Fabricação de um Dispositivo de Órgão-em-um-Chip de Complexo Dentina-Polpa Empilhado Verticalmente Utilizando um Disco de Dentina Humana

Resumo

Descrever a fabricação e montagem de um dispositivo em chip de complexo dentinário-pulpar em empilhamento vertical, incorporando um disco de dentina humana e microcanais fabricados por fotolitografia, seguido pelo revestimento e cultivo de células-tronco da polpa dentária.

Resumo

Modelos pré-clínicos convencionais utilizados na pesquisa odontológica, incluindo modelos animais e culturas celulares estáticas, apresentam limitações importantes na reprodução das condições fisiológicas da interface dentina-pulpa e na previsão de respostas biológicas humanas a biomateriais odontológicos. A tecnologia de órgão-em-uma-chip (OoC) oferece uma abordagem alternativa ao permitir a recriação de microambientes específicos de tecidos dentro de sistemas microfluídicos controlados. Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a fabricação e montagem de um dispositivo OoC do complexo dentina-pulpa que incorpora um disco de dentina humana em uma plataforma microfluídica de polidimetilsiloxano (PDMS) com três camadas. O protocolo inclui a preparação do disco de dentina, fabricação de moldes microestruturados por fotolitografia, moldagem e cura do PDMS, ligação assistida por plasma das camadas, montagem do dispositivo, teste de vazamento e semeadura de células-tronco da polpa dentária sob condições de cultura estática. Parâmetros críticos de fabricação que influenciam o desempenho do dispositivo são discutidos, incluindo o controle da espessura da camada de PDMS, tratamento superficial por plasma e integração do disco de dentina no dispositivo para minimizar vazamentos. A adesão celular e viabilidade dentro do dispositivo foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura e coloração confocal de células vivas/mortas. Resultados representativos demonstram a integração bem-sucedida do disco de dentina na montagem microfluídica, manutenção de condições livres de vazamentos e adesão de células-tronco da polpa dentária viáveis à superfície da dentina. Este protocolo fornece uma abordagem reprodutível para a fabricação de uma plataforma OoC do complexo dentina-pulpa que pode apoiar estudos futuros sobre as respostas celulares a biomateriais odontológicos e estímulos microambientais.

Introdução

A experimentação animal tem sido historicamente fundamental para o avanço da compreensão dos processos patológicos e fisiológicos e desempenhou um papel central nas fases iniciais do desenvolvimento de medicamentos¹. Ao longo do século XX, a expectativa de vida humana aumentou substancialmente, e embora não seja possível quantificar com precisão até que ponto essa melhoria se deve exclusivamente à pesquisa com animais, reconhece-se amplamente que muitos tratamentos médicos contemporâneos foram desenvolvidos ou validados utilizando modelos animais². Exemplos notáveis incluem o desenvolvimento de vacinas contra a poliomiel....

Protocolo

O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinki e aprovado pelo Comitê de Ética da Universidad de La Frontera para estudos envolvendo amostras humanas.

1. Aquisição de disco de dentina

OBSERVAÇÃO: Prepare o design do dispositivo antes de iniciar o protocolo (Figura 1A–1C).

1. Coleta e armazenamento de dentes
   1. Colete molares ou pré-molares humanos saudáveis após obter o consentimento informado do paciente.
   2. Mantenha todas as amostras em solução de cloramina a 0,5% a 4 °C para prevenir a desidratação da denti....

Resultados

A fabricação bem-sucedida do dispositivo dente-em-um-chip seguiu o fluxo de trabalho ilustrado na Figura 1A–1I, incluindo a preparação do disco de dentina (Figura 1D), a fabricação do molde derivado da fotolitografia (Figura 1E), a remoção das camadas de PDMS curadas (Figura 1F), a ativação por plasma antes da ligação (Figura 1G), a montagem do dispositivo .......

Discussão

Este estudo descreve um protocolo passo a passo para a fabricação de um dispositivo tipo dente-em-um-chip com empilhamento vertical, incorporando dentina e células-tronco da polpa dentária, e demonstra a adesão celular e viabilidade representativas dentro do dispositivo sob condições de cultivo estático. O protocolo foi desenvolvido para fornecer um fluxo de trabalho reprodutível para a fabricação e montagem de uma plataforma OoC (orgão-em-um-chip) do complexo dentina-polpa adequada para estudos in vitro da interface den.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais biológicos e químicos
Acetona	ExpertQ	SOLV 8	Limpeza de wafer de silício
Meio de cultura Alpha MEM	Cytiva	SH30265.02	Meio de cultura para células-tronco da polpa dentária
Cloranamina (0,5%)	Merck	7080-50-4	Solução de armazenamento para discos de dentina
Células-tronco da polpa dentária	Não aplicável	Não aplicável	Cultura primária de células. Consulte os passos 3.2.1 e 3.2.2
EDTA (10%)	Winkler	N2222158E	Remoção da camada de smear
Fotorresistência negativa à base de epóxi	Gersteltec	GM1060	Fabricação de molde por fotolitografia
Glutaraldeído (2,5%) em Sorensen 0,1 M’tampão fosfato s	Sigma-Aldrich	210908-06	Fixação para MEV
Dentes humanos saudáveis (molares ou pré-molares)	Não aplicável	Não aplicável	Amostra humana
Isopropanol	ExpertQ	SOLV 16	Limpeza do wafer, interrupção do desenvolvimento e limpeza de PDMS
Kit de Viabilidade LIVE/DEAD	Sigma-Aldrich	451	Coloração de viabilidade por fluorescência.
PBS (solução salina tamponada com fosfato)	Corning	46-013-CM	Lavagem e teste de vazamento
Base de PDMS e agente de cura (polidimetilsiloxano)	Dow	Sylgard 184	Fabricação do dispositivo
PGMEA	Sigma Aldrich	484431	Desenvolvimento do fotoresiste
Azul de tripano	Sigma Aldrich	T8154-100ml	Avaliação da viabilidade celular
Tripsina	Corning	25-053-CI	Desprendimento celular
Água ultrapura	Cytiva	SH30529.01	Solução de lavagem
Materiais descartáveis e vidraria de laboratório
agulhas de seringa 19G	Vmatic	VCB19050	Conexão do dispositivo com microbomba ou seringa
Punção biópsica (diâmetro: 1 mm)	Harris Unicore	WHAWB100073	Fabricação dos portos de entrada e saída
Tapete de corte	Nicecool	Não aplicável	Proteção da superfície durante a perfuração
Discos para acabamento odontológico (por exemplo, Sof-Lex)	3M	Sof-Lex	Polimento da dentina
Adaptadores fêmea Luér para barbado	Runze Fluidics	RH-M016	Conexão de tubo
Vareta de mistura de vidro ou plástico	Duran	Não aplicável	Mistura de PDMS
Seringas hipodérmicas	Cranberry	pc-12246	Semeadura celular e teste de vazamento
Gaze estéril sem fiapos	Linderson	Não aplicável	Remoção dos detritos da punção
Adaptadores Luer macho	Runze Fluidics	RH-G016	Conexão de tubo
Vaso de mistura	Duran	Não aplicável	Preparação do PDMS
placa de Petri (140 mm) × 20 mm)	Deltalab	2000219	Cultura de células/incubação
Base de politetrafluoroetileno	CCTVal	Não aplicável	Fabricação da camada de dentina intermediária
Placa de silício	Jiaozuo Commercial FineWin	Não aplicável	Fabricação do molde
Tubo de silicone	Runze Fluidics	96421	Conexão fluidica
Frasco T75	Corning	353136	Expansão de células-tronco da polpa dentária
Placa de microtitulação	SPL Life Sciences	30006	Preparação para coloração e imagem confocal
Equipamentos e instrumentos
Secador de ar	METALPLAN	TITAN-040	Secagem de ar comprimido
Fonte de ar comprimido	SCHULZ	CSD-18.1	Molde e limpeza de superfícies
Microscópio confocal	Olympus	Não aplicável	Modelo: FV1000
Sistema de litografia a laser direta	Heidelberg	uPG 101	Exposição à resistência fotossensível
Microscópio eletrônico de varredura ambiental	Hitachi	Não aplicável	Modelo: Quanta 400
Punção de alta velocidade	Nakanishi	Não aplicável	Modelo: Pana-max2
Placa aquecida	LabTech	EH20A Plus	Cocção da pastilha e cocção do fotoresiste
Capela de fluxo laminar	BioBase	BBS8V1708313D	Esterilização do dispositivo
Bomba microfluídica	Nova Era	Não aplicável	Modelo: 1002X-ES. Teste de vazamento em 10 µL/min
Molde microestruturado (fabricado por fotolitografia)	CCTVal	Não aplicável	Veja o Passo 2.2 para as especificações de fabricação do molde
Forno ou incubadora	Memmert	UN110	Curação de PDMS a 50°C e consolidação de vínculo a 75°C
Câmara de Limpeza por Plasma a Vácuo	Fari Plasma	GD-5	Ativação de wafer por plasma
Plasma Corona Portátil	Aurora Pro Scientific	APS-CD-20AC	Ativação de PDMS por plasma
Ultrassonicator	Elma Sonic	S 10 (H)	Limpeza de wafer
Câmara de vácuo ou dessecador (250 mm)	Winglass	Não aplicável	Desgaseificação de PDMS
Bomba de vácuo	ROCKER	300	Desgaseificação do PDMS