SMART (Tecnologia de Reconstrução Automatizada Shuimu): Uma plataforma computacional integrada para otimizar o fluxo de trabalho da crio-microscopia eletrônica

Resumo

Este protocolo demonstra um fluxo de trabalho passo a passo de criomicroscopia eletrônica usando uma plataforma integrada de software (SMART) que conecta aquisição de dados, reconstrução tridimensional e construção de modelos atômicos em uma única interface baseada em navegador. Como exemplo representativo, a estrutura humana TRPML1 é determinada com resolução de 2,38 Å.

Resumo

A microscopia crio-eletrônica (crio-EM) tornou-se uma ferramenta central em biologia estrutural, mas os fluxos de trabalho atuais normalmente exigem múltiplos pacotes de software especializados para aquisição de dados, reconstrução tridimensional (3D) e construção de modelos atômicos, levando a pipelines fragmentados e intervenções manuais frequentes. Aqui, apresentamos o SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology), uma plataforma de software integrada que combina três módulos — DataSmart para coleta automatizada de dados, CryoSmart para processamento de imagens e reconstrução 3D, e ModelSmart para construção de modelos atômicos baseados em aprendizado profundo — dentro de uma interface unificada acessível ao navegador. Este protocolo fornece instruções passo a passo para operar os três módulos. O fluxo de trabalho abrange navegação automatizada de amostras e aquisição de dados, correção de movimento, estimativa da função de transferência de contraste (CTF), seleção de partículas, classificação bidimensional (2D), refinamento 3D, aprimoramento de mapas e geração de modelos atômicos. Como exemplo representativo, aplicamos todo o fluxo de trabalho para determinar a estrutura do TRPML1 humano, um canal cátion lisossomal permeável a Ca²⁺, alcançando uma resolução global de 2,38 Å por correlação de conchas de Fourier (FSC) padrão ouro no critério 0,143. Todos os três módulos (DataSmart, CryoSmart e ModelSmart) foram aplicados sequencialmente ao mesmo conjunto de dados TRPML1 dentro deste estudo. O protocolo foi projetado para ser acessível a usuários com diferentes níveis de experiência em crio-EM.

Introdução

Microscopia Crio-Eletrônica: Evolução Tecnológica e Impacto Biológico. A determinação da estrutura tridimensional das proteínas continua sendo um desafio central na biologia molecular, já que a função biológica está intrinsecamente ligada ao arranjo espacial dos resíduos de aminoácidos. Elucidar essas configurações estruturais é imprescindível para decifrar mecanismos enzimáticos, interações com ligantes e vias de sinalização celular em resolução atômica. Esse imperativo impulsionou desenvolvimentos transformadores na crio-EM, que se tornou uma técnica amplamente adotada em biologia^{estrutural 1,2}.

A análise crio-EM de partícula única (SPA) serve como uma abordagem poderosa para obter insights biológicos em diversos tipos de amostras, resolvendo estruturas de alta resolução de complexos^{isolados 3}. Esses incluem vírus, proteínas de membrana, assemblagens helicoidais e outros complexos macromoleculares dinâmicos e heterogêneos, abrangendo uma ampla gama de tamanhos moleculares — de aproximadamente 50 kDa a dezenas de megadaltons.

A Cryo-EM SPA emergiu como uma técnica fundamental para resolver as arquiteturas tridimensionais (3D) de macromoléculas biológicas, abrangendo três estágios computacionais interdependentes: aquisição de dados, reconstrução 3D e construção de modelos atômicos (Figura 1).

Durante a aquisição de dados, amostras vitrificadas são imagens sob condições de baixa dose para gerar filmes micrográficos, capturando milhares de projeções de partículas em estados próximos aos nativos. Esses conjuntos de dados brutos são posteriormente processados por algoritmos iterativos de alinhamento e classificação para reconstruir mapas de densidade volumétrica. Por fim, modelos atômicos são construídos e refinados para se ajustar à densidade, elucidando interações moleculares em resolução próxima à atômica.

A análise acima demonstra que a saída do crio-EM representa apenas o ponto de partida do pipeline estrutural. Transformar esses dados brutos em modelos atômicos interpretáveis exige uma cascata de ferramentas computacionais especializadas. Assim, o software serve como a ponte crítica que transforma dados brutos em modelos atômicos.

Ecossistema de Software Crio-EM Fragmentado: Ferramentas Atuais e Limitações. Fluxos de trabalho crio-EM modernos dependem de um mosaico de ferramentas de software especializadas, cada uma abordando estágios discretos:

Aquisição de dados. Embora diversos pacotes de software de aquisição de dados crio-EM estejam disponíveis publicamente — incluindo Leginon ^4,5, SerialEM⁶, UCSFImage4⁷, TFS EPU ^8,9, Gatan Latitude, JEOL JADAS¹⁰ e Auto-EMation¹¹ — essas ferramentas produzem predominantemente dados brutos de filmes com capacidades limitadas de processamento pós-aquisição. Etapas críticas do fluxo de trabalho, como definição de parâmetros e personalização de templates, ainda exigem operações manuais intensivas em trabalho, muitas vezes exigindo parâmetros demais por conjunto de dados. Essa dependência da intervenção de especialistas introduz desafios de reprodutibilidade e ineficiências nos fluxos de trabalho, especialmente em cenários de alto rendimento.

Reconstrução 3D. a cryo-EM testemunhou avanços significativos em softwares de reconstrução 3D, permitindo resolução quase atômica de macromoléculas biológicas. Entre as ferramentas mais amplamente utilizadas estão RELION, cryoSPARC e EMAN2, cada uma oferecendo vantagens e limitações distintas. O RELION emprega uma abordagem bayesiana para refinamento iterativo, destacando-se no manejo de conjuntos de dados heterogêneos e alcançando reconstruções de alta^{resolução 12}. No entanto, sua intensidade computacional e curva de aprendizado íngreme frequentemente exigem intervenção de especialistas. cryoSPARC, aproveitando aceleração de GPU e deep learning, reduz significativamente o tempo de processamento e é amigável^{para o usuário 13}. O EMAN2 oferece um conjunto abrangente para picking de partículas e reconstrução 3D, mas requer ajuste manual extensivo e carece de capacidades de feedback em tempo^{real 14}. Embora essas ferramentas se destaquem em aspectos específicos da reconstrução 3D, permanecem restritas a funcionalidades singulares, carecendo de integração com aquisição de dados upstream ou modelagem atômica downstream. Por exemplo, RELION e cryoSPARC exigem transferência manual de dados a partir de softwares de controle de microscópio, introduzindo ineficiências e potenciais erros. Além disso, nenhuma dessas ferramentas fornece avaliação de qualidade em tempo real durante a coleta de dados ou transição fluida para a construção de modelos atômicos, resultando em fluxos de trabalho fragmentados que dificultam o rendimento e a reprodutibilidade.

A etapa computacional final na determinação estrutural baseada em crio-EM é a construção de modelos atômicos, onde coordenadas moleculares são ajustadas iterativamente em mapas de densidade reconstruídos para elucidar interações em nível atômico.

Embora abordagens convencionais de construção de modelos empreguem algoritmos de minimização de energia baseados em física — incorporando potenciais eletrostáticos, interações de van der Waals e restrições de geometria de ligações covalentes — elas continuam fortemente dependentes da intervenção manual para posicionamento inicial do modelo, interpretação de densidade e validação estereoquímica 15,16,17,18 . Essa dependência da curadoria de especialistas não apenas limita o rendimento, mas também introduz vieses subjetivos, especialmente em regimes de baixa resolução (< 4 Å), onde as características de densidade são ambíguas.

Para superar essas limitações, metodologias baseadas em aprendizado profundo (DL) surgiram como soluções transformadoras, aproveitando redes neurais para automatizar a extração de características, inicialização e refinamento de modelos. Essas abordagens demonstram desempenho aprimorado no manejo de mapas de densidade ruidosos ou incompletos, ao mesmo tempo em que reduzem significativamente a intervenção manual, como evidenciado por benchmarks recentes que mostram reduções de 40–60% nos passos dependentes do usuário em comparação com pipelines^{convencionais 19, 20, 21, 22.}

No entanto, esses métodos invariavelmente exigem exportar mapas de densidade de softwares de reconstrução 3D e importá-los para sistemas de construção de modelos. Antes da importação, etapas adicionais de pré-processamento — muitas vezes envolvendo ferramentas de terceiros — podem ser necessárias para otimizar os mapas de densidade. Esse fluxo de trabalho fragmentado exige transferências repetitivas de dados e conversões de formato, criando ineficiências. Além disso, se os resultados iniciais da construção do modelo forem insatisfatórios, os pesquisadores devem retornar à etapa de reconstrução para recálculo, seguida por outra rodada de construção e validação do modelo. Tais ciclos iterativos dificultam significativamente o throughput e a eficiência operacional dos pipelines de determinação estrutural crio-EM.

1.3 SMART: Uma Solução Integrada para Cryo-EM de ponta a ponta

Apesar dos avanços significativos na CRYO-EM SPA, a falta de soluções computacionais totalmente integradas continua a dificultar seu potencial para biologia estrutural de alto rendimento. Pacotes de software existentes, embora se destaquem na automação de componentes isolados de fluxos de trabalho — como aquisição de dados ou reconstrução 3D — não conseguem superar lacunas críticas entre a coleta de micrografias brutas, o refinamento do mapa de densidade e a construção de modelos atômicos. Essa fragmentação exige transferência manual de dados, conversões de formato e ajuste redundante de parâmetros, resultando em ineficiências que se acumulam com a escala do conjunto de dados.

Para resolver essas limitações, apresentamos a Plataforma Integrada de Fluxo de Trabalho Crio-EM, uma plataforma computacional integrada que unifica todo o pipeline CRYO-EM SPA em um fluxo de trabalho coeso e impulsionado por IA. A plataforma integrada integra três módulos centrais: DataSmart (aquisição automatizada de dados), CryoSmart (reconstrução 3D híbrida habilitada por redes neurais) e ModelSmart (modelagem atômica baseada em aprendizado profundo).

Os três módulos computacionais da plataforma estão interconectados por meio de um fluxo de dados padronizado, permitindo um fluxo de dados simplificado onde a saída de um módulo pode informar ajustes de parâmetros em etapas de processamento subsequentes. Essa integração visa reduzir o número de etapas manuais e transferências de dados exigidas nos fluxos de trabalho convencionais de crio-EM, potencialmente melhorando a acessibilidade e a eficiência para laboratórios de biologia estrutural.

Protocolo

A linhagem celular Expi293F usada para expressão proteica da proteína TRPML1 humana foi adquirida da Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd (Número de catálogo: SC0236058). A identidade da linha celular foi devidamente autenticada por meio de perfilamento Short Tandem Repeat (STR) (Arquivo Suplementar 1).

Declaração Ética
Este estudo não envolveu participantes humanos, animais ou amostras obtidas diretamente de humanos ou animais. A proteína humana TRPML1 foi produzida por expressão recombinante e purificada in vitro. A linhagem celular Expi293F utilizada para expressão de proteínas recombinantes é uma linha celular imortalizada e comercialmente disponível. Consequentemente, não era necessário consentimento ético institucional e por escrito.

NOTA: A plataforma integrada de fluxo de trabalho crio-EM é estruturada em três módulos principais: um módulo automatizado de aquisição de dados, um módulo de reconstrução 3D habilitado por rede neural híbrida e um módulo de modelagem atômica baseado em aprendizado profundo, com dados servindo como interface de comunicação entre esses componentes de software, conforme ilustrado na Figura 2. O sistema integrado de plataforma de fluxo de trabalho crio-EM adota uma arquitetura Navegador-Servidor (B/S), permitindo que os usuários realizem todas as operações por meio de uma interface web, garantindo assim usabilidade e acessibilidade operacional.

1. Aquisição Automatizada de Dados

NOTA: A plataforma integrada de fluxo de trabalho crio-EM consiste em três módulos principais: um módulo automatizado de aquisição de dados, um módulo de reconstrução 3D habilitado por rede neural híbrida e um módulo de modelagem atômica baseado em aprendizado profundo. Os dados servem como interface de comunicação entre esses componentes de software (Figura 2). O sistema utiliza uma arquitetura Navegador-Servidor (B/S) que permite todas as operações por meio de uma interface web.

1. Inicialização do Projeto
   1. Crie um novo projeto em uma plataforma automatizada de módulos de aquisição de dados.
   2. Selecione a opção de herdar configurações de um projeto recente, se desejar. Reutilize os parâmetros herdados para a configuração do microscópio eletrônico em vez de criar uma nova configuração.
2. Inspeção de Mudança de Feixe
   NOTA: Realize ajuste de deslocamento do feixe dentro do software de controle do microscópio eletrônico de transmissão (TEM).
   1. Verificação de Baixa Ampliação (Atlas e GridSquare)
      1. Abra o módulo de Triagem . Adquira imagens nas ampliações Atlas e GridSquare.
      2. Verifique se as imagens estão devidamente iluminadas e livres de desvio do feixe. Certifique-se de que o centro da imagem não esteja posicionado sobre as barras da grade.
   2. Verificação de Ampliação de Aquisição de Dados
      1. Adquira imagens na ampliação de aquisição de dados (por exemplo, 60K ou 100K). Avalie o alinhamento da viga.
      2. Corrija o deslocamento do feixe antes de prosseguir se a aquisição falhar ou se for observado um deslocamento significativo do feixe.
   3. Verificação de Ampliação Eucêntrica de Furos
      1. Adquira imagens com o buraco/ampliação eucêntrica (tipicamente 8K). Ajuste o deslocamento do feixe até que o ponto de iluminação fique centralizado, caso o feixe não esteja centralizado.
      2. Não modifique a posição da abertura. Verifique se o tamanho da abertura corresponde à usada durante a aquisição de dados.
3. Ajuste de Altura em Z
   1. Auto-Eucêntrico Ajuste
      1. Navegue até a página de Triagem . Mova o palco para uma área limpa de filme de carbono na ampliação de altura do furo/eucêntrica. Abra o módulo Auto-Eucêntrico na página AutoFunção .
      2. Clique em Iniciar. Monitore o painel de logs para receber feedback. Mude para outra área e repita o procedimento caso a operação falhe.
   2. Ajuste de Foco Automático
      1. Abra o módulo AutoFocus na página AutoFunção . Clique em Iniciar.
      2. Revise as mensagens do log. Ajuste os parâmetros conforme indicado ou repita a Seção 1.3.1 se o foco automático falhar.
4. Verificação de Alinhamento de Ampliação
   1. Inspeção de Alinhamento
      1. Localize uma característica distinta na ampliação de dados e adquira uma imagem. Adquira uma imagem na ampliação Hole/EucentricHeight.
      2. Compare as regiões centrais de ambas as imagens. Prossiga para a calibração se for observado desalinhamento entre as ampliações de Dados e Furos.
      3. Inspecione o alinhamento entre as ampliações do Hole e do GridSquare se as ampliações de Dados e do Furo estiverem alinhadas. Prossiga sem calibração se todos os níveis de ampliação estiverem alinhados.
   2. Calibração por Deslocamento de Ampliação
      1. Navegue até a página de Calibração . Abra o módulo de Ampliação Shift . Comece com a ampliação de dados ou a menor ampliação desalinhada.
      2. Adquira uma imagem de alta ampliação contendo uma característica distinta. Adquira uma imagem correspondente de baixa ampliação. Avalie o deslocamento entre as duas imagens.
      3. Clique com o botão direito no local correspondente ao centro de características na imagem de baixa ampliação. Selecione Mover Aqui. Recupere a imagem de alta ampliação e verifique o alinhamento.
      4. Repita o ajuste se necessário. Clique em Próximo para prosseguir para o próximo par de ampliação após o alinhamento. Repita o procedimento de calibração para todos os pares de ampliação desalinhados restantes.
5. Preparação para a Coleta de Dados
   1. Realize aquisição de atlas, seleção de quadrados, imagem de quadrados e seleção de buracos
      1. Abra o módulo Atlas . Deixe o campo de peças em branco para adquirir todas as 81 peças ou insira o número desejado de peças para adquirir.
      2. Navegue até a interface de Seleção de Quadrados . Clique com o botão direito para selecionar os quadrados adequados.
      3. Navegue até a página de Seleção de Buracos . Clique em Preparar Tudo. Monitore a janela de log até que a aquisição da imagem seja concluída.
      4. Selecione uma imagem quadrada capturada da lista de imagens. Use a função Encontrar Buracos para realizar a seleção automática de furos quando os furos estiverem claramente visíveis.
         ATENÇÃO: A detecção automática de furos pode falhar em grades com gelo espesso ou contaminação superficial. Verifique visualmente os furos detectados antes da aquisição e utilize o método semi-automatizado de seleção de furos quando a detecção automática for pouco confiável.
      5. Use a função de Seleção Baseada em Sementes quando gelo espesso ou contaminação impedir a seleção automática confiável (Figura 3).
         1. Selecione um buraco central. Selecione dois furos adjacentes que formem um ângulo reto.
         2. Selecione dois furos distantes nas direções definidas pelo segundo e terceiro buracos.
         3. Clique em enviar. Ative Mover Todos ao processar outro quadrado. Arraste um dos cinco buracos de sementes até um buraco livre. Clique em enviar.
   2. Definição de Modelo
      1. Navegue até a página de Definição de Modelo . Clique em Adquirir para obter uma imagem. Verifique se a imagem contém um buraco completo.
      2. Clique com o botão direito na área de destino e selecione MoveStageTo se um buraco completo não estiver visível. Recupere a imagem modelo. Especifique a posição da imagem e o local do autofoco arrastando os marcadores correspondentes.
      3. Insira o número de quadros por buraco. Insira o valor desejado de desfocar (por exemplo, −1,5 μm). Verifique todos os parâmetros de aquisição (Figura 4).
6. Re-Verificação do Deslocamento da Feixe
   1. Repita a Seção 1.2 após completar todos os procedimentos de preparação.
7. Astigmatismo e Correção do Coma
   1. Correção do Astigmatismo
      1. Mova o palco para uma área limpa de filme de carbono. Ajuste a altura usando AutoFocus para o valor de desfoco desejado (por exemplo, −1,5 μm). Abra o módulo Autostigmate na página AutoFunção .
      2. Clique em Iniciar. Monitore a saída do Ctffind no painel de log. Revise os valores de astigmatismo e adequação à resolução. Repita o procedimento em outra área se o astigmatismo continuar alto.
   2. Correção de coma
      1. Abra o módulo de Autocoma se os resultados do Autostigmate continuarem subótimos após múltiplas tentativas. Clique em Iniciar.
8. Coleta Automatizada de Dados
   1. Navegue até a página do AutoColeta . Clique em Iniciar. Permitir que o sistema realize automaticamente as calibrações de AutoEmissão e AutoZLP .
   2. Adquira dados usando os parâmetros definidos nas configurações de Triagem, Aquisição de Dados e Preparação. Monitore o processo automatizado de coleta (Figura 5).
      PONTO DE PAUSA: Após a conclusão da coleta de dados, as pilhas de filmes adquiridas podem ser armazenadas e o protocolo retomado na etapa de processamento de imagem em um momento posterior, sem afetar os resultados posteriores.
9. Monitoramento Remoto Instantâneo
   1. Monitore o progresso da coleta usando o módulo de monitoramento remoto. Revise os resultados de correção de movimento em tempo real gerados usando o MotionCor2²³. Revise medições em tempo real de astigmatismo e desfoco.
   2. Compartilhe a URL de monitoramento com usuários autorizados. Acesse informações sobre status de coleta e qualidade de dados a partir de um computador ou dispositivo móvel. Revise um exemplo de funcionalidade de monitoramento remoto na Figura 6.

2. Reconstrução Tridimensional

NOTA: Use o módulo de reconstrução 3D para realizar reconstrução tridimensional a partir de conjuntos de dados de imagens previamente adquiridos. O fluxo de trabalho inclui criação de projetos, importação de micrografias, estimativa da função de transferência de contraste (CTF), seleção de partículas, extração de partículas, classificação 2D, geração inicial de modelos e refinamento 3D (Figura 7).

1. Criação do Projeto
   1. Navegue até a página inicial do módulo de reconstrução 3D. Clique em Projetos para abrir a página de gerenciamento de projetos. Clique em NOVO PROJETO.
   2. Insira o nome do projeto e especifique o local de armazenamento. Clique em CRIAR PROJETO. Clique em Abrir ao lado do projeto recém-criado. Clique em NOVO Experimento para criar um novo experimento.
      NOTA: Um projeto representa uma sessão geral de processamento de dados, enquanto um experimento representa um fluxo de trabalho individual dentro de um projeto. Múltiplos experimentos podem ser criados dentro de um único projeto.
2. Importação de Arquivos
   1. Clique em Novo Emprego. Selecione Importar e clique em Criar. Selecione o tipo de arquivo apropriado. Importe os arquivos .mrc gerados durante a aquisição de dados. Insira o tamanho dos pixels, a tensão de aceleração e o número de CPUs. Clique em Fila de Trabalho.
      NOTA: Para encerrar uma tarefa em execução, clique em Matar, depois clique em Limpar para retornar a tarefa ao estado do Edifício. Para trabalhos concluídos ou em fila, clique em Limpar para redefinir o status da vaga.
3. Estimativa do CTF
   1. Clique em Novo Emprego. Selecione Estimativa CTF e clique em Criar.
      NOTA: O módulo de reconstrução 3D suporta múltiplos algoritmos de estimativa de CTF. Este protocolo usa CTFFIND4.
   2. Clique no botão Conectar para Exposições. Selecione as micrografias importadas. Defina o contraste de amplitude para 0,1, resolução mínima de ajuste para 30 Å. Resolução máxima de ajuste para 4 Å, valor mínimo de busca de desfoco para 5.000 Å, valor máximo de busca para desfocamento para 50.000 Å e tamanho do passo de desfocamento para 500 Å.
   3. Clique em Fila de Trabalho.
4. Seleção Manual de Partículas
   1. Clique em Novo Emprego. Selecione Seleção de Partículas e depois selecione Coletor de Blobs. Clique em Criar. Clique no botão Conectar para Micrografias (Exposições).
   2. Selecione as micrografias importadas. Insira os parâmetros exigidos. Clique em Fila de Trabalho. Inspecione 3–4 micrografias representativas. Selecione partículas usando o botão esquerdo do mouse.
   3. Desmarque partículas usando o botão direito do mouse. Determine o intervalo de diâmetros das partículas selecionadas. Clique Terminando de Escolher! Extrair partículas.
      NOTA: Meça partículas a partir de pelo menos três micrografias.
5. Coletor de Blobs
   1. Clique em Novo Emprego. Selecione Seleção de Partículas e depois selecione Coletor de Blobs. Clique em Criar. Conecte a entrada de Micrografias (Exposições).
   2. Selecione as micrografias importadas. Insira os parâmetros exigidos. Clique em Fila de Trabalho.
6. Inspecionar Picks de Partículas
   1. Clique em Novo Emprego. Selecione Inspecionar Escolhas de Partículas. Clique em Criar. Conecte a entrada de Micrografias (Exposições). Conecte as partículas de entrada.
   2. Selecione os arquivos correspondentes. Insira os parâmetros exigidos. Clique em Fila de Trabalho. Inspecione 3 a 4 imagens representativas após a conclusão do trabalho.
   3. Verifique a seleção correta de partículas. Clique Terminando de Escolher! Localizações de saída.
7. Extrair Partículas de Micrografias
   1. Clique em Novo Emprego. Selecione extrato de micrografias. Clique em Criar. Conecte a entrada de Micrografias (Exposições). Conecte as partículas de entrada. Selecione os arquivos correspondentes.
   2. Ajuste o tamanho da caixa de extração para 2–3 vezes o diâmetro da partícula. Use um tamanho de caixa de extração de 400 pixels para TRPML1. Ajuste o tamanho da colheita de Fourier para um quarto a metade do tamanho da caixa de extração.
   3. Use um corte de Fourier de 100 pixels para TRPML1. Clique em Fila de Trabalho.
      NOTA: Reduzir o tamanho da colheita de Fourier diminui a demanda computacional da GPU.
8. Classificação Bidimensional
   1. Clique em Novo Emprego. Selecione a classificação 2D. Clique em Criar. Conecte as partículas de entrada.
   2. Importe a pilha de partículas. Insira os parâmetros exigidos. Clique em Fila de Trabalho.
      NOTA: Selecione 50–200 classes. Use menos classes para conjuntos de dados menores e mais classes para conjuntos maiores.
9. Selecionar Classes Bidimensionais
   1. Clique em Novo Emprego. Selecione Classes 2D selecionadas. Clique em Criar. Conecte as partículas de entrada. Conecte a entrada dos Templates.
   2. Importe os arquivos necessários. Clique em Fila de Trabalho. Espere até o emprego entrar no estado de Espera. Clique em Esperar.
   3. Selecione classes 2D claras e bem definidas. Clique em Finalizar.
10. Geração Inicial de Modelos
    1. Clique em Novo Emprego. Selecione Reconstrução Abinit. Conecte as partículas de entrada. Importe as partículas selecionadas.
    2. Insira o número de turmas iniciais. Entra o parâmetro de simetria. Clique em Fila de Trabalho.
11. Refinamento Heterogêneo
    NOTA: Use refinamento heterogêneo para amostras heterogêneas e refinamento homogêneo para amostras homogêneas.
    1. Clique em Novo Emprego. Crie um trabalho de refinamento heterogêneo . Conecte as partículas de entrada. Conecte a entrada de volume.
    2. Selecione os arquivos correspondentes. Introduzam os parâmetros de refinamento. Especifique a simetria apropriada (por exemplo, C1). Clique em Fila de Trabalho.
12. Refinamento Homogêneo
    1. Clique em Novo Emprego. Crie um trabalho de refinamento homogêneo . Conecte as partículas de entrada. Conecte a entrada de volume.
    2. Opcionalmente, conecte a entrada da Máscara. Importe a pilha de partículas e a classe de volume com melhor desempenho da etapa de refinamento anterior. Insira os parâmetros exigidos.
    3. Especifique a simetria apropriada (por exemplo, O ou C1). Clique em Fila de Trabalho. Clique em Saída após a conclusão do trabalho. Inspecione o mapa de densidade reconstruído na interface do navegador (Figura 8).
13. Aprimoramento do Mapa
    NOTA: O Map Enhancer usa o DeepEMhancer²⁴. Use meia-mapas sempre que possível. Modificações pós-traducionais e moléculas de ligante não foram incluídas no conjunto de treinamento DeepEMhancer e podem não ser aprimoradas com precisão. O Map Enhancer realiza afiação local, mascaramento automatizado e redução de ruído.
    1. Clique em Novo Emprego. Crie um trabalho de Aprimorador de Mapas . Importe o Volume gerado durante o Refinamento Homogêneo.
    2. Importe a máscara correspondente. Importar arquivos de mapas pela opção Caminho de Dados do Mapa, se necessário. Execute o trabalho.

3. Uma Modelagem Atômica Baseada em Aprendizado Profundo

NOTA: Um módulo de modelagem atômica baseado em aprendizado profundo é baseado no framework^{SMARTFold 25} , desenvolvido anteriormente, e suporta a construção de modelos atômicos para proteínas e ácidos nucleicos (RNA/DNA) a partir de mapas de densidade crio-EM.

1. Lançar um módulo de modelagem atômica baseado em aprendizado profundo
   1. Faça login em um sistema de módulos de modelagem atômica baseado em aprendizado profundo. Abra a interface de envio de tarefas. Envie o mapa de densidade crio-EM no painel esquerdo.
   2. Insira os parâmetros de entrada necessários. Envie a tarefa de modelagem.
2. Envie o Mapa de Densidade Crio-EM
   1. Envie o mapa de densidade nos formatos .mrc, .ccp4 ou .map. Verifique se o tamanho do arquivo é menor que 100 MB.
      NOTA: Se o mapa de densidade ultrapassar 100 MB, reduza o tamanho do arquivo antes de fazer o upload.
      1. Recorte o mapa de densidade para a região de interesse usando o UCSF ChimeraX²⁶ com o comando: volume zone. Reamostre o mapa para um tamanho maior em pixel.
      2. Aplique uma máscara macia para remover as regiões do solvente.
         NOTA: Inspecione o mapa de densidade antes de enviar para garantir o desempenho ideal do modelo e reduzir o risco de erros de processamento.
3. Inspecionar e preparar o mapa de densidade
   1. Realize o corte do mapa de densidade. Para essa cultura, o mapa de densidade para remover regiões desnecessárias. Verifique se o mapa recortado contém apenas a região necessária para a construção de modelos.
      NOTA: O corte reduz o tamanho do arquivo e ajuda a evitar o excesso de memória durante a geração do modelo.
   2. Depois verifique se há Inversão do Espelho. Inspecione o mapa de densidade para possível inversão do espelho. Examine regiões α-helicoidais dentro do mapa. Verifique se as hélices α apresentam configuração para destro e espiralam para cima no sentido anti-horário. Inverta o mapa de densidade se uma estrutura espelhada for detectada.
4. Faça o upload do arquivo de sequência
   1. Faça upload do arquivo de sequência correspondente. Alternativamente, insira a sequência manualmente. Forneça todas as sequências de proteínas ou ácidos nucleicos incluídas na reconstrução.
   2. Especifique informações de sequência heteromérica ou homomérica quando aplicável. Insira o Nome da Proteína, se desejado (Passo Opcional).
5. Especifique a resolução do mapa. Apresente a resolução relatada do mapa de densidade crio-EM. Selecione a partição de computação. Selecione o nó de computação da GPU a ser usado para geração de modelos.
6. Para especificar Recursos de CPU, insira o número de CPUs a serem alocadas. Não ultrapasse oito CPUs. Revise todos os arquivos e parâmetros enviados. Clique em ENVIAR para iniciar a geração do modelo.
7. Inspecionar o Modelo Atômico Previsto
   1. Abra a janela de visualização interativa após a conclusão do trabalho. Gire o modelo para inspecionar as características estruturais. Dê zoom in e out para examinar detalhes estruturais locais e globais.
   2. Inspecione o modelo a partir de múltiplas orientações. Avalie a qualidade do modelo, conformação espacial e características em nível atômico. Use o modelo gerado para análise e validação a jusante.
   3. Consulte a Figura 9 para um exemplo da interface de visualização.

Resultados

TRPML1, também conhecido como mucolipina-1 (MCOLN1), é um canal cátiônico lisossômico essencial para manter a homeostase iônica, regular o tráfego vesicular e apoiar a autofagia em células^{mamíferas 27,28}. A disfunção do TRPML1 devido a mutações genéticas tem sido diretamente associada à mucolipidose tipo IV, um grave distúrbio neurodegenerativo de armazenamento lisossomal caracterizado por neurodesenvolvimento anormal, degeneração retiniana e anemia por deficiênc...

Discussão

A determinação estrutural de macromoléculas biológicas por meio de criomicroscopia eletrônica (crio-EM) envolve inerentemente um fluxo de trabalho prolongado e em múltiplas etapas, exigindo integração rigorosa de ferramentas computacionais e dependência de intervenção de especialistas. A plataforma integrada enfrenta esse desafio unificando aquisição de dados, reconstrução 3D e modelagem atômica em uma única estrutura verticalmente integrada — um passo para fluxos de trabalho crio-EM mai...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CryoSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Módulo de reconstrução 3D da plataforma SMART; habilitado por rede neural híbrida
Microscópio de crio-eletrões	Shuimu BioSciences Ltd.	SHUIMU TOTEM 300S	Usado para aquisição de dados; equipado com filtro de energia
DataSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Módulo de aquisição de dados automatizada da plataforma SMART
DeepEMhancer	Open source	V0.17	Processamento pós-volume de crio-EM baseado em aprendizagem profunda; integrado no Map Enhancer CryoSmart
Detetor de elétrons direto	Gatan	GATAN K3 (6k x 4k)	Câmara usada para gravação de filmes
Grelha	Quantifoil	Au R1.2,1.3	Grelha de espécimes de crio-EM
ModelSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Módulo de modelação atômica baseado em aprendizagem profunda da plataforma SMART; estende o framework SMARTFold
Plataforma SMART	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Plataforma integrada de crio-EM; arquitetura Browser-Server (B/S); inclui módulos DataSmart, CryoSmart e ModelSmart
Software de controlo TEM	Shuimu BioSciences Ltd.	V1.0	Software de controlo do microscópio eletrónico para ajuste de mudança de feixe
Topaz	Open source	V 2.5	Ferramenta de seleção de partículas baseada em aprendizagem profunda; integrado como plug-in dentro do CryoSmart
Amostra de proteína TRPML1	Shuimu Biosciences Ltd.	SMPP-0053	TRPML1 humano (mucolipidin-1); preparado no local pelo Departamento de Proteínas e Cristalografia
Dispositivo de vitrificação	Thermo Fisher Scientific	Vitrobot Mark IV	Para preparação de amostras de crio-EM
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Software de propósito geral para exibição, análise e mais
SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology)	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Plataforma de fluxo de trabalho crio-EM integrada
SMARTFold	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Framework de aprendizagem profunda subjacente ao ModelSmart
Leginon	National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM)	RRID:SCR_016731	Software automatizado de aquisição de dados de crio-EM
SerialEM	University of Colorado	RRID:SCR_017293	Software automatizado de aquisição TEM/crio-EM
EPU	Thermo Fisher Scientific	N/A	Software automatizado de recolha de dados de crio-EM
EPU Multigrid	Thermo Fisher Scientific	N/A	Aquisição automatizada crio-EM multi-grelha
Gatan Latitude	Gatan Inc.	N/A	Software de aquisição de microscopia eletrônica
JADAS	JEOL Ltd.	N/A	Sistema de aquisição automatizado crio-EM
Auto-EMation	Tsinghua University	N/A	Software automatizado de aquisição crio-EM
RELION	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016274	Software de reconstrução crio-EM bayesiana
cryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	RRID:SCR_016501	Processamento de imagem e reconstrução crio-EM
EMAN2	Baylor College of Medicine	RRID:SCR_017270	Suite de processamento de imagem crio-EM
CTFFIND4	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016732	Software de estimativa CTF
Gctf	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016500	Estimação CTF acelerada por GPU
MotionCor2	Howard Hughes Medical Institute / UCSF	RRID:SCR_016499	Software de correção de movimento
DeepEMhancer	Spanish National Center for Biotechnology (CNB-CSIC)	RRID:SCR_021214	Melhoria de mapa crio-EM baseada em aprendizagem profunda
Topaz	University of California Berkeley	RRID:SCR_018037	Seleção de partículas por aprendizagem profunda
UCSF ChimeraX	University of California San Francisco	RRID:SCR_015872	Software de visualização molecular
CTFFIND4	Grigorieff Lab	RRID:SCR_016732	Ajuste CTF usado no fluxo de trabalho CryoSmart
EMDB-8840	Electron Microscopy Data Bank	Accession: EMD-8840	Mapa de referência TRPML1 humano
EMPIAR-10204	Electron Microscopy Public Image Archive	Accession: EMPIAR-10204	Conjunto de dados de referência de β-galactosidase
Microscópio de Transmissão de Eletrões (TEM)	Não especificado	N/A	Usado para aquisição de dados crio-EM
Microscópio Eletrónico Tecnai FEI	FEI (agora Thermo Fisher Scientific)	Não especificado	Mencionado no fluxo de trabalho citado
Filtro de Energia	Não especificado	N/A	Usado durante a recolha automatizada
Nó de Computação GPU	Não especificado	N/A	Usado para cálculos ModelSmart