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Laminectomia Lombar L5 em Camundongos C57BL/6J Idosos para Modelar a Disfunção Cognitiva Pós-Operatória

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DOI:

10.3791/71733

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22 de setembro de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacology, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma laminectomia lombar padronizada no nível L5 em camundongos C57BL/6J idosos para estabelecer um modelo de disfunção cognitiva pós-operatória, minimizando ao mesmo tempo o comprometimento locomotor, o que favorece estudos comportamentais, histológicos e mecanicistas de transtornos neurocognitivos perioperatórios.

Resumo

A disfunção cognitiva pós-operatória (POCD) é uma complicação neurológica comum após cirurgia e anestesia, especialmente em adultos mais velhos, e está associada à recuperação tardia, hospitalização prolongada e redução da qualidade de vida. Procedimentos ortopédicos e da coluna vertebral estão ligados a um risco relativamente alto de POCD; no entanto, modelos pré-clínicos que reflitam fielmente as características perioperatórias da cirurgia da coluna ainda são limitados. Modelos comumente utilizados, incluindo laparotomia e fratura da tíbia, podem provocar déficits locomotores persistentes e inflamação periférica prolongada, o que pode confundir a interpretação dos resultados comportamentais cognitivos. Aqui, este protocolo descreve um modelo padronizado e de baixo custo para simular a POCD por meio de laminectomia lombar L5 sob anestesia com sevoflurano em camundongos machos C57BL/6J com 18 meses de idade. O procedimento é realizado com instrumentos cirúrgicos de uso rotineiro e produz uma lesão cirúrgica controlada, minimizando déficits motores persistentes. A função cognitiva é avaliada pelos testes de reconhecimento de objeto novo, labirinto em Y com braço novo e labirinto de Barnes, enquanto lesões neuronais no hipocampo e alterações neuroinflamatórias são avaliadas por meio da coloração de Nissl e imunofluorescência para Iba1, respectivamente. Resultados representativos demonstram atividade locomotora preservada, desempenho cognitivo prejudicado, integridade neuronal hipocampal reduzida e neuroinflamação hipocampal acentuada após a cirurgia. Este modelo padronizado e acessível fornece uma plataforma clinicamente relevante para investigar os mecanismos subjacentes à disfunção cognitiva associada à cirurgia da coluna vertebral e para avaliar intervenções neuroprotetoras perioperatórias em estudo.

Introdução

A disfunção cognitiva pós-operatória (POCD) é definida como uma diminuição na aprendizagem e na memória, atenção, velocidade de processamento e função executiva após anestesia e cirurgia1, afetando predominantemente pacientes idosos, e sua incidência relatada parece variar conforme o contexto cirúrgico e a população de pacientes2,3. Relatou-se que a POCD ocorre com frequência entre adultos mais velhos submetidos a cirurgia ortopédica eletiva4. Clinicamente, a POCD pode persistir por semanas a meses após a cirurgia e tem sido associada à hospitalização prolongada e aumento da mortalidade5,6,7. Com o envelhecimento populacional contínuo e o aumento do volume cirúrgico em todo o mundo, a POCD tornou-se uma questão importante de saúde pública e de cuidados perioperatórios.

Do ponto de vista fisiopatológico, a DCOP é considerada uma síndrome multifatorial desencadeada pelo trauma cirúrgico e pela exposição à anestesia, sendo a neuroinflamação, o estresse oxidativo, a disfunção da autofagia e a disfunção sináptica alguns dos mecanismos propostos para a disfunção neuronal em regiões relevantes para a cognição, como o hipocampo8. Para investigar esses mecanismos e avaliar intervenções candidatas, foram desenvolvidos diversos modelos pré-clínicos de DCOP. Os modelos pré-clínicos incluem modelos baseados apenas em anestesia, modelos baseados em cirurgia abdominal e modelos de lesão ortopédica, como fratura da tíbia9. Embora esses modelos tenham impulsionado o avanço do campo, eles podem não reproduzir completamente as características perioperatórias relevantes para cirurgias da coluna vertebral, e alguns podem introduzir fatores de confusão, como déficits locomotores persistentes e inflamação tecidual prolongada, que complicam a avaliação cognitiva e a interpretação mecanicista.

Entre as estratégias cirúrgicas disponíveis, selecionamos um modelo de laminectomia lombar em L5 para investigar o comprometimento cognitivo precoce no pós-operatório em um contexto cirúrgico padronizado e relevante para a coluna vertebral. Este procedimento proporciona um insulto cirúrgico controlado e localizado sob anestesia inalatória, permitindo a investigação das respostas neuroinflamatórias pós-operatórias e da disfunção cognitiva sem causar prejuízo motor evidente. Com aprimoramento das principais etapas operatórias, este protocolo oferece um método padronizado, prático e economicamente viável para estudar o comprometimento cognitivo associado à cirurgia da coluna vertebral e avaliar estratégias neuroprotetoras no período perioperatório.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Zhejiang (número de aprovação ética: ZJU20260153).

1. Preparação pré-operatória

  1. Animais experimentais, alocação em grupos, analgesia e cegamento
    1. Utilize camundongos machos C57BL/6J com 18 meses de idade e peso entre 30–34 g. Mantenha os camundongos em ciclo claro/escuro de 12 h, com acesso livre a alimento e água.
    2. Permita que os camundongos se aclimatizem às condições de alojamento por pelo menos 7 dias antes da cirurgia. Aloque aleatoriamente os camundongos no grupo de laminectomia L5 ou no grupo controle após a aclimatação.
    3. Atribua a cada camundongo um número de identificação codificado antes dos procedimentos experimentais. Mantenha o código de alocação em grupo para que as avaliações comportamentais possam ser realizadas sem conhecimento da atribuição ao grupo.
    4. Submeta os camundongos do grupo de laminectomia L5 à anestesia com sevoflurano seguida de laminectomia lombar L5. Não exponha os camundongos do grupo controle à anestesia com sevoflurano, preparo do local cirúrgico ou intervenção cirúrgica.
    5. Administre meloxicam por via subcutânea na dose de 2 mg/kg para os camundongos de ambos os grupos. Administre a primeira dose após a indução da anestesia no grupo de laminectomia L5 e no momento correspondente ao fim da cirurgia no grupo controle.
    6. Administre doses subsequentes de meloxicam por via subcutânea na dose de 2 mg/kg a cada 24 h durante 48 h para os camundongos de ambos os grupos. Mantenha, maneje e monitore ambos os grupos nas mesmas condições durante todo o período experimental.
    7. Realize todas as avaliações comportamentais de acordo com o mesmo cronograma experimental para ambos os grupos. Assegure que o pesquisador que realiza as avaliações comportamentais permaneça cegado quanto à alocação dos grupos.
  2. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos e desinfete o local cirúrgico. Aqueça previamente uma placa térmica para manter a temperatura corporal durante a anestesia. Prepare o meloxicam para administração perioperatória.
  3. Ligue a máquina de anestesia por gás e coloque o camundongo em uma câmara de indução. Induza anestesia geral com 3–5% de sevoflurano por 3–5 min, mantendo uma taxa de fluxo de oxigênio de 1 L/min.
  4. Transfira o camundongo anestesiado para a plataforma cirúrgica. Mantenha a anestesia com 1,5–3% de sevoflurano fornecido por meio de uma máscara de anestesia com taxa de fluxo de oxigênio de 0,5–0,8 L/min. Administre meloxicam por via subcutânea na dose de 2 mg/kg. A duração total da anestesia, medida a partir do início da indução com sevoflurano, é de aproximadamente 4 h. Ajuste a concentração de sevoflurano conforme necessário para manter um plano cirúrgico de anestesia estável.
  5. Posicione o camundongo em decúbito ventral com a coluna lombar voltada para cima. Fixe suavemente os membros anteriores com fita adesiva para estabilizar o animal e garantir acesso desobstruído à área cirúrgica L5.
  6. Confirme profundidade adequada de anestesia verificando a ausência do reflexo de retirada do membro posterior. Aplique pomada oftálmica para prevenir o ressecamento da córnea.
  7. Remova os pelos da região lombar mediana (aproximadamente L3–S1) utilizando uma aparadora para pequenos animais. Desinfete a pele exposta com etanol 75%, seguido de iodopovidona, repetindo o procedimento 2–3 vezes para assegurar condições assépticas.

2. Cirurgia de laminectomia lombar L5

OBSERVAÇÃO: No presente protocolo, todos os passos cirúrgicos foram realizados sob visualização direta, sem o uso de estereomicroscópio ou lentes de aumento.

  1. Coloque o camundongo anestesiado em posição prona sobre uma plataforma cirúrgica pré-aquecida. Fixe as patas dianteiras com fita adesiva para estabilizar o corpo e expor completamente a região lombar (Figura 1).
  2. Identifique o nível vertebral L5 utilizando marcos superficiais. Palpe as cristas ilíacas bilaterais e trace uma linha transversal imaginária conectando seus pontos mais altos.
  3. Utilize a linha transversal como referência aproximada para o espaço intervertebral L5–L6. Centralize a incisão cutânea planejada ligeiramente cranial a esta linha para direcionar-se à lâmina de L5.
  4. Desinfete o local cirúrgico. Faça uma incisão longitudinal mediana na pele com aproximadamente 1,5–2,0 cm de comprimento sobre o nível L5 pré-determinado para expor a região de L4–L6.
  5. Retraia as bordas da pele com pinças estéreis. Exponha a fáscia dorsal e identifique a linha mediana da ráfia fascial.
  6. Confirme o nível vertebral após a exposição da coluna vertebral. Identifique a junção lombossacra e a vértebra lombar mais caudal.
  7. Identifique L5 como a vértebra imediatamente cranial a L6, pois camundongos C57BL/6 geralmente possuem seis vértebras lombares. Confirme o nível contando duas vértebras cranialmente a partir da junção lombossacra.
  8. Crie uma pequena abertura ao longo da ráfia fascial mediana. Retraia bilateralmente os músculos paravertebrais sob visualização direta.
  9. Sequencie os músculos adjacentes ao processo espinhoso de L5 para expor a lâmina subjacente. Estenda a exposição cranialmente até o processo espinhoso de L4 e caudalmente até o processo espinhoso de L6, até que os três processos espinhosos estejam claramente visíveis.
  10. Realize principalmente dissecação romba, adjacente ao osso, utilizando cotonetes ou pinças finas. Utilize dissecação afiada apenas quando necessário para liberar aderências fasciais e minimizar sangramento.
  11. Mantenha a retração lateral com cotonetes para expor completamente a lâmina de L5 e o espaço interlaminar L5–L6. Reconfirme o nível vertebral antes de prosseguir.
  12. Agarre suavemente o processo espinhoso de L5 com pinças e eleve o processo espinhoso e a coluna lombar adjacente até um ângulo de aproximadamente 30° em relação à plataforma cirúrgica, para alargar o espaço interlaminar L5–L6.
  13. Insira as pontas fechadas da tesoura oftálmica no espaço interlaminar L5–L6 sob visualização direta. Avance a tesoura ao longo de um plano raso imediatamente abaixo da borda caudal da lâmina de L5.
  14. Abra ligeiramente a tesoura para criar a abertura óssea inicial. Amplie a janela de laminectomia removendo fragmentos ósseos pequenos sequencialmente ao longo das margens da lâmina. Restrinja a remoção óssea à lâmina dorsal de L5 e evite estender a janela óssea lateralmente para as articulações facetárias bilaterais.
  15. Evite profundidade excessiva de inserção e força excessiva de corte para prevenir lesão da dura-máter.
  16. Continue removendo a lâmina de forma progressiva até que a dura-máter seja claramente visível através da janela óssea.
  17. Inspeccione cuidadosamente o campo cirúrgico. Confirme a ausência de sangramento ativo e verifique se a dura-máter permanece íntegra.
  18. Irrique o local cirúrgico com solução salina estéril aquecida. Obtenha hemostasia utilizando compressão suave.
  19. Fechamento da ferida em camadas. Feche a pele com pontos de náilon 6-0 e desinfete o local da incisão.
  20. Após o fechamento da ferida, mantenha a anestesia com sevoflurano até que a duração total da anestesia alcance aproximadamente 4 h. Em seguida, interrompa a administração de sevoflurano e prossiga com os cuidados pós-operatórios.

3. Cuidados pós-operatórios

  1. No momento correspondente ao fim da cirurgia no grupo de laminectomia, administrar meloxicam por via subcutânea na dose de 2 mg/kg aos camundongos do grupo controle. Colocar cada camundongo do grupo de laminectomia sobre uma placa aquecida com controle de temperatura e manter a temperatura corporal até que o animal recupere a consciência e apresente respiração espontânea estável e atividade motora.
  2. Devolver cada camundongo do grupo de laminectomia à sua gaiola original após a recuperação completa da anestesia. A partir de então, monitorar o animal até que a deambulação normal seja observada. Administrar doses subsequentes de meloxicam por via subcutânea na dose de 2 mg/kg a cada 24 h durante 48 h aos camundongos de ambos os grupos.
  3. Examinar diariamente a incisão cirúrgica e a integridade dos pontos até o terceiro dia pós-operatório. Reanestesiar o camundongo e reposicionar quaisquer pontos soltos ou rompidos, se necessário.
  4. Examinar a incisão diariamente em busca de inchaço, sangramento, secreção ou sinais de inflamação local.
  5. Monitorar o peso corporal, comportamento de afeição, atividade espontânea e ingestão de alimento e água durante todo o período pós-operatório.
  6. Eutanasiar humanamente qualquer camundongo antes do término programado do experimento se algum dos seguintes critérios pré-definidos de fim ético for atingido: perda de ≥20% do peso corporal pré-operatório; anorexia completa por 24 h ou ingestão de alimento inferior a 50% da quantidade normal por 3 dias consecutivos; incapacidade ou relutância acentuada para se levantar ou acessar alimento e água, persistindo por 24 h após a recuperação da anestesia; ou estado moribundo caracterizado por depressão acentuada acompanhada por temperatura corporal abaixo de 37 °C.

4. Avaliação comportamental de DOCP

  1. Teste do campo aberto (controle de locomoção; dia pós-operatório 3)
    1. Realize o teste do campo aberto em uma arena de 45 cm × 45 cm com paredes de 40 cm de altura, sob iluminação de 20 lux. Posicione a câmera de vídeo diretamente acima do centro da arena, de modo que toda a área de teste esteja dentro do campo de visão.
    2. Coloque o camundongo no centro da arena e inicie o rastreamento por vídeo imediatamente após a colocação. Permita que o camundongo explore livremente por 5 min. Analise toda a sessão de 5 min e calcule a distância total percorrida e a velocidade média de movimento utilizando o sistema de rastreamento por vídeo.
  2. Análise da marcha
    1. Realize a análise da marcha no dia pós-operatório 3 utilizando um sistema automatizado de análise da marcha.
    2. Posicione cada camundongo em uma extremidade da passarela e permita que ele a percorra livremente. Registre as pegadas durante a locomoção utilizando a câmera de alta velocidade integrada ao sistema de análise da marcha.
    3. Registre ensaios de marcha para cada camundongo e colete três corridas válidas com movimento contínuo para frente ao longo da passarela para análise subsequente.
    4. Analise os dados das pegadas registradas utilizando o software de análise da marcha. Revise as pegadas identificadas automaticamente e corrija manualmente a classificação da pata dianteira direita, pata dianteira esquerda, pata traseira direita e pata traseira esquerda quando necessário, antes de extrair os parâmetros da marcha.
    5. Quantifique o comprimento da passada, o tempo de apoio, a velocidade da oscilação e a área da pegada, e calcule o valor médio das três corridas válidas para cada camundongo para análise estatística.
  3. Labirinto de Barnes (aprendizado e memória espacial; dias pós-operatórios 4–6)
    ​NOTA: Realize o teste no labirinto de Barnes uma vez ao dia durante três dias consecutivos, iniciando no dia pós-operatório 4. Realize os testes dentro do mesmo intervalo horário diário para minimizar a variabilidade circadiana.
    1. Posicione a caixa de fuga sob o orifício-alvo designado. Mantenha a mesma localização-alvo durante todo o experimento.
    2. Coloque o camundongo no centro do labirinto para iniciar cada ensaio. Permita que o camundongo procure a caixa de fuga por até 3 min. Encerre o ensaio quando o camundongo entrar na caixa de fuga.
    3. Guie suavemente o camundongo até o orifício-alvo caso ele não localize a caixa de fuga dentro de 3 min. Permita que o camundongo permaneça brevemente na caixa de fuga para reforçar o aprendizado da tarefa.
    4. Registre a latência de fuga e a distância percorrida utilizando o sistema de rastreamento por vídeo. Para ensaios em que o camundongo não entra na caixa de fuga dentro de 3 min, atribua uma latência de fuga de 180 s. Inclua apenas a latência de fuga e a distância percorrida registradas durante a sessão final no dia 3 na análise estatística.
  4. Reconhecimento de objeto novo (memória de reconhecimento; dias pós-operatórios 3–4)
    ​NOTA: Utilize a mesma arena e sistema de rastreamento por vídeo descritos para o teste do campo aberto. Utilize a sessão do campo aberto no dia pós-operatório 3 para habituar os camundongos à arena de teste antes do treinamento em reconhecimento de objeto novo.
    1. Posicione dois objetos cilíndricos idênticos em posições simétricas na arena durante a sessão de treinamento. Permita que o camundongo explore livremente por 5 min.
    2. Após um intervalo de retenção de 1 h, substitua um dos objetos cilíndricos familiares por um novo objeto com formato cúbico. Equilibre a posição do objeto novo entre os camundongos para minimizar preferências laterais potenciais. Permita que o camundongo explore por 5 min.
    3. Registre o tempo de exploração dos objetos familiar e novo utilizando o sistema de rastreamento por vídeo. Inclua apenas camundongos com tempo total de exploração dos objetos de pelo menos 3 s na análise.
    4. Calcule o índice de preferência (IP) como:
      figure-protocol-1
      Defina Tnovel e Tfamiliar como os tempos gastos explorando os objetos novo e familiar, respectivamente, durante a sessão de teste.
  5. Labirinto em Y com braço novo (memória de reconhecimento espacial; dia pós-operatório 5)
    1. Realize o teste em um labirinto em formato de Y composto por três braços idênticos separados por 120°. Bloqueie aleatoriamente um dos braços com uma porta opaca e designe esse braço como o braço novo.
    2. Selecione aleatoriamente um dos dois braços abertos como braço inicial. Designe o braço aberto restante como braço familiar. Coloque o camundongo na extremidade do braço inicial e permita que ele explore livremente os dois braços acessíveis por 5 min.
    3. Após um intervalo interensaio de 1 h, remova a porta opaca e retorne o camundongo à extremidade do mesmo braço inicial.
    4. Permita que o camundongo explore livremente os três braços por 5 min.
    5. Defina uma entrada em um braço como o centro do corpo rastreado entrando em uma zona predefinida do braço a partir da zona central. Registre o número de entradas e o tempo gasto em cada braço utilizando o sistema de rastreamento por vídeo.
    6. Calcule o índice de preferência por tempo no braço novo como:
      figure-protocol-2
      Defina Tnovel, Tstart e Tfamiliar como os tempos gastos nos braços novo, inicial e familiar, respectivamente.
    7. Calcule o índice de preferência baseado em entradas como:
      figure-protocol-3
      Defina Enovel como o número de entradas no braço novo e Etotal como o número total de entradas nos três braços durante o ensaio de teste.

5. Processamento do tecido, coloração de Nissl e coloração por imunofluorescência

  1. Processamento do tecido
    1. No ponto final experimental designado, anestesiar profundamente o camundongo com 3% de sevoflurano administrado a uma taxa de fluxo de oxigênio de 2 L/min.
    2. Confirmar a profundidade adequada da anestesia pela ausência do reflexo de retirada do pé. Enquanto mantém a anestesia profunda e antes da parada cardíaca, realizar perfusão transcardial com 20 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o sangue intravascular.
    3. Perfusar imediatamente o camundongo com 20 mL de paraformaldeído a 4% (PFA).
    4. Dissecar cuidadosamente o cérebro inteiro. Imersar o cérebro em PFA a 4% por 24 h a 4 °C para pós-fixação.
    5. Transferir o cérebro para solução de 30% de sacarose até que o tecido afunde completamente.
    6. Incrustar o cérebro em composto de temperatura de corte ideal (OCT).
    7. Congelar rapidamente o tecido embutido e armazená-lo a −80 °C até o corte em criostato.
  2. Coloração de Nissl
    1. Levar cortes criostáticos de 16 µm à temperatura ambiente. Deixar as lâminas secarem ao ar por 20 min.
    2. Lavar as lâminas em PBS por 2 min.
      NOTA: Garantir que os cortes teciduais permaneçam firmemente aderidos às lâminas antes da coloração.
    3. Cobrir completamente os cortes com solução de coloração com azul de toluidina. Incubar por 30 min a 55 °C.
      NOTA: Otimizar empiricamente o tempo de coloração para cortes de 16 µm para evitar supercoloração.
    4. Lavar brevemente as lâminas em água destilada por 10–30 s.
    5. Diferenciar os cortes sequencialmente em etanol a 95%, 85% e 75%, por 2 min cada.
      NOTA: Ajustar o tempo de diferenciação se necessário para otimizar a intensidade da coloração.
    6. Desidratar as lâminas duas vezes em xilol fresco por 5 min cada.
      NOTA: Realizar todos os passos com xilol em capela de exaustão química.
    7. Montar os cortes com bálsamo neutro. Colocar cuidadosamente uma lamínula sobre cada corte.
    8. Imagens dos cortes corados utilizando microscópio de luz com objetiva de 20×. Identificar a região CA1 com base na sua camada compacta característica de células piramidais no corte coronal do hipocampo. Para cada camundongo, analisar um corte coronal e obter dois campos não sobrepostos da região CA1 de cada hemisfério hipocampal.
    9. Contar manualmente neurônios positivos para Nissl e corpos de Nissl morfologicamente intactos utilizando o plugin de contagem celular no software de análise de imagem. Identificar neurônios intactos pela presença de soma intacto, núcleo redondo com nucléolo visível e substância de Nissl abundante no citoplasma; identificar os corpos de Nissl como estruturas granulares ou agregadas intensamente basófilas no citoplasma neuronal.
    10. Calcular a média dos valores obtidos em todos os campos analisados para gerar um único valor por animal. Garantir que o observador que realiza as contagens permaneça cego quanto à alocação dos grupos.
  3. Coloração de imunofluorescência para Iba1
    1. Deixar os cortes cerebrais atingirem equilíbrio à temperatura ambiente antes da coloração.
    2. Imersar as lâminas em solução de recuperação antigênica de citrato de sódio e realizar a recuperação antigênica em banho-maria a 80 °C por 25 min. Após a recuperação antigênica, deixar as lâminas e a solução esfriarem naturalmente até a temperatura ambiente.
    3. Lavar os cortes três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 3 min cada.
    4. Permeabilizar os cortes com Triton X-100 a 0,2% em PBS por 30 min à temperatura ambiente, seguido por três lavagens com PBS por 3 min cada.
    5. Bloquear ligações inespecíficas incubando os cortes com albumina sérica bovina (BSA) a 3% em PBS por 1 h à temperatura ambiente em câmara umidificada.
    6. Lavar os cortes três vezes com PBS por 3 min cada.
    7. Diluir o anticorpo primário contra a molécula adaptadora ligadora de cálcio ionizado 1 (Iba1; 1:100) na solução de bloqueio (BSA a 3% em PBS) e incubá-los com o anticorpo primário diluído durante a noite a 4 °C em câmara umidificada.
    8. Lavar os cortes três vezes com PBS por 3 min cada.
    9. Incubar os cortes com conjugado de cabra anti-coelho IgG (H+L) 488 (1:1000) por 90 min à temperatura ambiente no escuro.
    10. Lavar os cortes três vezes com PBS por 3 min cada no escuro.
    11. Contracolorir os núcleos com DAPI (1:8000) por 5 min no escuro.
    12. Lavar os cortes três vezes com PBS por 3 min cada no escuro.
    13. Montar os cortes com meio de montagem antifade, aplicar lamínulas e proteger os cortes da luz até a aquisição de imagens.
    14. Adquirir imagens de fluorescência da região CA1 do hipocampo utilizando microscópio de fluorescência confocal com objetiva de 20×. Utilizar configurações idênticas de aquisição de imagens para todos os cortes incluídos nas comparações quantitativas. Para cada camundongo, analisar um corte coronal e adquirir dois campos não sobrepostos da região CA1 de cada hemisfério hipocampal.
    15. Quantificar a intensidade média de fluorescência de Iba1 na região CA1 do hipocampo utilizando configurações de limiar idênticas em todas as imagens. Calcular a média dos valores de todos os campos para obter um único valor por animal.

6. Análise estatística

  1. Realize todas as análises estatísticas utilizando software de análise estatística. Apresente os dados como média ± desvio padrão (DP).
  2. Avalie a normalidade dos dados utilizando o teste de Shapiro–Wilk. Avalie a igualdade das variâncias utilizando o teste F.
  3. Compare os grupos controle e laminectomia L5 utilizando o teste t de Student não pareado bicaudal quando a suposição de variância for atendida. Utilize o teste t de Welch quando a suposição de variância não for atendida.
  4. Defina n como o número de animais incluídos em cada análise. Considere um valor de P < 0,05 estatisticamente significativo.

Resultados

Todos os camundongos sobreviveram até o ponto final planejado do experimento, nenhum atendeu aos critérios pré-definidos de ponto final ético e todos foram incluídos nas análises finais. A função motora foi avaliada no terceiro dia pós-operatório por meio de análises de campo aberto e da marcha. Nem a distância total percorrida nem a velocidade média no teste de campo aberto diferiram entre os grupos, indicando atividade locomotora espontânea comparável (Figura 2A). A análise da marcha também não mostrou diferenças significativas entre os grupos no comprimento da passada, tempo de apoio, velocidade de balanço ou área de impressão da pata (Figura 2B). Em conjunto, esses achados indicam que o procedimento de laminectomia L5 não produziu comprometimento motor evidente suficiente para explicar as diferenças subsequentes no desempenho cognitivo-comportamental.

O desempenho cognitivo foi avaliado utilizando o teste de reconhecimento de objeto novo (NOR), o labirinto em Y com braço novo e o labirinto de Barnes. No teste NOR, o grupo submetido à laminectomia L5 apresentou um índice de preferência por objeto novo (PI) significativamente menor do que o grupo controle (Figura 3A). No labirinto em Y com braço novo, o grupo submetido à laminectomia L5 apresentou PIs significativamente menores tanto para o tempo gasto quanto para as entradas no braço novo (Figura 3B). No labirinto de Barnes, o grupo submetido à laminectomia L5 apresentou maior latência de escape e maior distância percorrida no dia 3 do teste no labirinto de Barnes (Figura 3C). Em conjunto, esses achados comportamentais indicam prejuízo no desempenho cognitivo pós-operatório após laminectomia L5.

Na região CA1 do hipocampo, o grupo submetido à laminectomia L5 apresentou significativamente menos neurônios positivos para Nissl e significativamente menos corpúsculos de Nissl do que o grupo controle, indicando dano estrutural neuronal (Figura 4A, B). Além disso, a intensidade média de fluorescência de Iba1 foi significativamente aumentada no grupo submetido à laminectomia L5, compatível com maior ativação microglial (Figura 4C, D).

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Figura 1: O procedimento de laminectomia lombar L5 para modelagem de disfunção cognitiva pós-operatória (POCD) em camundongos. (A) Ilustração do alvo cirúrgico na lâmina L5 e da extensão da exposição que abrange os níveis vertebrais adjacentes (L4–L6). (B) Imagens intraoperatórias ilustrando etapas principais do procedimento de laminectomia lombar L5. (a) Região lombar após a depilação, com a linha média da coluna identificada; setas indicam a direção da incisão cutânea planejada. (b) Incisão cutânea mediana sobre a coluna lombar. (c) Incisão da fáscia com separação progressiva dos músculos paravertebrais para expor as apófises espinhosas e, posteriormente, remover o tecido ao redor da apófise espinhosa e lâmina L5 para expor completamente a lâmina L5. (d) Laminectomia L5 após a remoção da lâmina L5. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Avaliação da atividade locomotora e da marcha após laminectomia lombar L5. (A) Teste de campo aberto mostrando a distância total percorrida e a velocidade média (n = 10). (B) Análise da marcha mostrando o comprimento da passada, tempo de apoio, velocidade de balanço e área de impressão (n = 6). Os dados representam a média ± DP. A significância estatística é indicada como ns, não significativa. Abreviaturas: Controle = grupo controle; Laminectomia = grupo submetido à laminectomia L5. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Avaliações cognitivo-comportamentais após laminectomia lombar L5. (A) Teste de reconhecimento de objeto novo (n = 10). (B) Teste no labirinto em Y com braço novo (n = 10). (C) Teste no labirinto de Barnes (n = 10). Os dados representam a média ± DP. A significância estatística é indicada por *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001. Abreviações: Controle = grupo controle; Laminectomia = grupo com laminectomia L5. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Avaliação histológica da região CA1 do hipocampo após laminectomia lombar L5. (A) Imagens representativas da coloração de Nissl na região CA1 do hipocampo. (B) Quantificação de neurônios positivos para Nissl (esquerda) e corpos de Nissl (direita) (n = 5). (C) Imagens representativas da imunofluorescência para Iba1 na região CA1 do hipocampo. Barra de escala = 100 µm. (D) Quantificação da intensidade média de fluorescência de Iba1 (n = 6). Os dados representam a média ± DP. A significância estatística é indicada como **P < 0,01 e ***P < 0,001. Abreviações: Controle = grupo controle; Laminectomia = grupo com laminectomia L5. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Disfunção cognitiva pós-operatória tem sido relatada em adultos mais velhos submetidos a cirurgia da coluna vertebral10. Evidências experimentais indicam ainda que o envelhecimento aumenta a suscetibilidade ao prejuízo cognitivo associado à cirurgia e às respostas neuroinflamatórias11,12. O presente protocolo combina cerca de 4 h de anestesia com sevoflurano com laminectomia em L5 em camundongos idosos para modelar o prejuízo cognitivo precoce pós-operatório. Seu valor metodológico principal reside em fornecer um procedimento prático e acessível para investigar alterações comportamentais e histológicas do hipocampo após cirurgia da coluna vertebral.

Modelos pré-clínicos de DCOP incluem exposição apenas à anestesia, cirurgia abdominal e paradigmas de lesão ortopédica13. Os paradigmas com apenas anestesia permitem a avaliação dos efeitos anestésicos na ausência de trauma cirúrgico14, mas não reproduzem a exposição combinada à anestesia e à lesão tecidual. Modelos de cirurgia abdominal e de fratura da tíbia incorporam lesão cirúrgica e têm sido utilizados para investigar o comprometimento cognitivo associado à cirurgia15,16. No entanto, seus locais operatórios e padrões de lesão tecidual diferem dos procedimentos espinhais. Como o tipo e a intensidade do trauma cirúrgico podem afetar os resultados cognitivos pós-operatórios e as respostas inflamatórias centrais9, o contexto cirúrgico deve ser considerado ao selecionar um modelo pré-clínico. Assim, o presente protocolo de laminectomia L5 fornece um paradigma experimental relacionado à cirurgia da coluna vertebral para examinar o comprometimento cognitivo precoce no pós-operatório em camundongos idosos.

O principal desafio técnico neste protocolo é remover quantidade suficiente de osso da lâmina L5 para expor claramente a dura-máter, evitando ao mesmo tempo lesão dural. Durante uma laminectomia com visualização direta, é necessário controlar cuidadosamente a profundidade do instrumento, a força de corte e o ângulo de inserção da tesoura oftálmica. O osso deve ser removido de forma progressiva, com cortes pequenos e controlados ao longo das margens da lâmina. Segurar o processo espinhoso L5 com pinça e elevar o segmento lombar operado até um ângulo de aproximadamente 30° em relação à plataforma cirúrgica alarga o espaço interlaminar L5–L6. Esse movimento permite inserir as pontas da tesoura sob a borda óssea com menor profundidade e reduz o risco de contato com a dura. A remoção incompleta do osso pode limitar a exposição cirúrgica, enquanto cortes excessivamente agressivos ou profundidade de inserção excessiva podem causar lesão dural. Sangramento descontrolado pode ofuscar o campo operatório, prejudicar a recuperação pós-operatória e aumentar a variabilidade nos resultados comportamentais. Quando o espaço interlaminar for insuficiente para inserção segura das pontas da tesoura, deve-se reajustar a posição e o ângulo de elevação do segmento lombar operado, em vez de aumentar a profundidade de inserção. Se o sangramento ofuscar o campo operatório, a remoção do osso deve ser interrompida até que a visualização adequada seja restaurada, após o que qualquer osso remanescente deve ser removido de forma incremental.

A separação do músculo paravertebral e a laminectomia em L5 podem contribuir para dor transitória no pós-operatório, e a hipersensibilidade mecânica já foi documentada após laminectomia experimental em camundongos17. O meloxicam foi administrado de acordo com um regime analgésico predefinido. Relatou-se que expressões faciais relacionadas à dor no pós-operatório em camundongos persistem por aproximadamente 36–48 h18. O regime analgésico de 48 h teve como objetivo cobrir esse período pós-operatório inicial, e os testes cognitivo-comportamentais foram iniciados no terceiro dia pós-operatório, após a conclusão do regime analgésico, para reduzir a possível influência da dor imediata no pós-operatório. O teste do campo aberto tem sido utilizado em estudos experimentais de DCPO para avaliar a atividade locomotora espontânea e determinar se a redução da locomoção pode confundir o desempenho cognitivo-comportamental19,20. Assim, os testes no campo aberto e a análise da marcha foram realizados no terceiro dia pós-operatório, antes da avaliação cognitiva. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos na atividade locomotora no campo aberto nem nos parâmetros da marcha, sugerindo que as diferenças cognitivo-comportamentais subsequentes dificilmente poderiam ser explicadas principalmente por comprometimento motor evidente. Contudo, como a dor espontânea no pós-operatório e o desconforto da ferida não foram avaliados diretamente, seus efeitos residuais sobre o desempenho comportamental não podem ser totalmente descartados. Estudos futuros poderiam incluir avaliações diretas da dor espontânea no pós-operatório.

No geral, este protocolo fornece uma abordagem experimental prática para investigar o comprometimento cognitivo precoce em camundongos idosos após laminectomia L5. Pode ser utilizado para estudar os desfechos comportamentais e os mecanismos subjacentes ao comprometimento cognitivo associado à cirurgia da coluna vertebral, bem como para avaliar intervenções destinadas a prevenir ou reduzir o comprometimento cognitivo pós-operatório. A validação em coortes maiores e em laboratórios independentes ajudaria a consolidar a estabilidade e reprodutibilidade do modelo.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos a Sanhua Fang da plataforma de instalações centrais da Escola de Medicina da Universidade de Zhejiang, a Yanhong Chen e a Xuliang Zhang do centro de animais da Universidade de Zhejiang pelo apoio técnico. Este estudo foi financiado pelos seguintes fundos: Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nºs. 82575196, 82074535 e U23A20508).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos machos C57BL/6JSuzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd.SYXK2023-0005Modelo animal
Software de rastreamento de vídeo ANY-mazeStoelting Co., USA6000Rastreamento e análise comportamental por vídeo
Pomada oftálmica de eritromicinaBeijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd.H11021270Prevenir ressecamento ocular
Pinceta finaNANAPrender a pele
Manta térmicaNANAControlada por temperatura
Anticorpo monoclonal de coelho Iba1/AIF-1 (E4O4W)Cell Signaling Technology17198Coloração por imunofluorescência para Iba1
Equipamento de anestesia inalatóriaRWD Life Science Co., Ltd.R581SAnestesia
MGT-PRAnhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., ChinaMJY2025112704Análise da marcha
Tesoura microcirúrgica oftálmicaNANARemoção óssea
Solução para coloração de NisslHaoke Biotechnology Co., Ltd.HK2033Coloração de Nissl
Tesoura cirúrgicaShang Shou Jin Zhong Surgical Instruments Jiangsu ITD.,CorpY00030Incisão da pele
SevofluranoShanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd.25062331Anestesia
Campo cirúrgico descartávelJiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd.20212140221Plataforma para procedimento cirúrgico
Aparador para pequenos animaisYiwu Leiben Trading Co., Ltd.2504KFZB3592-03310Remoção de pelos
Agulhas cirúrgicas com fioShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD.F603Suturar a pele
Creme depilatório VeetRECKITT BENCKISER (India) LtdNARemoção de pelos

Referências

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Modelo de Cirurgia EspinhalAnestesia com SevofluranoTeste de Função CognitivaLesão Neuronal HipocampalAlterações NeuroinflamatóriasColoração de NisslImunofluorescência para Iba1

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