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Artigo de investigação
Este estudo integra farmacologia em redes, acoplamento molecular e simulação de dinâmica molecular (MD) para elucidar componentes ativos centrais e alvos terapêuticos de Kongsheng Zhenzhong Dan (KSZZD) no transtorno do espectro autista (TEA), identifica resíduos de ligação chave por meio de varredura de alanina e valida efeitos em um modelo de rato de rato ASD induzido pelo ácido valproico.
O transtorno do espectro autista (TEA) é um transtorno neurodesenvolvimental complexo, e sua patogênese está intimamente associada à neuroinflamação crônica. Como uma fórmula clássica da medicina tradicional chinesa (MTC), o Kongsheng Zhenzhong Dan (KSZZD) é usado para distúrbios do neurodesenvolvimento e da memória devido aos seus efeitos neuroprotetores relatados, mas seu mecanismo molecular específico no TEA permanece incerto. Este estudo integra farmacologia de rede, análise de acoplamento molecular e simulação de MD para elucidar sistematicamente os componentes ativos centrais e os alvos terapêuticos candidatos da KSZZD para TEA tanto em nível sistêmico quanto atômico. Subsequentemente, resíduos de ligação chave são identificados por varredura flexível de alanina, e os efeitos biológicos são avaliados usando um modelo de rato de TEA induzido pelo ácido valproico (VPA). A análise da farmacologia em redes revelou que a quercetina, um componente chave na KSZZD, pode atuar parcialmente regulando a via de sinalização inflamatória mediada pelo TNF-α. Os resultados do acoplamento molecular mostraram que as energias de ligação dos componentes centrais do KSZZD aos seus alvos eram todas menores que -5,0 kcal/mol, entre as quais a quercetina exibia a maior afinidade de ligação ao TNF (-8,52 kcal/mol). A simulação de MD sugeriu que a quercetina poderia manter uma ligação estável ao bolso ativo do TNF-α, e a varredura de alanina identificou ainda mais GLU104 e GLN102 como resíduos de aminoácidos chave para manter a estabilidade estrutural do complexo. Experimentos in vivo demonstraram que a intervenção com quercetina melhorou significativamente os comportamentos locomotores e exploratórios em ratos com TEA induzidos por APV, e reduziu efetivamente os níveis de expressão de TNF-α no tecido sérico e cerebral. Esses achados sugerem que a quercetina pode contribuir para os efeitos previstos da KSZZD, ao menos em parte, por meio da inibição da via de sinalização TNF-α.
O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é um transtorno neurodesenvolvimental complexo caracterizado por comunicação social prejudicada, interesses restritos e comportamentos estereotipadosrepetitivos 1. O mecanismo patológico do TEA é altamente complexo, envolvendo a interação de variações genéticas, regulação epigenética e fatores ambientais, o que, em última análise, leva a plasticidade sináptica prejudicada e conectividade anómala dos circuitosneurais 2,3. A inflamação crônica no sistema nervoso central (SNC) desempenha um papel central na patogênese do TEA, e intervenções voltadas para a neuroinflamação surgiram como estratégias terapêuticas promissoras.
Kongsheng Zhenzhong Dan (KSZZD), uma fórmula clássica da MTC, foi registrada pela primeira vez em Essential Prescriptions Worth a Thousand Gold for Emergencies. Consiste em quatro ervas medicinais: carapaça de tartaruga, Os Draconis, Polygalae Radix e Acori Tatarinowii Rhizoma. A KSZZD é tradicionalmente usada para tonificar o coração e o rim, tranquilizar a mente e estabilizar o espírito. Clinicamente, é comumente usado para tratar atraso do desenvolvimento intelectual e comprometimento da memória4. Estudos farmacológicos modernos sugerem que a KSZZD e seus componentes ativos exercem efeitos neuroprotetores, anti-inflamatórios e antioxidantes, podendo melhorar comportamentos de aprendizagem, memória e ansiedade em modelos de transtornoneurodesenvolvimental 5. Nossa análise fitoquímica revelou que a quercetina e outros flavonoides são os principais componentes ativos dessa fórmula, que podem penetrar a barreira hematoencefálica e exibir atividade anti-inflamatóriasignificativa 6. No entanto, o mecanismo pelo qual esses componentes ativos mediam os efeitos terapêuticos da KSZZD no TEA ainda é pouco compreendido.
Com o rápido desenvolvimento da biologia computacional, técnicas como farmacologia de redes, acoplamento molecular, simulação de dinâmica molecular e cálculo de química quântica forneceram ferramentas poderosas para elucidar as interações entre componentes ativos da medicina tradicional chinesa e alvos de doenças no nívelatômico 7,8,9,10,11 . Ao integrar fontes de dados heterogêneas, a farmacologia de redes possibilita a construção de uma rede complexa e interativa de "caminho-componente-alvo" sob a perspectiva da biologia de sistemas, identificando assim preliminarmente os principais nós biológicos para a intervenção da medicina tradicional chinesa em doenças.
Com base nisso, o acoplamento molecular pode ser usado para simular o matching geométrico e o ajuste de energia entre componentes e proteínas-alvo, além de prever seus modos de ligação e atividades potenciais. Posteriormente, é realizada uma simulação de dinâmica molecular (MD) para investigar a flutuação estrutural e a estabilidade de ligação do complexo sob condições aquosas e fisiológicas. Combinada com a varredura de alanina, a simulação de mutagênese dirigida ao local é aplicada para localizar com precisão os resíduos centrais de pontos quentes responsáveis por manter a afinidade de ligação e para esclarecer o peso de contribuição do farmacofóforo no nível de aminoácidos. Por fim, a verificação baseada em experimentos farmacológicos bem elaborados pode revelar efetivamente o mecanismo molecular subjacente aos efeitos terapêuticos dos compostos da medicina tradicional chinesa em doenças específicas.
Assim, este estudo tem como objetivo primeiro rastrear os componentes e alvos centrais da KSZZD no tratamento do TEA por meio da farmacologia em rede. Subsequentemente, combinado com acoplamento molecular, simulação de dinâmica molecular e varredura flexível por alanina, os "resíduos de pontos quentes" que mantêm estabilidade complexa serão identificados, e o padrão de interação dinâmica entre quercetina e TNF-α será avaliado. Por fim, os resultados computacionais serão verificados experimentalmente em um modelo de rato de TEA induzido pela VPA, utilizando avaliações de comportamento animal, histopatologia cerebral e níveis de expressão de fatores inflamatórios. Este estudo tem como objetivo explorar potenciais mecanismos pelos quais componentes derivados da KSZZD podem afetar vias inflamatórias relacionadas ao autismo sob uma perspectiva multiescala, fornecendo uma base para investigações adicionais das intervenções da medicina tradicional chinesa em transtornos do neurodesenvolvimento.
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Análise de farmacologia de redes
"Autismo" foi usado como palavra-chave para pesquisar no banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org/) por alvos relacionados aoautismo 12, 13, 14. Os alvos recuperados dos bancos de dados foram fundidos após a remoção de entradas duplicadas. Alvos conhecidos de componentes ativos não capturados pelas previsões do banco de dados foram complementados com base em relatórios da literatura15. Os alvos da doença e os potenciais alvos dos componentes do medicamento foram uniformmente padronizados para Símbolos Gênicos usando o banco de dados de proteínas UniProt (https://www.uniprot.org/), e esses dois conjuntos de alvos foram mapeados para identificar os potenciais alvos terapêuticos da KSZZD para autismo16.
Com base no Banco de Dados e Plataforma de Análise de Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php), os potenciais compostos bioativos em KSZZD e seus alvos correspondentes foram selecionados de acordo com os critérios de biodisponibilidade oral (OB ≥ 0,30) e índice de semelhança com fármacos (DL ≥ 0,18)17. Os identificadores SMILES dos compostos foram recuperados do banco de dados PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), e a Previsão de Alvos Suíça (http://swisstargetprediction.ch/) foi posteriormente empregada para explorar os potenciais alvos não incluídos na plataforma18 do TCMSP. Posteriormente, o banco de dados HERB (http://herb.ac.cn) foi utilizado para triagem suplementar de acordo com a Regra dos Cinco de Lipinski, com os seguintes critérios: peso molecular (MW ≤ 500 Da), coeficiente de partição octanol-água (AlogP ≤ 5), número de doadores de ligações de hidrogênio (Hdon ≤ 5), número de aceitadores de ligações de hidrogênio (Hacc ≤ 10) e número de ligações rotativas (RBN ≤ 10). Em seguida, a triagem do alvo foi realizada usando o banco de dados BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/) com os seguintes critérios: corte de pontuação (≥0,84), pontuação de druggabilidade (≥0,10) e valor P (≤0,05). Por fim, o banco de dados UniProt (https://www.uniprot.org) foi utilizado para converter os nomes alvo selecionados em Símbolos Genéticos padrão.
Os alvos sobrepostos entre os alvos de drogas e os alvos de autismo foram identificados usando a ferramenta online Desenhar Diagrama de Venn (http://bioinformatics.psb.ugent.be). Esses alvos sobrepostos foram importados para o banco de dados STRING (https://string-db.org/) para construir uma rede de interação proteína-proteína (PPI) 19. A espécie foi definida para Homo sapiens, e as interações proteína-proteína com escores de confiança abaixo de 0,40 foram filtradas. A rede resultante foi importada para o software Cytoscape 3.10.0 para análisevisual 16, onde medicamentos, compostos e alvos foram representados por losangos vermelhos, círculos azuis e triângulos verdes, respectivamente, e os pesos das arestas refletiam o grau de centralidade dos nós. O plugin CytoNCA foi então usado para calcular valores de centralidade de grau, classificar os compostos centrais e identificar os principais compostos centrais. A análise de enriquecimento bioinformática dos genes-alvo foi realizada utilizando a plataformaMetascape 20, incluindo análise GO (processo biológico, BP; função molecular, MF; componente celular, CC) e análise da via KEGG.
Acoplamento molecular
As proteínas receptoras relacionadas ao autismo identificadas acima foram pré-processadas antes do acoplamento, reparando resíduos ausentes, otimizando o estado de protonação e removendo moléculas de água cristalina para manter a integridade estrutural dos receptores. O método de acoplamento semi-flexível no móduloCDOCKER 21 foi então empregado. Resíduos dentro de 10 Å do ligante cocristalino foram definidos como o bolso ativo, e a ligação ao receptor de ligante foi simulada dentro dessa região.
Os resultados do acoplamento foram avaliados usando a Energia de Interação CDOCKER como índice-chave, com valores de energia mais baixos indicando uma ligação prevista mais estável entre o ligante e o receptor. A confiabilidade do modo de acoplamento foi avaliada comparando a conformação de ligação espacial do componente central com a do ligante cocristalino no bolso ativo. O complexo com a energia de ligação ideal e a interação mais forte foi selecionado como a conformação inicial para a simulação molecular subsequente.
Simulação de dinâmica molecular
Com base nos achados do acoplamento molecular, uma simulação de dinâmica molecular foi realizada para explorar o mecanismo de ligação entre o complexo de quercetina e o TNF-α. Essa abordagem simula o movimento molecular e as interações em nível atômico e analisa mudanças dinâmicas em proteínas, ligantes e no ambiente ao redor, fornecendo assim informações sobre mudanças conformacionais moleculares, estabilidade de ligação e dinâmica proteína-ligante. O complexo receptor-ligante foi solvenciado usando o modelo de água TIP3P, com uma distância tampão de pelo menos 12 Å entre o complexo e a fronteira do sistema para garantir a solvatação total e reduzir os efeitos da fronteira. A concentração iônica foi ajustada para 0,154 M, e íons Na⁺ e Cl⁻ foram adicionados para neutralizar a carga do sistema. Para melhorar a precisão da simulação, foi adotado o campo de força proteico Amber14SB22 , que descreve efetivamente interações intermoleculares não ligadas e modos de ligação e é particularmente adequado para estudos do complexo proteína-ligante23.
Para minimização inicial de energia, o método de descida mais íngreme foi executado por 5000 passos para remover contatos irrazoáveis e conformações de alta energia, usando um limiar de convergência de 10 kJ/mol/nm para garantir o relaxamento dos parâmetros do campo de forças. O método do gradiente conjugado foi então executado por 2.000 passos para otimizar ainda mais o estado termodinâmico e garantir a estabilidadedo sistema 24.
Durante o equilíbrio, a simulação de conjunto NVT foi realizada inicialmente para 100 ps com um passo de tempo de 2 fs. O sistema foi gradualmente aquecido até 300 K para reduzir a influência da estrutura inicial e alcançar o equilíbrio termodinâmico. O conjunto foi então transferido para NPT, e um equilíbrio adicional de 100 ps foi realizado a uma pressão constante de 1 bar para estabilizar densidade e pressão. Esse estágio foi usado para levar o sistema a um estado termodinâmico estável antes da simulaçãode produção 25. A simulação formal da dinâmica molecular foi realizada por 20 ns, mantendo a temperatura em 300 K, pressão em 1 bar e um intervalo de tempo de 2 fs. A trajetória era salva a cada 10 ps. Para garantir estabilidade e precisão na simulação, parâmetros físicos, incluindo temperatura, pressão e volume, eram monitorados regularmente para confirmar que permaneciam dentro dos intervalos esperados.
Varredura flexível alanina
Com base na conformação estável obtida pela simulação de dinâmica molecular, foi realizada varredura de alanina em todos os resíduos de aminoácidos dentro de um raio de 3 Å da interface de ligação ao ligante. Neste procedimento, os resíduos-alvo são sistematicamente substituídos por alanina, truncando assim a cadeia lateral enquanto preserva a conformação da cadeia principal e remove interações específicas mediadas pela cadeia lateral. O peso de contribuição de cada resíduo para a afinidade de ligação foi quantificado calculando a mudança na energia livre de ligação entre os complexos do tipo selvagem e mutante. Ao contrário dos modelos estáticos tradicionais, este estudo introduziu um mecanismo de relaxamento flexível em cadeia lateral, permitindo que o ambiente ao redor do local da mutação passasse por relaxamento estrutural e simulasse de forma mais realista a resposta dinâmica da interface de ligação. Essa análise teve como objetivo identificar resíduos candidatos de hotspots que mantêm estabilidade complexa, fornecendo uma impressão digital energética para a otimização de compostos líderes direcionados a proteínas relacionadas ao autismo.
Experimentos com animais
Animais experimentais
Ratos saudáveis de grau SPF Sprague-Dawley (SD) (três machos e três fêmeas, com 3 meses de idade), nascidos e criados em condições idênticas, foram selecionados. A temperatura do ambiente era controlada entre 18 e 22 °C, a umidade relativa era mantida entre 60% e 70%, e o ciclo de luz era de 12 h: 12 h (luz: escuro). Todas as operações experimentais com animais foram aprovadas pelo Comitê de Ética Experimental de Animais do Primeiro Hospital Popular de Zunyi (Aprovação nº: LunShen (2025)-2-362).
Acasalamento animal, identificação da gravidez e agrupamento
Todos os ratos foram alimentados adaptativamente em um ambiente de FPS por 1 semana após a compra. Uma fêmea e um rato macho eram enjaulados juntos às 18h todas as tardes. O exame vaginal do plug foi realizado às 8h da manhã seguinte (12h após a jaula). A presença de um tampão vaginal foi considerada um acasalamento bem-sucedido, e o mesmo dia foi designado como dia gestacional 0,5 (GD0,5). Ratos grávidos eram alojados individualmente em gaiolas separadas. O peso corporal de ratos grávidos era medido e registrado diariamente. O peso corporal de ratos grávidos aumentava continuamente, com um ganho médio diário de 2 a 5 g, e o peso total podia aumentar cerca de 30% antes do parto. Após aproximadamente 10 dias de gravidez, um volume assimétrico típico em formato de pêra do abdômen era visível, e massas duras de fetos podiam ser sentidas pela palpação, o que se distinguia da circunferência abdominal uniforme e macia causada pela obesidade.
Estabelecimento de modelos e configuração de grupos de controle:
No grupo-modelo, duas ratas grávidas foram selecionadas aleatoriamente e injetadas intraperitonealmente com solução de VPA (600 mg/kg) uma vez no dia gestacional 12,5 (GD12,5). A APV foi administrada por meio de uma única injeção intraperitoneal na dose de 600 mg/kg no dia gestacional 12,5. Esse regime foi selecionado com base no trabalho seminal de Schneider ePrzewłocki 26, que estabeleceram que a exposição à VPA nesse ponto específico de gestação recapitula tanto as características neuroanatômicas quanto comportamentais do TEA humano. Esse protocolo desde então se tornou o modelo padrão e tem sido consistentemente validado em estudos farmacológicos recentes usando parâmetrosidênticos 27. Para o grupo controle em branco, uma rata grávida foi selecionada e injetada intraperitonealmente com um volume igual de 0,9% de soro fisiológico normal no mesmo momento. Ratos grávidos deram à luz naturalmente, e o dia de nascimento da prole foi registrado como dia pós-natal 0 (PND0). Todos os filhotes de rato foram desmamados e alojados separadamente por gênero no PND21.
Agrupamento e intervenção da prole
No PND28, 12 filhotes machos foram selecionados aleatoriamente entre os filhotes de ratos grávidas expostos à VPA (6 no grupo modelo e 6 no grupo de intervenção com quercetina), e 6 filhotes machos foram selecionados aleatoriamente entre os filhotes de ratos grávidos expostos a soro fisiológico normal (6 no grupo em branco). Foi garantido que não houvesse diferença significativa no peso corporal entre os filhotes de cada grupo. Filhotes nascidos de ratas grávidas tratadas com soro fisiológico normal foram designados para o grupo em branco, aqueles nascidos de ratas grávidas tratadas com VPA para o grupo modelo, e aqueles nascidos de ratos grávidas tratados com VPA para o grupo de intervenção com quercetina.
A intervenção contínua foi realizada por 4 semanas a partir da PND28. Para o grupo de intervenção com quercetina, a suspensão de quercetina foi administrada intragicastricamente em um horário fixo todos os dias, com uma dose de 100 mg/kg/dia. Essa dosagem foi selecionada com base nas seguintes evidências integradas: (i) um estudo anterior de dosagem variada identificou 100 mg/kg como a dose ideal para aliviar comportamentos semelhantes à ansiedade e reduzir citocinas pró-inflamatórias em um modelo28 de ratos neuroinflamatórios induzidos por LPS; (ii) a quercetina em 50 mg/kg demonstrou prevenir déficits de interação social e danos cerebrais oxidativos em um modelo29 de ratos autistas induzidos por APV pré-natais (VPA); e (iii) foi recentemente demonstrado que a quercetina oral reduz os níveis de TNF-α cerebral e melhora comportamentos semelhantes aos do autismo em um modelo30 de rato autista induzido por ácido propiônico. Coletivamente, essas validações independentes apoiam a seleção de 100 mg/kg para garantir o engajamento robusto da via inflamatória mediada pelo TNF-α no modelo atual de TEA induzido por VPA pós-natal. Para os grupos de blank e modelo, um volume igual de 0,5% de solução fisiológica normal CMC-Na foi administrado intragicastricamente todos os dias. Todos os animais tiveram acesso livre a comida e água durante o período de intervenção, e seus pesos corporais foram medidos semanalmente para ajustar o volume de administração de acordo com seus pesos corporais.
Teste em campo aberto
Após 4 semanas de intervenção (aproximadamente PND56), foi realizado o teste de campo aberto para avaliar os níveis de atividade espontânea e ansiedade. O teste de campo aberto (OFT) é um experimento comportamental clássico para avaliar comportamentos relacionados à ansiedade em animais experimentais. Os indicadores medidos foram a capacidade de movimento espontâneo dos ratos em um ambiente aberto e o tempo passado no centro do campo aberto. O aparelho OFT para ratos tinha 30 cm de altura, 50 cm de comprimento e 50 cm de largura na parte inferior, com paredes internas brancas, e era artificialmente dividido em 16 pequenas grades, incluindo 4 na área interna e 12 na área externa. O local experimental foi mantido em silêncio para evitar estímulos sonoros que pudessem afetar a precisão dos resultados experimentais. Cada rato era colocado no centro do fundo da caixa, e a gravação de vídeo e o cronograma eram realizados simultaneamente. O campo de visão da câmera cobria todo o campo aberto e registrava o movimento espontâneo dos ratos e o número de cruzamentos entre grades. Cada teste durava 5 minutos, após os quais a gravação de vídeo era interrompida. A parede interna e o fundo da caixa aberta foram limpos com álcool 75% para evitar que fezes e odor corporal deixados por um animal afetassem os resultados dos testes do próximo animal. A operação foi repetida após a substituição dos ratos até que todos os ratos concluíssem o teste.
Método de detecção patológica
Após fixação com 4% de paraformaldeído, o tecido cerebral foi submetido a desidratação por gradiente usando um desidratador totalmente automático: 75% de etanol por 2 horas, 85% de etanol por 1 hora, 95% etanol por 1 hora e etanol absoluto I-IV por 20 minutos cada. Os tecidos foram então limpados com o agente de limpeza I por 25 minutos e o agente de limpeza II por 30 minutos, seguidos pela incorporação de parafina. Seções com espessura de 5 μm foram desenceradas com a solução de dewaxing I e II por 30 minutos cada e reidratadas com etanol gradiente. As seções foram coradas com hematoxilina por 5–10 minutos, diferenciadas com álcool ácido clorídrico por 3 segundos e contra-coloridas com água alcalina para ficarem azuladas. Depois, foram contra-coloridos com eosina solúvel em álcool por 3 minutos, desidratados com etanol gradiente, limpos, cobertos com meio neutro de montagem e observados ao microscópio.
Detecção dos níveis de TNF-α no soro e no tecido cerebral
Após a última administração, o sangue da aorta abdominal foi coletado de ratos e centrifugado a 3.000 r/min a 4 °C por 15 minutos, e o sobrenadante sérico foi coletado. Enquanto isso, tecidos hipocampais e corticais foram dissecados, e PBS pré-resfriado foi adicionado na proporção de 1:9 para homogeneização mecânica. O homogenado foi então centrifugado a 12.000 r/min a 4 °C por 20 minutos para coletar o sobrenadante. O método BCA foi utilizado para quantificação de proteínas teciduais. Seguindo as instruções do kit ELISA, as amostras a serem testadas e os anticorpos biotinilados foram adicionados à microplaca em sequência. Após incubação e lavagem, o complexo avidina-peroxidase foi adicionado e incubado. Após outra lavagem, a solução de substrato foi adicionada para o desenvolvimento da cor, a reação foi interrompida com solução de parada e a absorvância foi medida a 450 nm usando um leitor de microplaca. As concentrações de TNF-α no soro (pg/mL) e no tecido cerebral (pg/mg prot) foram calculadas usando a curva padrão.
Análise estatística
A função RANDBETWEEN no Microsoft Excel era usada para randomizar os ratos e gerar números aleatórios para a alocação dos ratos. Todos os dados experimentais deste estudo foram expressos como média ± desvio padrão (DS). Antes da análise estatística, o teste de normalidade (teste de Shapiro-Wilk) e o teste de homogeneidade de variância (teste de Levene) eram realizados primeiro com os dados de cada grupo. Para dados que se ajustavam à distribuição normal e à homogeneidade da variância, foi utilizada análise unidirecional da variância (ANOVA unidirecional). Se a diferença fosse estatisticamente significativa, o método LSD foi ainda utilizado para comparações múltiplas. Um valor de *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 foi considerado estatisticamente significativo.
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Análise dos resultados de um estudo de farmacologia em rede sobre KSZZD no tratamento do autismo
Um total de 15.770 alvos relacionados ao autismo foi recuperado do banco de dados GeneCards. Alvos com pontuação de relevância ≥ 4,21 foram selecionados como potenciais alvos para autismo, resultando em 1014 alvos de doença. Os 827 alvos do KSZZD foram intersectados com os 1.014 alvos de autismo, e 125 alvos comuns foram obtidos. A visualização foi...
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Uma questão crítica é por que a quercetina, em vez de outros componentes centrais, foi selecionada para validação experimental e se ela pode representar os efeitos holísticos do KSZZD. Essa seleção baseou-se nas seguintes linhas convergentes de evidência: (i) em um modelo pré-natal induzido por APV, a quercetina preveniu significativamente déficits de interação social e danos cerebraisoxidativos 29; (ii) em um modelo de autismo induzido por ácido propiônico, a que...
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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Esta obra faz parte do No.: Zun Shi Ke He HZ Zi (2024) No. 54. Título do Projeto: Estudo sobre o Efeito Terapêutico de Jiawei Kongsheng Zhenzhong Dan no Autismo Baseado na Via de Sinalização BDNF-ERK-CREB.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0.5% CMC-Na normal saline solution | Not specified in manuscript | Not specified | Vehicle used for blank/model groups and quercetin suspension. |
| 0.9% normal saline | Not specified in manuscript | Not specified | Vehicle for blank-control maternal injections. |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Thermo Scientific Chemicals | J61899.AK | Used for fixation of brain tissue. |
| 75% alcohol | Not specified in manuscript | Not specified | Used to clean the open-field apparatus between animals. |
| Absolute ethanol | Not specified in manuscript | Not specified | Used for tissue dehydration before embedding. |
| Alkaline water | Not specified in manuscript | Not specified | Used to blue hematoxylin-stained sections. |
| Amber14SB protein force field | Not specified in manuscript | Not applicable | Protein force field used for molecular dynamics simulations. |
| BATMAN-TCM database | Not specified in manuscript | Not applicable | Online target-screening database: http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/ |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Used for protein quantification of tissue homogenates. |
| Bluing reagent | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7301 | Used after hematoxylin staining to blue nuclei. |
| CDOCKER module | Not specified in manuscript | Not applicable | Semi-flexible docking module used for molecular docking. |
| Clearing / dewaxing reagent | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | Clear-Rite 3, 6901 | Can be used for clearing and deparaffinization in histology workflows. |
| CytoNCA plugin | Not specified in manuscript | Not applicable | Cytoscape plugin used for degree centrality analysis. |
| Cytoscape software | Not specified in manuscript | Version 3.10.0 | Used for network visualization and protein-protein interaction analysis. |
| Discovery Studio software | Not specified in manuscript | Versions 2019 and 2021 | Used for receptor preprocessing, docking, and alanine scanning. |
| Draw Venn Diagram online tool | Not specified in manuscript | Not applicable | Online tool for Venn diagrams: http://bioinformatics.psb.ugent.be |
| Eosin-Y (alcoholic) | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7111 | Used for cytoplasmic counterstaining in H&E staining. |
| Fully automatic dehydrator | Not specified in manuscript | Not specified | Used for gradient dehydration of fixed brain tissue. |
| GeneCards database | Not specified in manuscript | Not applicable | Online database used to retrieve autism-related targets: https://www.genecards.org/ |
| GraphPad Prism software | Not specified in manuscript | Version 9.5 | Used for statistical analysis and graphing. |
| Hematoxylin staining solution | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7211 | Used for nuclear staining in H&E staining. |
| HERB database | Not specified in manuscript | Not applicable | Online database used for supplementary compound screening: http://herb.ac.cn |
| Hydrochloric acid alcohol | Not specified in manuscript | Not specified | Used for differentiation during H&E staining. |
| Metascape platform | Not specified in manuscript | Not applicable | Online platform used for GO and KEGG enrichment analysis. |
| Microplate reader | Thermo Scientific | Multiskan FC, 51119000 | Used for absorbance reading at 450 nm. |
| Microscope | Not specified in manuscript | Not specified | Used to observe H&E-stained brain sections. |
| Microsoft Excel software | Microsoft | Not specified | Used to randomize rats with the RANDBETWEEN function. |
| Mounting medium | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 4111 | Used for coverslipping and permanent mounting of stained sections. |
| Open field test apparatus | Not specified in manuscript | Not specified | 50 cm × 50 cm × 30 cm box used for behavioral testing. |
| Paraffin | Not specified in manuscript | Not specified | Used for paraffin embedding of brain tissue. |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | Used as pre-cooled buffer for tissue homogenization. |
| PLIP interaction fingerprinting | Not specified in manuscript | Not applicable | Used for protein-ligand interaction fingerprint analysis. |
| PubChem database | Not specified in manuscript | Not applicable | Online database used to retrieve SMILES identifiers: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ |
| Quercetin | Not specified in manuscript | Not specified | Administered by gavage at 100 mg/kg/day. |
| Rat TNF-α ELISA Kit | Invitrogen | ERA56RB | Suitable for serum and tissue homogenate TNF-α detection. |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 16R, 75004383 | Used for serum and tissue homogenate centrifugation. |
| Schrödinger Suite software | Schrödinger, LLC | Version 2024 | Used to construct the molecular dynamics simulation system. |
| SPF-grade Sprague-Dawley rats | Not specified in manuscript | Not specified | 3 male and 3 female rats used for animal model establishment. |
| SPSS software | Not specified in manuscript | Version 25.0 | Used for statistical analysis. |
| SRplot platform | Not specified in manuscript | Not applicable | Online platform used for visualization: https://www.bioinformatics.com.cn/ |
| STRING database | Not specified in manuscript | Version 12.0 | Used to construct the protein-protein interaction network: https://string-db.org/ |
| SwissTargetPrediction platform | Not specified in manuscript | Not applicable | Online platform used for target prediction: http://swisstargetprediction.ch/ |
| TCMSP database | Not specified in manuscript | Not applicable | Online platform used for bioactive compound screening: http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php |
| TIP3P water model | Not specified in manuscript | Not applicable | Water model used for molecular dynamics simulation. |
| UniProt protein database | Not specified in manuscript | Not applicable | Used to standardize target names to Gene Symbol: https://www.uniprot.org/ |
| Valproic acid (VPA) solution | Not specified in manuscript | Not specified | Administered intraperitoneally at 600 mg/kg on gestational day 12.5. |
| Video recording system/camera | Not specified in manuscript | Not specified | Used to record rat movement during the open field test. |