Um método de ChIRP Baseado em UV para a Identificação Verificável de Proteínas que Interagem Diretamente com LncRNA: De Células Cultivadas a Testículos de Camundongos

Resumo

Um método ChIRP baseado em UV para identificar interações diretas entre lncRNA e proteína.

Resumo

RNAs longos e não codificantes (lncRNAs) emergiram como importantes reguladores de diversos processos biológicos. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes às funções da maioria dos lncRNAs continuam pouco compreendidos. Identificar proteínas interagindo, especialmente proteínas que se ligam a RNA (RBPs), é uma estratégia fundamental para elucidar a função dos lncRNAs. Entre as abordagens disponíveis, a identificação abrangente de proteínas de ligação a RNA (ChIRP) combinada com espectrometria de massa é amplamente utilizada devido ao seu design simples de sonda e fluxo de trabalho simples. O ChIRP convencional depende da reticulação de paraformaldeído (PFA), que captura tanto contatos diretos RNA-proteína quanto interações indiretas mediadas por fatores de ponte. Em contraste, a reticulação UV combinada com condições rigorosas de lavagem preserva preferencialmente as interações diretas RNA-proteína. Usando o lncRNA Tug1 como modelo, a reticulação UV e a reticulação com PFA foram comparadas dentro do framework ChIRP em células cultivadas, demonstrando que a ChIRP baseada em UV enriquece interações diretas entre lncRNA e proteína. Esse fluxo de trabalho baseado em UV foi posteriormente estendido para testículos de camundongo, nos quais os tecidos foram dissociados em suspensões unicelulares antes da reticulação UV, permitindo a identificação de proteínas de ligação ao Tug1 em um contexto de tecido nativo. A comparação com interactomas derivados de linhagens celulares revelou tanto interatores compartilhados quanto específicos de tecidos. Duas interações diretas compartilhadas foram validadas de forma independente por imunoprecipitação de reticulação aprimorada (eCLIP). Essa abordagem ChIRP baseada em UV é chamada de cPDiRT (captura de proteínas que interagem diretamente com um alvo de RNA). Juntos, o cPDiRT possibilita a identificação de proteínas ligadoras a RNAs tanto em células cultivadas quanto em tecidos nativos. A combinação de dissociação tecidual e reticulação UV oferece uma estratégia amplamente aplicável para estudar interações diretas entre RNAs e proteínas em diversos sistemas de órgãos.

Introdução

Estudos transcriptômicos recentes de alta capacidade revelaram milhares de RNAs longos não codificantes (lncRNAs) que participam de diversos processos biológicos, que vão desde a organização da cromatina até a sinalização^{celular 1,2}. Apesar de sua expressão ampla e importância funcional, os mecanismos moleculares da maioria dos lncRNAs permanecem pouco definidos. Um grande obstáculo é a identificação de seus parceiros proteicos físicos, particularmente proteínas que se ligam ao RNA (^RBPs)3,4,5.

Os métodos atuais centrados em RNA dependem principalmente da reticulação química, que captura tanto interações diretas quanto indiretas RNA-proteína. Como resultado, essas abordagens são mais adequadas para mapeamento global de interactomas do que para identificar contatos diretos^{genuínos 6}. A identificação abrangente de proteínas de ligação a RNA seguida por espectrometria de massa (ChIRP-MS) é uma técnica amplamente utilizada para mapear interações lncRNA-RBP devido ao seu design simples de sonda e fluxo de trabalho^{eficiente 7,8}. O ChIRP-MS convencional utiliza reticulação de paraformaldeído (PFA), que captura tanto contatos diretos RNA-proteína quanto associações indiretas mediadas por fatores de ponte ^9,10.

Em contraste, a reticulação UV a 254 nm oferece uma vantagem crítica. Ela liga covalentemente RNA e proteínas apenas quando estão em contato próximo a distância zero (tipicamente <1 Å)¹¹. Esse processo converte ligações de hidrogênio em ligações covalentes estáveis e permite condições rigorosas de lavagem com alto teor de sal que removem interatores indiretos ligados não covalentemente. Consequentemente, abordagens baseadas em UV fornecem maior especificidade para interações diretas RNA-proteína do que métodos de reticulação química^12,13. No entanto, abordagens baseadas em UV continuam subutilizadas em estudos de interactomas de lncRNA derivados de tecidos, principalmente devido a preocupações com a eficiência da reticulação cruzada e a penetração limitada do UV.

Para investigar interações diretas entre lncRNA e proteína em um contexto fisiologicamente relevante, o lncRNA Tug1 foi selecionado como sistema modelo. O Tug1 representa um parâmetro ideal para validar um fluxo de trabalho de interação direta compatível com tecidos devido ao seu fenótipo severo de knockout e alto enriquecimento no testículo. A ablação genética de Tug1 resulta em esterilidade masculina completa, espermatogênese comprometida e morfologia anormal do^{espermatozoide 14}. Além disso, o Tug1 apoia a função das células de Sertoli e a integridade da barreira sangue-testículo em camundongos dietistas^{ricos em gordura 15}. Apesar desses fenótipos bem estabelecidos, os parceiros proteicos diretos que mediam a função do Tug1 no testículo — um órgão que expressa grandes números de RBPs recentemente perfilados^{experimentalmente 16} — permanecem desconhecidos. Essa lacuna de conhecimento reflete em grande parte o fato de que a maioria dos métodos de mapeamento de interação lncRNA-proteína foi desenvolvida para sistemas celulares cultivados.

Para resolver essa limitação, a estrutura do ChIRP foi modificada substituindo a reticulação de PFA pela reticulação UV para capturar proteínas que interagem diretamente com a Tug1. As interações candidatas foram validadas independentemente por imunoprecipitação por reticulação aprimorada, seguida por sequenciamento profundo (eCLIP-seq⁾¹⁷. O fluxo de trabalho foi ainda mais estendido para aplicações tecidulares, dissociando tecido testicular fresco de camundongos em células individuais antes da reticulação UV. Essa abordagem otimizada foi designada cPDiRT (captura de proteínas interagindo diretamente com um alvo de RNA).

A aplicação do cPDiRT ao Tug1 no testis do camundongo permitiu o mapeamento de interação direta em um contexto de tecido nativo. Experimentos paralelos em células cultivadas forneceram uma comparação lado a lado entre perfis de interação baseados em PFA e baseados em UV. Combinada com validação independente do eCLIP, essa abordagem gerou um conjunto de parceiros moleculares de alta confiança que podem contribuir para a função do Tug1 durante a espermatogênese. O protocolo apresentado aqui permite a captura de proteínas que interagem diretamente com um lncRNA alvo tanto em células cultivadas quanto em tecidos nativos. Ao definir o interactoma direto de Tug1 no testículo, esse método avança estudos mecanicistas de um lncRNA essencial para a fertilidade e fornece uma plataforma generalizável para investigar interações lncRNA-proteína em tecidos reprodutivos e outros tecidos complexos.

Protocolo

Todas as soluções foram preparadas usando água ultrapura e reagentes sem nuclease e protease. Todos os reagentes e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Médica de Nanjing (Aprovação nº: IACUC-1812003-4) e foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Conselho Nacional de Pesquisa, 8ª edição). Mantenha os machos C57BL/6 camundongos (4 semanas de idade) em um ciclo de 12 horas de luz/12 horas de escuridão, com acesso ad libitum a comida e água. Minimize o sofrimento animal usando o menor número possível de animais necessários para alcançar a significância estatística. Eutanasiar camundongos por inalação de CO₂ seguida de luxação cervical, conforme protocolos institucionais aprovados.

1. Preparar os tampões

1. Prepare o tampão de lise celular
   1. Prepare o tampão de lise celular contendo 50 mM de Tris-HCl (pH 7,0), 10 mM de EDTA e 1% de SDS.
   2. Imediatamente antes do uso, adicione 1 mM de PMSF, um coquetel inibidor de protease e um inibidor especializado de RNase.
      ATENÇÃO: SDS é um irritante para a pele e os olhos. Evite inalar poeira ou aerossóis. O PMSF é altamente tóxico, atua como inibidor da colinesterase e é instável em solução aquosa. Prepare o PMSF imediatamente antes do uso. Use luvas e óculos de proteção ao manusear esses reagentes. Manuseie o PMSF em uma exaustão química.
2. Preparar o tampão de hibridização
   1. Prepare o tampão de hibridização contendo 750 mM de NaCl, 1% de SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM de EDTA e 15% de formamida.
   2. Imediatamente antes do uso, adicione 1 mM de PMSF, um coquetel inibidor de protease e um inibidor especializado de RNase.
      NOTA: Armazene formamida a 4 °C, protegida da luz.
      ATENÇÃO: A formamida é um teratogênio e um risco reprodutivo. Manuseie formamida em um exaustor químico usando luvas, jaleco e óculos de segurança. Evite inalação e contato com a pele.
3. Prepare o tampão de lavagem
   1. Prepare o tampão de lavagem contendo 50 mM de Tris-HCl (pH 7,0), 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS e 0,5% desoxicolato de sódio.
   2. Proteja o buffer de lavagem da luz durante o armazenamento.
4. Prepare o tampão da proteinase K (PK)
   1. Prepare um tampão PK contendo 100 mM de NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM de EDTA e 0,5% de SDS.
   2. Adicione a proteinase K a uma concentração final de 5% imediatamente antes do uso.

2. Projetar e preparar sondas

1. Projete sondas antissenso
   1. Projete sondas oligonucleotídeas antissenso usando o designer online de sondas disponível a^{partir de 18} singlemoleculefish.com.
2. Obtenha sondas biotiniladas
   1. Peça sondas de DNA antissenso contendo uma modificação 3'-BiotinTEG.
3. Prepare o poço de sondas
   1. Dilua cada sonda individualmente até 100 μM.
   2. Misture volumes iguais de todas as sondas para gerar um pool de sondas. Mantenha uma concentração final combinada de oligonucleotídeos de 100 μM.
   3. Armazene o pool de sonda a -20 °C.
      NOTA: Os parâmetros recomendados de projeto da sonda são os seguintes: (i) uma sonda por 100 bp de RNA-alvo, (ii) conteúdo de GC alvo de 45%, (iii) comprimento da sonda de 20 nt e (iv) espaçamento de 60–80 nt entre as sondas.
      NOTA: Se o RNA exceder o limite de tamanho aceito pelo projetista da sonda, divida a sequência em segmentos menores antes do projeto. Exclua regiões repetitivas e regiões com homologia de sequência extensa.

3. Realizar colheita celular, dissociação de tecidos e reticulação UV

1. Prepare controles sem UV
   1. Prepare amostras controle em paralelo com amostras experimentais.
   2. Omita a etapa de reticulação UV nas amostras de controle.
   3. Realize todos os procedimentos subsequentes, incluindo sonicação, puxagem de RNA-Proteína, extração de RNA e extração de proteínas, de forma idêntica para ambos os grupos.
      NOTA: Use o controle sem UV para distinguir as interações RNA-proteína dependentes de UV da ligação de fundo não específica.
2. Colhe células e realize reticulação UV
   1. Células cultivadas por lavagem
      1. Lave as células três vezes com PBS para remover o meio de cultivo residual.
   2. Células de ligação cruzada
      1. Distribua 3 mL de PBS uniformemente em um recipiente de cultura de 15 cm.
      2. Irradiam células em um crosslinker UV de 254 nm em uma dose de 4000 mJ/^cm2.
   3. Coletar células reticuladas
      1. Colete células no PBS após a reticulação.
      2. Centrifuge a suspensão e descarte o sobrenadante.
      3. Pese o pellet e confirme uma massa mínima de pellet de 500 mg por amostra.
3. Dissociar tecido testicular e realizar reticulação UV
   1. Prepare testículos
      1. Descapsule testículos.
      2. Lave o papel duas vezes com DMEM.
   2. Realize digestão de colagênase
      1. Incubar tecido em DMEM contendo 1 mg/mL de colagenase IV a 37 °C por 5 a 15 minutos.
      2. Continue a digestão até que os túbulos seminíferos sejam liberados.
         NOTA: Não ultrapasse 15 minutos de digestão.
   3. Lave os túbulos seminíferos
      1. Centrifuge a suspensão a 1000 × g por 1 minuto a 4 °C.
      2. Remova o sobrenadante.
      3. Lave o pellet com 5–10 mL de DMEM.
      4. Centrifugar novamente nas mesmas condições.
   4. Realize a digestão de tripsina
      1. Ressuspenda o pellet em 0,25% de tripsina contendo 1 mg/mL de DNase I.
      2. Incube a 37 °C por 5–15 minutos.
         NOTA: Não ultrapasse 15 minutos de digestão.
   5. Parar a digestão enzimática
      1. Adicione um volume igual de DMEM complementado com 10% de FBS.
   6. Gerar uma suspensão de célula única
      1. Filtre a suspensão por um filtro de célula de 70 μm.
   7. Células de lavagem
      1. Centrífuga as células a 2000 × g por 5 minutos a 4 °C.
      2. Descarte o supernadante.
      3. Lave o pellet com 5–10 mL de PBS.
      4. Centrifugar novamente nas mesmas condições.
   8. Células testiculares de reticulação cruzada
      1. Resuspenda a suspensão de célula única no PBS.
      2. Distribua a suspensão uniformemente em uma placa de cultura de 15 cm.
      3. Irradiam células em um crosslinker UV de 254 nm em uma dose de 4000 mJ/^cm2.
   9. Coletar células reticuladas
      1. Para controles sem UV, omita a irradiação.
      2. Colete células no PBS.
      3. Centrifuge a suspensão e descarte o sobrenadante.
      4. Pese o pellet e confirme uma massa mínima de pellet de 500 mg por amostra.
         NOTA: O número de camundongos necessários para obter aproximadamente 500 mg de pellet celular depende da idade e do rendimento tecidual. Aproximadamente 10–12 camundongos de quatro semanas foram usados neste estudo.

4. Realizar sonicação

1. Preparar lisados
   1. Resuspenda pellets celulares no buffer de lise celular na proporção de 100 mg de pellet por 1 mL de buffer.
   2. Misture bem para obter uma suspensão homogênea.
2. Samples sonicados
   1. Sonice lisas usando um sonicador de banho-maria ou um ultrasonicador focado.
   2. Continue a sonicação até que o lisado fique visualmente nítido.
      NOTA: Verifique a fragmentação do DNA por eletroforese em gel de agarosa. Continue a sonicação até que a maioria dos fragmentos de DNA esteja entre 1 kb e 2 kb.

5. Realizar pull-down RNA-proteína

1. Coletar amostras de entrada
   1. Remova as aliquotas de lisato para os controles de entrada.
   2. Reserve aproximadamente 10 μL para análise de RNA e 10 μL para análise de proteínas.
   3. Mantenha as amostras de entrada a 37 °C durante os procedimentos de hibridização e lavagem.
2. Lisados pré-claras
   1. Adicione 30 μL de esferas magnéticas pré-lavadas a cada amostra.
   2. Incube as amostras a 37 °C por 30 minutos com mistura suave em um forno de hibridização.
      NOTA: Lave as esferas magnéticas antes de usar. Coloque as alquotas das contas em um suporte magnético por 1 minuto ou até a solução ficar clara. Remova completamente a solução de armazenamento. Lave as esferas duas vezes com 500 μL de tampão de lise celular.
3. Remova as contas de pré-limpeza
   1. Coloque amostras em um suporte magnético.
   2. Transfira o sobrenadante para um tubo novo.
   3. Repita a transferência uma vez para garantir a remoção completa das contas residuais.
4. Hibridizar sondas
   1. Adicione dois volumes de buffer de hibridização a cada amostra.
   2. Adicione sondas na proporção de 1 μL de estoque de sondas de 100 μM por 1 mL de lisado (Tabela Suplementar 1).
5. Reações de hibridização por incubação
   1. Incubar as amostras a 37 °C com rotação ponta a ponta por 12–16 horas em um forno de hibridização.
6. Prepare as contas de captura
   1. Lave 100 μL de esferas magnéticas três vezes com buffer de lise celular imediatamente antes do fim da hibridização.
   2. Remova todo o buffer residual após a lavagem final.
7. Capturar complexos ligados a sondas
   1. Brevemente, reações de hibridização por centrífuga.
   2. Resuspenda as esferas lavadas em 1 mL de amostra hibridizada.
8. Unir complexos a contas
   1. Retorne a suspensão do talão ao tubo original.
   2. Incube a 37 °C com mistura por 30–40 minutos.
9. Recuperar contas
   1. Amostras de centrifugação breve.
   2. Coloque os tubos em um suporte magnético por 1–2 minutos ou até a solução ficar clara.
   3. Descarte o supernadante.
   4. Remova o líquido residual usando uma ponta de pipeta.
      NOTA: Evite perturbar o pellet de esferas magnéticas durante a remoção do líquido.
10. Complexos capturados por lavagem
    1. Adicione 1 mL de buffer de lavagem.
    2. Lave as esferas a 37 °C com mistura contínua por 5 minutos.
    3. Repita o procedimento de lavagem cinco vezes.
       NOTA: O tampão de lavagem contém 1 M de NaCl, que interrompe as interações proteína-proteína não covalente e proteína-RNA, enquanto preserva as ligações cruzadas covalentes induzidas por UV. Essas condições rigorosas removem interatores indiretos e fundo inespecífico, enriquecendo assim parceiros proteicos^{diretos 19}.
11. Material de reserva para análise de RNA
    1. Transfira 1%–10% das esferas lavadas para um tubo novo para análise de RNA.
    2. Use as contas restantes imediatamente para extração de proteína ou armazene-as a -80 °C.
       NOTA: Pause o protocolo aqui se necessário. Armazene amostras de esferas a -80 °C até a extração da proteína.
12. Proteínas elutas
    1. Adicione o buffer de amostra SDS às contas.
    2. Ferva as amostras a 95 °C por 30 minutos para eluir proteínas e reverter as ligações cruzadas.
    3. Prossiga para a análise de espectrometria de massa.

6. Extrair RNA

1. Proteínas digeridas
   1. Ressuspenda amostras de RNA ligadas à esfera em 100 μL de tampão PK.
   2. Ajuste as amostras de entrada de RNA para um volume final de 100 μL usando o tampão PK.
2. Incubar com a proteinase K
   1. Incube as amostras a 50 °C por 45 minutos com mistura contínua.
3. Inativar a proteinase K
   1. Aqueça as amostras a 95 °C por 10 minutos.
4. Adicionar reagente TRIzol
   1. Adicione 500 μL de reagente TRIzol a cada amostra.
   2. Vortex completamente.
   3. Incube por 5 minutos em temperatura ambiente.
      ATENÇÃO: O reagente Trizol contém fenol e tiocianato de guanidina. Manuseie o reagente em uma capela química usando luvas, jaleco e óculos de segurança. Evite inalação e contato com a pele. Se houver contato com a pele, lave imediatamente com água e sabão.
5. Realizar separação de fases
   1. Adicione 100 μL de clorofórmio a cada amostra.
   2. Vortex completamente.
   3. Incube por 5 minutos em temperatura ambiente.
6. Recuperar a fase aquosa
   1. Centrifuge amostras a 4 °C por 15 minutos.
   2. Transfira a fase aquosa superior para um tubo novo.
7. Ligue RNA às colunas de purificação
   1. Adicione um volume igual de 100% de etanol à fase aquosa.
   2. Misture bem.
   3. Carregue amostras em colunas de purificação de RNA.
8. Purificar RNA
   1. Realize a limpeza de RNA conforme as instruções do fabricante.
   2. RNA elutado em 30 μL de água livre de nuclease.
9. Verifique o enriquecimento de RNA por qRT-PCR
   1. Use 1 μL de RNA eluido por reação para PCR de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR).
   2. Avalie o enriquecimento de RNA-alvo em relação aos controles.

7. Realizar análise LC-MS/MS

1. Separar proteínas por SDS-PAGE
   1. Misture proteínas obtidas no Passo 5.12 com 4× tampão LDS de amostra.
   2. Separe proteínas em um gel Bis-Tris de 4%–12%.
   3. Tinga o gel usando um kit de tingimento prateado.
   4. Retire toda a linha proteica como uma única banda.
2. Peças de gel de consumo
   1. Retire a faixa proteica usando um bisturi limpo.
   2. Minimize a quantidade excessiva de gel.
   3. Corte o gel em aproximadamente 1^{mm e 3} pedaços.
   4. Transfira pedaços de gel para um tubo de 0,5 mL.
3. Destain peças de gel
   1. Adicione 100 μL de solução descolorante.
   2. Vórtice por 10 minutos.
   3. Centrifuge a 14.000 × g por 1 minuto.
   4. Remova o sobrenadante.
   5. Repita o procedimento de descoloração até que as partes do gel fiquem transparentes.
4. Reduzir proteínas
   1. Adicione 100 μL de solução redutora.
   2. Incube a 56 °C por 30 minutos.
   3. Amostras frias até a temperatura ambiente.
   4. Centrifuge brevemente e remova o sobrenadante.
5. Proteínas alquilatas
   1. Adicione 100 μL de solução alquilante.
   2. Incube em temperatura ambiente por 20 minutos no escuro.
   3. Remova o sobrenadante.
   4. Lave as peças de gel com 100 μL de buffer de digestão por 5 minutos.
6. Proteínas digeridas
   1. Adicione solução suficiente de tripsina para cobrir completamente as partes do gel.
   2. Incubar a 37 °C por 16–18 horas.
7. Peptídeos extraídos
   1. Adicione 30 μL de solução de extração.
   2. Sonicate por 15 minutos ou vórtice por 30 min.
   3. Centrifuge a 14.000 × g por 1 minuto.
   4. Transfira o sobrenadante para um tubo novo.
   5. Repita o procedimento de extração duas vezes.
   6. Agrupe todos os extratos.
   7. Extratos secos em pool em concentrador a vácuo por aproximadamente 1 hora.
8. Limpe peptídeos usando um StageTip
   1. Resuspenda peptídeos secos em 20 μL de 0,1% de ácido fórmico (FA).
   2. Carregue amostras em um C18 StageTip.
   3. Centrifuge a 1.000 × g por 2 minutos.
   4. Lave o StageTip com 20 μL de 0,1% de FA.
   5. Peptídeos elutais com 20 μL de 60% acetonitrila/0,1% FA em um frasco de LC-MS.
   6. Seque o eluate.
   7. Resuspenda peptídeos em 10 μL de 0,1% de FA.
      NOTA: Pause o protocolo aqui se necessário. Armazene peptídeos purificados a -80 °C antes da análise LC-MS/MS.
9. Adquirir dados LC-MS/MS
   1. Reconstitua peptídeos em 0,1% de ácido fórmico.
   2. Separe peptídeos em uma coluna analítica de 75 μm × 250 mm C18 com uma vazão de 300 nL/min.
   3. Aplique o seguinte gradiente B do solvente (0,1% de ácido fórmico em acetonitrila):
      2%–25% B em 0–40 min
      25%–40% B em 40–48 min
      40%–99% B ao longo de 50–57 min
      Mantenha 99% B por 3 minutos
   4. Operar o espectrômetro de massa em modo de aquisição dependente de dados.
   5. Adquirir espectros MS de varredura completa em uma faixa m/z de 350–1200 com resolução de 70.000.
   6. Adquira quinze varreduras sequenciais de dissociação colisional de alta energia (HCD) MS/MS com resolução de 17.500.
   7. Grave uma microscanografia por varredura.
   8. Defina exclusão dinâmica para 30 s.
10. Dados de espectrometria de massa de processos
    1. Processe dados brutos usando MaxQuant (v2.1.0.0).
    2. Pesquise espectros em relação a sequências de proteínas de camundongos baixadas do UniProt.
    3. Especifique a tripsina como a enzima digestiva.
    4. Permita no máximo duas clivages perdidas.
    5. Especifique a oxidação de metionina como uma modificação variável.
    6. Especifique a carbamidometilação da cisteína como uma modificação fixa.
    7. Defina as tolerâncias de massa de precursores e fragmentos para 15 ppm e 20 ppm, respectivamente.
    8. Controle a taxa de falsas descobertas em 1% tanto no nível do peptídeo quanto no de proteína.
    9. Estimar a abundância de proteínas usando quantificação sem rótulo baseada em iBAQ.

8. Realizar análise de enriquecimento por ontologia gênica

1. Analisar o enriquecimento funcional
   1. Realize análise de enriquecimento por Ontologia Gênica (GO) usando o pacote clusterProfiler R (v4.6.0).
   2. Use o banco de dados GO (v2024-09-20) como fonte de anotação de referência.
   3. Aplique correção de Benjamini-Hochberg para múltiplos testes.
   4. Defina significância estatística como um valor P ajustado (FDR) < 0,05.

9. Realizar validação eCLIP-seq

1. Prepare amostras de eCLIP
   1. Realizar imunoprecipitação por reticulação aprimorada (eCLIP) conforme descrito^{anteriormente 17}.
   2. Prepare amostras celulares cruzadas por UV para imunoprecipitação de PABPC1 e CCT3.
   3. Amostre lisa usando o buffer de lise eCLIP.
2. Complexos RNA-proteína imunoprecipitados
   1. Adicione 10 μg de anticorpo a cada amostra.
   2. Capture complexos RNA-proteína em esferas magnéticas.
   3. Colete amostras de entrada antes da imunoprecipitação.
3. Preparar bibliotecas de RNA
   1. Desfosforilar RNAs ligados a proteínas.
   2. Ligue um adaptador de RNA de 3' para RNA recuperado.
   3. Lave imunoprecipitada e amostre de entrada sob condições rigorosas.
   4. Elute complexos fervendo as contas.
   5. Resolva as amostras em um gel gradiente Bis-Tris de 4%–12%.
   6. Transfira complexos separados para uma membrana de nitrocelulose.
4. Recuperar RNA
   1. Retire uma região de membrana de tamanho semelhante.
   2. Digere proteínas usando ureia e proteinase K.
   3. Recupere RNA da membrana.
5. Gerar bibliotecas de sequenciamento
   1. A transcrição reversa recuperou RNA em cDNA.
   2. Purifique cDNA usando uma mistura de exonuclease I e fosfatase alcalina de camarão.
   3. Ligue um adaptador de DNA na extremidade 3' do cDNA usando ligase de RNA T4.
   4. Amplificar bibliotecas usando uma DNA polimerase de alta fidelidade.
   5. Separe as bibliotecas amplificadas em um gel de agarose de baixo ponto de fusão a 3%.
   6. Purifique bibliotecas selecionadas por tamanho usando um kit de extração em gel.
   7. Bibliotecas de sequências em uma plataforma Illumina.
6. Analisar dados eCLIP-seq
   1. Analise os dados de sequenciamento usando o pipeline^{ENCODE eCLIP 20}.
   2. Adaptadores de corte e dímeros adaptadores de 3' usando cutadapt (v1.14).
   3. Align lê para elementos de repetição UCSC usando STAR (v2.7.6a).
   4. Remova o mapeamento de leituras para elementos repetidos.
   5. Alinhe as leituras restantes ao genoma de referência do mm10 (GENCODE vM23).
   6. Remova duplicatas de PCR.
   7. Identifique sítios de ligação enriquecidos usando o CLIPPER.
   8. Defina picos significativos como aqueles com enriquecimento de dobras ≥ 8 e P ajustado ≤ 0,001.
   9. Identifique picos reproduzíveis usando um limiar de taxa de descoberta irreproduzível (IDR) de 0,01.

Resultados

Para identificar proteínas de ligação ao Tug1, a reticulação UV foi incorporada ao fluxo de trabalho do ChIRP, estabelecendo um método designado cPDiRT (Figura 1). O ChIRP convencional foi realizado pela primeira vez em células GC2 para enriquecer proteínas que interagem com o Tug1 (Figuras 2A, B). A análise por espectrometria de massa identificou mais de 190 proteínas enriquecidas em relação a...

Discussão

O cPDiRT foi desenvolvido como um protocolo modificado baseado em ChIRP que substitui a reticulação de paraformaldeído (PFA) por reticulação UV para capturar seletivamente interações diretas entre lncRNA e proteína. Ao combinar dissociação enzimática de tecido testicular fresco em células individuais com reticulação UV, o mapeamento de interação direta foi estendido das linhas celulares cultivadas para tecidos nativos. Experimentos paralelos em células cultivadas permitiram uma comparaçã...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Gibco	25200056	para dissociação de tecidos e preparação de suspensão de células únicas
100% Ethanol	Sigma-Aldrich	459844	para limpeza de RNA
AffinityScript Reverse Transcriptase	Agilent	600107	para síntese de cDNA eCLIP
Anti-CCT3 Antibody	Abcam	Ab225878	anticorpo para eCLIP
Anti-PABPC1 Antibody	Abcam	Ab312314	anticorpo para eCLIP
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	para extração de RNA
Collagenase Type IV	Sigma-Aldrich	C5138	para dissociação enzimática de tecido testicular
Dephosphorylation reagents (T4 PNK)	New England Biolabs	M0201S	para desfosforilação de RNA eCLIP
DMEM High Glucose Medium	Gibco	11965092	para cultura de células e buffer de dissociação de tecidos
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Magnetic Beads	Thermo Fisher Scientific	65001	para captura de complexos de sonda biotinilada-RNA-proteína
DynaMag-15 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12301D	para separação de contas magnéticas
DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D	para separação de contas magnéticas
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	para quelação de cátions divalentes em tampões de lise e lavagem
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S	para purificação de cDNA eCLIP
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099141C	para parar a digestão de tripsina
Formamide	Thermo Fisher Scientific	AM9342	para preparação de buffer de hibridização
Hybridization Oven	TUOHE	LF-I	para hibridização de sondas e lavagem de contas
Low-Melting-Temperature Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	para seleção de tamanho de biblioteca eCLIP
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	para seleção de tamanho de biblioteca eCLIP
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	para purificação de RNA
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	para preparação de buffer de lavagem com alto teor de sal
Nitrocellulose Membrane	GE Healthcare / Amersham	10600002	para transferência de western blot eCLIP
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85125	para detergente de buffer de lavagem
Nuclease- and protease-free water	Thermo Fisher Scientific	10977035	para preparar soluções livres de nucleases
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX	para seleção de tamanho eCLIP
NuPAGE Bis-Tris Precast Gels	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX	para separação de proteínas SDS-PAGE
PBS (pH 7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010023	para lavagem celular e ressuspensão
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	inibidor de protease serina para buffer de lise celular; adicionado fresco antes do uso
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001	inibidor de protease de amplo espectro para buffer de lise celular; adicionado fresco antes do uso
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850	para digestão de proteínas na extração de RNA
qRT-PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	11704044	para RT-PCR quantitativa para confirmar o enriquecimento de RNA
RNase/Protease-Free DNase I Solution	Thermo Fisher Scientific	EN0521	para dissociação de tecidos
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	para purificação de RNA
SDS-PAGE Sample Loading Buffer	Beyotime	P0286	para preparação de amostra de proteína
Shrimp Alkaline Phosphatase	New England Biolabs	M0371S	para purificação de cDNA eCLIP
Silver Stain Kit	Beyotime	P00175	para visualização de proteínas em géis SDS-PAGE
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	para detergente de buffer de lavagem
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	para lise celular e desnaturação de proteínas
Superase-in RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	inibidor de RNase especializado; adicionado fresco antes do uso
T4 RNA Ligase	New England Biolabs	M0204	para ligação de adaptador eCLIP
Tris–HCl (pH 7.0)	Sigma-Aldrich	T5941	para preparar tampões de lise, hibridização e lavagem
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026CN	para extração de RNA
Ultrasonic cell crusher	ATPIO	ATPIO-650D	para lise celular e fragmentação de DNA
Ultraviolet Crosslinker	Analytik Jena	UVP CL-1000	para reticulação UV de interações RNA-proteína
urea	Sigma-Aldrich	U5128	para degradação de proteínas eCLIP na membrana