Fabricação de um Dispositivo de Órgão-em-um-Chip de Complexo Dentina-Polpa Empilhado Verticalmente Utilizando um Disco de Dentina Humana

Resumo

Descrever a fabricação e montagem de um dispositivo em chip de complexo dentinário-pulpar em empilhamento vertical, incorporando um disco de dentina humana e microcanais fabricados por fotolitografia, seguido pelo revestimento e cultivo de células-tronco da polpa dentária.

Resumo

Modelos pré-clínicos convencionais utilizados na pesquisa odontológica, incluindo modelos animais e culturas celulares estáticas, apresentam limitações importantes na reprodução das condições fisiológicas da interface dentina-pulpa e na previsão de respostas biológicas humanas a biomateriais odontológicos. A tecnologia de órgão-em-uma-chip (OoC) oferece uma abordagem alternativa ao permitir a recriação de microambientes específicos de tecidos dentro de sistemas microfluídicos controlados. Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a fabricação e montagem de um dispositivo OoC do complexo dentina-pulpa que incorpora um disco de dentina humana em uma plataforma microfluídica de polidimetilsiloxano (PDMS) com três camadas. O protocolo inclui a preparação do disco de dentina, fabricação de moldes microestruturados por fotolitografia, moldagem e cura do PDMS, ligação assistida por plasma das camadas, montagem do dispositivo, teste de vazamento e semeadura de células-tronco da polpa dentária sob condições de cultura estática. Parâmetros críticos de fabricação que influenciam o desempenho do dispositivo são discutidos, incluindo o controle da espessura da camada de PDMS, tratamento superficial por plasma e integração do disco de dentina no dispositivo para minimizar vazamentos. A adesão celular e viabilidade dentro do dispositivo foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura e coloração confocal de células vivas/mortas. Resultados representativos demonstram a integração bem-sucedida do disco de dentina na montagem microfluídica, manutenção de condições livres de vazamentos e adesão de células-tronco da polpa dentária viáveis à superfície da dentina. Este protocolo fornece uma abordagem reprodutível para a fabricação de uma plataforma OoC do complexo dentina-pulpa que pode apoiar estudos futuros sobre as respostas celulares a biomateriais odontológicos e estímulos microambientais.

Introdução

A experimentação animal tem sido historicamente fundamental para o avanço da compreensão dos processos patológicos e fisiológicos e desempenhou um papel central nas fases iniciais do desenvolvimento de medicamentos¹. Ao longo do século XX, a expectativa de vida humana aumentou substancialmente, e embora não seja possível quantificar com precisão até que ponto essa melhoria se deve exclusivamente à pesquisa com animais, reconhece-se amplamente que muitos tratamentos médicos contemporâneos foram desenvolvidos ou validados utilizando modelos animais². Exemplos notáveis incluem o desenvolvimento de vacinas contra a poliomielite, sarampo e hepatite B, a avaliação da segurança e eficácia da penicilina e a produção de insulina. No campo da pesquisa odontológica e de biomateriais, esses modelos têm sido fundamentais para investigar o processo de cárie, a biologia e regeneração do complexo dentina-polpa e a fisiopatologia dos tecidos periodontais^3,4.

Apesar do uso extensivo dessas metodologias, o atual processo de desenvolvimento de medicamentos continua apresentando altas taxas de falha, com muitos candidatos a fármacos falhando durante os ensaios clínicos, apesar de demonstrarem eficácia e segurança em ambientes laboratoriais pré-clínicos e modelos animais⁵. Essa discrepância tem sido associada a diferenças interespecíficas que podem limitar a previsibilidade translacional dos modelos animais devido a diferenças anatômicas, genéticas e fisiológicas entre espécies⁶. Além disso, o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas permanece demorado e oneroso⁷. Ademais, os modelos convencionais in vitro empregam predominantemente culturas monocamada simples em duas dimensões (2D) sobre substratos plásticos não fisiológicos, falhando em reproduzir os estímulos bioquímicos e físicos, as interações célula-célula e a sinalização da matriz extracelular (ECM) presentes na cavidade oral humana^8,9. Embora os modelos 2D ofereçam certas vantagens experimentais, são inerentemente incapazes de reproduzir as interações complexas que ocorrem simultaneamente entre múltiplos componentes, como biofilmes, biomateriais, dentina e células da polpa¹⁰. Consequentemente, cresce o interesse no desenvolvimento de plataformas experimentais alternativas capazes de reproduzir com maior precisão as respostas biológicas humanas. Em 2022, o FDA Modernization Act 2.0 removeu a exigência obrigatória de testes em animais no processo de aprovação de medicamentos e reconheceu o potencial uso de plataformas alternativas, incluindo tecnologias de órgão-em-um-chip (OoC), na pesquisa pré-clínica¹¹.

Um OoC é um dispositivo microfluídico projetado para replicar a estrutura, função e microambiente de um órgão ou componente tecidual específico¹². Esses dispositivos são povoados com células e tecidos vivos cultivados em microcanais projetados que recapitulam aspectos-chave do microambiente fisiológico ao qual as células estão naturalmente expostas. Além da semelhança estrutural, os microcanais permitem controle espaciotemporal sobre o ambiente celular e sustentam a manutenção de funções específicas do tecido, fornecendo assim condições experimentais que podem se assemelhar mais à fisiologia in vivo do que os sistemas convencionais de cultura¹². De particular relevância, os microcanais em dispositivos OoC facilitam o fluxo controlado do meio de cultura, que exerce estresse cisalhante sobre as células residentes¹³. Esses estímulos mecânicos influenciam respostas celulares, incluindo adesão, proliferação, migração, expressão gênica e interações célula-célula^14,15. Além disso, o fluxo contínuo do meio contribui para a manutenção do microambiente por meio do fornecimento de nutrientes e remoção de produtos residuais metabólicos¹⁶. Além disso, em comparação com culturas convencionais em 2D, alguns plataformas OoC demonstraram oferecer melhor controle sobre leituras relacionadas ao estresse oxidativo, incluindo espécies reativas de oxigênio intracelulares e viabilidade celular, em modelos tridimensionais (3D) em chip¹⁷. Assim, os sistemas OoC surgiram como plataformas promissoras para o estudo da fisiologia tecidual, interações com biomateriais e processos de doenças sob condições experimentais controladas¹⁸. Na pesquisa odontológica, a tecnologia OoC tem sido progressivamente aplicada para modelar interfaces teciduais orais cada vez mais complexas¹⁹. Plataformas iniciais de dente-em-um-chip simularam a interface biomaterial-dentina-polpa²⁰, enquanto versões mais avançadas incorporaram vasculatura e inervação trigeminal para replicar com maior fidelidade a complexidade estrutural e funcional do complexo polpa-dentina²¹. Além da polpa, modelos 3D de canais radiculares imaturos permitiram a avaliação de irrigantes endodônticos e brotamento angiogênico em células-tronco da papila apical^22,23. No nível periodontal, plataformas de gengiva-em-um-chip têm sido utilizadas para investigar interações entre hospedeiro e microrganismos e para avaliar o potencial imunomodulador de probióticos como agentes terapêuticos²⁴, enquanto dispositivos de ligamento periodontal-em-chip demonstraram como o fluxo de fluido intersticial modula a formação de redes vasculares e a diferenciação osteogênica de esferoides de células-tronco do ligamento periodontal^25,26. Complementando esses modelos, sistemas especializados de mucosa oral-em-um-chip e implante dentário-em-um-chip ampliaram ainda mais o escopo da pesquisa microfluídica odontológica, caracterizando interações entre hospedeiro e materiais e a citotoxicidade de monômeros odontológicos sob condições fisiologicamente relevantes^27,28.

Embora os sistemas de órgão-em-um-chip (OoC) tenham sido aplicados com crescente frequência em pesquisas odontológicas, orais e craniofaciais, esforços contínuos rumo à padronização e reprodutibilidade dos fluxos de trabalho de fabricação permanecem importantes. Vários modelos de dente-em-um-chip foram descritos na literatura^20,29,30,31, demonstrando diferentes configurações de dispositivos e aplicações experimentais. No entanto, variações na arquitetura do dispositivo, nos métodos de fabricação, na incorporação de dentina e na apresentação dos parâmetros experimentais podem limitar a reprodutibilidade e a comparação direta entre estudos. Em particular, diferenças na geometria dos microcanais, nas estratégias de integração da dentina e nas abordagens de fabricação podem influenciar o microambiente biológico e mecânico dentro do dispositivo. Alguns modelos descritos incorporam dentina para reproduzir aspectos da interface dentina-pulpa^20,29,30, enquanto outros utilizam configurações alternativas³¹. Além disso, métodos de fabricação como fotolitografia, corte a laser, micromilhagem e impressão 3D apresentam vantagens e limitações específicas, dependendo do design e da aplicação pretendidos do dispositivo. Ademais, um determinante crítico da utilidade biológica é a orientação arquitetônica do dispositivo, especificamente se os canais e a fatia de dentina são organizados em uma configuração horizontal ou vertical^19,32. Em configurações empilhadas horizontalmente, compartimentos dispostos lado a lado facilitam a compartimentalização lateral e a visualização em tempo real das células, tornando-as particularmente adequadas para modelar tecidos com organização espacial inerentemente lateral, como o complexo periodontal^24,32. Contudo, esse design possui uma limitação inerente em sua capacidade de recriar interfaces biológicas perpendiculares, como o complexo biomaterial-dentina-pulpa, já que o arranjo lateral dos compartimentos não replica fielmente a orientação in vivo da barreira de dentina entre a cavidade e a polpa^20,32. As configurações empilhadas verticalmente superam essas limitações ao sobrepor dois compartimentos ao longo do eixo y, separados por uma fatia de dentina nativa, permitindo a quantificação simultânea do transporte molecular através da dentina intacta e o monitoramento em tempo real das respostas das células da polpa, medido no meio de saída³⁰. No entanto, uma limitação reconhecida dessa orientação diz respeito à imagem de seção transversal da interface dentina-célula, pois obter imagens de seção transversal da interface dentina-célula no mesmo plano focal permanece tecnicamente mais desafiador do que nas configurações empilhadas horizontalmente, nas quais células e matrizes extracelulares são dispostas lateralmente. Embora múltiplos modelos de complexo dentina-polpa-em-um-chip tenham sido descritos na literatura, a maioria adota uma configuração empilhada horizontalmente, na qual os compartimentos são dispostos lado a lado no mesmo plano^10,20,21,29, enquanto relativamente poucos incorporaram uma fatia de dentina nativa em uma configuração empilhada verticalmente³⁰. Apesar disso, as variações nas abordagens de fabricação e nos parâmetros relatados entre esses modelos continuam a limitar a reprodutibilidade e as comparações entre estudos³³. O presente manuscrito tem como objetivo melhorar a reprodutibilidade metodológica ao fornecer um protocolo detalhado de fabricação para um dispositivo dente-em-um-chip com configuração empilhada verticalmente, facilitando assim a adoção mais ampla da plataforma pela comunidade de pesquisa odontológica.

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para fabricação e montagem de um dispositivo em chip de complexo polpa-dentinário empilhado verticalmente, incorporando um disco de dentina humana em uma plataforma microfluídica de polidimetilsiloxano (PDMS) com três camadas, fabricada utilizando um molde produzido por fotolitografia. O protocolo também descreve o semeador e o cultivo de células-tronco da polpa dentária no dispositivo sob condições estáticas.

Protocolo

O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovado pelo Comitê de Ética da Universidad de La Frontera para estudos envolvendo amostras humanas.

1. Aquisição do disco de dentina

OBSERVAÇÃO: Prepare o design do dispositivo antes de iniciar o protocolo (Figura 1A–1C).

1. Coleta e armazenamento de dentes
   1. Coletar molares ou pré-molares humanos saudáveis após obter o consentimento informado do paciente.
   2. Manter todas as amostras em solução de cloramina a 0,5% a 4°C para prevenir a desidratação da dentina e a desnaturação proteica.
   3. Substituir a solução de cloramina uma vez por semana durante o armazenamento.
2. Preparação de discos de dentina
   1. Seccionar cada dente horizontalmente no terço médio da coroa utilizando uma peça de mão de alta velocidade operando a 350.000 rpm e equipada com uma broca diamantada cilíndrica (diâmetro de 1 mm; granulometria de 100–150 µm).
   2. Realizar a seccionamento com irrigação contínua de água a aproximadamente 50 mL/min.
   3. Posicionar o corte no terço médio da coroa para evitar a câmara pulpar e o esmalte presente nos sulcos e fissuras oclusais, obtendo assim um disco composto predominantemente por tecido dentinário.
      CAUTELA: Realizar a seção dos dentes com irrigação contínua e usar equipamento de proteção individual apropriado, incluindo luvas, máscara e proteção ocular.
3. Acabamento dos discos de dentina
   1. Polir o disco de dentina utilizando discos de acabamento com granulometria decrescente.
   2. Continuar o polimento até atingir uma espessura final de dentina de aproximadamente 0,8 mm (±± 0,3 mm) e dimensões laterais de aproximadamente 5 mm × 5 mm (±± 0,3 mm) (Figura 1D).
4. Armazenamento dos discos de dentina
   1. Armazenar os discos de dentina preparados em solução de cloramina a 0,5% a 4°C até a montagem do dispositivo OoC.

Figura 1: Fluxo de projeto e fabricação do dispositivo organ-on-a-chip (OoC) do complexo dentina-pulpa. (A) Projeto tridimensional do dispositivo mostrando a arquitetura de três camadas. (B) Vista superior do design do dispositivo com as dimensões principais. (C) Vista lateral da configuração do dispositivo de três camadas. (D) Disco representativo de dentina preparado com espessura aproximada de 0,8 mm e dimensões laterais de aproximadamente 5 mm × 5 mm. (E) Molde-mestre de silício fabricado por fotolitografia e utilizado para moldar as camadas superior e inferior de polidimetilsiloxano (PDMS). (F) Remoção de uma camada de PDMS curada do molde de silício após polimerização térmica. (G) Tratamento com plasma da superfície do PDMS antes da união das camadas. (H) Dispositivo OoC final do complexo dentina-pulpa com três camadas montado por ligação com plasma e incorporando a interface de dentina. (I) Dispositivo montado conectado a tubos para teste de vazamento e preparação para experimentos microfluídicos. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

2. Fabricação do dispositivo OoC do complexo dentina-pulpa

1. Preparação do ambiente de trabalho e dos materiais
   1. Preparar materiais e equipamentos
      1. Prepare todos os materiais e equipamentos listados na Tabela de Materiais antes de iniciar a fabricação do dispositivo.
      2. Prepare os furadores de biópsia antes da montagem do dispositivo.
      3. Realize todos os procedimentos de fabricação em um ambiente limpo e livre de poeira.
      4. Use luvas, proteção ocular e equipamento de proteção individual apropriado durante toda a fabricação e montagem do dispositivo.
         NOTA: Prepare o molde produzido por fotolitografia antes de iniciar o protocolo (Figura 1E).
2. Fabricação do molde microestruturado
   1. Preparação da pastilha de silício
      1. Fabricar o molde em uma pastilha de silício de 4 polegadas, com uma face polida (tipo N, dopada com As, método de crescimento CZ, orientação <100>, espessura de 500 ±± 25 µm, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, resistividade de 0,001–0,005 Ω·cm).
      2. Limpe a pastilha sequencialmente em acetona, isopropanol e água ultrapura por 10 min cada, sob ultrassonicação.
      3. Seque a pastilha com ar comprimido.
      4. Leve a pastilha ao forno a 200°C por 10 min em uma placa quente para remover a umidade residual.
      5. Deixe a pastilha esfriar até a temperatura ambiente (TA; 20°C–25°C).
   2. Ativação da superfície e revestimento com fotoresina
      1. Ative a superfície da pastilha de silício utilizando um limpador de plasma a vácuo operado com plasma de ar no nível 7 por 120 s.
      2. Aplicar a fotoresina negativa à base de epóxi GM 1060 por centrifugação a 300 rpm por 10 s.
      3. Continue a centrifugação a 565 rpm por 100 s e a 965 rpm por 1 s, utilizando uma aceleração de 200 rpm/s.
      4. Deixe a pastilha revestida repousar por 10 min.
      5. Realize uma pré-secagem a 65°C por 10 min.
      6. Continue a pré-secagem a 95°C por 1 h.
      7. Deixe a pastilha esfriar até a TA.
   3. Exposição e desenvolvimento
      1. Exponha a fotoresina utilizando um sistema de litografia a laser direto com uma dose de 1.950 mJ/cm².
      2. Realize uma pós-secagem a 65°C por 10 min.
      3. Continue a pós-secagem a 95°C por 30 min.
      4. Deixe a pastilha esfriar até a TA.
      5. Deixe a pastilha repousar por 10 min.
      6. Desenvolva o padrão em PGMEA por 4 min.
      7. Estenda o desenvolvimento em intervalos de 30 s se restar fotoresina residual.
      8. Interrompa o desenvolvimento lavando com isopropanol.
      9. Seque a pastilha utilizando ar comprimido.
   4. Secagem final (hard bake)
      1. Realize uma secagem final a 135°C por 2 h.
      2. Obtenha um molde mestre microestruturado contendo microcanais com 1 mm de largura e 50 µm de altura.
3. Preparação e dessurgimento da mistura de PDMS
   1. Preparação da mistura de PDMS
      1. Misture a base de PDMS e o agente de cura na proporção de 10:1 em peso.
      2. Agite manualmente a mistura com uma haste de vidro em um béquer plástico por aproximadamente 5 min.
      3. Mantenha movimentos circulares lentos e contínuos durante a mistura.
         NOTA: Evite introduzir bolhas de ar durante a mistura.
   2. Dessurgimento
      1. Coloque a mistura de PDMS em um dessecador a vácuo conectado a uma bomba de vácuo.
      2. Dessurja a mistura a aproximadamente 700 mmHg por 5 min.
      3. Libere o vácuo brevemente para permitir que as bolhas na superfície estourem.
      4. Reaplique o vácuo.
      5. Repita o ciclo até que não haja bolhas visíveis.
         NOTA: O tempo total de dessurgimento é tipicamente de aproximadamente 30 min.
4. Conformação do PDMS sobre o molde
   1. Preparação do molde
      1. Coloque o molde sobre uma superfície plana.
      2. Limpe o molde utilizando ar comprimido.
      3. Evite contato direto com a superfície moldada.
      4. Verifique se o molde está livre de poeira e contaminantes.
   2. Dispensação do PDMS
      1. Dispense aproximadamente 8 g de PDMS ao redor do disco de dentina para fabricar a camada de incorporação da dentina.
      2. Ajuste a altura do PDMS para corresponder à espessura do disco de dentina (0,8 ±± 0,3 mm).
      3. Evite que o PDMS cubra a superfície da dentina.
      4. Dispense aproximadamente 0,26 g de PDMS por unidade do molde para fabricar cada camada de microcanal.
      5. Bata suavemente no molde ou aplique vibração para facilitar o preenchimento das microestruturas.
      6. Deixe o PDMS assentar nas menores características.
      7. Cubra o molde com uma tampa ou cobertura plana sem tocar na superfície do PDMS.
         NOTA: A camada de incorporação da dentina tem aproximadamente 0,8 mm de espessura, e cada camada de microcanal tem aproximadamente 0,4 mm de espessura, resultando em uma espessura total do dispositivo de aproximadamente 1,6 mm.
         NOTA: Ajuste a espessura da camada de acordo com a distância de trabalho do objetivo confocal quando a imagem confocal estiver planejada.
5. Curagem
   1. Coloque os moldes em um forno a 50°C.
   2. Cure o PDMS por 4 h.
6. Remoção das camadas de PDMS
   1. Remoção do PDMS curado
      1. Descasque cuidadosamente as camadas de PDMS curado do molde (Figura 1F).
      2. Manuseie as camadas de PDMS com cuidado para evitar danos às microestruturas.
7. Junção das camadas de PDMS e fabricação dos orifícios de entrada e saída
   1. Fabricação dos orifícios de entrada e saída
      1. Crie perfurações nos locais designados de entrada e saída utilizando um furador de biópsia de 1 mm.
      2. Posicione o lado do microcanal voltado para cima durante a perfuração.
         NOTA: Coloque a camada de PDMS sobre uma base de corte para evitar danos estruturais.
      3. Crie duas perfurações na camada superior correspondentes ao microcanal superior.
   2. Limpeza das camadas de PDMS
      1. Limpe as camadas de PDMS utilizando álcool isopropílico ou etanol.
      2. Remova partículas residuais de poeira utilizando fita adesiva estéril.
      3. Verifique se todas as superfícies de junção estão livres de contaminantes antes da montagem.
   3. Ativação por plasma das superfícies de PDMS
      1. Posicione as camadas superior e intermediária de PDMS para o tratamento com plasma (Figura 1G).
      2. Ative as superfícies utilizando um tratador de plasma corona portátil operando a aproximadamente 25 W com ar ambiente como gás de trabalho.
      3. Mantenha uma distância de trabalho de aproximadamente 1 mm entre a fonte de plasma e a superfície de PDMS.
         CAUTELA: Realize o tratamento com plasma sob ventilação adequada e evite exposição direta ao ozônio gerado pelo plasma.
      4. Ative o dispositivo de tratamento com plasma e aguarde 5 s para estabilização.
      5. Verifique a geração de um feixe de plasma uniforme antes do tratamento.
      6. Trate a camada superior de PDMS por 10 s utilizando um movimento contínuo de vai-e-vem a aproximadamente 5 mm/s.
      7. Trate a camada intermediária de PDMS por 10 s utilizando o mesmo movimento e distância.
      8. Aplique um tratamento adicional de 1 s com plasma na camada superior imediatamente antes da junção.
   4. Junção das camadas superior e intermediária
      1. Alinhe o microcanal superior com o disco de dentina imediatamente após o tratamento com plasma.
      2. Junte as camadas superior e intermediária.
      3. Coloque o conjunto montado em um forno a 75°C por 5 min.
      4. Consolide a junção durante a incubação.
         NOTA: O disco de dentina e o microcanal são visíveis a olho nu e podem ser alinhados sem ferramentas adicionais de alinhamento.
   5. Fabricação dos orifícios do microcanal inferior
      1. Fure duas perfurações correspondentes ao microcanal inferior através das camadas superior e intermediária já unidas.
      2. Realize a perfuração através de ambas as camadas simultaneamente para garantir o alinhamento.
         NOTA: Este procedimento gera quatro perfurações na camada superior e duas perfurações na camada intermediária.
      3. Coloque o conjunto montado sobre uma base de corte firme antes da perfuração.
      4. Aplicar pressão descendente constante em um único movimento.
         NOTA: Evite forças rotacionais ou laterais para minimizar o risco de descolamento.
      5. Remova os detritos dos locais de perfuração utilizando gaze estéril sem fiapos umedecida com álcool isopropílico.
      6. Inspecione as perfurações e áreas adjacentes unidas sob iluminação adequada.
      7. Verifique a ausência de descolamento, rasgos ou perfurações incompletas antes de prosseguir.
   6. Junção da camada inferior
      1. Trate com plasma a camada inferior conforme descrito no Passo 2.7.4.
      2. Alinhe os orifícios de entrada e saída do microcanal inferior com as perfurações nas camadas superior e intermediária.
      3. Junte a camada inferior para completar a montagem do dispositivo.
         NOTA: Marque os locais de entrada e saída na superfície externa da camada inferior antes da junção para facilitar o alinhamento.
         NOTA: Câmaras de plasma podem proporcionar junções mais fortes do que canetas de plasma, conforme relatado na literatura³⁶.
         NOTA: O dispositivo final consiste em uma plataforma microfluídica de três camadas que incorpora uma interface de dentina (Figura 1H). A superfície inferior da dentina representa o lado da polpa do modelo, enquanto a superfície superior da dentina representa o lado coronal para exposição a biomateriais dentários ou preparações bacterianas.
8. Teste de vazamento do dispositivo microfluídico
   1. Inspecção do dispositivo montado
      1. Inspecione o dispositivo montado quanto a desalinhamentos.
      2. Inspecione a montagem quanto a junção incompleta e vazamentos visíveis.
   2. Teste de vazamento
      1. Conecte agulhas Luer-lock de 19G aos orifícios de entrada (Figura 1E).
      2. Conecte as agulhas às tubulações da bomba microfluídica.
      3. Pressione suavemente os conectores das agulhas nos orifícios perfurados para obter um encaixe hermético.
      4. Injete PBS estéril ou meio de cultura a uma taxa de fluxo de 10 µL/min.
      5. Mantenha o fluxo de fluido por pelo menos 5 min.
      6. Inspecione todas as interfaces unidas, margens dos canais e bordas do disco de dentina durante o fluxo.
      7. Observe o dispositivo sob iluminação adequada durante e após a injeção.
      8. Confirme a ausência de acúmulo de fluido, umidade ou formação de gotículas.
      9. Classifique o dispositivo como livre de vazamentos se nenhum vazamento for detectado.
      10. Descarte dispositivos que apresentem vazamento.
          NOTA: Realize o teste de vazamento em todos os dispositivos fabricados antes do cultivo celular ou uso experimental.
9. Sterilização e armazenamento do dispositivo microfluídico
   1. Sterilização
      1. Exponha a superfície superior do dispositivo montado à luz UV (254 nm) por 30 min dentro de uma cabine de fluxo laminar.
      2. Exponha a superfície inferior à luz UV por mais 30 min.
      3. Enxágue os microcanais com etanol a 70% por 20 min.
      4. Lave os microcanais três vezes com PBS estéril para remover o etanol residual.
   2. Armazenamento
      1. Utilize o dispositivo esterilizado imediatamente para experimentos de cultura celular.
      2. Alternativamente, armazene o dispositivo submerso em PBS estéril a 4°C dentro de um recipiente estéril até o uso.
         ​CAUTELA: Não utilize cloramina ou outras soluções desinfetantes após a montagem do dispositivo, pois o PDMS pode absorver esses compostos e comprometer a viabilidade celular.

3. Avaliação da adesão e viabilidade de células-tronco da polpa dentária

1. Pré-condicionamento da superfície dentinária
   1. Injete 10% de EDTA no dispositivo.
   2. Mantenha o contato entre a solução de EDTA e a superfície dentinária por 15 min.
   3. Injete 0,5 mL de EDTA a cada 3 min para manter o movimento do fluido dentro do microcanal.
   4. Lave o disco de dentina três vezes com água ultrapura.
   5. Mantenha cada lavagem por 5 min.
      NOTA: O tratamento com EDTA remove a camada de smear e expõe as proteínas da matriz dentinária.
      ATENÇÃO: Manipule soluções de EDTA usando luvas e proteção ocular para evitar irritação na pele e nos olhos.
2. Plaquiação de células-tronco da polpa dentária
   1. Expansão de células-tronco da polpa dentária
      1. Plaque células-tronco da polpa dentária em um frasco T75 com densidade de 1 × 10⁶ células por frasco.
      2. Incube as células a 37°C e 5% de CO₂ até atingir cerca de 80% de confluência.
      3. Desprenda as células utilizando tripsina.
      4. Neutralize a tripsina utilizando meio de cultura completo.
      5. Centrifugue a suspensão celular para obter um pellet celular.
      6. Avalie a viabilidade celular utilizando azul de tripano.
      7. Utilize suspensões celulares com viabilidade ≥90%.
   2. Preparação da suspensão celular
      1. Prepare uma suspensão celular pré-aquecida a 37°C.
      2. Ajuste a concentração celular para 100.000 células/mL em meio de cultura completo.
      3. Prepare um volume final de suspensão de 1–2 mL.
         NOTA: Células na passagem 5 foram utilizadas no presente estudo.
   3. Plaquiação celular
      1. Injete a suspensão celular na porta de entrada do microcanal inferior.
      2. Inverta o dispositivo após a plaquiação celular
         NOTA: A inversão do dispositivo promove a sedimentação celular em direção à superfície dentinária e melhora a adesão celular.
   4. Incubação
      1. Coloque o dispositivo invertido dentro de uma placa de Petri.
      2. Adicione 1 mL de meio de cultura à placa de Petri para minimizar a evaporação.
      3. Incube o dispositivo a 37°C e 5% de CO₂ por 24 h.
      4. Mantenha condições de cultura estática durante todo o período de incubação.
         NOTA: A validação com fluxo dinâmico não foi realizada no presente estudo.
         NOTA: O presente protocolo descreve condições de cultura estática para validação inicial do dispositivo e avaliação da adesão celular.
   5. Validação inicial do dispositivo
      1. Avalie a adesão celular utilizando microscopia eletrônica de varredura.
      2. Recupere o disco de dentina pela desmontagem do dispositivo antes da análise.
3. Preparação de amostras para microscopia eletrônica de varredura
   1. Recuperação e lavagem da amostra
      1. Desmonte o dispositivo após 24 h de incubação.
      2. Recupere o disco de dentina e transfira-o para uma placa de cultura ou placa de Petri.
      3. Posicione a superfície dentinária com células voltada para cima.
      4. Lave o disco de dentina duas vezes com 1 mL de PBS.
   2. Fixação
      1. Adicione 2 mL de glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato de Sorensen 0,1 M.
      2. Incube a amostra por 30 min à temperatura ambiente (RT).
         ATENÇÃO: O glutaraldeído é tóxico e pode causar irritação na pele, olhos e trato respiratório. Realize os procedimentos de fixação dentro de uma câmara de exaustão química, utilizando equipamento de proteção individual apropriado.
   3. Lavagem após fixação
      1. Remova a solução de glutaraldeído.
      2. Lave o disco de dentina três vezes com água destilada ultrapura à temperatura ambiente (RT).
   4. Análise por MEV
      1. Analise as amostras utilizando um microscópio eletrônico de varredura ambiental.
      2. Opere o microscópio em condições de baixo vácuo (25 Pa).
      3. Utilize uma tensão de aceleração de 10,0 kV e uma distância de trabalho de 7,0 mm.
      4. Adquira imagens utilizando o modo de detecção 3D de elétrons retroespalhados (BSE-3D).
      5. Capture imagens com aumento de ×200 (Figura 2A).
4. Avaliação da viabilidade celular por microscopia confocal
   1. Preparação da amostra
      1. Plaque e cultive as células conforme descrito no Passo 3.2.
      2. Incube o dispositivo por 24 h a 37°C e 5% de CO₂.
      3. Desmonte o dispositivo e exponha a superfície dentinária.
      4. Transfira o disco de dentina para uma placa de poços contendo HBSS⁺/+ suplementado com Ca²⁺ e Mg²⁺.
   2. Lavagem da amostra
      1. Lave o disco de dentina duas vezes com HBSS⁺/⁺.
      2. Remova o soro residual e o vermelho de fenol antes da coloração.
         NOTA: O soro residual e o vermelho de fenol podem aumentar a autofluorescência de fundo.
   3. Coloração de células vivas
      1. Prepare uma solução trabalho fresca de Calceína AM a 2 µM em HBSS⁺/⁺.
      2. Adicione quantidade suficiente de solução de coloração para cobrir completamente a superfície dentinária.
      3. Incube a amostra por 20 min a 37°C no escuro.
      4. Remova a solução de coloração após a incubação.
   4. Coloração de células mortas
      1. Adicione solução trabalho de iodeto de propídio (1–2 µg/mL em HBSS⁺/⁺).
      2. Incube a amostra por 5–8 min a 37°C no escuro.
      3. Não exceda 10 min de incubação.
      4. Lave a amostra duas vezes com HBSS⁺/⁺.
      5. Mantenha a amostra submersa em tampão até a aquisição de imagens.
   5. Aquisição de imagens por microscopia confocal
      1. Adquira imagens confocais dentro de 30 min após a coloração.
      2. Adquira imagens sequencialmente nos canais verde e vermelho.
      3. Utilize λ_ex 490 nm e λ_em 515 nm para a imagem de células vivas.
      4. Utilize λ_ex 535 nm e λ_em 617 nm para a imagem de células mortas.
         ​NOTA: Proteja as soluções fluorescentes de coloração e as amostras coradas da exposição à luz durante os procedimentos de incubação e aquisição de imagens (Figura 2B).

Figura 2: Avaliação representativa da adesão e viabilidade de células-tronco da polpa dentária no dispositivo OoC do complexo polpa-dentinária. (A) Imagem de microscopia eletrônica de varredura mostrando células-tronco da polpa dentária aderidas (asterisco branco) na superfície do dentina após 24 h de cultivo estático no dispositivo OoC. Após 24 h de cultivo, as células aderidas cobriram 54,35 ± 0,92% da superfície de dentina exposta ao microcanal. Nenhuma célula é observada na região da dentina coberta por PDMS (asterisco preto), indicando selamento eficaz entre as camadas do dispositivo. Barra de escala = 200 µm. (B) Imagem de microscopia confocal mostrando células-tronco da polpa dentária viáveis coradas em verde e aderidas à superfície da dentina (setas brancas) após 24 h de cultivo estático. Células não viáveis coradas em vermelho também são observadas (setas azuis). Barra de escala = 50 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Resultados

A fabricação bem-sucedida do dispositivo dente-em-um-chip seguiu o fluxo de trabalho ilustrado na Figura 1A–1I, incluindo a preparação do disco de dentina (Figura 1D), a fabricação do molde derivado da fotolitografia (Figura 1E), a remoção das camadas de PDMS curadas (Figura 1F), a ativação por plasma antes da ligação (Figura 1G), a montagem do dispositivo final (Figura 1H) e a conexão do dispositivo ao sistema microfluídico (Figura 1I). O dispositivo resultante consistiu em uma montagem de três camadas de PDMS na qual o disco de dentina foi totalmente integrado à camada intermediária, com os microcanais superior e inferior posicionados em ambos os lados da superfície da dentina (Figura 1H).

Um resultado positivo nesta etapa foi caracterizado pela ausência de bolhas de ar visíveis ou deslaminação e por passagem de fluido sem vazamentos após a injeção de PBS ou meio de cultura através das portas de entrada (Figura 1I). O desalinhamento das portas dos microcanais, ligação por plasma incompleta ou vazamento na interface entre a dentina e o PDMS indicavam montagem falha e exigiam a repetição do procedimento de fabricação.

Um total de 30 dispositivos foram fabricados, dos quais aproximadamente 20% falharam durante a fabricação ou os testes. As falhas estiveram principalmente associadas a vazamentos de fluido além dos limites do microcanal devido à ligação por plasma incompleta, enquanto uma proporção menor de falhas resultou de deslaminação em outras regiões do dispositivo. Nenhuma falha foi atribuída a vazamentos na interface dentina–PDMS ou ao desalinhamento das portas de entrada e saída do microcanal.

Após 24 h de cultivo estático, a semeadura celular bem-sucedida foi confirmada pela presença de células-tronco da polpa dentária aderidas, exibindo morfologia fibroblástica, na superfície da dentina. A microscopia eletrônica de varredura permitiu a avaliação da adesão celular e da integridade do dispositivo (Figura 2A). Utilizando o presente protocolo, as células aderidas cobriram 54,35 ± 0,92% da superfície da dentina exposta ao microcanal após 24 h de cultivo. Um resultado positivo foi evidenciado pela presença de células aderidas exclusivamente na área do microcanal, enquanto a superfície da dentina coberta por PDMS permaneceu livre de adesão celular (Figura 2A). Essa distribuição espacial indicou um selamento bem-sucedido entre as camadas do dispositivo e uma montagem adequada do mesmo. Por outro lado, a presença de células além dos limites do microcanal indicou vazamento e deve ser considerada um resultado negativo.

A microscopia confocal utilizando coloração vital permitiu a avaliação não destrutiva da viabilidade celular dentro do dispositivo. Um resultado bem-sucedido foi caracterizado pela predominância de células viáveis exibindo fluorescência verde e morfologia fibroblástica, com apenas ocasionais células não viáveis coradas em vermelho (Figura 2B). Em contraste, uma alta proporção de células não viáveis indicaria um pré-condicionamento de dentina subótimo, lavagem inadequada ou condições de cultivo inadequadas.

Durante a otimização do protocolo, foi avaliada uma estratégia inicial de fabricação na qual um molde fixo, incorporando uma reentrância predefinida, foi usado para posicionar o disco de dentina dentro da camada média de PDMS (Figura 3A). Embora essa abordagem tivesse como objetivo padronizar a colocação do disco e reduzir vazamentos na interface disco–PDMS, mostrou-se ineficiente na prática. Como a região correspondente à reentrância do disco de dentina precisava ser cortada manualmente da camada de PDMS curada, a adaptação precisa entre as margens do disco e as bordas cortadas do PDMS não pôde ser alcançada de forma confiável, resultando em lacunas interfaciais que causaram vazamento em aproximadamente 50% dos dispositivos fabricados (Figura 3A).

Figura 3: Imagens representativas ilustrando abordagens de fabricação sem sucesso identificadas durante a otimização do dispositivo OoC do complexo dentina-pulpa. (A) Molde de silício contendo reentrâncias fixas projetadas para posicionamento padronizado de discos de dentina (setas brancas). Devido à variabilidade inerente nas dimensões dos discos de dentina resultante da preparação manual dos espécimes, não foi possível obter uma adaptação confiável à geometria fixa do molde, levando à formação de lacunas interfaciais e vazamentos em aproximadamente 50% dos dispositivos fabricados. (B) Imagem de microscopia eletrônica de varredura da superfície da dentina após a aplicação de um material selante na interface disco-PDMS. A dentina exposta (asterisco preto) e os depósitos do material selante (asterisco branco) são indicados. A disseminação não intencional do material selante sobre a superfície da dentina comprometeu a adesão celular e reduziu a área superficial disponível para colonização celular. Barra de escala = 100 µm. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Para resolver essa limitação, um material selante foi aplicado na interface entre o disco e o PDMS. No entanto, essa abordagem introduziu uma desvantagem adicional, pois o material selante espalhou-se sobre a superfície da dentina e impediu a adesão celular nas regiões cobertas, conforme demonstrado por microscopia eletrônica de varredura (Figura 3B). Esses resultados subótimos destacaram duas limitações críticas da estratégia inicial de fabricação: adaptação inadequada entre a reentrância de PDMS cortada manualmente e o disco de dentina, e adesão celular reduzida associada ao material selante.

Discussão

Este estudo descreve um protocolo passo a passo para a fabricação de um dispositivo tipo dente-em-um-chip com empilhamento vertical, incorporando dentina e células-tronco da polpa dentária, e demonstra a adesão celular e viabilidade representativas dentro do dispositivo sob condições de cultivo estático. O protocolo foi desenvolvido para fornecer um fluxo de trabalho reprodutível para a fabricação e montagem de uma plataforma OoC (orgão-em-um-chip) do complexo dentina-polpa adequada para estudos in vitro da interface dentinária. O estabelecimento de tal fluxo de trabalho é particularmente significativo porque nossa revisão sistemática recente destacou que o campo dos modelos microfluídicos para o complexo dentina-polpa ainda se encontra em estágio emergente, caracterizado por alta heterogeneidade metodológica na arquitetura e nos materiais dos dispositivos, o que compromete severamente a reprodutibilidade e padronização dos modelos atuais de dente-em-um-chip³⁴. Ao fornecer um protocolo detalhado e reprodutível, este estudo aborda essas limitações e contribui para o desenvolvimento de modelos biológicos melhor definidos. No contexto mais amplo do desenvolvimento de OoC aplicado à biologia oral, França et al.¹⁵ foram pioneiros na área com um modelo microfluídico de dente-em-um-chip que incorpora discos de dentina e células semelhantes a odontoblastos, demonstrando a viabilidade de recriar a interface dentina-polpa em um ambiente microfluídico dinâmico e avaliando a resposta citotóxica a materiais dentários. Desde essa contribuição inovadora, um número crescente de plataformas orais de OoC tem sido relatado na literatura³⁴, abordando diversos aspectos da biologia dos tecidos dentários, interações com biomateriais e microbiologia oral, consolidando essa abordagem como um campo de pesquisa ativo e em rápida expansão. O presente protocolo contribui para esse cenário ao fornecer um fluxo de trabalho detalhado e reprodutível de fabricação para uma plataforma dente-em-um-chip com empilhamento vertical, acessível a grupos de pesquisa com capacidades microfluídicas padrão.

Várias etapas do protocolo são críticas para a fabricação bem-sucedida e o desempenho do dispositivo. Em particular, despejar o PDMS sobre o molde exige um controle cuidadoso para obter espessura uniforme da camada e formação adequada dos microcanais. A espessura das camadas de PDMS deve ser selecionada de acordo com a aplicação final pretendida. Por exemplo, a microscopia confocal exige camadas de PDMS suficientemente finas para permitir a visualização óptica de células aderidas à superfície da dentina. No entanto, camadas mais finas podem ser mais difíceis de manipular durante os procedimentos de fabricação e montagem. Consequentemente, a otimização da espessura do PDMS representa um equilíbrio importante entre acessibilidade para imagem e manuseio prático durante a fabricação do dispositivo. Além disso, no presente estudo, a microscopia confocal de dispositivos intactos não foi viável porque a camada de PDMS sobrejacente às células tinha uma espessura de 0,4 mm, excedendo a profundidade de penetração do microscópio confocal disponível (0,2 mm). Como resultado, a aquisição de imagens confocais foi realizada após a desmontagem do dispositivo e exposição direta da superfície da dentina. Adicionalmente, a microscopia de fluorescência não foi aplicável neste dispositivo porque a opacidade inerente da dentina impediu a visualização óptica direta de células aderidas à sua superfície.

Essa limitação é particularmente relevante para configurações de OoC empilhadas verticalmente, nas quais o microcanal contendo as células está posicionado abaixo do disco de dentina, resultando em acesso óptico prejudicado tanto pela camada de PDMS sobrejacente quanto pela opacidade da própria dentina. Essa limitação não é encontrada em designs de chips empilhados horizontalmente, onde os microcanais se estendem lateralmente ao lado da dentina em vez de abaixo dela, permitindo assim acesso óptico direto à superfície semeadas com células, sem interferência da opacidade da dentina ou da espessura do PDMS. A escolha entre configurações empilhadas vertical ou horizontalmente deve, portanto, considerar não apenas os requisitos fluidicos e biológicos, mas também as modalidades de imagem disponíveis no laboratório. Em um sistema OoC, o design do dispositivo desempenha um papel significativo, e o microambiente deve ser mantido o mais próximo possível das condições in vivo. Como a maioria dos tecidos, o dente está sujeito a estímulos mecânicos e apresenta comportamento anisotrópico³⁵, o que significa que suas propriedades variam conforme a direção do estímulo aplicado. Além disso, existem diferenças histológicas entre a porção coronal do complexo dentina-pulpa, onde a dentina e os odontoblastos estão dispostos verticalmente, e a porção lateral, onde os odontoblastos estão adjacentes à dentina, com diferenças notáveis no número de células, organização e orientação dos túbulos dentinários. Um design de chip empilhado verticalmente fornece, portanto, uma representação anatômica mais fiel de lesões cariosas e materiais restauradores que afetam a região coronal do complexo dentina-pulpa.

O tratamento preciso da superfície por plasma é essencial para a montagem bem-sucedida de dispositivos e permanece um dos principais desafios na produção de chips³⁶. Neste estudo, ocorreu delaminação em 20% dos dispositivos fabricados. Esse resultado não é inesperado, pois a ligação PDMS–PDMS obtida com uma caneta de plasma manual, como a utilizada no presente estudo, gera uma concentração menor de espécies reativas de oxigênio em comparação com sistemas de câmara de plasma baseados em vácuo, que permitem concentrações de oxigênio acima dos níveis atmosféricos e, consequentemente, produzem um maior número de grupos superficiais covalentes disponíveis para ligação³⁶. Como resultado, a resistência da ligação alcançada com uma caneta de plasma é inerentemente menor e menos reprodutível do que a obtida com uma câmara de plasma dedicada, o que provavelmente contribuiu para a taxa de delaminação observada. A otimização da estratégia de integração da dentina também exigiu múltiplas iterações de fabricação para alcançar um contato íntimo entre o disco de dentina e a camada intermediária de PDMS, minimizando ao mesmo tempo os vazamentos. Uma abordagem inicial envolveu a fabricação de um recesso predefinido na camada intermediária para a colocação da dentina; no entanto, o corte manual do recesso impediu uma adaptação consistente entre o disco de dentina e as margens de PDMS, resultando em vazamentos durante a injeção do meio de cultura e gerando uma taxa de sucesso geral de fabricação de aproximadamente 50%.

Um adesivo para prótese foi posteriormente avaliado para melhorar a vedação na interface dentina-PDMS, mas a microscopia eletrônica de varredura demonstrou interferência na adesão celular e redução da visualização das células na superfície da dentina. O protocolo final foi, portanto, otimizado posicionando o disco de dentina diretamente dentro do molde antes do vazamento cuidadoso do PDMS ao redor do espécime, melhorando assim a integração do disco de dentina no dispositivo e reduzindo a necessidade de materiais adicionais de vedação. Essa abordagem eliminou efetivamente vazamentos na interface dentina-PDMS, garantindo contato íntimo e conformacional entre as bordas do disco de dentina e o PDMS circundante, sem depender de agentes de vedação secundários que poderiam interferir na adesão celular à superfície da dentina. Algumas limitações do método atual também devem ser consideradas. A fabricação de dispositivos microfluídicos permanece parcialmente dependente de procedimentos manuais, o que pode introduzir variabilidade entre dispositivos e operadores. Embora a fotolitografia ofereça alta precisão e reprodutibilidade na fabricação de geometrias de microcanais, o processo pode exigir equipamentos especializados e expertise técnica. Abordagens alternativas de fabricação, incluindo técnicas de impressão tridimensional, podem facilitar a prototipagem de dispositivos e o acesso a alguns laboratórios; entretanto, fatores como resolução de impressão, monômeros residuais e biocompatibilidade do material requerem otimização cuidadosa³⁷.

O fornecimento contínuo de meio proporciona às células um ambiente estável e as protege contra o acúmulo de resíduos ou desequilíbrio de cálcio/fosfato¹⁶. Vários estudos demonstraram que a tensão de cisalhamento induzida por fluxo constante pode simular processos de mecanotransdução semelhantes à sinalização in vivo, que são determinantes-chave do comportamento celular^38,39, contribuindo para a diferenciação e maturação celular e induzindo alterações significativas na morfologia celular, expressão gênica e função³⁹. O presente estudo relata a fabricação e a validação inicial do dispositivo, demonstrando adesão celular e viabilidade após 24 h sob condições de cultivo estático; portanto, os efeitos do fluxo dinâmico não foram avaliados. A implementação de condições de fluxo dinâmico representa uma importante perspectiva para pesquisas futuras e será abordada em investigações subsequentes. O presente protocolo fornece um fluxo de trabalho reprodutível para a fabricação de um dispositivo OoC de complexo dentina-pulpa empilhado verticalmente, incorporando dentina em uma plataforma microfluídica de PDMS com três camadas. Aplicações potenciais do modelo incluem a investigação de interações entre dentina e biomateriais, respostas celulares a materiais odontológicos e a avaliação in vitro da interface dentina-pulpa sob condições experimentais controladas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais biológicos e químicos
Acetona	ExpertQ	SOLV 8	Limpeza de wafer de silício
Meio de cultura Alpha MEM	Cytiva	SH30265.02	Meio de cultura para células-tronco da polpa dentária
Cloranamina (0,5%)	Merck	7080-50-4	Solução de armazenamento para discos de dentina
Células-tronco da polpa dentária	Não aplicável	Não aplicável	Cultura primária de células. Consulte os passos 3.2.1 e 3.2.2
EDTA (10%)	Winkler	N2222158E	Remoção da camada de smear
Fotorresistência negativa à base de epóxi	Gersteltec	GM1060	Fabricação de molde por fotolitografia
Glutaraldeído (2,5%) em Sorensen 0,1 M’tampão fosfato s	Sigma-Aldrich	210908-06	Fixação para MEV
Dentes humanos saudáveis (molares ou pré-molares)	Não aplicável	Não aplicável	Amostra humana
Isopropanol	ExpertQ	SOLV 16	Limpeza do wafer, interrupção do desenvolvimento e limpeza de PDMS
Kit de Viabilidade LIVE/DEAD	Sigma-Aldrich	451	Coloração de viabilidade por fluorescência.
PBS (solução salina tamponada com fosfato)	Corning	46-013-CM	Lavagem e teste de vazamento
Base de PDMS e agente de cura (polidimetilsiloxano)	Dow	Sylgard 184	Fabricação do dispositivo
PGMEA	Sigma Aldrich	484431	Desenvolvimento do fotoresiste
Azul de tripano	Sigma Aldrich	T8154-100ml	Avaliação da viabilidade celular
Tripsina	Corning	25-053-CI	Desprendimento celular
Água ultrapura	Cytiva	SH30529.01	Solução de lavagem
Materiais descartáveis e vidraria de laboratório
agulhas de seringa 19G	Vmatic	VCB19050	Conexão do dispositivo com microbomba ou seringa
Punção biópsica (diâmetro: 1 mm)	Harris Unicore	WHAWB100073	Fabricação dos portos de entrada e saída
Tapete de corte	Nicecool	Não aplicável	Proteção da superfície durante a perfuração
Discos para acabamento odontológico (por exemplo, Sof-Lex)	3M	Sof-Lex	Polimento da dentina
Adaptadores fêmea Luér para barbado	Runze Fluidics	RH-M016	Conexão de tubo
Vareta de mistura de vidro ou plástico	Duran	Não aplicável	Mistura de PDMS
Seringas hipodérmicas	Cranberry	pc-12246	Semeadura celular e teste de vazamento
Gaze estéril sem fiapos	Linderson	Não aplicável	Remoção dos detritos da punção
Adaptadores Luer macho	Runze Fluidics	RH-G016	Conexão de tubo
Vaso de mistura	Duran	Não aplicável	Preparação do PDMS
placa de Petri (140 mm) × 20 mm)	Deltalab	2000219	Cultura de células/incubação
Base de politetrafluoroetileno	CCTVal	Não aplicável	Fabricação da camada de dentina intermediária
Placa de silício	Jiaozuo Commercial FineWin	Não aplicável	Fabricação do molde
Tubo de silicone	Runze Fluidics	96421	Conexão fluidica
Frasco T75	Corning	353136	Expansão de células-tronco da polpa dentária
Placa de microtitulação	SPL Life Sciences	30006	Preparação para coloração e imagem confocal
Equipamentos e instrumentos
Secador de ar	METALPLAN	TITAN-040	Secagem de ar comprimido
Fonte de ar comprimido	SCHULZ	CSD-18.1	Molde e limpeza de superfícies
Microscópio confocal	Olympus	Não aplicável	Modelo: FV1000
Sistema de litografia a laser direta	Heidelberg	uPG 101	Exposição à resistência fotossensível
Microscópio eletrônico de varredura ambiental	Hitachi	Não aplicável	Modelo: Quanta 400
Punção de alta velocidade	Nakanishi	Não aplicável	Modelo: Pana-max2
Placa aquecida	LabTech	EH20A Plus	Cocção da pastilha e cocção do fotoresiste
Capela de fluxo laminar	BioBase	BBS8V1708313D	Esterilização do dispositivo
Bomba microfluídica	Nova Era	Não aplicável	Modelo: 1002X-ES. Teste de vazamento em 10 µL/min
Molde microestruturado (fabricado por fotolitografia)	CCTVal	Não aplicável	Veja o Passo 2.2 para as especificações de fabricação do molde
Forno ou incubadora	Memmert	UN110	Curação de PDMS a 50°C e consolidação de vínculo a 75°C
Câmara de Limpeza por Plasma a Vácuo	Fari Plasma	GD-5	Ativação de wafer por plasma
Plasma Corona Portátil	Aurora Pro Scientific	APS-CD-20AC	Ativação de PDMS por plasma
Ultrassonicator	Elma Sonic	S 10 (H)	Limpeza de wafer
Câmara de vácuo ou dessecador (250 mm)	Winglass	Não aplicável	Desgaseificação de PDMS
Bomba de vácuo	ROCKER	300	Desgaseificação do PDMS