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Artigo de método

Fabricação de um Dispositivo de Órgão-em-um-Chip de Complexo Dentina-Polpa Empilhado Verticalmente Utilizando um Disco de Dentina Humana

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DOI:

10.3791/71713

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14 de agosto de 2026

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1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

Neste artigo

Resumo

Descrever a fabricação e montagem de um dispositivo em chip de complexo dentinário-pulpar em empilhamento vertical, incorporando um disco de dentina humana e microcanais fabricados por fotolitografia, seguido pelo revestimento e cultivo de células-tronco da polpa dentária.

Resumo

Modelos pré-clínicos convencionais utilizados na pesquisa odontológica, incluindo modelos animais e culturas celulares estáticas, apresentam limitações importantes na reprodução das condições fisiológicas da interface dentina-pulpa e na previsão de respostas biológicas humanas a biomateriais odontológicos. A tecnologia de órgão-em-uma-chip (OoC) oferece uma abordagem alternativa ao permitir a recriação de microambientes específicos de tecidos dentro de sistemas microfluídicos controlados. Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a fabricação e montagem de um dispositivo OoC do complexo dentina-pulpa que incorpora um disco de dentina humana em uma plataforma microfluídica de polidimetilsiloxano (PDMS) com três camadas. O protocolo inclui a preparação do disco de dentina, fabricação de moldes microestruturados por fotolitografia, moldagem e cura do PDMS, ligação assistida por plasma das camadas, montagem do dispositivo, teste de vazamento e semeadura de células-tronco da polpa dentária sob condições de cultura estática. Parâmetros críticos de fabricação que influenciam o desempenho do dispositivo são discutidos, incluindo o controle da espessura da camada de PDMS, tratamento superficial por plasma e integração do disco de dentina no dispositivo para minimizar vazamentos. A adesão celular e viabilidade dentro do dispositivo foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura e coloração confocal de células vivas/mortas. Resultados representativos demonstram a integração bem-sucedida do disco de dentina na montagem microfluídica, manutenção de condições livres de vazamentos e adesão de células-tronco da polpa dentária viáveis à superfície da dentina. Este protocolo fornece uma abordagem reprodutível para a fabricação de uma plataforma OoC do complexo dentina-pulpa que pode apoiar estudos futuros sobre as respostas celulares a biomateriais odontológicos e estímulos microambientais.

Introdução

A experimentação animal tem sido historicamente fundamental para o avanço da compreensão dos processos patológicos e fisiológicos e desempenhou um papel central nas fases iniciais do desenvolvimento de medicamentos1. Ao longo do século XX, a expectativa de vida humana aumentou substancialmente, e embora não seja possível quantificar com precisão até que ponto essa melhoria se deve exclusivamente à pesquisa com animais, reconhece-se amplamente que muitos tratamentos médicos contemporâneos foram desenvolvidos ou validados utilizando modelos animais2. Exemplos notáveis incluem o desenvolvimento de vacinas contra a poliomielite, sarampo e hepatite B, a avaliação da segurança e eficácia da penicilina e a produção de insulina. No campo da pesquisa odontológica e de biomateriais, esses modelos têm sido fundamentais para investigar o processo de cárie, a biologia e regeneração do complexo dentina-polpa e a fisiopatologia dos tecidos periodontais3,4.

Apesar do uso extensivo dessas metodologias, o atual processo de desenvolvimento de medicamentos continua apresentando altas taxas de falha, com muitos candidatos a fármacos falhando durante os ensaios clínicos, apesar de demonstrarem eficácia e segurança em ambientes laboratoriais pré-clínicos e modelos animais5. Essa discrepância tem sido associada a diferenças interespecíficas que podem limitar a previsibilidade translacional dos modelos animais devido a diferenças anatômicas, genéticas e fisiológicas entre espécies6. Além disso, o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas permanece demorado e oneroso7. Ademais, os modelos convencionais in vitro empregam predominantemente culturas monocamada simples em duas dimensões (2D) sobre substratos plásticos não fisiológicos, falhando em reproduzir os estímulos bioquímicos e físicos, as interações célula-célula e a sinalização da matriz extracelular (ECM) presentes na cavidade oral humana8,9. Embora os modelos 2D ofereçam certas vantagens experimentais, são inerentemente incapazes de reproduzir as interações complexas que ocorrem simultaneamente entre múltiplos componentes, como biofilmes, biomateriais, dentina e células da polpa10. Consequentemente, cresce o interesse no desenvolvimento de plataformas experimentais alternativas capazes de reproduzir com maior precisão as respostas biológicas humanas. Em 2022, o FDA Modernization Act 2.0 removeu a exigência obrigatória de testes em animais no processo de aprovação de medicamentos e reconheceu o potencial uso de plataformas alternativas, incluindo tecnologias de órgão-em-um-chip (OoC), na pesquisa pré-clínica11.

Um OoC é um dispositivo microfluídico projetado para replicar a estrutura, função e microambiente de um órgão ou componente tecidual específico12. Esses dispositivos são povoados com células e tecidos vivos cultivados em microcanais projetados que recapitulam aspectos-chave do microambiente fisiológico ao qual as células estão naturalmente expostas. Além da semelhança estrutural, os microcanais permitem controle espaciotemporal sobre o ambiente celular e sustentam a manutenção de funções específicas do tecido, fornecendo assim condições experimentais que podem se assemelhar mais à fisiologia in vivo do que os sistemas convencionais de cultura12. De particular relevância, os microcanais em dispositivos OoC facilitam o fluxo controlado do meio de cultura, que exerce estresse cisalhante sobre as células residentes13. Esses estímulos mecânicos influenciam respostas celulares, incluindo adesão, proliferação, migração, expressão gênica e interações célula-célula14,15. Além disso, o fluxo contínuo do meio contribui para a manutenção do microambiente por meio do fornecimento de nutrientes e remoção de produtos residuais metabólicos16. Além disso, em comparação com culturas convencionais em 2D, alguns plataformas OoC demonstraram oferecer melhor controle sobre leituras relacionadas ao estresse oxidativo, incluindo espécies reativas de oxigênio intracelulares e viabilidade celular, em modelos tridimensionais (3D) em chip17. Assim, os sistemas OoC surgiram como plataformas promissoras para o estudo da fisiologia tecidual, interações com biomateriais e processos de doenças sob condições experimentais controladas18. Na pesquisa odontológica, a tecnologia OoC tem sido progressivamente aplicada para modelar interfaces teciduais orais cada vez mais complexas19. Plataformas iniciais de dente-em-um-chip simularam a interface biomaterial-dentina-polpa20, enquanto versões mais avançadas incorporaram vasculatura e inervação trigeminal para replicar com maior fidelidade a complexidade estrutural e funcional do complexo polpa-dentina21. Além da polpa, modelos 3D de canais radiculares imaturos permitiram a avaliação de irrigantes endodônticos e brotamento angiogênico em células-tronco da papila apical22,23. No nível periodontal, plataformas de gengiva-em-um-chip têm sido utilizadas para investigar interações entre hospedeiro e microrganismos e para avaliar o potencial imunomodulador de probióticos como agentes terapêuticos24, enquanto dispositivos de ligamento periodontal-em-chip demonstraram como o fluxo de fluido intersticial modula a formação de redes vasculares e a diferenciação osteogênica de esferoides de células-tronco do ligamento periodontal25,26. Complementando esses modelos, sistemas especializados de mucosa oral-em-um-chip e implante dentário-em-um-chip ampliaram ainda mais o escopo da pesquisa microfluídica odontológica, caracterizando interações entre hospedeiro e materiais e a citotoxicidade de monômeros odontológicos sob condições fisiologicamente relevantes27,28.

Embora os sistemas de órgão-em-um-chip (OoC) tenham sido aplicados com crescente frequência em pesquisas odontológicas, orais e craniofaciais, esforços contínuos rumo à padronização e reprodutibilidade dos fluxos de trabalho de fabricação permanecem importantes. Vários modelos de dente-em-um-chip foram descritos na literatura20,29,30,31, demonstrando diferentes configurações de dispositivos e aplicações experimentais. No entanto, variações na arquitetura do dispositivo, nos métodos de fabricação, na incorporação de dentina e na apresentação dos parâmetros experimentais podem limitar a reprodutibilidade e a comparação direta entre estudos. Em particular, diferenças na geometria dos microcanais, nas estratégias de integração da dentina e nas abordagens de fabricação podem influenciar o microambiente biológico e mecânico dentro do dispositivo. Alguns modelos descritos incorporam dentina para reproduzir aspectos da interface dentina-pulpa20,29,30, enquanto outros utilizam configurações alternativas31. Além disso, métodos de fabricação como fotolitografia, corte a laser, micromilhagem e impressão 3D apresentam vantagens e limitações específicas, dependendo do design e da aplicação pretendidos do dispositivo. Ademais, um determinante crítico da utilidade biológica é a orientação arquitetônica do dispositivo, especificamente se os canais e a fatia de dentina são organizados em uma configuração horizontal ou vertical19,32. Em configurações empilhadas horizontalmente, compartimentos dispostos lado a lado facilitam a compartimentalização lateral e a visualização em tempo real das células, tornando-as particularmente adequadas para modelar tecidos com organização espacial inerentemente lateral, como o complexo periodontal24,32. Contudo, esse design possui uma limitação inerente em sua capacidade de recriar interfaces biológicas perpendiculares, como o complexo biomaterial-dentina-pulpa, já que o arranjo lateral dos compartimentos não replica fielmente a orientação in vivo da barreira de dentina entre a cavidade e a polpa20,32. As configurações empilhadas verticalmente superam essas limitações ao sobrepor dois compartimentos ao longo do eixo y, separados por uma fatia de dentina nativa, permitindo a quantificação simultânea do transporte molecular através da dentina intacta e o monitoramento em tempo real das respostas das células da polpa, medido no meio de saída30. No entanto, uma limitação reconhecida dessa orientação diz respeito à imagem de seção transversal da interface dentina-célula, pois obter imagens de seção transversal da interface dentina-célula no mesmo plano focal permanece tecnicamente mais desafiador do que nas configurações empilhadas horizontalmente, nas quais células e matrizes extracelulares são dispostas lateralmente. Embora múltiplos modelos de complexo dentina-polpa-em-um-chip tenham sido descritos na literatura, a maioria adota uma configuração empilhada horizontalmente, na qual os compartimentos são dispostos lado a lado no mesmo plano10,20,21,29, enquanto relativamente poucos incorporaram uma fatia de dentina nativa em uma configuração empilhada verticalmente30. Apesar disso, as variações nas abordagens de fabricação e nos parâmetros relatados entre esses modelos continuam a limitar a reprodutibilidade e as comparações entre estudos33. O presente manuscrito tem como objetivo melhorar a reprodutibilidade metodológica ao fornecer um protocolo detalhado de fabricação para um dispositivo dente-em-um-chip com configuração empilhada verticalmente, facilitando assim a adoção mais ampla da plataforma pela comunidade de pesquisa odontológica.

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para fabricação e montagem de um dispositivo em chip de complexo polpa-dentinário empilhado verticalmente, incorporando um disco de dentina humana em uma plataforma microfluídica de polidimetilsiloxano (PDMS) com três camadas, fabricada utilizando um molde produzido por fotolitografia. O protocolo também descreve o semeador e o cultivo de células-tronco da polpa dentária no dispositivo sob condições estáticas.

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Protocolo

O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinki e aprovado pelo Comitê de Ética da Universidad de La Frontera para estudos envolvendo amostras humanas.

1. Aquisição de disco de dentina

OBSERVAÇÃO: Prepare o design do dispositivo antes de iniciar o protocolo (Figura 1A–1C).

  1. Coleta e armazenamento de dentes
    1. Colete molares ou pré-molares humanos saudáveis após obter o consentimento informado do paciente.
    2. Mantenha todas as amostras em solução de cloramina a 0,5% a 4 °C para prevenir a desidratação da dentina e a desnaturação de proteínas.
    3. Substitua a solução de cloramina uma vez por semana durante o armazenamento.
  2. Preparação de discos de dentina
    1. Seccione cada dente horizontalmente no terço médio da coroa utilizando uma peça de mão de alta velocidade operando a 350.000 rpm e equipada com uma broca cilíndrica de diamante (diâmetro de 1 mm; granulometria de 100–150 µm).
    2. Realize a seccionamento com irrigação contínua de água a aproximadamente 50 mL/min.
    3. Posicione o corte no terço médio da coroa para evitar a câmara pulpar e o esmalte presente nos sulcos e fissuras oclusais, obtendo assim um disco composto predominantemente por tecido dentinário.
      ATENÇÃO: Realize o seccionamento dos dentes com irrigação contínua e utilize equipamento de proteção individual adequado, incluindo luvas, máscara e proteção ocular.
  3. Acabamento dos discos de dentina
    1. Polir o disco de dentina utilizando discos de acabamento com granulometria decrescente.
    2. Continue o polimento até atingir uma espessura final de dentina de aproximadamente 0,8 mm (±± 0,3 mm) e dimensões laterais de aproximadamente 5 mm × 5 mm (±± 0,3 mm) (Figura 1D).
  4. Armazenamento dos discos de dentina
    1. Armazene os discos de dentina preparados em solução de cloramina a 0,5% a 4 °C até a montagem do dispositivo OoC.

Diagrama de montagem do dispositivo microfluídico; estágios de fabricação com pinça, ferramenta de perfuração e canalização de líquido.
Figura 1: Fluxo de trabalho de projeto e fabricação do dispositivo em chip de órgão (OoC) do complexo dentina-polpa. (A) Projeto tridimensional do dispositivo mostrando a arquitetura de três camadas. (B) Vista superior do projeto do dispositivo com as dimensões principais. (C) Vista lateral da configuração do dispositivo de três camadas. (D) Disco representativo de dentina preparado com espessura aproximada de 0,8 mm e dimensões laterais de aproximadamente 5 mm × 5 mm. (E) Molde-mestre de silício fabricado por fotolitografia e utilizado para moldar as camadas superior e inferior de polidimetilsiloxano (PDMS). (F) Remoção de uma camada de PDMS curada do molde de silício após polimerização térmica. (G) Tratamento por plasma da superfície do PDMS antes da união das camadas. (H) Dispositivo final do OoC do complexo dentina-polpa com três camadas montado por ligação por plasma e incorporando a interface de dentina. (I) Dispositivo montado conectado a tubos para teste de vazamento e preparação para experimentos microfluídicos. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

2. Fabricação do dispositivo OoC do complexo dentina-pulpa

  1. Preparação do ambiente de trabalho e dos materiais
    1. Preparar materiais e equipamentos
      1. Prepare todos os materiais e equipamentos listados na Tabela de Materiais antes de iniciar a fabricação do dispositivo.
      2. Prepare os furadores de biópsia antes da montagem do dispositivo.
      3. Realize todos os procedimentos de fabricação em um ambiente limpo e livre de poeira.
      4. Use luvas, proteção ocular e equipamento de proteção individual apropriado durante toda a fabricação e montagem do dispositivo.
        NOTA: Prepare o molde produzido por fotolitografia antes de iniciar o protocolo (Figura 1E).
  2. Fabricação do molde microestruturado
    1. Preparação da placa de silício
      1. Fabricar o molde em uma placa de silício de 4 polegadas, com uma face polida (tipo N, dopada com As, método de crescimento CZ, orientação <100>, espessura de 500 ±± 25 µm, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, resistividade de 0,001–0,005 Ω·cm).
      2. Limpe a placa sequencialmente em acetona, isopropanol e água ultrapura por 10 min cada, sob ultrassonicação.
      3. Seque a placa com ar comprimido.
      4. Leve a placa ao forno a 200°C por 10 min em uma placa quente para remover a umidade residual.
      5. Deixe a placa esfriar até a temperatura ambiente (TA; 20°C–25°C).
    2. Ativação da superfície e aplicação do fotoresiste
      1. Ative a superfície da placa de silício utilizando um limpador de plasma a vácuo operado com plasma de ar no nível 7 por 120 s.
      2. Aplicar o fotoresiste negativo à base de epóxi GM 1060 por centrifugação a 300 rpm por 10 s.
      3. Continue a centrifugação a 565 rpm por 100 s e a 965 rpm por 1 s, utilizando uma aceleração de 200 rpm/s.
      4. Deixe a placa recoberta repousar por 10 min.
      5. Realize uma pré-secagem a 65°C por 10 min.
      6. Continue a pré-secagem a 95°C por 1 h.
      7. Deixe a placa esfriar até a TA.
    3. Exposição e desenvolvimento
      1. Exponha o fotoresiste utilizando um sistema de litografia a laser direto com uma dose de 1.950 mJ/cm2.
      2. Realize uma pós-secagem a 65°C por 10 min.
      3. Continue a pós-secagem a 95°C por 30 min.
      4. Deixe a placa esfriar até a TA.
      5. Deixe a placa repousar por 10 min.
      6. Desenvolva o padrão em PGMEA por 4 min.
      7. Estenda o desenvolvimento em intervalos de 30 s se restar fotoresiste residual.
      8. Interrompa o desenvolvimento lavando com isopropanol.
      9. Seque a placa utilizando ar comprimido.
    4. Secagem final (hard bake)
      1. Realize uma secagem final a 135°C por 2 h.
      2. Obtenha um molde mestre microestruturado contendo microcanais com 1 mm de largura e 50 µm de altura.
  3. Preparação e dessurgimento da mistura de PDMS
    1. Preparação da mistura de PDMS
      1. Misture a base de PDMS e o agente de cura na proporção de 10:1 em peso.
      2. Agite manualmente a mistura com uma haste de vidro em um béquer plástico por aproximadamente 5 min.
      3. Mantenha movimentos circulares lentos e contínuos durante a mistura.
        NOTA: Evite introduzir bolhas de ar durante a mistura.
    2. Dessurgimento
      1. Coloque a mistura de PDMS em um dessecador a vácuo conectado a uma bomba de vácuo.
      2. Dessurja a mistura a aproximadamente 700 mmHg por 5 min.
      3. Libere o vácuo brevemente para permitir que as bolhas na superfície estourem.
      4. Reaplique o vácuo.
      5. Repita o ciclo até que não haja bolhas visíveis.
        NOTA: O tempo total de dessurgimento é tipicamente de aproximadamente 30 min.
  4. Conformação do PDMS sobre o molde
    1. Preparação do molde
      1. Coloque o molde sobre uma superfície plana.
      2. Limpe o molde utilizando ar comprimido.
      3. Evite contato direto com a superfície moldada.
      4. Verifique se o molde está livre de poeira e contaminantes.
    2. Aplicação do PDMS
      1. Aplicar aproximadamente 8 g de PDMS ao redor do disco de dentina para fabricar a camada de incorporação da dentina.
      2. Ajuste a altura do PDMS para corresponder à espessura do disco de dentina (0,8 ±± 0,3 mm).
      3. Evite que o PDMS cubra a superfície da dentina.
      4. Aplicar aproximadamente 0,26 g de PDMS por unidade do molde para fabricar cada camada de microcanal.
      5. Bata suavemente no molde ou aplique vibração para facilitar o preenchimento das microestruturas.
      6. Deixe o PDMS assentar nas menores características.
      7. Cubra o molde com uma tampa ou cobertura plana sem tocar na superfície do PDMS.
        NOTA: A camada de incorporação da dentina tem aproximadamente 0,8 mm de espessura, e cada camada de microcanal tem aproximadamente 0,4 mm de espessura, resultando em uma espessura total do dispositivo de aproximadamente 1,6 mm.
        NOTA: Ajuste a espessura das camadas de acordo com a distância de trabalho do objetivo confocal quando a imagem confocal estiver planejada.
  5. Curagem
    1. Coloque os moldes em um forno a 50°C.
    2. Cure o PDMS por 4 h.
  6. Remoção das camadas de PDMS
    1. Remoção do PDMS curado
      1. Retire cuidadosamente as camadas de PDMS curado do molde (Figura 1F).
      2. Manuseie as camadas de PDMS com cuidado para evitar danos às microestruturas.
  7. Junção das camadas de PDMS e fabricação dos orifícios de entrada e saída
    1. Fabricação dos orifícios de entrada e saída
      1. Crie perfurações nos locais designados de entrada e saída utilizando um furador de biópsia de 1 mm.
      2. Posicione o lado do microcanal voltado para cima durante a perfuração.
        NOTA: Coloque a camada de PDMS sobre um tapete de corte para evitar danos estruturais.
      3. Crie duas perfurações na camada superior correspondentes ao microcanal superior.
    2. Limpeza das camadas de PDMS
      1. Limpe as camadas de PDMS utilizando álcool isopropílico ou etanol.
      2. Remova partículas residuais de poeira utilizando fita adesiva estéril.
      3. Verifique se todas as superfícies de junção estão livres de contaminantes antes da montagem.
    3. Ativação por plasma das superfícies de PDMS
      1. Posicione as camadas superior e intermediária de PDMS para tratamento por plasma (Figura 1G).
      2. Ative as superfícies utilizando um tratador de plasma corona portátil operando a aproximadamente 25 W com ar ambiente como gás de trabalho.
      3. Mantenha uma distância de trabalho de aproximadamente 1 mm entre a fonte de plasma e a superfície de PDMS.
        CAUTELA: Realize o tratamento por plasma sob ventilação adequada e evite exposição direta ao ozônio gerado pelo plasma.
      4. Ative o dispositivo de tratamento por plasma e aguarde 5 s para estabilização.
      5. Verifique a geração de um feixe de plasma uniforme antes do tratamento.
      6. Trate a camada superior de PDMS por 10 s utilizando um movimento contínuo de vai e vem a aproximadamente 5 mm/s.
      7. Trate a camada intermediária de PDMS por 10 s utilizando o mesmo movimento e distância.
      8. Aplique um tratamento adicional de 1 s por plasma na camada superior imediatamente antes da junção.
    4. Junção das camadas superior e intermediária
      1. Alinhe o microcanal superior com o disco de dentina imediatamente após o tratamento por plasma.
      2. Junte as camadas superior e intermediária.
      3. Coloque o conjunto unido em um forno a 75°C por 5 min.
      4. Consolide a junção durante a incubação.
        NOTA: O disco de dentina e o microcanal são visíveis a olho nu e podem ser alinhados sem ferramentas adicionais de alinhamento.
    5. Fabricação dos orifícios do microcanal inferior
      1. Fure duas perfurações correspondentes ao microcanal inferior através das camadas superior e intermediária unidas.
      2. Realize a perfuração através de ambas as camadas simultaneamente para garantir o alinhamento.
        NOTA: Este procedimento gera quatro perfurações na camada superior e duas perfurações na camada intermediária.
      3. Coloque o conjunto unido sobre um tapete de corte firme antes da perfuração.
      4. Aplique pressão descendente constante em um único movimento.
        NOTA: Evite forças rotacionais ou laterais para minimizar o risco de descolamento.
      5. Remova os detritos dos locais de perfuração utilizando gaze estéril sem fiapos umedecida com álcool isopropílico.
      6. Inspecione as perfurações e áreas adjacentes unidas sob iluminação adequada.
      7. Verifique a ausência de descolamento, rasgos ou perfurações incompletas antes de prosseguir.
    6. Junção da camada inferior
      1. Trate por plasma a camada inferior conforme descrito no Passo 2.7.4.
      2. Alinhe os orifícios de entrada e saída do microcanal inferior com as perfurações nas camadas superior e intermediária.
      3. Junte a camada inferior para completar a montagem do dispositivo.
        NOTA: Marque os locais de entrada e saída na superfície externa da camada inferior antes da junção para facilitar o alinhamento.
        NOTA: Câmaras de plasma podem proporcionar junções mais fortes do que canetas de plasma, conforme relatado na literatura36.
        NOTA: O dispositivo completo consiste em uma plataforma microfluídica de três camadas que incorpora uma interface de dentina (Figura 1H). A superfície inferior da dentina representa o lado da polpa do modelo, enquanto a superfície superior da dentina representa o lado coronal para exposição a biomateriais odontológicos ou preparações bacterianas.
  8. Teste de vazamento do dispositivo microfluídico
    1. Inspecção do dispositivo montado
      1. Inspecione o dispositivo montado quanto a desalinhamento.
      2. Inspecione a montagem quanto a junção incompleta e vazamentos visíveis.
    2. Teste de vazamento
      1. Conecte agulhas Luer-lock de 19G aos orifícios de entrada (Figura 1E).
      2. Conecte as agulhas às tubulações da bomba microfluídica.
      3. Pressione suavemente os conectores das agulhas nos orifícios perfurados para obter um encaixe hermético.
      4. Injete PBS estéril ou meio de cultura a uma taxa de fluxo de 10 µL/min.
      5. Mantenha o fluxo de fluido por pelo menos 5 min.
      6. Inspecione todas as interfaces unidas, margens dos canais e bordas do disco de dentina durante o fluxo.
      7. Observe o dispositivo sob iluminação adequada durante e após a injeção.
      8. Confirme a ausência de acúmulo de fluido, umidade ou formação de gotículas.
      9. Classifique o dispositivo como livre de vazamentos se nenhum vazamento for detectado.
      10. Descarte dispositivos que apresentem vazamento.
        NOTA: Realize o teste de vazamento em todos os dispositivos fabricados antes do semeadura celular ou uso experimental.
  9. Sterilização e armazenamento do dispositivo microfluídico
    1. Sterilização
      1. Exponha a superfície superior do dispositivo montado à luz UV (254 nm) por 30 min dentro de uma cabine de fluxo laminar.
      2. Exponha a superfície inferior à luz UV por mais 30 min.
      3. Enxágue os microcanais com etanol a 70% por 20 min.
      4. Lave os microcanais três vezes com PBS estéril para remover o etanol residual.
    2. Armazenamento
      1. Utilize o dispositivo esterilizado imediatamente para experimentos de cultura celular.
      2. Alternativamente, armazene o dispositivo submerso em PBS estéril a 4°C dentro de um recipiente estéril até o uso.
        ​CAUTELA: Não utilize cloramina ou outras soluções desinfetantes após a montagem do dispositivo, pois o PDMS pode absorver esses compostos e comprometer a viabilidade celular.

3. Avaliação da adesão e viabilidade de células-tronco da polpa dentária

  1. Pré-condicionamento da superfície dentinária
    1. Injetar 10% de EDTA no dispositivo.
    2. Manter o contato entre a solução de EDTA e a superfície dentinária por 15 min.
    3. Injetar 0,5 mL de EDTA a cada 3 min para manter o movimento do fluido dentro do microcanal.
    4. Lavar o disco de dentina três vezes com água ultrapura.
    5. Manter cada lavagem por 5 min.
      NOTA: O tratamento com EDTA remove a camada de smear e expõe as proteínas da matriz dentinária.
      ATENÇÃO: Manipular soluções de EDTA usando luvas e proteção ocular para evitar irritação na pele e nos olhos.
  2. Plaquiação de células-tronco da polpa dentária
    1. Expansão de células-tronco da polpa dentária
      1. Plaquear células-tronco da polpa dentária em um frasco T75 com densidade de 1 × 106 células por frasco.
      2. Incubar as células a 37°C e 5% de CO2 até atingir cerca de 80% de confluência.
      3. Desanexar as células utilizando tripsina.
      4. Neutralizar a tripsina utilizando meio de cultura completo.
      5. Centrifugar a suspensão celular para obter um pellet celular.
      6. Avaliar a viabilidade celular utilizando azul de tripano.
      7. Utilizar suspensões celulares com viabilidade ≥90%.
    2. Preparação da suspensão celular
      1. Preparar uma suspensão celular pré-aquecida a 37°C.
      2. Ajustar a concentração celular para 100.000 células/mL em meio de cultura completo.
      3. Preparar um volume final de suspensão de 1–2 mL.
        NOTA: Células na passagem 5 foram utilizadas no presente estudo.
    3. Plaquiação celular
      1. Injetar a suspensão celular na porta de entrada do microcanal inferior.
      2. Inverter o dispositivo após a plaquiação celular
        NOTA: A inversão do dispositivo promove a sedimentação celular em direção à superfície dentinária e melhora a adesão celular.
    4. Incubação
      1. Colocar o dispositivo invertido dentro de uma placa de Petri.
      2. Adicionar 1 mL de meio de cultura à placa de Petri para minimizar a evaporação.
      3. Incubar o dispositivo a 37°C e 5% de CO2 por 24 h.
      4. Manter condições de cultura estática durante todo o período de incubação.
        NOTA: A validação com fluxo dinâmico não foi realizada no presente estudo.
        NOTA: O presente protocolo descreve condições de cultura estática para validação inicial do dispositivo e avaliação da adesão celular.
    5. Validação inicial do dispositivo
      1. Avaliar a adesão celular utilizando microscopia eletrônica de varredura.
      2. Recuperar o disco de dentina pela desmontagem do dispositivo antes da análise.
  3. Preparação de amostras para microscopia eletrônica de varredura
    1. Recuperação e lavagem das amostras
      1. Desmontar o dispositivo após 24 h de incubação.
      2. Recuperar o disco de dentina e transferi-lo para uma placa de cultura ou placa de Petri.
      3. Posicionar a superfície dentinária com células plaqueadas voltada para cima.
      4. Lavar o disco de dentina duas vezes com 1 mL de PBS.
    2. Fixação
      1. Adicionar 2 mL de glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato de Sorensen 0,1 M.
      2. Incubar a amostra por 30 min à temperatura ambiente (RT).
        ATENÇÃO: O glutaraldeído é tóxico e pode causar irritação na pele, olhos e trato respiratório. Realizar os procedimentos de fixação dentro de uma cabine de exaustão química, utilizando equipamento de proteção individual adequado.
    3. Lavagem após fixação
      1. Remover a solução de glutaraldeído.
      2. Lavar o disco de dentina três vezes com água destilada ultrapura à temperatura ambiente (RT).
    4. Análise por MEV
      1. Analisar as amostras utilizando um microscópio eletrônico de varredura ambiental.
      2. Operar o microscópio em condições de baixo vácuo (25 Pa).
      3. Utilizar uma tensão de aceleração de 10,0 kV e uma distância de trabalho de 7,0 mm.
      4. Adquirir imagens utilizando o modo de detecção 3D de elétrons retroespalhados (BSE-3D).
      5. Capturar imagens com aumento de ×200 (Figura 2A).
  4. Avaliação da viabilidade celular por microscopia confocal
    1. Preparação da amostra
      1. Plaquear e cultivar as células conforme descrito no Passo 3.2.
      2. Incubar o dispositivo por 24 h a 37°C e 5% de CO2.
      3. Desmontar o dispositivo e expor a superfície dentinária.
      4. Transferir o disco de dentina para uma placa de poços contendo HBSS+/+ suplementado com Ca2+ e Mg2+.
    2. Lavagem da amostra
      1. Lavar o disco de dentina duas vezes com HBSS+/+.
      2. Remover soro residual e vermelho de fenol antes da coloração.
        NOTA: Soro residual e vermelho de fenol podem aumentar a autofluorescência de fundo.
    3. Coloração de células vivas
      1. Preparar uma solução trabalho fresca de Calceína AM a 2 µM em HBSS+/+.
      2. Adicionar quantidade suficiente de solução de coloração para cobrir completamente a superfície dentinária.
      3. Incubar a amostra por 20 min a 37°C no escuro.
      4. Remover a solução de coloração após a incubação.
    4. Coloração de células mortas
      1. Adicionar solução trabalho de iodeto de propídio (1–2 µg/mL em HBSS+/+).
      2. Incubar a amostra por 5–8 min a 37°C no escuro.
      3. Não exceder 10 min de incubação.
      4. Lavar a amostra duas vezes com HBSS+/+.
      5. Manter a amostra submersa em tampão até a aquisição de imagens.
    5. Aquisição de imagens por microscopia confocal
      1. Adquirir imagens confocais dentro de 30 min após a coloração.
      2. Adquirir imagens sequencialmente nos canais verde e vermelho.
      3. Utilizar λex 490 nm e λem 515 nm para aquisição de imagens de células vivas.
      4. Utilizar λex 535 nm e λem 617 nm para aquisição de imagens de células mortas.
        ​NOTA: Proteger as soluções fluorescentes e as amostras coloridas da exposição à luz durante a incubação e a aquisição de imagens (Figura 2B).

Comparação entre microscopia eletrônica e microscopia de fluorescência, análise de estrutura celular.
Figura 2: Avaliação representativa da adesão e viabilidade de células-tronco da polpa dentária no dispositivo OoC do complexo polpa-dentinária. (A) Imagem de microscopia eletrônica de varredura mostrando células-tronco da polpa dentária aderidas (asterisco branco) na superfície do dentina após 24 h de cultivo estático dentro do dispositivo OoC. Após 24 h de cultivo, as células aderidas cobriram 54,35 ± 0,92% da superfície de dentina exposta ao microcanal. Nenhuma célula é observada na região de dentina coberta por PDMS (asterisco preto), indicando selamento eficaz entre as camadas do dispositivo. Barra de escala = 200 µm. (B) Imagem de microscopia confocal mostrando células-tronco da polpa dentária viáveis coradas em verde e aderidas à superfície da dentina (setas brancas) após 24 h de cultivo estático. Células não viáveis coradas em vermelho também são observadas (setas azuis). Barra de escala = 50 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Resultados

A fabricação bem-sucedida do dispositivo dente-em-um-chip seguiu o fluxo de trabalho ilustrado na Figura 1A–1I, incluindo a preparação do disco de dentina (Figura 1D), a fabricação do molde derivado da fotolitografia (Figura 1E), a remoção das camadas de PDMS curadas (Figura 1F), a ativação por plasma antes da ligação (Figura 1G), a montagem do dispositivo ...

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Discussão

Este estudo descreve um protocolo passo a passo para a fabricação de um dispositivo tipo dente-em-um-chip com empilhamento vertical, incorporando dentina e células-tronco da polpa dentária, e demonstra a adesão celular e viabilidade representativas dentro do dispositivo sob condições de cultivo estático. O protocolo foi desenvolvido para fornecer um fluxo de trabalho reprodutível para a fabricação e montagem de uma plataforma OoC (orgão-em-um-chip) do complexo dentina-polpa adequada para estudos in vitro da interface den...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes e não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Projeto DIM24-0004 e Projeto PP24-0031, Direção de Investigação, Universidade de La Frontera; FONDECYT Regular nº 1260116; e FONDECYT de Iniciação nº 11230701, Agência Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (ANID), Chile.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais biológicos e químicos
AcetonaExpertQSOLV 8Limpeza de wafer de silício
Meio de cultura Alpha MEMCytivaSH30265.02Meio de cultura para células-tronco da polpa dentária
Cloranamina (0,5%)Merck7080-50-4Solução de armazenamento para discos de dentina
Células-tronco da polpa dentáriaNão aplicávelNão aplicávelCultura primária de células. Consulte os passos 3.2.1 e 3.2.2
EDTA (10%)WinklerN2222158ERemoção da camada de smear
Fotorresistência negativa à base de epóxiGersteltecGM1060Fabricação de molde por fotolitografia
Glutaraldeído (2,5%) em Sorensen 0,1 M’tampão fosfato sSigma-Aldrich210908-06Fixação para MEV
Dentes humanos saudáveis (molares ou pré-molares)Não aplicávelNão aplicávelAmostra humana
IsopropanolExpertQSOLV 16Limpeza do wafer, interrupção do desenvolvimento e limpeza de PDMS
Kit de Viabilidade LIVE/DEADSigma-Aldrich451Coloração de viabilidade por fluorescência. 
PBS (solução salina tamponada com fosfato)Corning46-013-CMLavagem e teste de vazamento
Base de PDMS e agente de cura (polidimetilsiloxano)DowSylgard 184Fabricação do dispositivo
PGMEASigma Aldrich484431Desenvolvimento do fotoresiste
Azul de tripanoSigma Aldrich T8154-100mlAvaliação da viabilidade celular
TripsinaCorning25-053-CIDesprendimento celular
Água ultrapuraCytivaSH30529.01Solução de lavagem
Materiais descartáveis e vidraria de laboratório
agulhas de seringa 19GVmaticVCB19050Conexão do dispositivo com microbomba ou seringa
Punção biópsica (diâmetro: 1 mm)Harris UnicoreWHAWB100073Fabricação dos portos de entrada e saída
Tapete de corteNicecoolNão aplicávelProteção da superfície durante a perfuração
Discos para acabamento odontológico (por exemplo, Sof-Lex)3MSof-LexPolimento da dentina
Adaptadores fêmea Luér para barbadoRunze FluidicsRH-M016Conexão de tubo
Vareta de mistura de vidro ou plásticoDuranNão aplicávelMistura de PDMS
Seringas hipodérmicasCranberrypc-12246Semeadura celular e teste de vazamento
Gaze estéril sem fiaposLindersonNão aplicávelRemoção dos detritos da punção
Adaptadores Luer machoRunze FluidicsRH-G016Conexão de tubo
Vaso de misturaDuranNão aplicávelPreparação do PDMS
placa de Petri (140 mm) × 20 mm)Deltalab2000219Cultura de células/incubação
Base de politetrafluoroetilenoCCTValNão aplicávelFabricação da camada de dentina intermediária
Placa de silícioJiaozuo Commercial FineWinNão aplicávelFabricação do molde
Tubo de siliconeRunze Fluidics96421Conexão fluidica
Frasco T75Corning 353136Expansão de células-tronco da polpa dentária
Placa de microtitulaçãoSPL Life Sciences30006Preparação para coloração e imagem confocal
Equipamentos e instrumentos
Secador de arMETALPLANTITAN-040Secagem de ar comprimido
Fonte de ar comprimidoSCHULZCSD-18.1Molde e limpeza de superfícies
Microscópio confocalOlympusNão aplicávelModelo: FV1000
Sistema de litografia a laser diretaHeidelberguPG 101Exposição à resistência fotossensível
Microscópio eletrônico de varredura ambientalHitachiNão aplicávelModelo: Quanta 400 
Punção de alta velocidadeNakanishiNão aplicávelModelo: Pana-max2
Placa aquecidaLabTechEH20A PlusCocção da pastilha e cocção do fotoresiste
Capela de fluxo laminarBioBaseBBS8V1708313DEsterilização do dispositivo
Bomba microfluídicaNova EraNão aplicávelModelo: 1002X-ES. Teste de vazamento em 10 µL/min
Molde microestruturado (fabricado por fotolitografia)CCTValNão aplicávelVeja o Passo 2.2 para as especificações de fabricação do molde
Forno ou incubadoraMemmertUN110Curação de PDMS a 50°C e consolidação de vínculo a 75°C
Câmara de Limpeza por Plasma a VácuoFari PlasmaGD-5Ativação de wafer por plasma
Plasma Corona Portátil Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACAtivação de PDMS por plasma
UltrassonicatorElma SonicS 10 (H)Limpeza de wafer
Câmara de vácuo ou dessecador (250 mm)WinglassNão aplicávelDesgaseificação de PDMS
Bomba de vácuoROCKER300Desgaseificação do PDMS

Referências

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