração lipídica/polímero. Todas as etapas subsequentes permanecem idênticas.
4. Medição de linha de base
   1. Deixe a concentração de oxigênio estabilizar e meça por 3 minutos sob agitação constante a 22 °C para obter uma linha de base estável.
5. Preparação da mistura redutora/quinona
   1. Prepare frescamente a mistura DTT/Q₁ imediatamente antes do uso, misturando 9,6 μL de 1 M de DTT em água Milli-Q com 0,6 μL de 80 mM ubiquinona-1 (Q₁) em DMSO, depois faça um vórtice completo para garantir homogeneidade.
6. Ativação enzimática
   1. Ative a oxidase bo₃ adicionando 8,5 μL da mistura recém-preparada de DTT/Q₁ à câmara de medição, resultando em concentrações finais de 8 mM de DTT e 40 μM Q₁.
7. Replicas
   1. Meça cada amostra três vezes para garantir a reprodutibilidade.
8. Análise de dados
   1. Plote a concentração de oxigênio em função do tempo. Determine a inclinação da porção linear da curva, que corresponde à taxa de consumo de oxigênio.
9. Relatórios
   1. Informe a taxa de consumo de oxigênio como a média de três medições, com o desvio padrão.

7. Preparação de GUVs funcionalizados por proteínas

1. Limpeza por plasma de lâminas de vidro revestidas com ITO
   1. Coloque lâminas de vidro revestidas com óxido de índio-estanho (ITO) no limpador de plasma com o lado condutor (revestido com ITO) voltado para cima. O plasma os limpa por 1 minuto em alta potência ("HI") (230 V, potência máxima de RF 18 W) e pressão de aproximadamente 0,5 mbar.
      NOTA: A ignição bem-sucedida do plasma pode ser confirmada visualmente pelo aparecimento de um brilho rosa/roxo dentro da câmara.
2. Desidratação parcial de proteo-LUVs
   1. Misture 20 μL de LUVs livres de proteína com 20 μL de proteo-LUVs contendo bo-3oxidase-ATTO 643 reconstituído. Leve o vórtice para garantir uma mistura homogênea.
   2. Deposite sete gotículas de 2 μL da suspensão resultante de 5 mg/mL LUV/proteo-LUV na superfície condutora (revestida com ITO) de cada lâmina usada para eletroformação (Figura 2A). Distribua as gotículas uniformemente pela superfície de 160,6^{mm 2} , mantendo-as separadas para promover a formação uniforme do filme.
      NOTA: Para outros sistemas poliméricos, a concentração de LUV e o volume de gotículas podem exigir otimização (faixa típica: 5–100 mg/mL LUVs; 0,2–2 μL gotículas).
   3. Deixe as gotículas se desidratarem parcialmente em temperatura ambiente (∼22 °C) e com umidade de ∼20% por aproximadamente 40 minutos, ou até que um anel branco se forme no perímetro das gotículas (Figura 2B).
      NOTA: A desidratação depende da umidade ambiente. Se a umidade relativa estiver acima de 40%, estenda o tempo de desidratação conforme necessário (até 20 minutos). Determine o ponto final com base na aparência de um anel branco no perímetro da gotícula, em vez de em um tempo fixo. Sob condições ambientais consistentes (temperatura e umidade), o tempo de desidratação necessário é reproduzível. Evite a secagem excessiva, que é evidente como gotículas completamente planas e uniformemente brancas, pois isso pode causar precipitação de proteínas.
3. Montagem da câmara de eletroformação
   1. Monte a câmara de eletroformação sanduíche dois slides revestidos com ITO (lados revestidos voltados para dentro) separados por um espaçador de silicone de 1,81 mm de espessura com um corte em um dos lados, o que permite adicionar ou remover o tampão durante o enchimento e a coleta.
   2. Encha a câmara com tampão de reidratação (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM de sacarose).
      Para experimentos sensíveis ao pH, adicione pirarina de 10 μM (8-hidroxipireno-1,3,6-ácido trissulfônico sal trissódico, HPTS) ao tampão.
4. Eletroformação
   1. Aplique um campo elétrico alternado senoidal usando o seguinte programa: 50 Hz em 50, 100, 200, 300, 500, 700 e 900 mV por 6 minutos cada; 50 Hz em 1,1 V para 2 horas.
      NOTA: Para promover a formação de proteo-GUVs maiores, esse passo pode ser estendido para 12 horas, e 4 Hz a 2 V por 30 minutos para o passo de descolamento. Quando o buffer contém piranina de 10 μM, aumente a frequência para 500 Hz durante os dois primeiros passos de rampa de tensão.
5. Coleção de GUVs
   1. Abra cuidadosamente a câmara usando uma pinça e colete GUVs usando pipetas FineTip Ultra-Micro Pastette (ou pipetas equivalentes de baixa cisalhamento) para minimizar o estresse mecânico.
      NOTA: Evite usar pontas padrão de pipeta de baixo volume abaixo de 200 μL, pois elas podem romper GUVs maiores. Alternativamente, pontas padrão podem ser cortadas na extremidade para alargar a abertura e reduzir o cisalhamento durante a coleta.
6. Armazenamento
   1. Armazene proteo-GUVs a 4 °C e utilize em até 48 horas para preservar a atividade proteica.
      NOTA: A taxa de perda de atividade depende do tipo e da estabilidade da proteína de membrana reconstituída, bem como da composição da membrana.

8. Microscopia de GUVs funcionalizados por proteínas

1. Configuração do microscópio
   1. Ligue o microscópio confocal. Se estiver usando o sistema Leica, lance o software LAS X. Para outras marcas de microscópios, utilize o software de aquisição recomendado pelo fabricante.
   2. Selecione um objetivo de imersão em óleo de 63× (NA 1,40); ajuste para uma ampliação maior ou menor se necessário, dependendo do tamanho do GUV.
   3. Abra dois canais de imagem correspondentes aos fluoróforos: Rhodamine Red (membrana) e ATTO 643 (proteína reconstituída).
      NOTA: Para fluoróforos com espectros parcialmente sobrepostos, selecione linhas de laser apropriadas e janelas de detecção estreitas para minimizar a diafonia espectral. Adquira cada canal sequencialmente para evitar o vazamento do sinal e garantir uma quantificação precisa da fluorescência.
2. Sedimentação de GUVs
   1. Coloque um isolador de silicone press-to-seal sobre um vidro limpo No. 1.5 (0,17 mm de espessura).
      NOTA: Para microscópios verticais (não invertidos), podem ser usados lâminas de vidro mais grossas.
   2. Pipete 60 μL de tampão (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM de glicose) no centro do espaçador.
   3. Adicione suavemente 20 μL da suspensão GUV sobre o buffer.
   4. Cubra imediatamente a câmara com uma segunda lâmina de vidro para evitar evaporação.
   5. Deixe os GUVs sedimentarem por ~5 minutos antes da imagem.
3. Aquisição de imagem
   1. Foque na parte inferior da câmara para capturar seções transversais dos GUVs.
   2. Adquira imagens de diferentes GUVs em toda a câmara escaneando sistematicamente do canto superior esquerdo até o canto inferior direito (padrão "serpente") para obter uma população representativa (~100 GUVs). Imageie todas as vesículas encontradas durante a varredura sem pré-seleção, independentemente do tamanho ou intensidade de fluorescência, para evitar viés de seleção e garantir a reprodutibilidade.
      NOTA: Evite imagens repetidas do mesmo GUV para evitar o fotodescolorimento (fotobleicing).
4. Análise de imagens
   1. Quantifique a intensidade de fluorescência da proteína reconstituída marcada com ATTO 643 desenhando uma polilinha ao longo da membrana de GUVs individuais. Ao usar o software LAS X, selecione Quantify → Line Profile, depois escolha a ferramenta poliline e trace a membrana de cada GUV. Para obter a intensidade média de fluorescência, abra o Statistics e registre o valor médio. Analisar apenas GUVs limpos e unilamelares; Exclua vesículas multivesiculares e vesículas agregadas da análise.
      NOTA: Se as medições forem adquiridas em dias diferentes, as intensidades de fluorescência devem ser normalizadas à potência do laser, medida sob configurações de imagem idênticas (comprimento de onda e potência nominal). Para levar em conta as variações diárias na saída do laser, aplica-se a seguinte normalização: , onde F_a.u. é a intensidade de fluorescência medida em unidades arbitrárias, P_referência é a potência do laser medida no dia de referência, e é a potência do laser medida no dia da aquisição. Essa correção assume uma relação linear entre potência do laser e intensidade de fluorescência sob condições de iluminação não saturada. No presente estudo, todas as imagens foram adquiridas no mesmo dia, e a normalização não foi necessária.
   2. Reporte a intensidade de fluorescência como uma média de 100 GUVs com o desvio padrão correspondente.

9. Análise de bombeamento de prótons em proteo-GUVs

1. Configuração do microscópio
   1. Ligue o microscópio confocal e inicie o software de aquisição apropriado (por exemplo, LAS X para sistemas Leica).
   2. Selecione uma meta de imersão em óleo de 63× (NA 1,40). Ajuste para uma ampliação maior ou menor se necessário, dependendo do tamanho do GUV.
   3. Configure três canais de imagem correspondentes aos fluoróforos. Para Rhodamine Red (marcador de membrana), use uma excitação de 561 nm e uma faixa de emissão de 570–620 nm. Para piranina (corante encapsulado sensível ao pH), utilize excitações em 448 nm e 405 nm, e colete emissão entre 499 e 551 nm.
      NOTA: Se um laser de 458 nm estiver disponível, use-o em vez de 448 nm para excitar a forma desprotonada (básica) da piranina.
   4. Ajuste a potência do laser e o ganho do detector para evitar a saturação dos pixels e minimizar o fotobranqueamento. Mantenha as configurações de aquisição constantes durante todo o experimento.
2. Sedimentação de GUVs
   1. Adicione 280 μL de tampão (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM de glicose) a um poço de uma lâmina com 8 poços (volume total do poço: ~874 μL).
      NOTA: Não use menos que 200 μL, pois volumes abaixo de 200 μL aumentam a evaporação e a deriva do pH. Não exceda 400 μL para evitar derramamentos e garantir pipetas confortáveis. Se usar um formato de câmara diferente, ajuste o volume de acordo. Para microscópios invertidos, use lâminas de câmara compatíveis com a espessura do coverslip #1.5H.
   2. Adicione suavemente 20 μL da suspensão _{BO 3-GUV} sobre o amortecedor sem introduzir bolhas de ar.
      NOTA: Para o controle negativo, substitua a suspensão _{bo 3-GUV} por um volume equivalente (20 μL) de GUVs livres de proteínas da mesma composição lipídica/polímero, preparados e sedimentados sob condições idênticas. Esse controle leva em conta quaisquer efeitos inespecíficos da DTT e do Q₁ na razão de fluorescência da piranina que sejam independentes da atividade da oxidase bo₃.
   3. Deixe os GUVs sedimentarem por aproximadamente 5 minutos antes da imagem.
3. Aquisição de base
   1. Foque no plano inferior da câmara onde os GUVs se sedimentaram.
   2. Ajuste o zoom para obter de 3 a 6 GUVs dentro do campo de visão.
   3. Registre a fluorescência de base em todos os canais por 5 minutos antes da ativação.
4. Ativação do bombeamento de prótons
   1. Prepare uma mistura nova de DTT–Q₁ imediatamente antes do uso, misturando 4,8 μL de 1 M de DTT com 0,3 μL de 80 mM Q₁ em DMSO, depois misture cuidadosamente por vortexing.
   2. Ative a citocromo bo₃ oxidase adicionando suavemente 2,6 μL da mistura DTT–Q₁ na superfície da solução sem inserir a ponta da pipeta no tampão, resultando em concentrações finais de aproximadamente 8 mM de DTT e 40 μM Q₁ na câmara.
   3. Monitore a fluorescência de piralina intravesicular por 30 minutos sob aquisição contínua.
5. Análise da fluorescência de piralina intravesicular
   1. Para cada GUV, defina uma região de interesse (ROI) dentro do lúmen da vesícula. No software LAS X, vá em Quantify → Stack Profile, selecione Desenhar Elipse e desenhe um retorno de investimento circular dentro de cada GUV.
   2. Para determinar a intensidade média de fluorescência em 499–551 nm para ambos os comprimentos de onda de excitação (448 nm e 405 nm), abra o Statistics no software e registre o valor médio.
   3. Calcule a razão de fluorescência como R = I₄₄₈/I₄₀₅.
   4. Plote a razão ao longo do tempo para obter traços cinéticos da variação intravesicular do pH.

Resultados

A citocromo bo₃ oxidase de E. coli foi expressa a partir do plasmídeo pETcyo na cepa C43 (DE3) ΔcyoABCDE e purificada conforme descrito^{anteriormente 29}. A bo 3 oxidase purificada foi usada diretamente para reconstituição e medições de atividade, ou marcada com corantes fluorescentes, como o ATTO 643 (neste estudo) ou outros corantes^{ATTO 1,15}. Para corantes altamente hidrofílicos como o ATTO 643, uma coluna de 30 cm foi usada para alcançar a separação eficiente do corante não ligado da proteína marcada (Figura 3A). O grau de marcação (DOL), calculado a partir de espectros de absorção, normalmente variava de 1,1 a 1,3 moléculas de corante por enzima, dependendo do corante ATTO utilizado. Para _bo3 oxidase marcada com ATTO 643, o DOL foi 1,16 (Figura 3B).

Para a reconstituição de proteínas, os LUVs foram primeiro preparados por meio de reidratação em filme fino, seguidos por ciclos de congelamento-descongelamento e extrusão para obter tamanhos uniformes de vesículas. Para os polimersomos, o tampão de reidratação era complementado com detergente. As distribuições do tamanho das vesículas foram analisadas por espalhamento dinâmico da luz antes da reconstituição (Figura 4, Tabela 2). Tanto os LUVs híbridos quanto os poliméricos tipicamente apresentavam diâmetros médios de 85–95 nm com distribuições de tamanho estreitas (PDI < 0,2). Vesículas baseadas em PDMS-g-PEO devem ser ligeiramente menores do que o tamanho nominal dos poros da membrana extrusiva. Polimerssomos típicos apresentaram tamanhos altamente uniformes, com valores de PDI abaixo de 0,1, enquanto vesículas híbridas formaram populações razoavelmente uniformes com valores de PDI ocasionalmente acima de 0,1, mas consistentemente abaixo de 0,2.

A proteína de membrana bo₃ oxidase foi então inserida nos LUVs na presença de detergente (colito de sódio neste estudo). O detergente foi posteriormente removido usando Bio-Beads. Após a reconstituição, o tamanho do polimersoma aumentou apenas ligeiramente (Figura 4A), enquanto o tamanho da vesícula híbrida permaneceu inalterado (Figura 4B). Em ambos os sistemas, observou-se um pequeno aumento na PDI (Tabela 2). Mudanças de tamanho tão pequenas são esperadas, pois a solubilização e remoção mediadas por detergente podem reorganizar as cadeias poliméricas na membrana. A atividade proteica foi avaliada medindo o consumo de oxigênio, o que indica se a proteína manteve a atividade funcional (Figura 5A). A ausência de consumo de oxigênio no controle LUV negativo sem proteínas confirma que o sinal observado surge especificamente da atividade da _{bo-oxidase bo3}. Com a reconstituição mediada por colato de sódio nas concentrações usadas aqui, a atividade proteica foi tipicamente ligeiramente maior em vesículas híbridas em comparação com polimersomas (Figura 5B). Foi observada alguma variabilidade na atividade proteica entre lotes de purificação e até mesmo entre frações dentro do mesmo lote. Portanto, para estudos comparativos — como comparar a atividade proteica entre diferentes sistemas de membranas — a mesma fração de proteína purificada deve ser usada para garantir consistência.

Para gerar PDMS-g-PEO e PDMS-g-PEO/GUVs de soja, funcionalizados por proteína, foi empregada uma abordagem de fusão-eletroformação. Nesse método, proteo-LUVs foram misturados com LUVs livres de proteína e depositados em lâminas de vidro revestidas com ITO, seguidos por desidratação parcial para promover a fusão de vesículas e a formação de um filme polímero/proteína ou polímero/lipídio/proteína. Desidratação insuficiente resultou em baixo rendimento de proteo-GUV, tamanho menor de GUV e presença de (proteo-)LUVs não fundidos.

A incorporação bem-sucedida da proteína marcada, bo₃ oxidase–ATTO 643, na membrana foi confirmada por microscopia confocal após a sedimentação dos GUVs em um gradiente de densidade de sacarose/glicose (Figuras 6A, B). A quantificação da fluorescência associada à membrana usando um perfil de linha simples pode ser enviesada, pois a intensidade medida depende do ângulo em que a linha é desenhada. Para minimizar esse efeito, a intensidade da fluorescência foi avaliada usando uma polilinha desenhada ao longo de todo o contorno da membrana de cada GUV.

Para avaliar possíveis correlações entre o tamanho da vesícula e a incorporação de proteínas, o diâmetro do GUV foi analisado em paralelo (Figura 6C, D). GUVs maiores (acima de 20 μm) tipicamente apresentavam menor fluorescência proteica associada à membrana em comparação com vesículas menores. Essa observação pode ser atribuída ao mecanismo fusão-eletroformação: vesículas menores se formam mais cedo e podem incorporar proteínas de forma mais eficiente, enquanto vesículas maiores surgem de eventos de fusão subsequentes e crescimento de membranas, potencialmente levando à diluição com material pobre em proteínas.

A incorporação geral de proteínas é determinada principalmente no estágio inicial da reconstituição em LUVs, especialmente pelo tipo de detergente, concentração e a etapa em que é adicionado. Para LUVs poliméricos, uma incorporação ligeiramente menor foi observada quando detergente foi adicionado às vesículas pré-formadas em comparação com a adição durante a formação da vesícula (etapa de reidratação), resultando em intensidades de fluorescência de 18,9 ± 3,9 u. e 20,6 ± 3,7 u., respectivamente (Figura 6C, D, à esquerda). Para sistemas híbridos, onde detergente é adicionado após a formação da vesícula, a concentração de detergente desempenha um papel notável: o aumento do colato de sódio de 0,015% para 0,1% levou a um aumento significativo na incorporação de proteínas (22,1 ± 5,2 u.a. vs. 26,2 ± 5,0 u.a., Figura 6C, D, à direita). Comparando sistemas poliméricos e híbridos, uma incorporação ligeiramente maior de bo-3 oxidase pela membrana foi geralmente observada em GUVs híbridos. Isso provavelmente se deve à presença de defeitos de empacotamento nas interfaces polímero–lipídio, que, além dos defeitos induzidos pelo detergente, fornecem locais de inserção favoráveis para proteínas de membrana.

Usando um segundo passo de eletroformação de 2 horas, o diâmetro médio dos GUVs funcionalizados por_{oxidase bo 3} foi de aproximadamente 14–15 μm (13,5 ± 3,7 μm para GUVs poliméricos e 15,4 ± 6,3 μm para GUVs híbridos), embora vesículas notavelmente maiores também estivessem presentes (Figura 6C, D). Aumentar a duração do segundo passo de eletroformação para 12 horas resultou em um aumento geral do tamanho do^{GUV 1,27}.

O protocolo fusão-eletroformação também permite o encapsulamento de espécies solúveis em água, como corantes sensíveis ao pH (por exemplo, piranina), adicionando o corante ao tampão de reidratação durante a eletroformação (Figura 7A). O tamanho do GUV normalmente diminui quando vesículas são formadas na presença de corantes solúveis em água. Para compensar esse efeito, a frequência durante os passos iniciais da eletroformação deve ser aumentada de 50–500 Hz.

O encapsulamento de um corante sensível ao pH ratiométrico, como a piranina, permite o monitoramento de vesícula única do bombeamento de prótons e fornece insights sobre a orientação das bombas de próton. Com a acidificação do lúmen da vesícula, a razão de fluorescência da pirania excitada em 448 nm e 405 nm diminui. Essa razão reflete o estado de protonação da pirania e, portanto, correlaciona-se com o pH. Medições ratiométricas são vantajosas, pois são em grande parte insensíveis a variações na eficiência do encapsulamento de corantes e no fotobranqueamento. Um exemplo de atividade de bombeamento de prótons é mostrado na Figura 7B, onde uma diminuição na razão de fluorescência de pirania intravesicular (I₄₄₈/I₄₀₅) é observada em GUVs híbridos contendo bo-3oxidase reconstituída após a adição do doador de elétrons DTT e do mediador de elétrons Q₁. A razão de fluorescência começa a diminuir bruscamente aproximadamente 1 minuto após a ativação e continua a diminuir rapidamente por cerca de 1 minuto, depois desacelera nos ~18 minutos seguintes. Esse comportamento indica que a maioria das moléculas de bo₃ oxidase está orientada de modo que o bombeamento de prótons ocorre em direção ao interior dos GUVs. GUVs sem proteínas, submetidos a condições idênticas, apresentaram uma diminuição menor na razão de fluorescência, servindo como controle negativo e confirmando que a maior diminuição observada em BO_3-GUVs decorre especificamente da atividade de bombeamento de prótons da oxidase bo₃, e não dos efeitos inespecíficos da DTT e Q₁ na razão de fluorescência da piranina.

Figura 1. Representação esquemática da preparação de grande vesícula unilamelarem (LUV), reconstituição da proteína de membrana citocromo bo₃ oxidase em LUVs e formação de vesículas unilamelares gigantes funcionalizadas por bo₃ oxidase (GUVs) por meio da abordagem de fusão-eletroformação. Os LUVs são preparados por reidratação em filme fino, ciclos de congelamento-descongelamento e extrusão através de uma membrana do tamanho de um poro de 100 nm. A reconstituição da citocromo bo₃ oxidase é realizada na presença de detergente, que é posteriormente removido usando Bio-Beads. Os_bo-3-GUVs são formados depositando _bo-3-LUVs sobre lâminas de vidro revestidas com óxido de índio-estanho (ITO), seguidas por desidratação e reidratação parcial na presença de corrente elétrica. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2. Formação de um filme de vesícula unilamellar grande fundida (LUV) por desidratação. Sete gotículas de 2 μL de proteo-LUVs mistos e LUVs foram depositadas em lâminas de vidro revestidas com óxido de índio-estanho (ITO): (A) imediatamente após a deposição e (B) após desidratação parcial. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3. Marcagem fluorescente do citocromo bo₃ oxidase. (A) Cromatograma (perfil de elução) de bo 3 oxidase-ATTO 643 purificado em uma coluna Superdex 200 10/300 GL. As frações destacadas em cinza foram coletadas e posteriormente concentradas. (B) Espectros de absorção da concentrada bo₃ oxidase-ATTO 643, mostrando picos em 280 nm (proteína), 400 nm (banda de Soret dos cofatores hemo na bo₃ oxidase) e 643 nm (corante). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4. Distribuições de tamanho das grandes vesículas unilamelares (LUVs) antes e depois da reconstituição proteica: (A) polímero poli(dimetilsiloxano)-enxerto (óxido de etileno) (PDMS-g-PEO) e (B) vesículas híbridas PDMS-g-PEO/fosfatidilcolina de soja (PC). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5. Consumo de oxigênio pela _bo-oxidase reconstituída em grandes vesículas unilamelares (LUVs). (A) Traço representativo da concentração de oxigênio ao longo do tempo após a ativação da citocromo _bo3 oxidase reconstituída pela adição de ditiotreitol (DTT) e ubiquinona-1 (Q₁). O traço verde corresponde aos LUVs reconstituídos por proteína, e o traço cinza ao controle negativo (LUVs livres de proteína). (B) Taxas de consumo de oxigênio (OCR) da _bo-3oxidase reconstituída em LUVs poli(dimetilsiloxano)-enxerto-poli (óxido de etileno) (PDMS-g-PEO) e PDMS-g-PEO/fosfatidilcolina de soja (PC). As barras representam a média ± desvio padrão (DE) de três medições independentes (n = 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6. Inserção de bo-3oxidase marcada fluorescentemente em vesículas unilamelares gigantes (GUVs). Micrografias representativas de (A) poli(dimetilsiloxano)-enxerto-poli(óxido de etileno) (PDMS-g-PEO) e (B) PDMS-g-PEO/fosfatidilcolina de soja (PC) GUVs (membranas marcadas com fosfatidiletanolamina-Rodamina (PE-Rho), vermelho) contendo citocromo bo3 oxidase-ATTO 643 (magenta) reconstituído. Quantificação da intensidade de fluorescência da bo₃ oxidase-ATTO 643 em função do tamanho do GUV (N = 100) para diferentes condições de reconstituição: (C) adição de 0,2% de colato de sódio (SC) a vesículas unilamelares grandes de polímero pré-formadas (LUVs) e 0,015% de SC a LUVs híbridos pré-formados; (D) LUVs poliméricos formados na presença de 0,1% de SC e LUVs híbridos tratados com 0,1% de SC após a formação. Os valores representam a intensidade de fluorescência de GUVs individuais (N = 100 por condição). Valores médios ± desvio padrão (SD) são reportados no texto. As comparações são descritivas; nenhum teste estatístico formal foi realizado. A.U. (unidades arbitrárias). Barra de escala = 20 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. Bombeamento de prótons por _bo-3 oxidase reconstituído em vesículas unilamelares gigantes (GUVs). (A) Micrografia representativa de fluorescência dos GUVs poli(dimetilsiloxano)-enxerto-poli (óxido de etileno) (PDMS-g-PEO)/fosfatidilcolina de soja (PC), com membranas marcadas com 0,05% fosfatidiletanolamina-Rodamina (PE-Rho, vermelho), contendo citocromo _bo3 oxidase reconstituída e piranina corante sensível ao pH encapsulada (excitação em 405 e 448 nm; canais azul e verde), sedimentados em uma lâmina de vidro com câmara. (B) Alteração na razão de fluorescência da piralina intravesicular após ativação com ditiotreitol (DTT) e ubiquinona-1 (Q₁) em GUVs de soja de PC que contêm bo-3oxidase reconstituída. O traço verde corresponde aos GUVs reconstituídos por proteína, e o traço cinza ao controle negativo (GUVs livres de proteína). O traço representa a média ± desvio padrão (DS) (n = 3 vesículas). Barra de escala = 20 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	Componente	Estoque	Valor	Composição final da membrana
Polimersomas	PDMS-g-PEO em clorofórmio:metanol (2:1, v/v)	10 mg/mL	499,9 μL	99,95% mol%
	PE-Rodamina no clorofórmio	1 mg/mL	1,1 μL	0,05 mol%
Vesículas híbridas	PDMS-g-PEO em clorofórmio:metanol (2:1, v/v)	10 mg/mL	450,1 μL	70 mol%
	Soja PC (95%) em clorofórmio	10 mg/mL	49,8 μL	29,95 mol%
	PE-Rodamina no clorofórmio	1 mg/mL	1,4 μL	0,05 mol%

Tabela 1: Soluções e volumes de material usados para preparação de filmes finos para formação de grandes vesículas unilamelares (LUV). As concentrações de stock são indicadas em mg/mL. Os volumes são calculados para um total de concentração de 5 mg/mL de anfifílios. A composição final da membrana é expressa em mol%. PDMS-g-PEO: poli(dimetilsiloxano)-enxerto-poli (óxido de etileno); PE-Rodamina: fosfatidiletanolamina-Rodamina; soja PC: fosfatidilcolina de soja; V/V: Volume/volume.

	Condição de reconstituição	Diâmetro (nm)	PDI
Polimersomas	Pré-reconstituição	84,34 ± 0,22	0.084
	Pós-reconstituição	100,73 ± 0,81	0.109
Híbridos	Pré-reconstituição	89,21 ± 0,77	0.129
	Pós-reconstituição	85,01 ± 0,42	0.17

Tabela 2: Tamanho médio da vesícula e índice de polidispersidade (PDI) de polimersomos (poli(dimetilsiloxano)-enxerto-poli (óxido de etileno), PDMS-g-PEO) e vesículas híbridas (PDMS-g-PEO/fosfatidilcolina de soja (PC)) antes e após a reconstituição. Os dados representam a média de três medições independentes.

Discussão

Polimersomas e vesículas híbridas polímero/lipídico exibem maior estabilidade química e mecânica em comparação com vesículas lipídicas convencionais, tornando-as altamente atraentes para aplicações que vão desde administração de fármacos e biosensição até nano e microrreatores e células artificiais. No entanto, sua arquitetura de membrana distinta e propriedades biofísicas frequentemente impedem a transferência direta de protocolos otimizados para vesículas lipídicas para sistemas baseados em^polímeros 15,20,30. O protocolo apresentado aqui aborda essas diferenças e oferece um fluxo de trabalho otimizado para a reconstituição de proteínas de membrana em polímeros e LUVs híbridos baseados em PDMS-g-PEO, seguido pela escalabilidade para GUVs por meio de eletroformação por fusão.

Uma etapa crítica no protocolo é a preparação de LUVs com distribuição de tamanho estreita e reproduzível. Assim como nos filmes lipídicos, os filmes PDMS-g-PEO se auto-montam em vesículas após a reidratação com um tampão aquoso. Em contraste com os sistemas lipídicos, que frequentemente produzem uma mistura de vesículas uni- e multilamelares, o PDMS-g-PEO forma preferencialmente estruturas^{unilamelares 1}, eliminando a necessidade de ciclos de congelamento-descongelamento tipicamente usados para reduzir a multilamelaridade em preparações lipídicas. A extrusão é realizada para padronizar a distribuição do tamanho das vesículas. Devido ao aumento da suavidade das membranas PDMS-g-PEO em relação às bicamadas^{lipídicas 1}, pressões de extrusão mais baixas são suficientes. Embora as 11 passagens de extrusão recomendadas pelo fabricante sejam geralmente suficientes, aumentar o número de passagens normalmente resulta em uma distribuição de tamanhos mais estreita e melhora na reprodutibilidade. No entanto, extrusão excessiva pode produzir vesículas ligeiramente menores que o tamanho nominal dos poros da membrana. A extrusão repetida também pode reduzir o rendimento das vesículas devido à perda de material; determinamos anteriormente que aproximadamente 31% do material de PDMS-g-PEO e 25% do material de vesícula PC DE PDMS-G-PEO/SOY foram perdidos após 21 passagens por uma^{membrana 1} de 100 nm. Portanto, o número de passagens de extrusão deve ser otimizado para equilibrar a uniformidade do tamanho com a integridade e o escoamento da vesícula.

A reconstituição mediada por detergente representa outro fator crucial para o sucesso. O tipo e a concentração ideais de detergente dependem tanto da proteína específica da membrana quanto da composição da^{membrana 3,20}. No caso de membranas poliméricas puras, quando as condições de saturação são ideais, incorporar detergente durante a reidratação do filme proporciona eficiências de inserção maiores do que as vesículas pré-formadas saturadas. Membranas poliméricas mais rígidas, como as formadas a partir de PBD-b-PEO, exigem concentrações substancialmente maiores de detergente para solubilização em^{membrana 30}, ressaltando a necessidade de otimização específica para polímeros. A inserção bem-sucedida deve ser verificada não apenas por medições de atividade — em comparação com micelas de detergente ou vesículas lipídicas — mas também por análise estrutural, como crio-TEM, para avaliar a profundidade de inserção e a adaptação da membrana ao desajuste^{hidrofóbico 1}. A orientação das proteínas é igualmente crítica, especialmente para bombas de prótons, já que um gradiente funcional de prótons exige que a maioria das bombas esteja uniformemente orientada. Idealmente, as bombas devem transportar prótons para dentro para permitir o acoplamento com processos que consomem gradiente, como a síntese^{de ATP 3,15}. A orientação pode ser avaliada usando etiquetas de proteína, por exemplo, ao temperar seletivamente corantes expostos ao exterior da vesícula ou ao deslocar marcadores fluorescentes fixados às etiquetas^{Him 20}. Essas abordagens são apresentadas como recomendações gerais para otimização de protocolos e não foram realizadas neste estudo.

A escala de proteo-LUVs para proteo-GUVs usando eletroformação de fusão-requer controle cuidadoso dos parâmetros de deposição e desidratação. A concentração de LUVs e o tamanho das gotículas influenciam criticamente o rendimento e a pureza finais dos GUV. Concentrações excessivamente altas de LUV (≥10 mg/mL) podem levar à permanecimento de LUVs não fundidos na amostra final, enquanto concentrações muito baixas (<5 mg/mL) reduzem o rendimento de GUV devido à insuficiente de material depositado. A desidratação deve ser parcial, e não completa — indicada pela aparição de um anel branco no perímetro da gota em vez de uma gota totalmente branca — pois a desidratação excessiva pode prejudicar ou abolir a atividade proteica da membrana, especialmente para bombas de prótons. Umidade e temperatura controladas são, portanto, essenciais para desestabilizar suficientemente as membranas para a fusão, preservando a funcionalidade das proteínas.

Cargas altas de proteínas podem diminuir o tamanho dos GUV, mas esse efeito pode ser mitigado diluindo LUVs funcionalizados por proteína com LUVs livres de proteína. Dessa forma, a densidade proteica dentro das membranas GUV pode ser modulada com precisão antes da deposição. Por exemplo, misturar _bo-3-LUVs altamente carregados com LUVs vazios (até 1:10, v/v) produz GUVs com diâmetros de 5–30 μm e conteúdo proteico ajustável, mantendo uma distribuição uniforme de^{membranas 27}. Embora essa estratégia resulte em populações heterogêneas de vesículas em termos de densidade proteica, procedimentos de calibração permitem a avaliação quantitativa dos níveis de^{incorporação 23,31}. Importante destacar que a abordagem de mistura permite uma carga total maior de proteína sem redução excessiva do tamanho²⁷ do GUV.

A análise funcional de proteínas reconstituídas pode ser realizada encapsulando corantes sensíveis ao pH, como a piranina, no tampão de eletroformação, para monitorar as mudanças de pH intravesiculares. Para uma imagem em tempo real confiável, as vesículas precisam sedimentar ou ser imobilizadas para evitar movimentos, o que embaçaria os sinais de fluorescência e dificultaria a quantificação precisa da dinâmica do pH intravesicular. A imobilização via acoplamento biotina–estreptavidina, utilizando lipídios biotinilados e superfícies revestidas com^{estreptavidina, 32}, proporciona fixação estável, mas pode alterar a composição ou tensão da membrana. A semiimobilização em armadilhas microfluídicas oferece uma alternativa que evita componentes adicionais de membrana e minimiza^{perturbações 1,33}. Embora medições de fluorescência em massa sejam possíveis após a remoção do corante externo por sedimentação repetida e troca de tampão, o corante residual associado à membrana pode interferir na leitura; portanto, a microscopia confocal de GUVs individuais geralmente é preferida.

Comparada a abordagens alternativas que tentam inserir proteínas diretamente em GUVs pré-formados, a estratégia de fusão-eletroformação permite otimização independente das condições de reconstituição no nível de LUV antes de escalar para GUVs. Esse fluxo de trabalho modular melhora a reprodutibilidade e o rendimento funcional, especialmente para membranas poliméricas e híbridas que são menos adequadas a protocolos convencionais baseados em lipídios. O método é compatível com uma ampla gama de proteínas^{de membrana,} incluindo sistemas multiproteicos¹⁵, e permite a funcionalização da membrana e a coencapsulação de componentes adicionais. Como tal, oferece uma plataforma versátil para construir células artificiais duráveis, microreatores e sistemas modelo para investigar interações polímero–proteína sob condições controladas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ÄKTA pure™ chromatography system	Cytiva	29018224
18:1 Liss Rhod PE	Avanti Research	810150
8 well chambered coverglass	Cellvis	C8-1.5H-N
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	Sigma Aldrich	UFC5030
ATTO 643 NHS ester	ATTO-TEC	AD 643-31
Bio-Beads SM-2	Bio-Rad	1523920
Cholic acid-Na-salt (sodium cholate)	Serva	361-09-1
Coenzyme Q1	TargetMol	TGM-T19594
Confocal microscope STELLARIS 5	Leica Microsystems	603810
DTT (Dithiothreitol)	Merck	10197777001
Fine Tip Ultra Micro Pastette	Pastette	LW4243
HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt)	Sigma Aldrich	6358-69-6
ITO-coated glass slides (25×75×1.1 mm, ≤20 Ohm/sq.)	pgo	CEC020S
LAS X software	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Mini centrifuge MCF-2360	LMS	24572
Mini-extruder	Avanti Research	610000
Oxytherm+P system	Hansatech Instruments	/
Plasma cleaner (benchtop)	Harrick Plasma	PDC-32G-2
Polycarbonate membranes 0.1 μm	Avanti Research	610005
Press-to-seal silicone isolator (round, 20 mm diameter, 1 mm depth)	Grace Bio-Labs	41161502
Silicone spacers (round, 24.2 mm outer diameter, 14.3 mm inner diameter, 1.8 mm depth)			laboratory-made, cut from silicone sheet
Soy PC (95%)	Avanti Research	441601
Specord 50 PLUS spectrophotometer	Analytik Jena	823-0200P-3
Superdex 200 10/300 GL column (column L × I.D. 30 cm × 10 mm)	Cytiva	28-9909-44
Test tube shaker (2800 rpm)	IKA Lab Dancer	3365000
Thermomixer comfort 5355	Eppendorf	5355000.011
Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO; MW 3000)	Dow Corning	000000000004109892
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical	ZEN3600